Système immunitaire

4102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir une biopsie de la queue, douze semaines de régime gras, jusqu'à dix injections, des jeûnes de six à seize heures, des gavages et cinq à dix prélèvements de sang à la queue. L'obésité provoquée entraîne prise de poids et baisse d'activité, et le pancréas ainsi que d'autres organes sont prélevés après mise à mort. Le projet cherche à comprendre le rôle des cellules immunitaires du pancréas dans le diabète de type 2, une piste thérapeutique annoncée comme lointaine.

Objectifs

Le pancréas régule la glycémie grâce à des cellules spécialisées qui produisent de l’insuline. Il contient aussi des cellules immunitaires qui participeraient à cet équilibre, mais dont le rôle reste encore mal connu. Ce projet cherche à comprendre comment ces cellules influencent le fonctionnement du pancréas, en particulier dans le cas de consommation excessives de graisses, pouvant conduire au développement d’une obésité et d’un diabète.

Bénéfices attendus

Étudier la fonction des cellules immunitaires du pancréas est essentiel pour mieux comprendre comment le pancréas régule le sucre dans le sang et réagit aux déséquilibres métaboliques, comme ceux causés par une alimentation riche en graisses. Ces cellules immunitaires, longtemps considérées comme de simples défenseurs contre les infections, jouent en réalité un rôle plus complexe dans le soutien des cellules productrices d’insuline et dans le maintien de la santé métabolique. En comprenant les mécanismes par lesquels ces cellules influencent le fonctionnement du pancréas, ce projet pourrait révéler de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir ou traiter des maladies comme le diabète de type 2.

Procédures

1 biopsie de queue (10s), 1 régime riche en gras et en cholestérol (WD - 12 semaines), 1 régime riche en graisse (HFD - 12 semaines), 1 à maximum 10 injections (20s), 1 à 2 jeun (6h ou 16h), 1 à 2 gavages (1min), 5 à 10 prélèvements de sang à la queue (3s).

Impact sur les animaux

Injections : douleur légère due à la piqure. Obésité : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Coupure du bout de la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Biopsie de queue : douleur modérée. -Gavage : contention soutenue et introduction de la sonde.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de permettre le prélèvement du pancréas ainsi que d’autres organes d’intérêt. Ces prélèvements sont indispensables à la réalisation d’analyses visant à comprendre les mécanismes étudiés dans ce projet, notamment pour identifier les voies de régulation du métabolisme dans différentes conditions expérimentales et caractériser et localiser les différentes populations cellulaires.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier le rôle des cellules immunitaires du pancréas en condition normale et de surcharge lipidique. Le pancréas répond à la prise et la perte de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux, réduit à son minimum, a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles pour les étudier. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours (souriceaux) et 22 semaines (adultes).

1012 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras destiné à provoquer une maladie du foie gras, avec perte de poids et baisse d'activité possibles, et pour 72 d'entre elles une biopsie du bout de la queue. Le projet étudie une protéine de stress exprimée dans le foie malade, comme cible thérapeutique éventuelle. Tous les animaux sont tués pour prélever le foie et en analyser l'inflammation et le métabolisme.

Objectifs

La maladie du foie gras non liée à l’alcool touche de plus en plus de personnes et peut évoluer vers une inflammation et une fibrose du foie, appelée MASH, avec un risque important de carcinome. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine fortement exprimée dans le foie des personnes atteintes par cette maladie métabolique grave. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées afin de déterminer comment cette protéine influence le foie, dont l’inflammation et le renouvellement des cellules immunitaires. Ces travaux permettront de mieux comprendre la maladie et de déterminer si cette protéine peut être un candidat important comme future cible thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie du foie gras sévère. Les résultats vont contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ralentir ou inverser l’évolution de la maladie.

Procédures

Une injection par jour (environ 5 secondes) pendant 3 jours successifs sur 192 animaux. Pour 72 animaux, un prélèvement unique de 2mm de l’extrémité de la queue (environ 5 secondes x 1 par animal), sera réalisé.

Impact sur les animaux

Une légère douleur de courte durée et de faible intensité peut survenir au moment du prélèvement de la biopsie au niveau de la queue. Les régimes alimentaires utilisés pour provoquer la maladie du foie gras chez les souris peuvent entraîner une perte de poids progressive, une baisse d’activité ou des changements dans le comportement alimentaire. Les animaux seront surveillés chaque jour pour détecter ces signes et des seuils d’alerte ont été définis afin d’intervenir rapidement et d’éviter toute souffrance prolongée. Les injections peuvent provoquer une inflammation temporaire ou un fonctionnement hépatique altéré. Les animaux feront l’objet d’un suivi attentif pendant les 72h suivant l’injection pour détecter toute anomalie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, et seront ensuite utilisés afin de récupérer prélever le foie pour des analyses biochimiques, immunohistochimiques, transcriptionnelles et protéomiques afin d’évaluer l’inflammation, le métabolisme lipidique, l’expression des gènes et des protéines, ainsi que la composition cellulaire.

Remplacement

Les interactions entre les cellules du foie et le système immunitaire sont très complexes. Pour les étudier correctement, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal. La souris est l’espèce la plus adaptée, car son fonctionnement biologique est proche de celui de l’être humain

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. Pour garantir que nos conclusions soient pertinentes pour les deux sexes, chaque expérience sera réalisée à la fois sur des mâles et des femelles. Pour chaque souris, plusieurs analyses seront réalisées (sur le métabolisme, les cellules et les tissus), ce qui permet d’obtenir un maximum d’informations sans utiliser d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de malaise. Une grille d’évaluation permettra au personnel formé de suivre leur état de santé et d’agir si nécessaire. Toute modification visible de leur apparence ou de leur comportement sera notée. Les animaux concernés seront alors suivis chaque jour et peuvent éventuellement recevoir un traitement contre la douleur. Si certains signes de mal-être persistent plus de 48 heures, l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle bien établi pour étudier les maladies du foie, car son organisme fonctionne de manière similaire à celui de l’être humain. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies dont la maladie du foie gras. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, dont le foie et le système immunitaire sont pleinement développés, afin d’obtenir des résultats fiables.

