Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etudes précliniques d’infection dans des modèles murins et évaluation de l’efficacité et de la toxicité de candidats thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Inoculées avec le VIH ou les virus des hépatites B, C et D, 3 600 souris subissent des injections de plasmides, des prélèvements sanguins répétés et des prélèvements vaginaux quotidiens pendant au moins cinq jours, parfois plusieurs semaines. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 200 d'entre elles et modéré pour les 3 400 autres. Les animaux sont des souris immunodéficientes greffées de cellules humaines, dont certaines portent un foie humanisé, que le porteur met à disposition des laboratoires pharmaceutiques et biotechnologiques pour tester leurs candidats médicaments. Sur l'effectif, il indique qu'aucune approche statistique n'a été réalisée et que l'estimation repose sur les études des années antérieures, en anticipant une croissance annuelle "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
Le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) est une cause majeure de mortalité dans le monde, et aucun traitement curatif n’est actuellement disponible pour les patients. Par ce projet, nous souhaitons mettre à disposition des laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques un modèle d’étude spécifique de l’espèce humaine permettant d’étudier l’impact du virus et des traitements sur le système immunitaire humain, et ainsi d’améliorer la connaissance de ce pathogène, d’évaluer l’efficacité prophylactique (vaccinale ou non) et thérapeutique de candidats médicaments et d’analyser les phénomènes de résistance aux traitements. Bien qu’un vaccin et des traitements anti-viraux existent contre le virus de l’hépatite B (VHB) et de l’hépatite C (VHC), plus de 250 millions de personnes dans le monde vivent avec une infection chronique, ce qui les exposent à un risque grave de cirrhose voire de cancer. La recherche de nouveaux traitements pour ces maladies est donc essentielle. Par ce projet, nous souhaitons développer un modèle d'étude de l'hépatite B et de l’hépatite C ainsi que de la co-infection avec les virus de l’hépatite B et D, en inoculant le virus à des souris, en particulier des souches possédant un foie humanisé. Ce modèle sera utilisé, non seulement pour la compréhension de cette pathologie, mais aussi pour le développement de candidats médicaments. Dans ces projets, nous utiliserons des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé. Ces modèles permettront non seulement d’évaluer l’effet du candidat thérapeutique mais également d’analyser sa toxicité.
Bénéfices attendus
Les lymphocytes T humains constitue un atout pour suivre les mécanismes d’infection, de persistance virale et de destruction progressive des cellules immunitaires. Cela permet d’analyser les étapes précoces de l’infection, l’établissement du réservoir viral et la dynamique de la réponse immunitaire humaine. L’utilisation de souris au foie humanisé ouvre des perspectives comparables pour l’étude des infections chroniques par les virus de l’hépatite B et C. Ces modèles reproduisent fidèlement les principales caractéristiques physiopathologiques d’une infection hépatique humaine grâce à la présence d’hépatocytes humains infectés, constituant une plateforme adaptée à l’évaluation des réponses antivirales et des mécanismes de pathogénicité. Ils fournissent un outil indispensable pour mieux comprendre les mécanismes de persistance virale, l’inflammation chronique et la progression vers des complications graves telles que la cirrhose ou le carcinome hépatocellulaire. Ce projet met à disposition une gamme de modèles précliniques de haute valeur translationnelle offrant la possibilité d’étudier l’impact des virus sur les populations immunitaires humaines et de tester dans des conditions proches de la clinique l’efficacité et la tolérance de candidats médicaments. Cela permet de réduire le fossé entre les résultats obtenus en laboratoire et leur transposition à l’homme, en apportant des données prédictives plus robustes pour guider le développement clinique. L’intérêt est d’ouvrir la voie à la validation accélérée de nouvelles stratégies thérapeutiques, qu’il s’agisse d’antiviraux innovants, de combinaisons thérapeutiques visant à éliminer les réservoirs viraux, ou d’approches vaccinales de nouvelle génération. Ils constituent un outil précieux pour identifier et comprendre les mécanismes d’échappement immunitaire, facilitant le développement de traitements capables d’améliorer durablement la prise en charge des patients. Le VIH et les hépatites virales chroniques sont responsables de millions de cas et de décès chaque année, et représentent un fardeau économique et social. En fournissant des modèles précliniques fiables et transposables, il contribue à accélérer l’arrivée de nouvelles solutions thérapeutiques et préventives pour réduire la morbi-mortalité associée à ces infections et améliorer la qualité de vie des patients à l’échelle internationale.
Procédures
L’administration de composés de recherche destinés au traitement des pathologies pourra être réalisée selon différentes voies. Une anesthésie gazeuse sera appliquée en fonction de la voie choisie. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal avec un maximum défini. La durée sera généralement de 10-15 secondes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal, sans réveil de l’animal, sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Les administrations effectuées pour induire les modèles infectieux seront réalisées par injections qui pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux. Un jeûne de nourriture pourra être effectué sans dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. - Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : hématome, troubles cardio-respiratoires, altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Prise de température rectale : stress transitoire, inconfort ou légère douleur à l’insertion du thermomètre, risque minimal de blessure rectale. - Prélèvements vaginaux : irritation locale, inflammation ou stress temporaire. - Administration de traitements ou de composés : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées). - Infection par le VIH ou les virus des hépatites B, C et D : peuvent induire une perte de poids et une détérioration de l’état général. - Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). - Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire. - Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux en fin de projet, ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire, et de mimer son interaction avec les virus, tout en objectivant les effets que pourra avoir un traitement sur un patient humain. Les études précliniques reposant sur des souris humanisées (qu’il s’agisse de modèles à système immunitaire humanisé, de modèles à foie humanisé ou de modèles double humanisés combinant foie et système immunitaire humains) constituent une approche scientifiquement robuste et indispensable pour le développement de thérapies innovantes contre les virus tels que le VIH, le VHB, le VHD et le VHC.
Réduction
Un total de 3600 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 72 études précliniques de 5 à 10 souris par groupe avec l’utilisation d’un groupe contrôle positif et contrôle négatif et au moins 3 doses du candidat médicament testé. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées par groupes sociaux, préférentiellement stables, de 2 à 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant toute procédure potentiellement douloureuse (par exemple : intervention chirurgicale, implantation de certains dispositifs ou cathéters, manipulations invasives des tissus, injection répétées). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique dépassant les seuils définis, perte de poids dépassant les seuils définis.
Choix des espèces
Les souches immunodéficientes, hautement permissives à la greffe de cellules humaines, permettent la reconstitution d’un système immunitaire fonctionnel ou d’un tissu hépatique humain, selon le type de modèle développé. Elles offrent la possibilité de mettre en place des modèles prédictifs adaptés à l’étude des infections virales humaines, qu’elles ciblent le système immunitaire (VIH) ou le foie (VHB, VHC, VHD). Concernant le VIH, la souris humanisée représente une alternative éthique et scientifiquement pertinente à l’utilisation de primates non humains, qui ne peuvent être infectés que par le VIS. Pour le VHB, les modèles de souris à foie humanisé se sont révélés efficaces pour évaluer l’activité thérapeutique de candidats médicaments. Ces approches garantissent une transposition plus fiable des résultats précliniques vers l’homme et soutiennent le développement de traitements innovants. Selon les besoins des études, des animaux immunocompétents pourront être utilisés, historiquement utilisés dans ces modèles infectieux. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 280
Les animaux dont la douleur ou la détresse "dépasse le cadre de l'étude" sont tués. 1 000 souris et 280 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, tous tués à l'issue pour prélèvement de fluides et d'organes. L'équipe leur injecte jusqu'à quatre fois une protéine, un adjuvant et une toxine pour déclencher une encéphalomyélite auto-immune, modèle de sclérose en plaques qui fait perdre le tonus de la queue puis provoque tremblements, troubles de la coordination et paralysie progressive des membres postérieurs. Certains subissent en plus l'implantation chirurgicale d'un cathéter ou d'une mini-pompe, trente minutes à une heure sous anesthésie, pour tester des molécules candidates dont le porteur rappelle qu'aucune n'a jusqu'ici permis d'arrêter le processus de la maladie chez les patients.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune chronique du système nerveux central, caractérisée par une réponse immunitaire aberrante dirigée contre les constituants de la myéline. Cette gaine lipidique, essentielle à la conduction des influx nerveux, est progressivement détruite, compromettant la transmission neuronale. Ce processus de démyélinisation est souvent accompagné d’une inflammation périvasculaire et d’une infiltration lymphocytaire du tissu cérébral et médullaire, aboutissant à une symptomatologie neurologique variée incluant fatigue, troubles moteurs, spasticité, ataxie et parésies. Le modèle rongeur décrit dans ce projet reproduit les caractéristiques humaines de la maladie afin de tester l'efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Bénéfices attendus
À ce jour, aucun traitement curatif de la sclérose en plaques (SEP) n’est disponible. Les approches thérapeutiques actuelles se divisent en trois grandes catégories. Les traitements de fond, principalement des immunomodulateurs ou immunosuppresseurs, ont pour objectif de réduire la fréquence et l’intensité des poussées, de ralentir la progression du handicap neurologique et de limiter l’apparition de lésions cérébrales visibles à l’IRM. Les traitements des poussées, essentiellement à base de corticoïdes à haute dose, sont utilisés ponctuellement pour atténuer l'inflammation aiguë lors des épisodes de rechute. Enfin, les traitements symptomatiques visent à améliorer la qualité de vie des patients en ciblant des manifestations spécifiques comme la spasticité, la fatigue, les douleurs neuropathiques, les troubles urinaires ou les déficits moteurs, souvent pris en charge par des approches combinant médication et rééducation fonctionnelle. Malgré ces avancées, aucune de ces stratégies thérapeutiques ne permet à ce jour de stopper définitivement le processus pathologique sous-jacent à la SEP.
