Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Induction de tolérance au facteur VIII par thérapie génique dans un modèle murin hémophile A
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 666 souris vont être utilisées, dont 942 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est hémophile sévère, exposée à une hémorragie au moindre traumatisme, et reçoit jusqu'à dix injections sous anesthésie, quatre à sept prélèvements sanguins et une biopsie de queue pour le génotypage. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes lymphoïdes, celles qui n'ont pu entrer dans les procédures étant versées à d'autres projets quand c'est possible. Le porteur annonce une "preuve de concept" et des retombées en thérapie humaine à moyen terme, quand les injections, les prélèvements et le risque hémorragique courent, eux, sur toute la durée du projet.
Objectifs
L’hémophilie A est un trouble hémorragique héréditaire lié à un déficit en facteur VIII de la coagulation. 30 pourcents des patients hémophiles A traités avec du facteur VIII thérapeutique (afin de rétablir la coagulation) développent une réponse immunitaire contre le FVIII. L’apparition des anticorps anti-FVIII complique énormément la qualité de vie des patients et augmente considérablement le coût de leur prise en charge. Le but de ce projet est d’exploiter la thérapie génique pour induire une tolérance envers le facteur VIII. La thérapie génique ici consiste à introduire une copie fonctionnelle du gène codant le facteur VIII (transgène) dans les cellules hépatiques de l'hôte afin de restaurer la production endogène de facteur VIII. De nombreuses études dans divers modèles précliniques de pathologies humaines (hémophilie B, diabète de type 1, encéphalomyélite autoimmune expérimentale, ...) indiquent que la thérapie génique permet d’induire une tolérance envers la protéine que l’on fait produire par l’organisme. Pourtant, les expériences effectuées chez les souris hémophiles A sont décevantes, probablement en raison des faibles niveaux de facteur VIII exprimés après thérapie génique. L'objectif de ce projet est dans un premier temps de démontrer que la quantité de facteur VIII produit après thérapie génique est trop faible pour permettre une induction de tolérance du système immunitaire vis-à-vis du facteur VIII. Dans un deuxième temps, nous testerons la possibilité d’induire une tolérance immunitaire spécifique au facteur VIII en utilisant des transgènes correspondants à des fragments de facteur VIII (mieux exprimés par les cellules) au lieu de la protéine entière pour la thérapie génique. L’induction de tolérance vis-à-vis du facteur VIII représente un intérêt scientifique et clinique majeur. Son utilisation chez les patients pourrait améliorer considérablement les conditions de vie des patients hémophiles A et diminuerait le coût de leur prise en charge. Les différents aspects de notre projet sont évalués par des comités scientifiques indépendants qui, sur la base de l’intérêt scientifique des questions posées, décident de financer notre recherche.
Bénéfices attendus
Nous anticipons plusieurs bénéfices du projet avec des retombées en thérapie humaine à moyen terme. Tout d’abord nous aurons une confirmation que la concentration de protéine produite après thérapie génique est bien le facteur contrôlant l’établissement de la tolérance immunitaire dans le contexte d'une thérapie génique. Cette observation encouragera des recherches complémentaires destinées à augmenter l'efficacité de production des protéines dont l'expression est induite par thérapie génique. Nous apporterons la preuve de concept que la thérapie génique à l’aide de transgènes codant pour des fragments de la protéine d’intérêt permet d’induire une tolérance immunitaire complète contre cette protéine. Il y aura une application directe dans l'hémophilie A (maladie rare concernant 1 homme sur 10000 naissances) où le Facteur VIII de la coagulation est très mal produit par les cellules, et où la production de fragments protéiques transgéniques représente une alternative prometteuse. Nous apporterons aussi la preuve que cette stratégie fonctionne dans un contexte d’alloimmunité (réponse immunitaire non-désirée contre un médicament par exemple comme chez l'hémophile A) et dans un contexte d’autoimmunité (par exemple l'hémophilie A acquise qui concerne 1 à 5 personnes par million). Enfin, nous validerons une nouvelle approche thérapeutique basée sur l’exploitation du potentiel tolérogène de cellules T régulatrices exogènes qui pourrait avoir de multiples applications, notamment dans les situations d'hépatites autoimmunes (1 cas pour 6000 individus).
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous anesthésie. Jusqu'à 10 injections maximum seront réalisées (dont 8 injections hebdomadaire et 2 injections espacées de 2 semaines). Ces injections demandent moins de 1 minute d’immobilisation de l’animal. Les animaux seront également soumis à des prélèvements de sang sous anesthésie: 4 à 7 prélèvements d’une durée inférieure à 1 minute seront réalisés. Ces prélèvements seront réalisés à une fréquence hebdomadaire pour certaines procédures.