Les souris qui perdent 20 % de leur poids ou atteignent un score clinique de 9 sont mises à mort. 30 souris immunodéficientes NSG sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Chacune reçoit une injection de cellules souches humaines pour lui reconstruire un système immunitaire humain, puis des prélèvements sanguins rétro-orbitaires toutes les deux semaines, alternés d'un œil à l'autre. Le porteur signale un risque de réaction du greffon contre l'hôte et retient ce modèle pour éviter le recours au sang de cordon.

Objectifs

Les cellules souches pluripotentes induites sont des cellules souches qui ont la capacité, selon les conditions de leur environnement, de s’orienter vers différents types de lignées cellulaires et notamment vers la voie immunitaire. Ce projet a pour objectif d’utiliser ces capacités, afin de recréer un système immunitaire humain chez des souris (= humanisation) immuno-déficientes (sans système immunitaire) à partir de cellules souches pluripotentes provenant de cellules humaines. L’utilisation de ces cellules va permettre de standardiser un protocole pour la création d’un modèle murin humanisé sans recourir à des cellules issues de sang de cordon humain, couramment utilisées pour l’humanisation, d’avoir un stock conséquent de cellules pour l’humanisation et de pouvoir recréer chez la souris un système immunitaire personnalisé (à partir de cellules reprogrammées issues de cellules de patients).

Bénéfices attendus

Pour comprendre le développement du système immunitaire humain et essayer d’analyser son comportement par rapport à différentes situations, beaucoup de travaux ont été effectués in vitro sur différents modèles cellulaires. Mais les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble notamment dans le cas de la recherche sur les rejets de greffe, l’impact d’un médicament ou autre. C’est pourquoi, pour observer le développement de ces cellules et leurs fonctionnalités, des modèles de souris et de rats humanisés (qui ont un système immunitaire humain) ont été développés. Ces modèles murins humanisés se font aujourd’hui essentiellement par l’injection de cellules issues de sang de cordon ombilicale qui est du matériel cher et précieux dû aux stocks limités. Aussi il est nécessaire souvent d’avoir recours à plusieurs donneurs pour un même protocole pouvant entrainer une variabilité dans les résultats. Ainsi ce projet permettrait d’avoir un modèle de souris humanisé standardisé par des cellules ayant la même origine dans un stade de développement contrôlé. Le stock important permettra également d’en réduire le coût et d’avoir un n plus important pour nos projets. Un autre axe de développement peut être l’étude de maladies génétiques impactant le système immunitaire. Effectivement, des iPSC peuvent être générées à partir de cellules d’un patient touché par une maladie génétique. Alors on pourrait orienter ces cellules vers le stade hématopoïétique avec notre protocole de culture cellulaire et les injecter chez l’animal. Ainsi nous aurions un modèle murin avec un système immunitaire humain comportant la mutation ou le fond génétique spécifique d’une maladie. Par ailleurs, on peut envisager également une modification génétique directement in vitro sur nos iPSC d’individus sains (nos iPSC de travail) afin d’avoir des modèles murins avec des cellules humaines ayant une mutation génétique spécifique.

Procédures

L'humanisation des animaux se fera via l'injection en intraveineux de cellules iPSC. Des prélèvements sanguins auront lieu au bout de 3 mois après l'humanisation sur animal endormi au niveau du sinus retro-orbital. Les prélèvements auront lieu toutes les 2 semaines alternativement à l'oeil gauche puis à l'oeil droit jusqu'à la fin du protocole.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris NSG qui sont des animaux immunodéficients et par ce fait, sont très sensibles aux infections. Pour ce protocole, les souris pourront avoir une douleur localisée et momentanée au niveau du site d’injection de la greffe. Elles pourront ressentir un stress dû aux manipulations et prélèvements répétés (pesée, prélèvement de sang) ainsi qu’à l’irradiation. L’injection des cellules en soi, peut être rejetée ou bien provoquer la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD). Ainsi, les souris seront examinées quotidiennement pour évaluer la présence de symptômes.

Devenir

A l'issu de la procédure tout les animaux seront mis mort afin de faire des prélèvements

Remplacement

Beaucoup d’étude sur le système immunitaire ont été réalisées in vitro mais de par sa complexité il est essentiel de l’étudier in vivo dans son ensemble. Et pour cela, un des moyens d’étudier le système immunitaire humain est d’utiliser des modèles murins humanisés, c’est-à-dire, ayant un système immunitaire humain. C’est donc dans ces perspectives d’étude du système immunitaire que nous souhaitons créer ce modèle murin à partir de cellules issues d’iPSC. Mais avant cela, notre laboratoire a réalisé beaucoup d’études uniquement in vitro pour ce projet afin de trouver le bon protocole de culture cellulaire et le passage chez l’animal se fait uniquement avec des cellules dont les propriétés sont celles souhaitées par notre équipe pour le développement du système immun humain chez la souris. Aucun autre test sera réalisé avec des cellules n’ayant pas ces propriétés pour ne pas utiliser d’animaux inutilement.

Réduction

L’efficacité de notre modèle de souris humanisées sera étudiée par le biais de tests statistiques. Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement analysables et de sorte d’avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Ce nombre prend aussi en compte le risque de GVHD et de rejet de greffe. Ce nombre de groupes de souris a été défini par la loi normale. Pour juger de l’efficacité de notre protocole, des prélèvements sanguins seront faits afin d’analyser, via la cytométrie en flux, les différentes populations immunitaires chez les animaux. Afin de comparer les groupes entre eux l’analyse des populations se fera via le test one way RM ANOVA