Procédures
L'induction de la réaction immunitaire sera réalisée par administration d'une protéine et d’une toxine (environ 1 minute, sous contention ou quelques minutes sous anesthésie) de manière unique ou répétée (en général, 1 fois/jour ou tous les 2 jours, max 4 injections). Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 fois max) par jour; pendant 1 à 4 semaines en fonction de la spécificité du traitement), sous anesthésie (quelques minutes) si nécessaire. Une phase chirurgicale, pourra être nécessaire dans le cas de d’administration chronique continue ou si le traitement se fait par voie intracérébrale ou intrathécale (durée de 30 minutes à 1heure) sous anesthésie. Le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes (score comportemental et force d’agrippement) à 30 minutes pour les tests activité locomotrice. Des prélèvements sanguins (4 maximum par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non).
Impact sur les animaux
Les administrations, les phases chirurgicales (implantation sous anesthésie d’un cathéter veineux et/ou de mini-pompes pour diffusion lente) , les prélèvements sanguins ou les tests comportementaux (activité locomotrice, score EAE) peuvent entrainer un stress ou une douleur légère. Le protocole décrit dans ce projet conduit à l'apparition progressive d’effets neurologiques (perte du tonus de la queue (premier signe clinique souvent observé), troubles de la coordination, tremblements, faiblesse ou paralysie des membres postérieurs (diminution partielle puis totale de la force musculaire). De plus, l’injection de la protéine, de l’adjuvent et de la toxine, peut induire de l’inconfort, de l’inflammation ou de la douleur au niveau du site d’injection.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés pour prélèvements (fluides et organes).
Remplacement
Ces tests ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils permettent l’étude des potentiels effets secondaires de traitements expérimentaux dans un système complexe (interaction avec et entre les différents organes et systèmes physiologiques). De plus, ces tests sont réglementaires pour toutes substance ou l’un de ses principaux métabolites ont une activité au niveau du Système Nerveux Central. Cependant, il existe des tests in vitro et in silico permettant de sélectionner en amont des molécules efficaces et dont la toxicité n’est pas avérée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétiriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété adin de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Pour la procédure nécessitant une phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. En cas de prélèvements de sang, une anesthésie légère de type isolflurane sera appliquée afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) demeurent l'espèce privilégiée pour évaluer l'efficacité de nouveaux médicaments dans le modèle d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale. Le modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) chez le rongeur reproduit plusieurs aspects fondamentaux de la SEP : infiltration lymphocytaire dans le système nerveux central (SNC), démyélinisation, lésion de l’axone des neurones et déficits moteurs. De plus, les réactifs immunologiques disponibles (anticorps, sondes, lignées cellulaires) sont abondants et bien validés chez la souris et le rat. Principalement rongeurs (rats, souris) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément à la litérrature scientifique.
Evaluation de nouveaux vaccins ARN anti-cancer chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections de vaccin ARN sous anesthésie, une injection de cellules tumorales, un à trois prélèvements de sang, un lavage broncho-alvéolaire et un lavage nasal. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une immobilité, un isolement, une cachexie et des douleurs. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro ne miment pas le microenvironnement muqueux pulmonaire, que l'expérimentation animale est "indispensable" et qu'"aucune méthodes alternatives n'existent", sa rubrique réduction tenant pour sa part en deux phrases générales.
Objectifs
Les vaccins ARN actuels sont capables d’induire une bonne immunité générale mais restent peu efficace pour limiter la transmission. Pour limiter la transmission il est nécessaire d’induire une immunité locale au niveau des sites barrières, comme par exemple au niveau des voies respiratoires. L’immunisation par la voie respiratoire permet d’induire des réponses immunitaires locales dans les poumons et les voies aériennes. Jusqu’à présent les vaccins ARN administrés par la voie respiratoire se sont révélés peu efficaces. Les principaux obstacles pour les vaccins ARN sont de traverser la barrière muqueuse et le risque de dégradation. Ce projet a pour objectifs : 1/de tester de nouvelles formulations de vaccins ARN capables de traverser la barrière muqueuse et moins sensibles à la dégradation. 2/ tester de nouveaux schémas et voies de vaccination qui optimiseraient la distribution du vaccin et l’induction de réponses immunes locales 3/ enfin évaluer leur efficacité dans 2 modèles de cancer.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer de nouveaux vaccins ARN administrables par voie mucosale et capables d’induire des réponses locales pour traiter le cancer.
Procédures
3 injections de vaccin sur animaux anesthésiés ( durée injection 2-5 min, durée anesthésie: 5 et 30 min) ; 1 injection de tumeur sur animaux anesthésiés ( injection 2 min,durée anesthésie: 30min) ; 1 injection de tumeur sur animaux vigiles ( 5min); 1 à 3 prélèvements de sang sur animaux anesthésiés ( 5 min) ; 1 prélèvement de lavage broncho-alvéolaire (5min),1 prélèvement de lavage nasal (2min) et 1 perfusion sur animaux anesthésiés (2 min).
Impact sur les animaux
Les différentes injections peuvent induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration, une douleur légère de courte durée ou une irritation au niveau du site d’injection. La contention des souris peut générer un stress durant la durée de la contention. Les souris avec les tumeurs peuvent présenter des troubles du comportement (immobilité, isolement...), un aspect physique altéré (perte de poids, cachexie, ) et des douleurs associées à la présence de la tumeur.
Devenir
mise à mort pour analyses des tissus
Remplacement
L’analyse des cellules impliquées dans les réponses immunitaires, dans différents organes au cours du temps, ne peut être évaluée que dans des organismes entiers. Les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement muqueux pulmonaire. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme. Aucune méthodes alternatives n'existent
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été déterminés selon des données déjà publiées. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les différentes injections et les prélèvements de sang sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Les vaccins sont préparés dans des formulations validées pour des administrations chez l’animal et ne sont pas décrits comme toxiques aux doses utilisées. Des points limites spécifiques ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteinte d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.
Choix des espèces
Cette étude sera réalisée avec des souris, car nous avons des formulations de vaccins déjà validés dans cette espèce ainsi que tous les outils et techniques d’analyse adéquats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car le système immunitaire est développé et mature.
Effets bénéfiques de la nutrition sur la réponse immunitaire anti-tumorale chez la souris obèse (MODIFICATIONS)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 90 d'entre elles soumises pendant vingt semaines à une alimentation riche en graisses destinée à les rendre obèses. Chacune est identifiée par poinçonnage de l'oreille, mise à jeun six puis douze heures avant deux tests métaboliques, gavée d'une solution sucrée puis d'huile, incisée au bout de la queue pour dix prélèvements de sang, puis reçoit une injection de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie. Les tumeurs sont ensuite palpées chaque jour, puis mesurées sous anesthésie tous les trois jours. Le porteur espère qu'un régime riche en oméga-3 réduira l'inflammation liée à l'obésité et améliorera l'immunothérapie, en renvoyant toute application humaine à des recherches ultérieures.
Objectifs
Lorsqu’un cancer se développe, le système immunitaire réagit en envoyant des signaux pour combattre la tumeur, comme des substances inflammatoires. Mais les cellules cancéreuses ont trouvé un moyen de tromper ce système en utilisant ces signaux pour activer des "freins" qui empêchent le système immunitaire d'attaquer la tumeur. L’immunothérapie fonctionne en bloquant ces "freins", ce qui permet au système immunitaire de mieux lutter contre le cancer. Cette approche est particulièrement prometteuse pour des cancers agressifs, comme le cancer du sein triple négatif, qui peut être aggravé par l’obésité. En effet, chez les personnes obèses, les cellules graisseuses se gonflent et libèrent des signaux inflammatoires qui activent en permanence le système immunitaire. Ces signaux peuvent aider les cellules cancéreuses, proches du tissu graisseux, à échapper à la surveillance du système immunitaire et à se développer. Des recherches, y compris des travaux de notre équipe, suggèrent que les acides gras oméga-3, présents dans certains aliments, pourraient réduire cette inflammation liée à l’obésité et rendre l’immunothérapie plus efficace contre le cancer du sein triple négatif. Pour mieux comprendre ce lien entre obésité, nutrition et immunothérapie, nous devons aller au-delà des études théoriques et mener des expériences concrètes sur des souris. Cela nous permettra de mieux identifier les mécanismes en jeu et d’explorer de nouvelles pistes pour améliorer les traitements. Les objectifs de notre étude sur les souris sont : 1. Comprendre l’impact de l’obésité sur la défense du corps contre une tumeur agressive du sein. 2. Tester l’effet de l’alimentation sur cette défense, en introduisant des aliments riches en oméga-3 et des extraits de plantes aux propriétés bénéfiques. 3. Vérifier si ces changements alimentaires peuvent aider à renforcer l’effet des traitements d’immunothérapie contre ce type de cancer du sein. Notre objectif est donc d’identifier de nouvelles stratégies basées sur la nutrition pour améliorer la lutte contre le cancer, en tenant compte du rôle de l’obésité et du système immunitaire.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment l’alimentation peut influencer la santé. Il pourrait montrer qu’un régime riche en oméga-3, avec ou sans extraits de plantes bénéfiques, aide à réduire l’inflammation causée par l’obésité. Cette diminution de l’inflammation pourrait alors améliorer l’efficacité des traitements contre le cancer. À plus long terme, ces résultats pourraient mettre en évidence le rôle clé de la nutrition dans la protection du corps contre la maladie, en particulier chez les personnes obèses. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles approches pour renforcer l’action des traitements contre le cancer. Enfin, cette étude pourrait poser les bases de futures recherches chez l’Homme, afin de voir si des ajustements alimentaires permettent d’optimiser les traitements et d’améliorer la lutte contre le cancer.