Impact sur les animaux
Un des modèles utilisés est un modèle préclinique de l'hémophilie A sévère, des risques hémorragiques sont possibles en cas de blessure ou traumatisme et demandent donc une adaptation de certaines procédures. L'induction d'un hématome, d'une hémorragie, d'une douleur ou d'une lésion lors des injections et des prélèvements sont possibles. L'induction d'un saignement et d'une douleur lors de la biopsie pour le génotypage est possible. L'induction d'une détresse respiratoire ou d'une hypothermie est possible lors de l'anesthésie, de même qu'un stress lors du réveil.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Une première partie dans le but de collecter les organes lymphoïdes pour l' évaluation de la réponse immunitaire ou pour des analyses ultérieures. Une seconde partie des animaux produits dans ce projet ne seront pas prélevés car ils ne pourront être inclus dans les procédures. Ils seront néanmoins si cela est possible inclus dans d'autres projets préalablement autorisés.
Remplacement
Le projet fera appel à différents modèles expérimentaux chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment l’induction d'une réponse immunitaire ou d'une tolérance au FVIII). Néanmoins, les différentes constructions ont été validés sur des cellules in vitro (production/ sécrétion). Par ailleurs, toute information obtenue par l’expérimentation animale sera immédiatement transposée à des systèmes in vitro pour analyses ultérieures.
Réduction
Un nombre maximum de 1666 animaux sera utilisé pour ce projet. Le nombre de répétitions des expériences sera défini de manière rationnelle : si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs avec une puissance appropriée, elle ne sera pas répétée, sinon elle sera répétée une à deux fois maximum. Les organes, sérum et cellules des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés; ainsi, aucune expérience supplémentaire ne sera faite si des questions nouvelles surviennent. Nous optimiserons aussi les contrôles de manière à minimiser le nombre de groupes de souris. Enfin, les enseignements tirés des premières procédures seront utilisés pour réduire le nombre de groupe par lot dans les procédures suivantes.
Raffinement
Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées avec le personnel de l’animalerie. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de nids végétaux et de tunnels en carton). Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Du matériel stérile et exempt d’endotoxine sera utilisé afin de réduire au maximum le risque de lésion/ inflammation lors des injections/ prélèvements. Des points limites ont été définis et les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.
Choix des espèces
La seule alternative connue est l’utilisation d’un modèle canin hémophile. Cependant, la souris est la seule espèce qui permettent d’avoir un nombre d’individus de même âge suffisant, et de génotype homogène, qui permette l’obtention de résultats statistiquement fiables, et pour lequel les outils nécessaires à l’étude de la réponse immunitaire sont disponibles sans restriction. Des souris adultes, âgées de 7-14 semaines en début d’expérimentation (systèmes immunitaires matures) seront utilisées.
Phénotypage/génotypage par prélèvement sanguin de lignées murines génétiquement modifiées, modèles pour l’étude des cellules myéloïdes
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Remises en accouplement pour produire de nouvelles portées, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une contention et un ou deux prélèvements sanguins de quelques secondes, destinés à vérifier la fluorescence de ses cellules immunitaires. Ce projet entretient des lignées génétiquement modifiées destinées à d'autres travaux sur les macrophages, le porteur revendiquant un élevage calibré pour qu'un maximum de descendants portent le bon génotype. Celles qui ne le portent pas sont versées à d'autres projets déjà autorisés ou tuées pour prélever leurs organes.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’assurer le suivi de lignées de souris génétiquement modifiées présentant des cellules immunitaires (monocytes et macrophages) avec différentes fluorescences permettant d’étudier leur complexité lors de processus physiologiques ou pathologiques. Le génotypage de ces souris nécessite un prélèvement sanguin pour analyser la fluorescence des cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Les études récentes montrent une implication de plus en plus importante des cellules immunitaires et en particulier des macrophages dans de nombreuses pathologies, notamment le cancer et les maladies inflammatoires. Cette étude de la physiologie des macrophages au sein de différents tissus permettra à moyen terme de mieux comprendre leur hétérogénéité et leur complexité notamment en présence des différents systèmes hormonaux. A plus long terme ce projet permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre des immunothérapies.
Procédures
Les animaux au cours de ce projet seront soumis à une contention d’immobilisation et d‘un ou deux prélèvements sanguins. Ces gestes ont une durée de quelques secondes à une minute par animal.
Impact sur les animaux
Le principal effet indésirable attendu est la génération de stress lors de la contention et du prélèvement sanguin. Les prélèvements sanguins peuvent également provoquer un hématome dans de rares cas.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale les animaux seront remis en accouplement pour la génération de nouvelles portées dans le cadre du maintien et du développement des lignées. Ils seront utilisés en continu dans le cadre de projets expérimentaux autorisés ou mis à mort s'ils ne possèdent pas les gènes d'intérêt ou pour le prélèvement d'organes.