Raffinement

Les souris NSG seront distribuées par 5 maximum par cage avec des moyens d’enrichissement propre à l’espèce (frisottis, dôme et tunnel). Les souris étant immunodéficientes, les cages seront entreposées sur un portoir ventilé et les animaux manipulés sous hottes avec des équipements de protection adaptés pour éviter toute infection. Une surveillance quotidienne des animaux en protocole sera réalisée pour déceler un éventuel problème chez une souris (blessure, forte souffrance non observée auparavant) par les expérimentateurs ou les animaliers. De plus pour déceler les signes éventuels d’une GVHD ou de rejet de greffe, une observation plus attentive sera effectuée une fois par semaine selon une liste de symptômes permettant d’évaluer ces processus avec une grille de score (voir tableau annexe). Le même jour, les animaux seront pesés (pesée une fois par semaine) afin de constater une éventuelle perte de poids. Une souris avec l’un des symptômes suivants : perte de 20% du poids par rapport à J0, un refus d’alimentation, une incapacité de mouvement, une voussure sévère du dos ou une diarrhée sanguinolente, aura atteint un point limite et sera mise à mort. L’atteinte d’un score clinique de 9 points ou plus est également considéré comme un point limite. Les animaux souffrants seront séparés des autres pour leur offrir une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Concernant les injections, un système de contention adapté sera utilisé et une pommade anesthésiante sera appliquée avant l’introduction de la seringue. Après le prélèvement, du collyre à la lidocaïne sera déposé sur les yeux. Un change de litière (minimum 1 fois par semaine) sera réalisé. Un contrôle de l’alimentation et des boissons sera effectué à chaque passage, soit par l’utilisateur, soit par les animaliers. La salle d’hébergement est soumise au rythme jour/nuit et à une isolation efficace afin de limiter les bruits. L’accès à l’animalerie est strictement limité au personnel autorisé. Les personnels habilités à accéder à l’animalerie doivent revêtir une tenue adaptée avec charlotte, masque, sabot et gant.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris immuno-déficiente pour deux raisons principales : *La souris présente une facilité d'hébergement et de manipulation. *Ces souris immuno-déficientes permettent l'acceptation d’une greffe des cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules humaines seraient rejetées par le système immunitaire murin. Les animaux utilisés auront 5 semaines en début de protocole. C’est l’âge idéale décrit dans la littérature et selon l’expérience de notre laboratoire pour injecter des cellules humaines chez des souris.

472 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour étudier l'effet préventif d'une molécule sur la douleur. Toutes reçoivent une injection de la molécule ou d'un placebo, 252 subissent une incision de la peau de la patte au scalpel et 220 une injection d'un composé inflammatoire. La sensibilité est mesurée avant et après par des filaments pressés sur la patte. Les animaux sont tués moins de dix-huit heures après l'intervention pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Depuis 2013, notre équipe travaille sur une molécule nommée Tafa4, dont la perte de fonction chez la souris transforme une douleur aigue (inflammatoire, neuropathique ou post-opératoire) en douleur chronique. Nous avons aussi constaté que l'injection de Tafa4 permettait de réduire l'hypersensibilité mécanique suite à une lésion. Cette molécule a donc une forte valeur thérapeutique et notre équipe de recherche se propose d'étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet. Récemment, nous avons montré que l'injection de Tafa4 avant une lésion post-opératoire empêchait la mise en place de l'hypersensibilité mécanique chez la souris. Ainsi, ce projet possède un double objectif. D'une part de comprendre comment la preinjection de Tafa4 empêche la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, augmentant encore son potentiel thérapeutique. D'autre part, cet effet préventif est le modèle parfait pour comprendre comment l'hypersensibilité mécanique se met en place, ce qui est une question biologique ouverte depuis des années et qui serait à même d'avoir une incidence sur la prise en charge de certaines douleurs.

Bénéfices attendus

Le but final est que TAFA4 soit prescrite comme une molécule antidouleur en clinique. De plus, comprendre quels types cellulaires permets la mise en place de l'hypersensibilité ouvrira un nouveau panel de solutions pour la prise en charge de patients souffrant de douleurs chroniques.

Procédures

Afin d’étudier l’effet préventif de TAFA4, nous serons amenés à injecter la molécule (ou un placebo) en sous-cutanée sur toutes les souris (472). 252 d’entre-elles seront opérées chirurgicalement sous anesthésie générale. L’anesthésique sera administré par voie intra-péritonéale. La chirurgie consiste en une fine incision de la peau de la patte avec une lame de scalpel. Pour le modèle inflammatoire, nous injecterons un composé inflammatoire dans la patte de la souris sur 220 d’entre-elles. Ces interventions dureront moins de 20 minutes. Un jour avant et un jour après ces procédures, nous mesurerons la sensibilité au niveau de la patte des animaux grâce à des filaments exerçant une pression donnée.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à recevoir l’administration de composés par injection intra-péritonéale et sous-cutanée. L’injection de ces produits n’entraine pas d’effet indésirable sur les animaux mais la contention et l’injection peut générer un stress chez les souris. De plus, nous utiliserons des modèles lésionnels mimant une lésion inflammatoire ou post-opératoire qui pourraient entrainer une douleur légère qui n'a pas d'incidence sur le comportement de l'animal. Le test d'hypersensibilité appelé test de Von Frey engendrera un léger stress et au cours duquel on évoquera une contrainte sur une patte. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en oeuvre pour minimiser la nuisance provoquée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort car nous devons prélever leurs tissus qui seront par la suite analysés. En effet, l’analyse est indispensable pour comprendre les mécanismes de la douleur et notamment l’effet préventif de TAFA4.

Remplacement

La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes non animales. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers des zones spécialisées du cerveau. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Des stratégies seront mises en place afin d’éviter ou de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Nos études se concentreront essentiellement sur la peau de la patte, mais nous utiliserons également d'autres tissus de chaque animaux pour pouvoir avancer sur d'autres projets parallèles.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie lors du procédé chirurgical et des soins préopératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Après une lésion, de la nourriture humide sera placée au sol pour éviter que les animaux ne se dressent sur leur patte lésée. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Moins de 18 heures après l'intervention sur les animaux, ceux-ci seront mis à mort.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, différents tissus impliqués dans l'intégration nociceptives (peau, neurones sensoriels et moelle épinière) sont parfaitement décrit chez la souris. Il est clairement admis et recommandé par la communauté scientifique que les expériences de comportement soient réalisées sur des individus ayant atteint leur maturité sexuelle et âgés de 8 semaines. A ce stade du développement, le système sensoriel primaire arrive à maturation avant tous les autres, aussi c'est à ce stade que nous avons choisi de réaliser nos expériences. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie.