Procédures
Une identification par poinçonnage de l’oreille pour les 120 souris. • 90 souris recevront une alimentation riche en graisses pendant 20 semaines. • 2 mesures de la composition corporelle seront réalisées sur les 120 souris éveillées et placées dans un tube (- de 2 min/souris). 16 semaines entre les mesures. • Tests du métabolisme : - Du sucre : toutes les souris seront à jeun pendant 6h avant le test puis un petit volume d’une solution sucrée sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (- d’1 min/souris, contention incluse). Une incision à l’extrémité de la queue (- de 1 mm) sera réalisée pour permettre 6 prélèvements d’une goutte de sang (quelques secondes/souris). - Des graisses : toutes les souris seront à jeun 12 heures avant le test puis un petit volume d’huile sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (- d’1 min/souris, contention incluse). Une incision à l’extrémité de la queue (- de 1 mm) sera réalisée pour permettre 4 prélèvements de quelques gouttes de sang (30 sec/souris, sans contention). - Ces tests seront effectués avec une 1 semaine d’écart. • Injection des cellules tumorales et suivi : - Avant l’injection des cellules, une injection d’anesthésiques sera réalisée chez toutes les souris (30 sec/souris, contention comprise). L’injection des cellules tumorales se fera sous anesthésie générale dans la glande mammaire (injection < 30 sec/souris, anesthésie 45 min, toutes les souris). - Palpation de la zone d’injection tous les jours pour détecter la tumeur (toutes les souris vigiles, 30 secondes par souris contention comprise, 5 jours de suite maximum) - Traitement : 7 injections des traitements auront lieu sur une période de 21 jours (30 sec/souris, contention comprise, toutes les souris sont concernées). - Surveillance de la tumeur pour toutes les souris : Une mesure tous les trois jours pendant 21 jours sous anesthésie gazeuse (30 sec/souris). • A la fin de l’étude : - Une injection d’anesthésique pour toutes les souris (quelques sec/souris). - Un prélèvement sanguin final sous anesthésie pour toutes les souris (30 sec/souris). MODIFICATION DU 30-09-2025 : Après l’anesthésie locale et générale et avant l’injection des cellules tumorales, une incision de 3mm autour du mamelon sera réalisée afin de repérer précisément la glande mammaire pour injecter les cellules. L’incision sera refermée par 4 points de suture résorbables. Six heures après toutes les souris recevront une injection complémentaire d’un antidouleur.
Impact sur les animaux
La pesée des souris peut être une source de stress temporaire. L’alimentation riche en graisses entraînera une prise de poids importante, sans impact sur la mobilité. Le bref placement dans un petit tube (moins de 2 minutes) pour la mesure de la composition corporelle cause un stress. Les périodes de jeûne avant les tests métaboliques peuvent être inconfortables pour les animaux. L’administration par voie orale de la solution sucrée et de l’huile est une source de stress transitoire et d’inconfort pour les animaux. La petite incision au bout de la queue réalisée avant les deux tests métaboliques peut provoquer une douleur passagère. Le fait que pendant le test sur les sucres, les souris soient placées seules dans une cage pendant deux heures peut générer un léger stress. Les différentes injections (anesthésiques, antidouleurs, traitements, cellules tumorales) réalisées vont provoquer du stress et une légère douleur transitoire. La palpation des glandes pour détecter l’apparition des tumeurs va générer un inconfort transitoire chez les animaux. Le développement de la tumeur peut générer un inconfort et une légère douleur pour les animaux. MODIFICATION DU 30-09-2025 : Avant l'incision cutanée, un anesthésique sera appliqué au niveau de la zone d'incision. Les points de sutures peuvent entraîner une douleur post-opératoire localisée au niveau de l’incision et des sutures, ainsi qu’un tiraillement transitoire lié à la cicatrisation. L'injection supplémentaire d'un antidouleur après l’intervention implique une manipulation supplémentaire pouvant générer stress et douleur transitoire.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Ce projet fait suite à des recherches déjà réalisées en laboratoire, où des expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ont permis d’étudier l’influence de la graisse corporelle sur l’évolution du cancer du sein. Ces travaux ont montré que les oméga-3 et certains extraits de plantes pourraient avoir des effets bénéfiques. Cependant, ces expériences ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le cancer et son environnement dans un corps vivant. C’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser un modèle avec des organismes complets, comme la souris, pour observer l’impact global de l’alimentation sur l’inflammation, les déséquilibres liés à l’obésité et la manière dont le corps se défend contre la tumeur. Ce type d’étude nécessite un modèle vivant, car il n’existe actuellement aucune alternative qui permette d’obtenir ces résultats uniquement avec des cellules en laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été soigneusement calculé pour limiter leur utilisation tout en garantissant des résultats fiables. D’après les informations existantes dans la littérature scientifiques et les échanges avec des experts, chaque groupe doit contenir 30 souris, réparties ensuite en deux sous-groupes de 15. Cela permet d’assurer que les résultats seront suffisamment solides et exploitables. Au total, 120 souris seront utilisées. Pour éviter de multiplier les expériences, un maximum de prélèvements de tissus sera effectué et mis à disposition pour d’autres recherches.
Raffinement
Pour éviter les gavages, les oméga-3, antioxydants et extraits de plantes sont ajoutés à la nourriture. Seules 2 personnes expérimentées manipuleront les souris tout au long de l’étude. Une surveillance de tous les animaux sera mise en place 2X/semaine avant l’injection des cellules cancéreuses puis 7jrs/7 après injection. A chaque passage une vérification de l’état général des souris (apparence et comportement) sera réalisée. Un suivi du poids sera réalisé 1X/semaine. L’évaluation de la prise alimentaire sera faite 2X/semaine. En ce qui concerne les tests pour évaluer le métabolisme les quantités de solution sucrée et d’huile ont réduites au minimum pour éviter l’inconfort, une seule incision au bout de la queue (1 mm) sera réalisée par test pour prélever du sang, une semaine d’intervalle sera respectée entre les tests pour limiter le stress. Les prises de sang seront faites sans immobilisation des animaux. Enfin, si le taux de sucre ne revient pas à la normale en 90 min, il sera surveillé à 240 min et, si besoin, à 360 min. L’injection des cellules cancéreuses sera réalisée sous anesthésie générale avec ajout d’un antidouleur. Ensuite, une palpation quotidienne sera faite pour détecter la tumeur dès son apparition. Concernant le suivi de la tumeur et les traitements : une mesure de la tumeur sera faite tous les 3 jours sous anesthésie dès que la tumeur est détectée, l’injection du traitement contre le cancer sera réalisée en même temps (volume d’injection réduit au strict nécessaire et changement de site d’injection à chaque fois pour limiter l’inconfort). L’expérience durera 4 semaines maximum afin d’éviter que le volume de la tumeur ne devienne trop important. Des aménagements seront mis en place pour faciliter l’accès à la nourriture. A la fin de l’étude : les souris seront anesthésiées avant un dernier prélèvement de sang puis mises à mort rapidement et sans douleur. Des points limites précis ont été définis pour stopper immédiatement l’étude si un seuil critique est atteint, afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux. MODIFICATION DU 30-09-2025 L’incision est réduite au strict minimum (≈ 3 mm) et réalisée sous anesthésie générale, garantissant l’absence de douleur pendant la procédure. Les sutures sont résorbables, évitant une intervention pour leur retrait. Un antidouleur est administré avant et après l’intervention. Une surveillance rapprochée des animaux est mise en place pour détecter toute complication locale.
Choix des espèces
Le choix de la souris repose sur plusieurs raisons : • Elle peut développer une obésité comparable à celle de l’humain en suivant un régime riche en graisses. • Son métabolisme des graisses est similaire à celui de l’Homme, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les effets protecteurs des oméga-3 et des composés naturels contre l’obésité et le cancer. Les souris seront intégrées à l’étude à l’âge de 7 semaines. À cet âge, elles tolèrent bien une alimentation riche en graisses, et les modifications métaboliques qui en découlent sont bien documentées et maîtrisées. Nous avons choisi des souris jeunes, car le cancer du sein triple négatif est souvent diagnostiqué chez des patientes jeunes.
Étude du rôle de RANKL derivé de l’os dans la croissance et de la dissémination métastatique du cancer du sein
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant une biopsie de la queue à trois semaines puis, à huit semaines, une injection de cellules tumorales, avant huit injections supplémentaires étalées sur quatre semaines. Une partie reçoit ces cellules par voie intracardiaque sous anesthésie gazeuse, d'autres dans la glande mammaire au cours d'une chirurgie, et la croissance des tumeurs se mesure au pied à coulisse à chaque manipulation. Le porteur indique que les tumeurs pourraient causer une douleur et une perte de poids, et que les souris sont tuées en fin de procédure ou à l'atteinte d'un point limite pour récupérer des échantillons. Le bénéfice annoncé, identifier de nouveaux marqueurs de prédisposition au cancer du sein et les valider comme cibles thérapeutiques, reste formulé au conditionnel.
Objectifs
Nous avons fait la découverte surprenante que les ostéoblastes (les cellules qui synthétisent les os) sont capables de stimuler à distance la croissance de tumeurs mammaires ainsi que leur dissémination métastatique dans l’ensemble de l’organisme. Nous avons découvert que les ostéoblastes sécrètent des molécules pro tumorales qui circulent dans le sang et stimulent la croissance des tumeurs partout où elles se trouvent. Nous avons identifié une molécule sécrétée par les ostéoblastes potentiellement responsables de ces effets : RANKL. Notre hypothese est que la secretion de RANKL par les osteoblastes puisse etre un facteur pro-tumoral direct favorisant la croissance tumoral a distance de l'os, supprimer ca secretion nous informera du role de RANKL issu des osteoblastes. Cependant, les données de la littérature indiquent que RANKL produit dans l'os pourrait egalement réguler la production cellules immunosuppressives provenant du lignage lymphocytaire B qui produisent de l’IL10. Nous supposons alors que le RANKL, lorsqu’il est produit par les ostéoblastes, exerce un contrôle négatif sur la production de ces cellules immunodépressives, de manière directe ou indirecte. Ainsi, lorsque la production de RANKL est interrompue, ces cellules deviennent plus nombreuses et favorisent la croissance du cancer du sein. Le premier objectif est de tester le rôle de RANKL produite par les ostéoblastes dans la progression du cancer du sein, à l’aide de modèles génétiques murins où la formation osseuse est augmentée par la réduction de la résorption osseuse du a labsence de RANKL, facteur d'osteoclastogenese. Notre deuxième objectif est de tester l’hypothèse selon laquelle RANKL produite par les ostéoblastes participent au contrôle systémique de la progression du cancer du sein en modulant la réponse immunitaire antitumorale via les cellules B IL10+. Ces travaux sont nécessaires afin de déterminer si le ciblage des molécules produites par les ostéoblastes est capable de limiter, voire prévenir le développement des cancers du sein.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra d’identifier de nouveaux marqueurs de prédisposition aux cancers du sein et de valider ces marqueurs en tant que cibles thérapeutiques. Ceci pourrait permettre de prévenir l’apparition, ou du moins de limiter la progression de tumeurs mammaires métastatiques. Ce travail pourrait notamment permettre d’améliorer les traitements visant à activer l’immunité antitumorale.