Remplacement
Nous disposons de modèles cellulaires et de tissus de patients nous permettant d’étudier les macrophages dans des systèmes simples. Cependant l’étude dynamique de la complexité des populations de macrophages et de leur localisation dans différents tissus et notamment de l’impact des systèmes hormonaux sur ces populations nécessite l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux générés dans cet élevage, nous faisons particulièrement attention aux génotypes des parents afin qu’un maximum des descendants ait le bon génotype. Nous contrôlons le nombre de couples afin de ne pas générer d’excédent d’animaux. Les animaux dont le génotype ne correspond pas sont dans la plupart des cas utilisés dans le cadre d'autres projets déclarés afin de ne pas produire d'animaux inutilement. Les mâles et femelles sont utilisés ensemble ou indépendamment en fonction des projets.
Raffinement
Nous accordons un point important à la formation du geste technique des zootechniciens réalisant les prélèvements sanguins. Le prélèvement de sang est limité au strict nécessaire. Concernant l'hébergement, les animaux disposent dans leur une cage de trois types d'enrichissements : du papier kraft, des carrés de coton et une maison en cellulose pour le confort des animaux leur permettant d’exprimer leurs besoins naturels de nidification.
Choix des espèces
L'étude de la complexité des populations de macrophages dans les différents tissus dans des conditions physiologiques et pathologiques et particulièrement de l’impact des systèmes hormonaux sur ces populations sont des éléments importants pour comprendre le fonctionnement et le rôle du système immunitaire. Les souris génétiquement modifiées utilisées sont un moyen unique de suivre et d'étudier les cellules immunitaire d'intérêts grace à leur fluorescence.
Etude des mécanismes pathogènes et des facteurs environnementaux dans un modèle de sclérodermie chez la souris 3/3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
1 214 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à 24 injections dans l'abdomen et 40 gavages sur deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent deux instillations dans la gorge sous anesthésie, un prélèvement sanguin, une séance d'imagerie, un acte chirurgical et des transports entre trois établissements. Le porteur indique que le modèle peut provoquer des atteintes cutanées à partir de quatorze semaines, puis une perte de poids et une mobilité réduite, pour étudier une sclérodermie déclenchée par la silice. Toutes sont tuées afin de prélever sang, poumon, rate et peau, une partie l'étant simplement faute de porter le génotype recherché.
Objectifs
La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.
Procédures
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.
Impact sur les animaux
Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques. Une partie des animaux seront euthanasiés car sans génotype d'intérêt.
Remplacement
Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.
Determiner les modulations du phénotype microglial dans les pathologies neurodégénératives pour détecter des biomarqueurs précoces et développer de nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Chercher des biomarqueurs précoces des maladies neurodégénératives dans la rétine et le cerveau conduit à utiliser 6 104 souris, toutes tuées à l'issue pour prélever système nerveux central, ganglions lymphatiques et rates. 5 240 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 64 un niveau léger, et 800 sont opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. 5 304 souris subissent des lavages oculaires vigiles, 6 040 des injections intrapéritonéales cinq jours de suite dont 2 000 des injections de toxine, et 3 240 des interventions chirurgicales de 30 minutes à 2 heures avant une mise à mort trois à neuf semaines plus tard. La toxine provoque une hypothermie marquée pouvant aller jusqu'à une mortalité aiguë, quand les retombées annoncées, prévenir ou ralentir des pathologies "toujours incurables", restent au conditionnel.
Objectifs
Avec près de 2 millions de cas en France, l’impact sociétal des maladies neurodégénératives est extrêmement élevé et devrait augmenter à l’avenir en raison de la proportion toujours croissante de la population âgée de plus de 65 ans. Ces maladies se caractérisent à la fois par la dégénérescence progressive de certains neurones et par l’apparition d’une inflammation marquée et chronique dans le cerveau. Cette neuroinflammation implique à la fois l’activation de cellules résidentes (astrocytes et microglies) et une infiltration de cellules immunitaires de la périphérie, notamment de lymphocytes et de macrophages. Plusieurs études dont les nôtres ont démontré que la neuroinflammation participe activement à la progression pathologique, a minima en exacerbant les lésions neuronales, voire précédant ces lésions. Dans de précédentes expériences, nous avons mis en évidence un rôle majeur d'une protéine dans la microglie, dans l’orchestration de ces phénomènes dans des modèles de la maladie de Parkinson. Le projet actuel vise d’une part à étudier le rôle de 3 partenaires de cette protéine sur le phénotype microglial, et d’autre part à élargir l’étude à d’autres modèles physiopathologiques impliquant la microglie, notamment au cours du vieillissement et de la maladie d’Alzheimer. Nos travaux permettront de mieux comprendre ces phénomènes biologiques complexes et de déterminer de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces pathologies toujours incurables. Nous mettrons également en évidence des biomarqueurs précoces de ces conditions physiologiques et pathologiques permettant diagnostique et un pronostique précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et physiopathologiques impliqués dans les pathologies neurodégénératives, liées ou non au vieillissement. Il permettra en particulier de mieux caractériser la participation des phénomènes inflammatoires dans le déroulement physiopathologique, et de révéler les évènements précoces au niveau de la rétine. Les résultats obtenus pourront ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les fonctions microgliales, permettant la prévention ou un ralentissement de la progression de cette pathologie chez les patients. Par ailleurs, les résultats de ce projet permettront d’identifier des biomarqueurs pronostiques précoces, utiles à la fois pour le diagnostic et le suivi clinique des patients. Ces avancées sont particulièrement cruciales pour des maladies pour lesquelles aucune option thérapeutique curative n’est à ce jour disponible.