5 148 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune recevant quatre à huit injections, huit recueils d'urine et quatre prélèvements sanguins. Le modèle induit une vascularite qui peut atteindre les reins, les poumons et la peau. Le porteur consacre un long développement à justifier la mise à mort par les analyses histologiques et l'impossibilité de garantir une récupération durable. La souris est présentée comme la seule espèce scientifiquement valide, notamment pour les lignées génétiquement modifiées requises.

Objectifs

Les vascularites des petits vaisseaux sont des maladies rares mais graves, dans lesquelles le système immunitaire, qui sert normalement à nous protéger des infections, s’emballe et attaque de manière inappropriée aux vaisseaux sanguins de petit calibre et crée une inflammation. Cela peut entraîner des atteintes importantes de plusieurs organes, en particulier des reins et des poumons, avec un impact majeur sur la santé et la qualité de vie des patients. Les traitements actuellement utilisés permettent souvent de contrôler la maladie en freinant fortement le système immunitaire. Mais ces traitements peuvent entraîner des effets indésirables importants (infections, fatigue…), ce qui justifie la recherche de stratégies thérapeutiques plus ciblées et mieux tolérées. Des travaux récents suggèrent que certains mécanismes de l’inflammation, regroupés sous le terme d’« inflammasome », pourraient jouer un rôle central dans le développement et l’aggravation des vascularites des petits vaisseaux. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment l’inflammasome participe au développement des vascularites des petits vaisseaux. Pour cela, des modèles expérimentaux reconnus seront utilisés afin de reproduire certaines caractéristiques essentielles de la maladie humaine chez la souris. Différents types de souris seront étudiés, notamment des animaux présentant des modifications ciblées de certains processus inflammatoires, ainsi que des modèles permettant de visualiser l’activation de ces mécanismes dans les tissus. Certaines approches thérapeutiques ciblant spécifiquement ces voies inflammatoires seront également évaluées afin d’explorer leur capacité à limiter les lésions induites par l’inflammation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre ce qui déclenche et entretient l’inflammation dans les vascularites des petits vaisseaux, en particulier le rôle d’un mécanisme appelé inflammasome. En identifiant si ce mécanisme est trop activé et comment il peut contribuer aux lésions des organes comme les reins et les poumons, nous espérons mettre en évidence les étapes clés de la maladie sur lesquelles nous pourrions développer de nouveaux traitements. À court terme, le bénéfice principal est scientifique et permettra de mieux expliquer pourquoi la maladie devient sévère chez certains patients et quels signaux inflammatoires sont les plus impliqués. Ces connaissances permettront de repérer de nouvelles cibles thérapeutiques et d’orienter des recherches futures vers des traitements ciblées. À plus long terme, si ces voies sont confirmées comme importantes, cela nous permettrait de soutenir le développement de traitements plus ciblés que les immunosuppresseurs utilisés aujourd’hui. En contrôlant mieux l’inflammation, les effets secondaires pourraient diminuer voir totalement disparaître. Ces stratégies pourraient également contribuer à réduire la dépendance aux corticoïdes et à améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

2376 souris (animaux sans traitement inhibiteur) recevront : 4 injections (≈ 2 minutes chacune) + 8 recueils d’urines (≈ 1–2 minutes) + 4 prélèvements sanguins (≈ 30 secondes à 1 minute). 2772 souris (animaux recevant un traitement inhibiteur) recevront : 8 injections (≈ 2 minutes chacune) + 8 recueils d’urines (≈ 1–2 minutes) + 4 prélèvements sanguins (≈ 30 secondes à 1 minute).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues comprennent des douleurs brèves et de faible intensité liées aux différentes injections et aux différents prélèvements, ainsi qu’un stress transitoire induit par les manipulations répétées. Le modèle utilisé peut entraîner un affaiblissement général de l’animal, une fatigue et une perte de poids, ainsi qu’une atteinte cutanée, rénale et/ou pulmonaire secondaire à la vascularite. Les atteintes rénales peuvent se traduire par une altération de la fonction rénale (hématurie, protéinurie, augmentation de la créatinine), les atteintes pulmonaires par une gêne respiratoire modérée, et les atteintes cutanées par des lésions inflammatoires localisées.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort et ne seront ni réutilisés ni replacés. Cette décision est justifiée par des considérations scientifiques, réglementaires et liées au bien-être animal. D’un point de vue scientifique, les objectifs du projet nécessitent l’analyse détaillée de plusieurs tissus, en particulier les reins et d’autres organes cibles de l’inflammation des petits vaisseaux. Ces analyses comprennent des examens histologiques, immunologiques et moléculaires, qui requièrent des prélèvements d’organes en fin de protocole et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie ou la réutilisation des animaux. Par ailleurs, les procédures mises en œuvre visent à induire une maladie inflammatoire expérimentale susceptible d’entraîner des atteintes organiques durables. Même lorsque les signes cliniques restent modérés, une récupération complète et durable des animaux ne peut être garantie. La réutilisation ou le replacement des animaux pourrait donc exposer ceux-ci à un risque accru de souffrance ultérieure et n’est pas conforme au principe de protection du bien-être animal. Enfin, le recours à une mise à mort en fin de procédure permet de limiter la durée d’exposition des animaux à la maladie expérimentale, et de réaliser les analyses nécessaires (histologie, prelvement sanguins). Des critères d’arrêt précoces sont appliqués tout au long de l’étude afin de garantir que tout animal présentant des signes de souffrance importante ou persistante est euthanasié sans délai. Ainsi, la mise à mort des animaux en fin de protocole constitue l’option la plus appropriée pour répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en respectant les principes éthiques et réglementaires encadrant l’expérimentation animale.

Remplacement

Aucune méthode de remplacement ne permet de reproduire la complexité des vascularites, qui reposent sur des interactions dynamiques entre les différents tissus impliqués dans la maladie. L’expérimentation animale reste donc indispensable pour étudier, dans un organisme complet, l’activation du système immunitaire et l’évaluation du potentiel thérapeutique des traitements testés.