Procédures
À l’âge de trois semaines, chaque souris subira une biopsie de la queue afin de permettre l’identification des modifications génétiques présentes chez l’individu. À huit semaines, une partie des souris sera soumise à une injection de cellules tumorales. L’intervention dure environ dix minutes par individu et n’est réalisée qu’une seule fois. Au cours de la croissance tumorale, les souris pourront être injectées à une fréquence de deux fois par semaine pendant quatre semaines, avant d’être euthanasiées. La mesure de la croissance tumorale se fait à l’aide d’un pied à coulisse, ne dure que quelques secondes et est réalisée en même temps que les injections durant la phase de croissance.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer des tumeurs ce qui pourrait causer une douleur et une perte de poids. Les manipulations successives des animaux (anesthésies, injections, mesures des tumeurs au pied à coulisse) peuvent engendrer un stress chez les animaux
Devenir
En fin de procedure ou lors d'atteinte de point limite, euthanasie des souris, et recuperation d'echantillions biologiques.
Remplacement
Le tissu osseux comprend de nombreux types cellulaires en plus des cellues qui fabriques l'os, qui interagissent et s’influencent mutuellement. Des travaux visant au développement de modèles synthétiques capables de récapituler l’environnement osseux sont en cours, mais les versions existantes restent très rudimentaires. De plus, notre projet vise à évaluer les effets directs et indirects des ostéoblastes sur la croissance de tumeurs primitives et la dissémination de la tumeur. Tous ces processus sont d’une grande complexité et ne peuvent être reproduits de façon fidèle synthétiquement.
Réduction
La principale méthode de réduction du nombre d’animaux utilisés dans notre projet repose sur un calcul statistique de taille d’effectif nécessaire pour chaque expérience afin d’avoir une puissance d’au moins 80 % pour détecter une différence correspondant à une taille d’effet estimée pour chaque expérience, grâce aux données préliminaires disponibles. Nos expériences sont réalisées séquentiellement avec des groupes relativement petits de souris contrôles et mutantes (2 à 5 animaux/groupe) car il nous est impossible de générer des groupes importants d’animaux du même âge en une seule fois. Ceci permet éventuellement de réduire en cours de projet le nombre de souris impliquées dans une expérience donnée, en arrêtant plus tôt que prévu cette expérience, une fois que le test statistique démontre que la/les différences observées sont significatives. Le suivi longitudinal de la croissance tumorale par imagerie de bioluminescence in vivo permet d’éviter de devoir euthanasiés...
Raffinement
Les injections intracardiaques se feront sous anesthésie gazeuse permettant un réveil rapide, moins impactant que l’anesthésie par injection. Les animaux inoculés dans la glande mammaire subiront une chirurgie mineure et seront anesthésiés ayant des propriétés analgésiques. Un gel oculaire sera appliqué sur ces animaux afin d’éviter l’assèchement durant la phase de sommeil. Le lendemain de la chirurgie, les animaux présentant des signes de souffrance recevront une dose d’analgésique. De la nourriture gélifiée sera en outre ajoutée dans les cages concernées. Tous les animaux seront observés pendant les deux heures suivant la procédure afin de confirmer une activité cardio-respiratoire normale et une bonne reprise de la mobilité. Dans tous les cas, un examen clinique et comportemental sera réalisé quotidiennement lors de la première semaine après l’intervention, puis tous les 2 à 3 jours jusqu'à la fin de la procédure, afin de détecter tout signe de souffrance animale. La croissance tumorale est monitorée par bioluminescence, permettant d’évaluer l’état des animaux et de surveiller les points limites par une méthode non invasive. Au cours de cet examen, les animaux sont anesthésiés par gaz, ce qui permet un réveil plus rapide et moins stressant que l’anesthésie chimique. Des points limites précis ont été définis et seront surveillés tout au long des procédures. En cas d’atteinte d’un point limite, les mesures décidées seront mises en place immédiatement.
Choix des espèces
L’influence des ostéoblastes présents dans notre squelette sur la croissance et la dissémination métastatique de tumeurs mammaires doit être étudiée dans un modèle animal vertébré (présence d’un squelette) et mammifère (présence de glandes mammaires). De plus, notre projet requiert l’utilisation d’animaux transgéniques et la souris est le mammifère de choix pour cela. Il est relativement facile d’évaluer les troubles comportementaux et les signes de souffrance de la souris du fait des nombreuses études préalables réalisées avec ce modèle animal (recherches en cancérologie notamment). Nous possédons une expérience importante de l’utilisation de la souris en recherche et les protocoles que nous prévoyons d’utiliser ont été mis au point pour cette espèce. La souris constitue donc l’espèce la plus adaptée pour répondre à nos questions scientifiques et éviter la souffrance de nos animaux du fait de l’expérience que nous avons déjà acquise. Toutes nos expériences seront réalisées à partir d’animaux âgés de 8 semaines, stade auquel le phénotype osseux des animaux mutants est bien marqué et où les glandes mammaires et le système immunitaire sont correctement développés.
Évaluation d’un traitement immunitaire contre la fibrose pulmonaire liée au vieillissement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Jusqu'à 30 % des souris pourraient devoir être retirées de l'étude avant son terme, atteintes d'une inflammation pulmonaire, de difficultés respiratoires, d'une perte de poids ou d'un affaiblissement général. 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Une instillation unique sous anesthésie déclenche la fibrose, suivie de cinq à six injections espacées de trois jours, d'une ponction sanguine et de collectes d'urine hebdomadaires. Le porteur annonce des effets bénéfiques persistant plusieurs mois chez des souris âgées et espère prévenir des maladies humaines liées au vieillissement, quand la fibrose pulmonaire est ici provoquée volontairement chez chaque animal.
Objectifs
Des études récentes ont montré que certaines cellules abîmées par le vieillissement (cellules sénescentes) peuvent s’accumuler dans les tissus, notamment les poumons, et qu’elles échappent à la surveillance du système immunitaire. Un traitement expérimental a permis de réactiver les défenses immunitaires contre ces cellules dans des modèles de fibrose pulmonaire, une maladie qui entraîne une perte progressive de la fonction respiratoire. Ce traitement a permis de réduire l’accumulation de ces cellules, d'améliorer la fonction des défenses naturelles de l’organisme, et de ralentir, voire d’inverser, l’évolution de la maladie. Chez des souris âgées, les effets bénéfiques ont persisté plusieurs mois après l’arrêt du traitement, suggérant que le système immunitaire avait conservé une forme de "mémoire". Hypothèse : Ce traitement pourrait entraîner une réponse immunitaire de longue durée, en apprenant à l’organisme à reconnaître et éliminer les cellules endommagées liées au vieillissement. Objectif expérimental : Tester si des cellules immunitaires prélevées sur des animaux ayant reçu ce traitement peuvent, une fois transférées à d’autres animaux, les protéger contre une nouvelle atteinte pulmonaire provoquée. L’objectif final est de mieux comprendre comment stimuler les défenses de l’organisme pour prévenir ou ralentir certaines maladies liées à l’âge. Cette approche pourrait à terme déboucher sur de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des maladies chroniques comme la fibrose ou certains cancers.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre comment le système immunitaire réagit face aux cellules endommagées qui s’accumulent avec l’âge dites cellules sénescentes. Elle aidera à clarifier les mécanismes par lesquels ces cellules sont reconnues, ciblées et éliminées, notamment dans le contexte de maladies chroniques liées au vieillissement. Les résultats obtenus pourraient aussi montrer si un traitement capable de renforcer cette réponse immunitaire pourrait être utilisé pour prévenir ou ralentir certaines maladies associées à la sénescence. À terme, cette approche pourrait contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour mieux vieillir en bonne santé.
Procédures
Chaque animal sera soumis aux interventions suivantes : • Instillation: 1 fois, durée < 5 minutes (sous anesthésie). • Traitement ou anticorps : jusqu’à 5 ou 6 injections selon les groupes, espacées de 3 jours, durée < 1 minute par injection. • Ponction sanguine : 1 fois par procédure, 200 µL maximum, durée estimée : 3 à 5 minutes. • Collecte d’urine : 1 fois par semaine, durée maximale 5 minutes, sans contention forte. • Pesée et observation clinique : 1 fois par semaine (ou quotidiennement pendant les périodes critiques), durée estimée : 1 minute par animal. • Manipulations pour transfert cellulaire (dans le cas de la procédure 2) : 1 injection intraveineuse unique, durée < 5 minutes. Chaque intervention est réalisée par du personnel expérimenté, dans le respect du bien-être animal.
Impact sur les animaux
L’administration du produit qui provoque la maladie peut entraîner une inflammation pulmonaire importante, à l’origine de difficultés respiratoires, d’une perte de poids ou d’un affaiblissement général. Dans certains cas, ces atteintes peuvent obliger à retirer l’animal de l’étude avant la fin, en respectant les seuils de souffrance définis. D’après notre expérience et les publications sur ce modèle, jusqu’à 30 % des animaux pourraient être concernés. Les injections nécessaires au traitement, tout comme les prélèvements urinaires ou sanguins, peuvent provoquer un stress modéré lié à la contention. Des inflammations locales (au site d’injection) ou un risque faible d’infection (après prélèvement de sang) sont également possibles. Pour limiter ces effets indésirables, des mesures de suivi et de confort seront mises en place tout au long du protocole : manipulation douce, surveillance quotidienne, arrêt immédiat en cas de signes de souffrance, et matériel stérile pour toutes les procédures.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude. Cela est nécessaire pour pouvoir récupérer leurs organes et analyser les effets du traitement sur les tissus. Ces analyses permettront d’évaluer la gravité des lésions pulmonaires, d’observer les cellules immunitaires présentes, et de mieux comprendre les mécanismes liés au vieillissement. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé sur des animaux vivants. Nous veillerons à limiter la souffrance en suivant les points limites et la fiche de score décrite et en assurant une surveillance étroite tout au long du protocole.