Réduction

Les paramètres expérimentaux (doses, voies d’administration, calendrier des injections) ont été définis à partir d’études déjà publiées, afin d’éviter toute expérimentation exploratoire inutile. Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé au préalable par un calcul statistique prédictif. Pour réduire au maximum le nombre total de souris, chaque animal sera utilisé pour un ensemble élargi d’analyses, ce qui permet de multiplier les paramètres mesurés à partir d’un même individu. De plus, certaines données déjà disponibles, obtenues à partir de prélèvements réalisés chez les patients, orientent précisément les hypothèses à tester, réduisant ainsi le besoin d’expérimentations supplémentaires. Les groupes contrôles ne seront pas répétés dans les procédures ultérieures.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées avec un souci maximal de confort et dans le respect du principe de raffinement. Les injections seront effectuées sur animaux vigiles par du personnel formé, afin de limiter la douleur et le stress. Pour les procédures nécessitant des injections répétées, les côtés d’injection seront alternés afin de préserver l’intégrité des tissus et réduire l’inconfort. L’évaluation du bien-être reposera sur un grand nombre de paramètres incluant l’apparence générale, la posture et la perte de poids. L’ensemble des paramètres surveillés vise à réduire au minimum la douleur, le stress et la souffrance, tout en maintenant la qualité scientifique des données obtenues.

Choix des espèces

LLa souris est le modèle de référence pour l’étude des vascularites auto-immunes et des mécanismes d’inflammation systémique. Elle présente une homologie remarquable avec l’homme en ce qui concerne les voies de signalisation de l’immunité innée, et les réponses du système immunitaire sont hautement conservées entre la souris et l’homme, ce qui améliore la transposabilité des données. Aucun autre modèle animal ou système en culture ne permet de reproduire de manière intégrée les interactions entre les différents tissus impliqués. Par ailleurs, la souris est la seule espèce pour laquelle sont disponibles les lignées génétiquement modifiées nécessaires à ce projet. Ces modèles permettent d’explorer de façon spécifique et mécanistique le rôle des inflammasomes dans la physiopathologie des vascularites, ce qu’aucune autre espèce ne permet à ce jour. Ainsi, l’utilisation de la souris constitue l’approche la plus pertinente, la plus fiable et la seule scientifiquement valide pour répondre aux objectifs du projet. Les animaux utilisés seront des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à un stade où le système immunitaire est pleinement mature et où la réponse inflammatoire est stable et reproductible. L’utilisation d’animaux trop jeunes augmenterait la sensibilité aux injections et la mortalité, tandis que des animaux plus âgés présentent une variabilité accrue et un risque de maladies spontanées liés à l’âge. L’intervalle 8–12 semaines représente donc le meilleur compromis scientifique et éthique.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection destinée à déclencher une inflammation de la moelle épinière, l'autre subit en plus une chirurgie de 45 minutes reproduisant un traumatisme cervical, suivie d'une paralysie transitoire, d'une perte allant jusqu'à 20 % du poids et, pour 1 % des animaux, d'une automutilation de la patte. Le projet veut savoir si une inflammation préalable modifie la récupération après un tel traumatisme. Toutes sont tuées pour prélever la moelle épinière et l'analyser.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière au niveau cervical sont relativement fréquentes chez l’homme, entrainant des problèmes au niveau locomoteur ainsi qu’au niveau du contrôle neural de l’activité respiratoire et cardio-vasculaire, représentant ainsi la première cause de mortalité chez les patients. Une restauration partielle spontanée de l’activité respiratoire, cardiovasculaire ainsi que locomotrice peut être observée après lésion incomplète au niveau cervical, principalement due à une réorganisation des connexions nerveuses restantes. Cette récupération reste modeste et peut être fortement influencée par l’état médical antérieur des individus, notamment lorsqu’une maladie ou un épisode inflammatoire a déjà sollicité le système immunitaire de la moelle épinière. Dans ce cas, la réponse immunitaire à un traumatisme ultérieur ne sera pas la même que chez un individu dont le système immunitaire spinal est sollicité pour la première fois. Il est donc nécessaire d’identifier l’impact d’une atteinte inflammatoire préalable de la moelle épinière sur les processus inflammatoires et plastiques déclenchés à la suite d’un traumatisme de la moelle épinière.

Bénéfices attendus

Les traumatismes cervicaux de la moelle épinière entraînent des déficits respiratoires et cardiovasculaires majeurs, altérant fortement la qualité de vie des patients. Les résultats attendus de ce projet se situent à l’interface entre recherche fondamentale, recherche préclinique et applications cliniques, et visent à améliorer la compréhension des mécanismes qui limitent la réparation du système nerveux après un traumatisme de la moelle épinière. L’identification de ces processus permettra d’approfondir nos connaissances de la physiopathologie des lésions de la moelle épinière et d’orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant spécifiquement les mécanismes neuroinflammatoires et neuroplastiques impliqués dans la récupération. Un apport majeur de ce projet réside dans la comparaison entre les animaux présentant une neuroinflammation de la moelle épinière préalable et ceux subissant uniquement le traumatisme de la moelle épinière. Les différences attendues dans la réponse inflammatoire et dans les capacités de réparation entre ces groupes mettront en évidence l’importance de l’état immunitaire initial de la moelle épinière. Ces résultats soutiendront l’idée que le passif inflammatoire d’un patient constitue un déterminant crucial de sa trajectoire de récupération et qu’il doit être pris en compte pour optimiser les interventions thérapeutiques. À terme, ce projet contribuera ainsi à promouvoir des stratégies de médecine de précision, mieux adaptées au profil de chaque patient et potentiellement plus efficaces pour améliorer les fonctions perdues.