Remplacement
Avant d'utiliser des animaux, nous avons testé le traitement sur des cellules en laboratoire. Ces tests ont montré un effet prometteur. Cependant, pour comprendre l’effet global du traitement sur le système immunitaire dans un organisme vivant, il est indispensable d’utiliser un modèle animal. Aucune méthode alternative ne permet aujourd’hui d’étudier cette complexité de manière fiable.
Réduction
Pour cette étude, nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Cela garantit des résultats fiables, tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : Nous mettons en place plusieurs mesures pour réduire la douleur, le stress et la souffrance : Suivi quotidien : Les animaux seront observés chaque jour à l’aide d’une grille clinique. En cas de dégradation de leur état, la fréquence du suivi sera augmentée. Cohésion sociale : Les animaux seront hébergés par petits groupes compatibles, afin de préserver leur bien-être social tout au long de l’étude. Habituation : Une phase d’habituation à la manipulation est prévue avant les interventions, afin de limiter le stress lors des gestes expérimentaux. Points limites précoces : Des seuils d’arrêt clairement définis seront appliqués dès l’apparition des premiers signes de souffrance, pour éviter toute douleur inutile. Suivi longitudinal : Un suivi dans le temps permettra de détecter précocement d’éventuels signes de mal-être, notamment par le contrôle du poids, du comportement et de l’état général. Alimentation adaptée : En cas de difficultés de déplacement ou de prise alimentaire, de la nourriture humidifiée sera mise à disposition directement dans la cage. Enrichissements supplémentaires : matériaux à manipuler (copeaux de bois compacts) et des objets à déplacer (bâtonnets). Utilisation d'une méthode d'anesthésie (la plupart des animaux expérimentaux). Toutes ces mesures sont mises en place pour limiter la souffrance, améliorer le confort des animaux, et garantir des conditions expérimentales éthiques et rigoureuses.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus adaptée pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Elle présente une organisation physiologique proche de celle de l’être humain, notamment au niveau des poumons et du squelette, ce qui permet de reproduire fidèlement certaines pathologies liées à l’âge, comme la fibrose pulmonaire. Son cycle de vie court constitue un atout majeur : un animal est considéré comme âgé à partir de 18 mois, ce qui permet d’étudier rapidement les effets du vieillissement dans un contexte contrôlé. Les mécanismes de réparation et de dérégulation des tissus sont bien décrits chez la souris, et de nombreux outils existent pour analyser les cellules immunitaires et sénescentes au cours de l’évolution des maladies. Ce modèle permet donc une approche globale, intégrant à la fois les réponses immunitaires, l’accumulation de cellules vieillissantes et la progression des atteintes tissulaires. Le marqueur ciblé par le traitement testé dans ce projet est présent de façon identique chez la souris et chez l’humain, ce qui renforce la pertinence du modèle et facilite l’interprétation et le transfert des résultats vers la recherche clinique. De plus, la souris dispose d’un système immunitaire bien connu, avec de nombreux réactifs et outils disponibles, ce qui est indispensable pour étudier les réponses de l’immunité innée induites par les cellules sénescentes. Enfin, la large disponibilité d’outils biotechnologiques (souches transgéniques, analyses cellulaires, tests moléculaires) fait de la souris un modèle de référence pour explorer les mécanismes du vieillissement et les stratégies thérapeutiques ciblant ses effets.
Immunisation des souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Identifiées par puce électronique, les souris reçoivent des composés immunogènes ou pathogènes, subissent des prélèvements sanguins répétés, des prélèvements vaginaux quotidiens pendant plusieurs jours voire plusieurs semaines, des prélèvements d'urine et de fèces obtenus par contention et massage du ventre, enfin un prélèvement terminal sous anesthésie. 1 500 souris, dont des souris humanisées porteuses de lymphocytes humains, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Aucune approche statistique n'a servi à fixer cet effectif, calculé d'après les études des années précédentes et une croissance anticipée conforme au plan commercial de l'établissement. 1 400 souris seront tuées faute de recouvrer leur état de santé, et 100 partiront, sur décision vétérinaire, vers un projet de formation interne aux gestes techniques.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer et de caractériser différents modèles d’immunisation chez la souris, aussi bien immunocompétente qu’humanisée, afin d’évaluer la production d’anticorps spécifiques ainsi que les réponses immunitaires induites par divers types d’antigènes dans un contexte physiologique et humanisés, ainsi que tester les différents traitements à visée thérapeutique. De plus, en vaccinant des souris exprimant des lymphocytes T et B humains, et en exposant ces populations cellulaires à un agent pathogène ou chimique, nous modélisons, fidèlement, une réaction vaccinale chez l’homme. Ces immunisations pourront inclure : • Antigènes pathogènes inactivés (virus, bactéries, parasites) utilisés à des fins de vaccination expérimentale ou d’étude de la réponse immunitaire innée et adaptative. • Antigènes protéiques recombinants ou purifiés, associés ou non à des adjuvants, permettant de stimuler des réponses humorales et cellulaires. • Agents chimiques ou haptenes pour modéliser des réponses d’hypersensibilité immédiate (type I) ou retardée (type IV). • Particules ou formulations vaccinales innovantes dans le but de tester leur immunogénicité et d’étudier leur mécanisme d’action. Les différentes immunisations pourront être associées ou non à des adjuvants selon le protocole et le model à utiliser.
Bénéfices attendus
Ce projet présente plusieurs bénéfices scientifiques, méthodologiques et translationnels qui justifient son importance dans le domaine de l’immunologie préclinique. 1. Avancées scientifiques et médicales : L’étude des mécanismes d’immunisation chez des souris immunocompétentes et humanisées permettra de mieux comprendre les réponses immunitaires adaptatives et innées face à différents antigènes (pathogènes inactivés, antigènes recombinants, peptides ou agents chimiques). L’analyse des réponses humorales et cellulaires fournira des données essentielles sur la diversité et la spécificité des réponses immunitaires. Ces travaux contribueront à identifier de nouveaux biomarqueurs de réponse vaccinale et à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans l’allergie, l’auto-immunité, l’inflammation et la protection contre les agents infectieux. 2. Développement de modèles précliniques pertinents. L’utilisation de souris immunisées, y compris humanisées, permettra de développer des modèles innovants plus proches de la physiologie humaine. Ces modèles serviront à évaluer des candidats vaccins, adjuvants et immunothérapies avec une meilleure prédictivité des résultats cliniques. Ils permettront également d’explorer les risques d’effets indésirables tels que les réactions d’hypersensibilité immédiate (type I) ou retardée (type IV). 3. Impact translationnel et réduction des échecs cliniques. En intégrant des modèles humanisés, ce projet améliorera la transposabilité des résultats précliniques vers l’homme. Cela contribuera à limiter les échecs lors des essais cliniques et à optimiser le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les données générées permettront de rationaliser les choix de molécules candidates et d’accélérer leur progression vers la clinique. 4. Valeur ajoutée en recherche et santé publique. Les connaissances issues de ce projet permettront de renforcer l’expertise dans le développement de modèles précliniques de vaccination et d’immunothérapie. À terme, ces avancées bénéficieront directement à la recherche biomédicale et au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour répondre à des enjeux majeurs de santé publique, tels que les maladies infectieuses émergentes, l’augmentation des pathologies inflammatoires chroniques et la recherche de traitements innovants en immuno-oncologie.
Procédures
Identification par puce électronique : 2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Des administrations de composés immunogènes, pathogènes ou thérapeutiques seront réalisés avec ou sans anesthésie. Une anesthésie gazeuse sera appliquée en fonction de la voie choisie. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal avec un maximum défini. La durée sera généralement de 10-15 secondes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Des prélèvements sanguins seront réalisés avec ou sans anesthésie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Prise de température rectale : stress transitoire, inconfort ou légère douleur à l’insertion du thermomètre, risque minimal de blessure rectale. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de composés immunogènes, pathogènes ou thérapeutiques : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. -Prélèvement vaginaux : douleur et/ou lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). Les nuisances attendues en lien avec les réactions immunitaires et le challenge par des agents pathogènes peuvent varier selon la nature du composé administré, de l’antigène ou de l’agent infectieux utilisé. Ces effets sont en général modérés et transitoires : réactions locales au site d’injection (rougeur, induration, gonflement, douleur transitoire, voire petit nodule ou abcès localisé), réactions systémiques liées à l’activation immunitaire : fièvre modérée, léthargie temporaire, diminution transitoire de l’activité ou de la prise alimentaire, piloérection, signes d’inflammation ou de réponse aiguë : perte de poids légère à modérée, altération passagère de l’état général, modification du comportement (moins d’exploration, regroupement), en cas de challenge infectieux (si applicable) : symptômes liés à la pathologie induite (ex. inflammation locale, troubles respiratoires légers, diarrhée, ou altération de l’état général selon la voie d’infection et le modèle), réactions immuno-allergiques rares : réactions exacerbées ou imprévisibles à certains antigènes ou adjuvants, généralement de faible intensité grâce aux doses et voies d’administration adaptées. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Tous les animaux en fin d'étude, ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro une séroconversion et d’évaluer son impact protecteur sur un organisme vivant. La souris humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 1500 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 50 études précliniques de 5 à 10 individus par groupe (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées par groupes sociaux, préférentiellement stables, de 2 à 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire et administrés avant toute procédure potentiellement douloureuse (par exemple : intervention chirurgicale, implantation de certains dispositifs ou cathéters, manipulations invasives des tissus, injection répétées). Un relais per os dans l’eau de boisson à 1 mg/kg/jour pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique dépassant les seuils définis ou perte de poids dépassant le seuil défini.