Procédures

Les animaux seront soumis à l’une des deux procédures. Une partie des animaux recevront une injection d’un composé permettant d’induire une neuroinflammation. Différentes concentrations de ce composé seront testés afin de déterminer la concentration permettant d’induire une neuroinflammation spinale significative chez nos animaux, sans induire de phénotype pathologique délétère. Cette concentration sera déterminée dans cette procédure grâce à des tests comportementaux (maximum 2 par animal, d’une dizaine de minutes chacun), ainsi que des évaluations fonctionnelles neuromusculaires (force de contraction et excitabilité neuromusculaire, durant une dizaine de minutes chacune). L'autre partie des animaux seront injectés avec le composé à la concentration déterminée précedemment, puis recevront une chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 45 minutes), permettant de créer le modèle préclinique de trauma de la moelle épinière cervicale, afin de mimer la pathologie humaine. Ces animaux seront ensuite eux aussi soumis à des tests comportementaux et fonctionnels.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues ou effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induits par l’administration en intra-péritonéal du composé testé sur souris vigile en contention. - Paralysie transitoire des pattes avant et arrière du côté lésé suite à la lésion de la moelle épinière cervicale. Cette paralysie est transitoire et disparaît en l’espace d’une semaine, permettant à l’animal de retrouver une locomotion comparable à celle observée avant la lésion spinale. - Perte de poids jusqu’à 20% du poids initial durant la première semaine après lésion de la moelle épinière cervicale. - Autophagie de la patte arrière contralatérale à la lésion spinale (1% des animaux).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole, et les tissus récupérés pour être utilisés dans des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle expérimental permettant d’étudier de manière pertinente et intégrée les réponses physiologiques complexes autrement qu’à travers des organismes vivants. Les connectivités neuronales et les interactions neuro-immunitaires impliquées dans ces processus ne peuvent être reproduites ni par des modèles in vitro, ni par des approches in silico. De plus, les manipulations nécessaires à l’étude de ces mécanismes, telles que l’intervention sur certains systèmes de neurotransmission ou les analyses neurochimiques en conditions physiologiques, ne peuvent pas être réalisées chez l’être humain. En l’absence d’alternative scientifiquement valable, l’utilisation de modèles animaux demeure indispensable pour répondre aux objectifs du projet.

Réduction

L’étude repose sur l’analyse de l’influence d’un état inflammatoire spinal préexistant sur la récupération fonctionnelle après une lésion cervicale incomplète de la moelle épinière, un concept encore peu exploré nécessitant une approche intégrative in vivo. Le protocole expérimental a été spécifiquement conçu afin de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire, en s’appuyant sur les données déjà disponibles dans la littérature et sur l’expertise du laboratoire concernant la physiopathologie des lésions de la moelle épinière cervicales. Ces connaissances ont permis de définir précisément le niveau et la sévérité de la lésion, ainsi que les fenêtres temporelles d’analyse, afin de réduire la variabilité interindividuelle et d’éviter toute répétition expérimentale non justifiée. Par ailleurs, les mêmes animaux sont suivis longitudinalement pour l’évaluation des paramètres comportementaux et respiratoires, ce qui permet de maximiser la quantité de données obtenues par individu et de réduire le nombre total d’animaux requis tout en garantissant la robustesse statistique de l’étude.

Raffinement

L’ensemble des procédures expérimentales a été élaboré afin de minimiser la contrainte imposée aux animaux et de préserver leur bien-être tout au long de l’étude. Le choix d’un modèle de lésion cervicale incomplète de la moelle épinière permet d’induire des déficits fonctionnels pouvant être compensés physiologiquement chez les animaux, évitant ainsi des atteintes sévères et prolongées. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, associée à une analgésie péri- et post-opératoire adaptée, et les paramètres opératoires ont été optimisés sur la base de l’expérience du laboratoire afin de limiter la durée de la chirurgie et les manipulations. Le suivi fonctionnel repose majoritairement sur des évaluations comportementales et respiratoires non-invasives, réalisées chez les mêmes animaux au cours du temps, ce qui permet de limiter les manipulations et d’éviter des procédures supplémentaires. Enfin, l’état clinique des animaux est surveillé quotidiennement après la lésion de la moelle épinière, et les conditions d’hébergement et de manipulation sont adaptées afin de réduire le stress, favoriser la récupération fonctionnelle et assurer une prise en charge individualisée, conformément aux principes de raffinement. Des tissus de moelle épinière seront de plus récupéré après mise à mort des animaux afin poursuivre en profondeur cette étude par des expérimentations moléculaires et cellulaires.

Choix des espèces

Nous utilisons cette espèce pour plusieurs raisons : 1) Plusieurs élevages de souris de laboratoires sont disponibles 2) Grâce à leur petite taille et leur cycle de vie court, les conditions environnementales peuvent être contrôlées de la naissance à l’âge adulte 3) Les souris constituent un modèle reproductible d’étude de la neurobiologie respiratoire et cardiovasculaire 4) Les souris ont un taux de mortalité faible (moins de 2%) suite à une lésion médullaire cervicale 5) Les souris présentent une récupération motrice très rapide suite à une lésion médullaire cervicale 6) Un des aspects clés du programme de recherche concerne les voies nerveuses phréniques croisées (voies respiratoires), données publiées dans la littérature 7) Les souris et les humains partagent plusieurs caractéristiques communes dans le contrôle du système respiratoire et cardiovasculaire, ce qui en fait un bon modèle préclinique. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes (âgées de 8-12 semaines) afin de s’affranchir de toutes incidences liées au développement de l’individu. La nécessité d’avoir un sujet adulte s’avère indispensable afin d’étudier de manière précise les effets de potentielles futures stratégies réparatrices qui pourront être appliquées sur des patients humains adultes.

Immunisées puis prélevées à répétition, 372 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit jusqu'à douze injections et subit jusqu'à quatre prises de sang et dix-sept prélèvements d'urine sous contention, au risque de douleurs, d'infections et, dans les formes sévères, d'une rétention d'eau. Le projet vise à comprendre les mécanismes d'une maladie rénale auto-immune et le porteur justifie l'espèce par sa proximité physiologique avec l'humain. L'objectif tient toutefois en une phrase et ne nomme ni le modèle précis ni les substances injectées.