Choix des espèces
La procédure expérimentale d’humanisation a été mise au point et est actuellement maîtrisée chez la souris. Les souches utilisées sont particulièrement réceptives à la greffe du système immunitaire ce qui va permettre à cette espèce d’exprimer des lignées lymphocytaires humaines. Cette particularité permet d’étudier les effets prophylactiques d’une vaccination en condition in vivo, et d’extrapoler, avec davantage de sécurité, les effets qu’auront les traitements chez l’utilisateur final : l’homme. D’autres souches de souris, en particulier non-humanisées, pourront être utilisées dans le cadre d’études préliminaires. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Étude des réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation : Gestion des souffrances d’un phénotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées dès qu'un point limite est atteint, ou dirigées vers d'autres protocoles et vers le renouvellement des trios reproducteurs, les souris de cet élevage ne quittent pas le circuit expérimental. 27 588 souris appartenant à vingt-six lignées immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte déclaré se réduit à une biopsie de l'oreille au poinçon de 2 mm, pratiquée avant le vingt-et-unième jour de vie sur 7 260 d'entre elles. Le porteur affirme que ces lignées sont "indispensables" à l'étude du rejet de greffe, que les organoïdes ne modélisent qu'imparfaitement le réseau immunitaire, et que l'immunodéficience reste sans conséquence tant que les animaux vivent en conditions stériles.
Objectifs
L’objectif global de ce projet est d’étudier les réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation d’organes. La transplantation d’organe consiste à remplacer un organe non fonctionnel par un organe provenant d’un donneur de la même espèce mais génétiquement différent. Un des principaux risques après une transplantation est le rejet de l’organe greffé. Celui-ci résulte de la capacité du système immunitaire du receveur à discriminer comme étranger le tissu transplanté. Les patients soient maintenus sous immunosuppresseurs (médicaments permettant de calmer le système immunitaire) pour réduire le risque de rejet. Cependant, malgré les traitements, le risque de rejet reste encore un point critique majeur pour les patients transplantés. Pour mieux comprendre les mécanismes de rejet et trouver de nouvelles voies thérapeutiques pour améliorer la survie des greffons et la qualité de vie des patients transplantés, il est nécessaire d’utiliser des lignées de souris présentant différents types d’immunodéficiences (26 lignées au total). Ce projet concerne que la gestion des souffrances liées au phénotype dommageable de différentes lignées de souris, l’ensemble des projets expérimentaux menés sur ces animaux sont validés en parallèle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme de générer les animaux qui rentreront ensuite dans différents projets de recherche ayant pour objectifs de mieux comprendre les réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation d’organes, et ceci en réduisant les nuisances du phénotype dommageable en élevage (conditions d'élevage stériles comme décrit précédemment), et en optimisant l’élevage. A moyen terme, cela pourrait déboucher sur de nouveaux traitements pour les patients transplantés.
Procédures
Un prélèvement de tissu par biopsie de l'oreille pour génotypage avant le 21ème jour de vie pour 7260 animaux.
Impact sur les animaux
Les souris ont un phénotype dommageable (immunodéficience) mais qui ne se déclarera pas dans les conditions d'hébergement et de reproduction décrites. Pour les lignées de souris qui nécessitent d’être géntoypées, le prélèvement de tissus nécessite de contentionner l’animal, ce qui peut induire un stress transitoire de courte durée chez les animaux. Ces gestes, réalisés une seule fois peuvent causer de la douleur légère et de l’inconfort chez l’animal.
Devenir
Tout animal ayant atteint un point limite sera automatiquement mis à mort. Les autres animaux produits seront utilisés encontinu pour le renouvellement des trios reproducteurs, dans les protocoles validés par le ministère sur ces lignées ou hors-projet (prélèvement d'organes post-mortem pour études in vitro ou mise au point de protocoles).
Remplacement
L’utilisation des lignées de souris immunodéficientes est indispensable pour l’étude des réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation d’organes. Des études in vitro ont été préalablement réalisées. Cepedant, le réseau complexe de cellules immunitaires impliquées dans la régulation des réponses immunitaires étudiées dans ce projet ne peut être reproduit in vitro et n’est qu’impartialement modellisé par les techniques actuelles telles que la production d'organoïdes. En effet, dans ce cas, la composante temps et développement reste imparfaite. D'autre part, l'interaction entre plusieurs organes étant nécessaire à l'apparition des phénotypes que nous étudions, des modèles in vitro ou in silico ne permettent pas d'accumuler des données suffisamment prédictives ou représentatives de la situation pathologique. Cette étude nécessite donc la réalisation d’expériences à l’échelle de l’animal. Les objectifs des projets scientifiques justifient donc l’existence de ces lignées.
Réduction
Des calculs d'effectifs ont permis d'établir le nombre minimal d'animaux par lignée nécessaire en reproduction pour permettre de réaliser les différents projets de cette thématique. Nous nous sommes basés sur un nombre moyen théorique d'animaux par portées (6) et le nombre moyen théorique de portées par femelle et par semestre (3). Nous avons calculé au plus juste le nombre de cages de reproduction nécessaires avec ces chiffres et compte-tenu du nombre d'animaux nécessaires pour les expérimentations en aval. Lorsqu’un génotypage est réalisé, le nombre de cage de reproduction est augmenté pour tenir compte des animaux de génotype non-désiré. Si certains animaux ne peuvent être utilisés pour nos protocoles expérimentaux, ils seront utilisés hors protocole pour des prélèvements post-mortem permettant la mise au point et l'optimisation des expériences (par exemple, mise au point des immuno-marquages multiparamétriques sur des suspensions cellulaires de rate). Enfin, les trios reproducteurs sont changés tous les 6 mois pour ne pas garder de trios peu productifs, ce qui impliquerait d'augmenter leur nombre pour garder une production constante. La dimension de l'élevage sera dynamiquement évaluée pour prendre en compte l'objectif de réduction et s'adapter aux besoins des projets (notamment une réduction de l'élevage dans les phases de diminution des besoins des projets).
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cagées à portoirs ventilés et manipulés par un personel expérimenté en conditions stériles. Le phénotype dommageable (immunodéficience) ne se déclare pas lorsque les souris sont élevées dans ces conditions. Certaines de ces lignées de souris sont hébergées dans notre animalerie depuis plus de 5 ans avec une observation quotidienne, nous avons donc le recul nécessaire pour affirmer que le phénotype d'immunodéficience n'est pas dommageable en condition d'élevage SPF mais requiert des conditions d'infections controlées pour s'exprimer expérimentalement. Une biopsie d'oreille est parfois requise à des fins de génotypage. Cette biopsie sera effecuée à l’aide d’une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables stress/douleurs. La biopsie sera réalisée avant le 21ème jour de vie à l'aide d'un poinçon de 2mm (régulièrement nettoyé et stérilisé par autoclavage) spécifique pour réaliser ce genre de prélèvement. Cet limite d’age a été choisie en fonction du développement des nouveaux-nés pour réaliser une biopsie indolore, ne nécessitant pas d’administration d’antalgique. La biopsie pourra être réalisée en même temps que le tatouage, afin d’éviter la préhension de l’animal plusieurs fois à quelques jours d’intervalle. Le lendemain de la biopsie, une attention particulière sera portée aux oreilles des animaux. En cas de lésions infectées, un lavage au sérum physiologique sera réalisé suivi d'une application de pommade antiseptique et cicatrisante sur conseil vétérinaire. Si l'infection auriculaire s'aggrave dans les 48h, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l'homme en termes de génétique, d'anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l'étude des réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation. La sélection de la souris permet également de bénéficier d’un nombre important de modèles génétiquement modifiés pertinents développés précédemment (comme c'est le cas ici) et facilite donc le raffinement du plan expérimental. Des souris âgées de plus de 6 semaines et de moins de 12 mois seront utilisées pour la reproduction du fait de leur maturité sexuelle et avant la décroissance de la fertilité.
Etude de la biologie des lymphocytes T chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour faire disparaître une population de lymphocytes T régulateurs chez des souriceaux âgés de un à sept jours, puis chez des souris de quatre semaines, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Trois injections sous la peau, sur animal vigile, sont pratiquées en une semaine, avant la mise à mort de l'ensemble des animaux pour prélever leurs organes. Le porteur affirme que la mise en place du système immunitaire périnatal résulte d'interactions complexes qui ne peuvent pas être reproduites in vitro, ce qui l'oblige à recourir à un modèle in vivo. Le suivi annoncé est hebdomadaire, et les points limites dont l'atteinte déclencherait une mise à mort anticipée ne sont pas décrits.
Objectifs
Les lymphocytes T régulateurs sont une population de cellules du système immunitaire cruciales dans la prévention de l’auto-immunité mais délétère dans les réponses anti-cancéreuse du fait de leur puissant effet immunosuppresseur. Il a récemment été montré que les lymphocytes T régulateurs produits au cours de la période néo-natale présentaient des propriétés particulières et protégeaient l’organisme tout au long de la vie. Il a été observé, chez la souris qu’une déficience pour une protéine spécifique altérait drastiquement la survie de cette population cellulaire. Nous souhaitons évaluer les conséquences de la disparition de ces cellules durant la période néonatale mais également chez la souris de 4 semaines via l’administration de molécules spécifiques ciblant ces cellules. Nous souhaitons également restaurer la survie des lymphocytes T régulateurs néonataux chez la souris déficiente pour la protéine identifiée, grâce à un traitement ciblé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de mieux comprendre les mécanismes contrôlant la mise en place des lymphocytes T régulateurs chez le nouveau-né et les conséquences à long terme d’une perturbation de ces mécanismes. Ces travaux pourraient ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques visant à moduler l’influence de ces cellules, bénéfique dans la prévention de l’auto-immunité mais délétère dans la mise en place d’une immunité anti-tumorale efficace.
Procédures
3 injections sous la peau seront réalisées sur animal vigile (30s/souris/injection) sur une durée d’une semaine
Impact sur les animaux
Les injections sous la peau peuvent induire un stress léger et des douleurs légères de courte durée.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort dans le but de prélever les organes pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.