Objectifs

Notre projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes immunologiques responsables de l'apparition d'une maladie rénale auto-immune dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologique impliqués dans l'apparition et la progression d'une maladie rénale auto-immune. Ces connaissances fondamentales pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutique plus personnalisées, visant à contrôler plus efficacement l’activité de la maladie et à limiter les rechutes chez l'Homme.

Procédures

1 à 12 injections sur animaux vigiles 30 secondes par injection; 1 à 4 prélèvements sanguins sur animaux vigiles, 30 secondes par prélèvement. 4 à 17 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle, 20 secondes par prélèvement. Lorsqu'il y aura des prélèvements sanguins, ceux-ci seront réalisés le même jour que les prélèvements d'urine. 1 prélèvement sanguin terminal,30 secondes par prélèvement.

Impact sur les animaux

Lors des manipulations, peuvent être sujettes à stress et angoisse voire des douleurs modérées liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les d’injections, prélèvements d’urine et de sang. Des complications peuvent survenir au cours de la procédure d’immunisation, d’injection ou du prélèvement sanguin, notamment une mauvaise cicatrisation, un léger saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement ou stress lié à la contention. Une rétention d'eau modérée peut survenir dans les formes sévères de la maladie. Une immunodéficience peut être présente.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement et analyse histologique et biochimique

Remplacement

Le modèle de souirs permet une étude sur l'être vivant et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. La souris est adaptée à notre étude car sa proximité avec l’être humain se traduit par la présence chez cette espèce d’homologies physiologiques très étroites avec notre espèce, notamment en ce qui concerne le système immunitaire et le système rénal auxquels nous nous intéressons.

Réduction

Le nombre d’animaux a été établi grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables et robustes. Le nombre d’animaux a également été fixé qu'à partir des données de la littérature.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Les souris immunodéprimées seront séparéées et hébergées dans un milieu protecteur adapté à leur statut immunitaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne (comportement, apparence générale, signes cliniques) par le personnel animalier ainsi que par les personnes en charge de l’expérimentation. Toute apparition de signes de douleur ou de souffrance, tels que la prostration, le dos voûté, l’isolement ou le poil hérissé, entraînera l’ouverture d’une fiche de score comportant des points limites clairement définis, pouvant conduire, le cas échéant, à l’euthanasie de l’animal. Une attention particulière sera portée au site d’injection abdominale (recherche de rougeur ou de signes inflammatoires) ainsi qu’au suivi du poids.

Choix des espèces

Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. De plus, ce modèle murin est déjà publié et développé. Les souris seront âgées de 12 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature). C'est également l'age des souris dans les articles publiés.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des molécules candidates par voie orale, sanguine, cutanée, musculaire ou abdominale pendant six semaines, avec des prélèvements de sang répétés, sans qu'aucun analgésique ne puisse leur être administré car il fausserait les mesures immunitaires. Ces essais sont menés à façon pour des laboratoires publics et privés, chaque protocole étant fixé par le partenaire. Le porteur qualifie l'ensemble de "recherche responsable" respectant les 3R, alors que le service consiste à tester en série des composés pour des tiers.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérance et l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques chez la souris, dans le cadre d’études réalisées pour des laboratoires publics et privés. Ces molécules peuvent cibler différentes maladies, comme les maladies auto-immunes ou inflammatoires, ou agir sur certaines fonctions précises du système immunitaire. Les expériences consistent à administrer ces molécules à des souris saines ou présentant un modèle de maladie, afin d’étudier les effets sur leur organisme et d’identifier les réponses immunitaires associées. Les modèles utilisés sont choisis en accord avec les partenaires, selon la nature du traitement et les objectifs scientifiques recherchés. Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche responsable : toutes les procédures sont standardisées et encadrées par des protocoles validés, dans le respect de la réglementation et du bien-être animal. Le personnel impliqué est spécifiquement formé et qualifié pour garantir des manipulations sûres, des résultats fiables et la prise en compte des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). En centralisant et en harmonisant ces études, notre unité contribue à la production de données scientifiques robustes tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés et en assurant la qualité éthique et technique des expérimentations.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité d’évaluer la tolérance et l’efficacité de composés thérapeutiques développés par différents partenaires académiques et industriels. Ces études précliniques constituent une étape essentielle dans le développement de nouveaux médicaments, avant toute évaluation chez l’être humain. L’objectif scientifique est de déterminer si les molécules testées présentent une activité biologique mesurable et compatible avec une utilisation thérapeutique potentielle. Les données obtenues permettront d’orienter la poursuite du développement de ces candidats, soit vers des études complémentaires, soit vers des essais cliniques lorsqu’ils démontrent un profil de sécurité et d’efficacité satisfaisant. La mise en œuvre de ces expérimentations chez la souris se justifie par la pertinence de ce modèle dans l’étude du système immunitaire et des mécanismes inflammatoires, ainsi que par la possibilité de transposer certaines réponses physiologiques à l’humain. En standardisant ces études au sein d’une même structure d’appui, le projet garantit la fiabilité des résultats, la reproductibilité des analyses et le respect rigoureux du bien-être animal. Il contribue ainsi à la qualité scientifique et éthique des recherches précliniques et à la réduction du nombre global d’expérimentations nécessaires pour valider les candidats thérapeutiques.