Remplacement
Des données bio-informatiques nous ont permis d’identifier des molécules importantes dans la survie des cellules T régulatrices. Des tests in vitro soutiennent également notre hypothèse. Cependant le système immunitaire est composé de nombreuses cellules qui interagissent entre elles. La mise en place de celui-ci lors de la période périnatale est le résultat d’interactions complexes qui ne peuvent pas être reproduites in vitro nous obligeant ainsi à utiliser un modèle in vivo.
Réduction
Les effectifs ont été calculé en utilisant une étude statistique garantissant la validité des données obtenues et l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Un suivi hebdomadaire de la part de l’équipe scientifique sera mis en place. De plus des points limites ont été définis, s’ils sont atteints, une mise à mort anticipée des animaux sera réalisée.
Choix des espèces
La souris est le modèle de référence dans l’étude du système immunitaire. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. L’étude du système immunitaire et de ses modulations entre le stade néonatal et adulte nécessite l’utilisation de souriceaux âgées de 1 à 7 jours et de jeunes souris âgées d’au moins 4 semaines.
Recherche de thérapies cellulaires et traitements des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une grille de score décide du moment de la mise à mort des souris dont la diarrhée devient sanglante, qui se déshydratent, maigrissent fortement et se recroquevillent de douleur. 650 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Une rectocolite hémorragique leur est provoquée par une molécule dissoute dans l'eau de boisson pendant six jours, ou une maladie de Crohn par injection sous anesthésie, avant mesure de la perméabilité intestinale et prises de sang tous les trois jours. Le porteur écrit qu'aucun traitement anti-inflammatoire ni anti-douloureux n'est possible, "car le but du modèle est d'induire une inflammation".
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) telles que la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn sont des maladies évoluant par poussées inflammatoires de durée et de fréquence extrêmement variables en fonction des patients, alternant avec des phases de rémission. En France, plus de 200 000 personnes sont atteintes d'une MICI et 2,5 millions en Europe. De plus, il est reconnu que l’inflammation chronique est un facteur de risque de survenue de cancer, notamment au niveau du colon. Aujourd’hui, nous ne disposons pas de traitements permettent de maintenir durablement l’homéostasie intestinale. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’effet d’approches pharmacologiques, nutritionnelles ou de thérapies cellulaires sur l’inflammation chroniques intestinales et leurs mécanismes d’action dans des modèles de MICI chez la souris permettant d’étudier le développement des MICI dans un contexte physiologique.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’évaluer l’effet des traitements (approches pharmacologiques, nutritionnelles ou thérapies cellulaires) et d’identifier des stratégies thérapeutiques contre les MICI
Procédures
Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’effet d’approches pharmacologiques, nutritionnelles ou de thérapies cellulaires sur l’inflammation chroniques intestinales et leurs mécanismes d’action dans des modèles de maladies inflammatoires digestives (rectocolite hémorragique ou une maladie de Crohn). La stratégie expérimentale consiste à induire une rectocolite hémorragique par une molécule dissoute dans l'eau de boisson ad libitum sur 6 jours ou une maladie de Crohn induite par une injection sous anesthésie (10 min) et évalué pendant 3 jours. Les traitements sont administrés soit par injection sur animaux vigiles (intervention de 10s) ou injection sous anesthésie (10 min), soit par voie orale 1 fois par jour (intervention de 10s) ou ad libitum. Selon les traitements, ils seront donnés 3 jours avant l’induction du modèle de MICI, en même temps ou 3 jours après le début du modèle de MICI. Nous évaluerons la perméabilité intestinale un jour avant l'induction des modèles et 3 jours après en administrant par injection (intervention 10s) d’une molécule fluorescente non toxique que nous rechercherons dans le sang après 4h (prélèvement de sang sous anesthésie 1min). Les animaux seront suivis journalièrement afin de mesurer leur poids, de prélever les selles et les urines (1 min lors de la préhension des animaux) et assurer une surveillance. Du sang pourra être prélevé sous anesthésie (1min) tous les 3 jours pour suivre l’effet des traitements. Une grille d'évaluation permet au personnel en charge de la surveillance et/ou du suivi des procédures d'évaluer de manière objective la douleur chez l’animal et de mettre en place des mesures pour limiter leurs souffrances.
Impact sur les animaux
Les modèles de rectocolite hémorragique (RCH) et la maladie de Crohn, tout comme les signes cliniques observés chez l'homme, entrainent des diarrhées qui vont devenir sanglantes au cours du traitement, pouvant entrainer une déshydratation et un fort amaigrissement et ainsi le décès de l’animal. Les animaux peuvent présenter des signes de cachexie, des signes de douleurs en se recroquevillant et en limitant leurs déplacements. Bien que les animaux soient habitués à la préhension, leur manipulation pour les injections ou pour le prélèvement d’urine et de selles peuvent stresser les animaux. Toutes les administrations en dehors de la douleur de l'aiguille ne présentent pas de nuissances particulières lorsqu'elles sont correctement effectuées. Une attention particulière sur les signes de douleurs sera portée. Pour les administrations par voie orale, irritation de l'oesophage avec possible perte de poids par manque d'alimentation seront à surveiller. Pour les injections, le point d’injection sera désinfecté et surveillé journalièrement. Les prélèvements de sang seront alternés d’un côté et de l’autre. Aucune nuisance des produits administrés ou injectés n'est attendue du fait de leur innocuité.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort ce qui permettra de réaliser différents prélèvements d’organes
Remplacement
Nous testerons plusieurs approches pharmacologiques, nutritionnelles ou de thérapies cellulaires qui sont susceptibles de moduler l’inflammation au cours de la progression des MICI. Il n’est pas possible de remplacer ces animaux car les mécanismes de la réponse immunitaire et de l'inflammation sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité qui ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches.
Réduction
Les traitements pour les approches pharmacologiques ou nutritionnelles , auront été présélectionnés via des résultats préliminaires basés sur des tests in vitro qui permettent d’appréhender les effets potentiels d’une molécule. Cette démarche permet de sélectionner les molécules et de limiter le nombre d’animaux utilisé. Concernant la thérapie cellulaire, l’effet immunomodulateur et anti-inflammatoire des cellules utilisées pour la thérapie cellulaire aura été validé préalablement in vitro. Cependant, les mécanismes de l’inflammation sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires qui ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Le modèle est bien maitrisé au laboratoire. Chaque animal est observé journalièrement. Les résultats actuels ont permis de valider des groupes d’animaux constitués de 6 à 10 individus pour acquérir des données fiables (projet antérieur ayant reçu l’accord du comité d’éthique et du ministère) et permettre une étude statistique. Un suivi individuel des animaux est réalisé afin de receuillir le maximum de données et de garantir la fiabilité des données. Des analyses post mortem sur différents organes seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possibles sur les animaux.
Raffinement
L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux. Les conditions d’hébergement permettront de conserver le comportement social des souris et de limiter le stress par l’enrichissement (papier pour la nidification, tunnel). Ceci permettra de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux en collectant le plus de données possibles. Il n’y a pas de possibilité de réaliser un traitement anti-inflammatoire ou anti-douloureux car le but du modèle est d’induire une inflammation. L'anesthésie par inhalation pour les actes nécéssitant une contention pouvant stresser l'animal et une analgésie locale en collyre seront utilisées pour les traitements intra_veineux. Les animaux anesthésiés seront maintenus jusqu'au réveil sur un support chauffant. Nous avons noté lors de protocoles précédents que les souris se recroquevillaient suite aux douleurs abdominales. Afin d’éviter la déshydratation des animaux, des biberons avec des embouts longs sont disposés au-dessus des cages permettant d’éviter aux souris de trop se relever. Les croquettes seront mises au fond de la cage afin de faciliter la prise alimentaire. Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, papier) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Une grille de scoring est utilisée afin d’évaluer précisément la douleur chez nos animaux permettant d'éviter toutes souffrances inutiles.
Choix des espèces
La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Les modèles de maladies inflammatoires digestives utiliseés dans ce projet permettent de mimer la physiopathologie dans toute sa complexité. Ce modèle nous permettra d'étudier l'impact de traitements tant au niveau physiologiue que au niveau cellulaire avec toutes les populations présentes (cellules de la muqueuse digestive, les cellules immunitaires...). Adultes, souris âgées de plus de 8 semaines afin d'avoir des souris avec un système immunitaire mature.
Etude des effets sur l’hypoxie et la réponse immunitaire d’une molécule vasodilatatrice sur la progression tumorale et l’hypoxie dans des modèles murins de xénogreffes de glioblastome en présence ou non de thérapies conventionnelles
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et chacune subit deux opérations avant la chirurgie terminale. La première implante des cellules de gliome dans le cerveau sous anesthésie et cadre stéréotaxique, la seconde place une pompe osmotique dans l'abdomen. 96 animaux reçoivent en plus une immunothérapie injectée dans l'abdomen à l'état vigile et une séance de radiothérapie sous anesthésie. Le porteur attend une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les souris qui développent un glioblastome, et résume le bénéfice espéré en une phrase, "une amélioration des stratégies thérapeutiques innovantes".
Objectifs
Le glioblastome demeure une tumeur incurable présentant des caractéristiques propres participant à la résistance aux thérapies actuelles. Parmi ces caractéristiques, l’hypoxie qui correspond à une diminution de la concentration en oxygène est un facteur identifié de mauvais pronostic. L’objectif de notre étude est d’évaluer les effets d’une molécule vasodilatatrice ayant pour objet de réduire l’hypoxie intratumorale sur l’efficacité des traitements antitumoraux, ici la radiothérapie et les immunothérapies. L'étude a les objectifs spécifiques suivants : • Déterminer l'effet de la molécule vasodilatatrice en accompagnement d’une immunothérapie sur l'hypoxie tumorale et la réponse immunitaire. • Déterminer l'efficacité in vivo de la molécule vasodilatatrice en présence d’immunothérapie en tant que composé candidat dans un modèle de xénogreffes murin de glioblastome humain, déterminée par la survie des animaux et la charge tumorale. • Déterminer la cinétique des changements aigus de l’hypoxie in vivo induits par la molécule vasodilatatrice en présence de radiothérapie dans un modèle de xénogreffes murin de glioblastome humain
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques innovantes sur le glioblastome (IT+RT)
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 244 animaux sont concernés. - Implantation de pompes osmotiques en intrapéritonéal : 15 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 244 animaux sont concernés. - Injection intrapéritonéale de l’immunothérapie (animal vigile) : 3 fois tous les 3 jours à partir de J6 ; 5 minutes maximum par animal, 96 animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 1 séance de radiothérapie : 10 minutes maximum par animal, 96 animaux sont concernés.- Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale - Chirurgie terminale sous anesthésie : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 10 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
Suivant l’expérience du laboratoire, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux développant de glioblastomes. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale peut induire des douleurs modérées. Les séances fractionnées de radiothérapie et les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. L’injection de traitements en eux-mêmes ne provoquent pas de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer différents organes pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale et la réponse aux traitements comme la radiothérapie. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Dans ce projet, nous nous intéressons aux phénomènes de vasodilatation, impossibles à appréhender in vitro.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasives se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est, dans ce cas, son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants, et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux (environ 25%) basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculé est un nombre maximal. Grâce notamment aux études en imageries qui sont quantitatives, nous réaliserons des analyses séquentielles. Ainsi, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation (au minimum 7jours) avant toute expérimentation et bénéficieront également d’enrichissement (roue d’activité, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Une évaluation des éventuelles douleurs de l’animal est faite grâce à une observation de l’expression faciale. Si « un signe évident de douleur 2 » est atteint sans que pour autant les points limites entrainant la mise à mort ne soient atteints, une couverture analgésique sera mise en place par une injection quotidienne. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. . Les analgésies générales sont faites par injection sous cutanée et des anesthésies locales sont réalisées par application de gel (sur la peau avant incision et sur les barres d’oreille avant placement dans le cadre stéréotaxique). Lors des implantations chirurgicales, un gel est appliquée sur les yeux de l’animal afin d’éviter leur asséchement. Pour remédier à la perte de poids, les souris disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire si nécessaire.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux in vivo sont indispensables pour récapituler au mieux l’environnement inflammatoire des tumeurs qui se développent chez les patients. Nous utiliserons des souris immunocompétentes car ces souris présentent toutes les populations de cellules immunitaires et parce que le modèle de tumeur cérébrale utilisé repose sur l’implantation de cellules de gliome, développées depuis cette souche. De plus, pour cette espèce et pour les cellules étudiées, tous les outils de caractérisation en cytométrie en flux sont déjà validés dans la littérature et dans notre laboratoire. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.
Evaluation du rôle d’une protéine endogène dans un modèle d’inflammation de l’intestin chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever sang, organes lymphoïdes et intestin. 384 d'entre elles reçoivent dans leur eau de boisson des sucres complexes qui déclenchent une colite, avec selles molles, saignements possibles, perte de poids et baisse d'activité. 48 subissent une irradiation corporelle totale aux rayons X puis une greffe de cellules immunitaires, 48 autres une injection détruisant une partie de leurs globules blancs. Le porteur écrit que ces effets "restent limités dans le temps" et n'auront "pas d'effet durable sur leur santé", et attend du projet l'exploration de pistes thérapeutiques contre les maladies inflammatoires de l'intestin.
Objectifs
Chez l’homme, les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, résultent de réponses immunitaires non contrôlées contre la flore intestinale, entraînant une inflammation persistante et des lésions de l’intestin. Cette inflammation soutenue est due à de nombreuses molécules dont la production dépend d’une voie biochimique particulière. Nous travaillons sur un facteur capable de moduler cette voie inflammatoire et avons pour objectif de déterminer l’influence que ce facteur peut avoir dans l’inflammation intestinale. Pour ce faire, nous prévoyons d’utiliser un modèle utilisé en routine pour mimer chez la souris, l’inflammation associée aux MICI: induire une inflammation réversible au niveau du colon au moyen de sucres complexes administrés par l’eau de boisson. Nous étudierons les caractéristiques de cette inflammation influencée ou non par notre facteur d’intérêt. Nous examinerons en particulier le rôle de différentes cellules du système immunitaire dans ce processus. La compréhension du rôle de ce facteur régulateur dans la colite expérimentale pourrait ainsi ouvrir la voie à l’exploration de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’inflammation et aider à développer des approches innovantes pour moduler durablement l’inflammation chronique intestinale.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une compréhension approfondie du rôle d’un facteur capable de moduler une voie biochimique majeure de l’inflammation qui est conservée chez l’homme et la souris. Cette étude se fera dans un modèle d’inflammation intestinale qui mime chez la souris, l’inflammation observable dans les maladies inflammatoires de l’intestin chez l’homme. Cette recherche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques, en explorant la possibilité de manipuler l’activité de ce facteur pour réguler efficacement l’inflammation intestinale de manière ciblée et durable.
Procédures
Au total, 384 souris seront pesées individuellement une fois par jour pendant 7 jours (durée estimée : 30 secondes par pesée). 48 souris recevront une injection unique dans l’abdomen d’un produit anesthésiant (environ 20 secondes par injection), puis ces 48 souris subiront une irradiation corporelle totale unique aux rayons X (durée estimée : 10 minutes). Ces souris recevront également, 4 heures après, une injection intraveineuse de cellules pour permettre la reconstitution de leur système immunitaire (durée estimée : 1 minute par injection). 6 souris recevront une injection unique dans l’abdomen d’un produit conçu pour induire localement le recrutement de cellules immunitaires (environ 30 secondes par injection). 48 souris recevront une injection unique dans l’abdomen d’un produit destiné à éliminer une partie de leurs globules blancs (environ 30 secondes par injection). 4 jours plus tard, ces 48 souris recevront une injection de cellules par voie intraveineuse (durée estimée : 1 minute par injection).
Impact sur les animaux
L’induction de la colite peut provoquer un stress chez les animaux, principalement en raison de la gêne et de l’inconfort digestif liés à l’inflammation intestinale. Les symptômes incluent une modification de la consistance des selles et l’apparition possible de saignements entraînant une perte de poids et une diminution de l’activité. L’irradiation peut provoquer un stress modéré et affaiblir temporairement les défenses immunitaires, mais ces effets restent limités dans le temps. Les cellules immunitaires seront temporairement absentes pendant moins de deux jours, avant d’être remplacées par des cellules provenant d’autres souris, ce qui n’aura pas d’effet durable sur leur santé. Enfin, les injections peuvent provoquer une légère gêne localisée au point d’injection, mais celle-ci reste de très courte durée et limitée en intensité.
Devenir
À la fin de chacune des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement du sang, des organes lymphoïdes et de l’intestin.
Remplacement
Les analyses in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité du système immunitaire, les interactions avec la flore intestinale, ni les interactions cellulaires qui régulent l’inflammation. En effet, l’inflammation intestinale implique non seulement les cellules immunitaires, mais aussi des cellules ayant des fonctions mécaniques, sécrétoires et régulatrices spécifiques, comme les cellules épithéliales intestinales, les fibroblastes locaux et des cellules du système nerveux. Ces différentes populations cellulaires communiquent via des médiateurs solubles, des interactions directes et des mécanismes d’activation complexes qu’il est impossible de recréer pleinement in vitro actuellement.
Réduction
De nombreux paramètres immunologiques ou paramètres tissulaires seront analysés sur chaque animal afin de limiter au maximum le nombre de répétitions tout en garantissant la robustesse des résultats. Pour le modèle de colite induite chez la souris, la variabilité biologique, mise en évidence par des données de la littérature scientifique, nécessite l’utilisation de groupes de 6 animaux par condition. Ce nombre a été optimisé afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, tout en maintenant des conditions statistiques suffisantes pour une interprétation fiable des résultats. Enfin, deux des procédures ne seront mises en œuvre que si les résultats de la première procédure le justifient, garantissant une utilisation raisonnée des animaux.
Raffinement
Dès le début de l’administration de l’eau de boisson modifiée, les souris seront surveillées quotidiennement et individuellement pendant 7 jours. Le suivi de l’inflammation intestinale sera assuré par une observation générale, une mesure du poids et un examen des selles. Toute souris présentant des signes manifestes de souffrance sévère sera immédiatement retirée de l’étude, anesthésiée sous anesthésie générale gazeuse et euthanasiée. Ces critères d’exclusion s’appliqueront également aux souris traitées pour des transferts de cellules. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale profonde afin de minimiser la douleur et le stress.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence pour l’étude des maladies inflammatoires de l’intestin en raison de sa pertinence immunologique vis-à-vis des maladies humaines. C’est chez la souris que de nombreux modèles de maladies inflammatoires humaines, tels que celui de l’induction de colite, ont été développés et validés. De plus, la souris permet d’accéder à de nombreux variants génétiquement modifiés (indispensables pour explorer les rôles spécifiques de facteurs particuliers) et bénéficie d’une grande disponibilité d’outils d’analyse immunologique (anticorps, méthodes de dosage…). Sa proximité immunologique et inflammatoire avec l’homme, combinée à une reproduction rapide et des conditions expérimentales bien contrôlées, en fait un modèle pertinent pour cette étude. Enfin, l’utilisation de la souris permet une mise en perspective des résultats avec de nombreux travaux antérieurs connexes. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 10 semaines au début de la procédure, un stade correspondant à l’âge adulte jeune, optimal pour l’étude des mécanismes inflammatoires et immunitaires. Ce choix est justifié par plusieurs facteurs. Tout d’abord, à cet âge, le système immunitaire est complètement mature, ce qui garantit une réponse inflammatoire reproductible et évite les biais liés à l’immaturité immunitaire des jeunes souris ou aux modifications du système immunitaire associées au vieillissement. De plus, l’homogénéité des réponses immunitaires dans cette tranche d’âge permet de limiter la variabilité interindividuelle, garantissant des résultats interprétables sans nécessiter un nombre excessif d’animaux.