Procédures

Administration des traitements candidats : applications de crème et/ou administrations par différentes voie systémique (orale, sanguine, cutanée, musculaire, abdominale) selon le schéma défini avec le partenaire : pendant 6 semaines maximum (durée du geste : environ 0.5 à 3min selon le geste). Une anesthésie gazeuse ou chimique peut être nécessaire suivant la voie d’administration choisie. Prélèvements sanguins (sur animaux vigiles) : le nombre de prélèvement est établi par le partenaire, chaque prélèvement est espacé d’au moins 7 jours (durée : environ 2min) (à partir de J0), et le volume de sang prélevé respectera les limites recommandées pour éviter tout risque pour l’animal. Pesées : 2 fois par semaine, durée : 2 min (à partir de J0). Observation quotidienne (quelques dizaines de secondes par cage) (à partir de J-3). Mise à mort à la fin de l’étude ou plus tôt si un point limite (critère prédéfini indiquant que l’animal ne peut plus continuer l’expérience sans souffrance majeure) est atteint.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables seront principalement liés à l’administration des traitements, aux anesthésies et aux prélèvements sanguins. Anesthésies : -Isoflurane : Stress lié à la répétition et irritation respiratoire légère. -Anesthésie/analgésie chimique : Récupération lente, diminution transitoire de l’activité motrice, hypothermie, baisse d’appétit, parfois respiration ralentie. Une surveillance rapprochée et des mesures de confort (tapis chauffants, hydratation) seront mises en place. Prélèvements sanguins : Gêne transitoire au point de prélèvement, stress de contention Voies d’administration des composés (préalablement testés pour toxicité par les partenaires, sans effets indésirables attendus) : -Intramusculaire : Douleur locale, gêne musculaire, risque de nécrose. -Sous-cutanée/Intradermique : Douleur modérée, irritation locale, croûtes, réaction inflammatoire locale, persistant de quelques jours à plusieurs semaines. En phase avancée, une mobilité réduite peut survenir en cas de gêne mécanique. -Intraveineuse Rétro-orbitale : Douleur légère. -Intraveineuse Caudale/Intrapéritonéale : Douleur légère, stress de contention. -Voie orale (gavage) : Stress de contention, risque d’irritation œsophagienne. -Voie orale (eau de boisson) : Altération possible du goût, réduction de la consommation. -Topique : Irritation cutanée mineure. Impact global : Chaque intervention (anesthésie, injections, prélèvements, pesées) aura un impact léger à modéré sur le bien-être de l’animal. Cependant, leur répétition ou leur accumulation pourra entraîner un stress plus marqué. Par ailleurs, une réaction systémique exceptionnelle (réponse immunitaire et inflammatoire généralisée) pourrait provoquer une perte de poids ainsi que des signes cliniques généraux et comportementaux. L’ensemble de ces effets indésirables fera l’objet d’un suivi quotidien à l’aide d’une grille de score. Le respect strict des points limites permettra d’assurer l’arrêt ou l’adaptation des procédures avant toute atteinte majeure au bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de l’expérimentation. Cette étape est indispensable pour permettre le prélèvement des tissus et organes nécessaires aux analyses histologiques, biochimiques et immunologiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet aujourd’hui de reproduire de façon fiable le fonctionnement complet du système immunitaire. L’étude des effets des molécules thérapeutiques doit se faire dans un organisme vivant, où toutes les interactions biologiques et les mécanismes de régulation sont présents. Le modèle murin (la souris) est le plus adapté pour ces recherches, car son système immunitaire est bien connu et proche de celui de l’être humain. De plus, il existe de nombreux outils scientifiques validés permettant d’étudier avec précision les réponses immunitaires chez ce modèle.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans chaque expérience est déterminé à partir de données issues d’expériences précédentes. Cela permet de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables sur le plan statistique, sans multiplier inutilement les essais. Avant toute expérimentation animale, des tests préliminaires réalisés in vitro (en laboratoire sur des cellules, sans animal) par nos partenaires permettent également de réduire le nombre de groupes à tester. En moyenne, chaque groupe comporte huit animaux, un nombre suffisant pour assurer la solidité des résultats tout en limitant le recours à l’animal. Le nombre total de groupes peut varier selon le type de molécule ou le nombre de doses à comparer. Les données recueillies sont ensuite analysées avec des outils statistiques adaptés, afin d’exploiter au mieux les résultats et d’éviter de répéter les expériences. Toutes les procédures sont conçues pour minimiser le nombre d’animaux utilisés et optimiser la qualité scientifique des études, dans le respect des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement).

Raffinement

Les animaux sont observés chaque jour par un personnel formé et qualifié, afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de mal-être. Une grille de suivi, adaptée à chaque protocole, permet d’évaluer l’état général des souris (comportement, poids, apparence, activité). Si un seuil critique est atteint, l’animal est retiré de l’étude et mis à mort de manière éthique et respectueuse, selon des procédures validées. Les manipulations pouvant provoquer une gêne ou une douleur sont réalisées par du personnel formé et compétent sous anesthésie appropriée, généralement gazeuse, ou chimique pour les interventions plus douloureuses. Lorsqu’un traitement est administré dans l’eau, la consommation est contrôlée chaque jour. Si le goût modifié entraîne une baisse de consommation, un sirop sans sucre peut être ajouté pour garantir une bonne hydratation et un confort alimentaire suffisant. L’administration d’antalgiques ou d’anti-inflammatoires n’est pas possible dans ce projet, car ces produits modifieraient les paramètres immunitaires étudiés. Pour compenser cette contrainte, plusieurs mesures de confort sont mises en place : utilisation de tapis chauffants pendant les anesthésies, manipulation douce et calme pour limiter le stress, alimentation enrichie et hydratée après les interventions, surveillance renforcée durant les périodes sensibles. Toutes les décisions sont guidées par une grille de score et un arbre décisionnel garantissant une évaluation objective et rigoureuse du bien-être animal. Les euthanasies sont réalisées dans des conditions adaptées, à l’écart des autres animaux, afin d’éviter toute source de stress.

Choix des espèces

La souris a été choisie car il s’agit d’un mammifère dont le patrimoine génétique est très proche de celui de l’être humain (environ 99 % des gènes sont communs). C’est un animal de petite taille, facile à élever et à manipuler, avec un cycle de reproduction rapide, ce qui en fait un modèle de référence en recherche biomédicale. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris est bien connu et présente de fortes similitudes avec celui de l’homme. Cela permet d’obtenir des informations utiles pour mieux comprendre les mécanismes immunitaires et évaluer le potentiel de nouvelles molécules thérapeutiques avant leur utilisation chez l’humain. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6 semaines, moment où leur système immunitaire est complètement mature. L’utilisation d’animaux jeunes adultes (pesant environ 20 g) permet d’assurer des réponses immunitaires stables, de limiter les variations liées à la croissance et de garantir la reproductibilité et la fiabilité des résultats expérimentaux.