Procédures
Au cours de ces procédures, les animaux seront soumis à des prélèvements issus de lavages oculaires sur animal vigile (5304 animaux). Des animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales (5 jours consécutifs) sur animal vigile (6040 animaux). Parmi ces derniers, certains seront soumis à 2 séries d'injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs dont des injections de toxine (2000 souris). Certains animaux seront soumis à des interventions chirurgicales sous anesthésie générale (3240 souris). Les interventions dureront 30 minutes à 2h et les animaux seront mis à morts 3 à 9 semaines après l'intervention.
Impact sur les animaux
Les injections par voie intrapéritonéale nécessitent une contention forte qui peut induire de l’anxiété, mais aucune des molécules injectées ne provoque de la douleur post-administration. LEs modèles de la maladie de Parkinson utilisés dans ce projet sont asymptomatiques. Néanmoins, l’administration de toxine entraîne une hypothermie transitoire marquée, susceptible de provoquer une instabilité cardiovasculaire pouvant aller jusqu’à une mortalité aiguë. Les injections stéréotaxiques et intravitréennes seront réalisées sous anesthésie générale, induisant une perte de la capacité de thermorégulation ainsi que des douleurs post-opératoires, minorées par les antalgiques.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. Le organes (systèmes nerveux central, ganglions lymphatiques, rates) seront récupérés pour réaliser des analyses cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Contrairement aux modèles in vitro, l’expérimentation animale permet de restituer la complexité spatio-temporelle des réponses cellulaires dans leur environnement physiologique, en tenant compte de la diversité des types cellulaires impliqués, de leur état métabolique spécifique, ainsi que de leurs interactions fonctionnelles. Les modèles cellulaires immortalisés ou les systèmes in vitro, bien qu’utiles pour des analyses mécanistiques ciblées, ne permettent pas de reproduire avec précision les régulations métaboliques fines ni les interactions neuro-immunitaires observées dans un organisme vivant. Le recours à l’expérimentation animale constitue ainsi une étape indispensable pour valider les hypothèses dans un contexte physiologique pertinent. Une fois ces mécanismes validés in vivo, nous approfondirons l’étude des processus moléculaires à l’aide de cultures primaires de neurones, de microglies et de lymphocytes, ainsi que par le biais de cultures organotypiques de rétine murine que nous avons développées au sein du laboratoire.
Réduction
Nous planifierons rigoureusement chaque expérience afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la robustesse statistique des résultats obtenus. Les modèles d’induction de la maladie de Parkinson sélectionnés ont déjà été validés au sein de notre équipe et chez nos collaborateurs, ce qui nous permet d’optimiser la taille des groupes expérimentaux ; des cohortes de 10 souris sont nécessaires pour obtenir des données exploitables. Pour le modèle de synucléinopathie, l’approche retenue repose sur l’injection unilatérale du vecteur d'intérêt dans un œil, tandis que l’autre œil reçoit un vecteur contrôle, ce qui permet de réduire significativement le nombre d’animaux tout en limitant la variabilité interindividuelle. Par ailleurs, dans la mesure du possible, nous analyserons un ensemble étendu de paramètres cellulaires, moléculaires et transcriptionnels sur les mêmes individus, afin d’optimiser l’exploitation des tissus et de limiter le recours à des procédures expérimentales supplémentaires.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera une priorité tout au long de nos expérimentations et fera l’objet d’un suivi rigoureux, conformément aux recommandations du comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) de notre établissement. Les souris seront hébergées en groupes dans des cages de surface adaptée, avec accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L’environnement sera systématiquement enrichi (présence de coton pour la construction de nids, tunnels), et une période d’acclimatation à l’hébergement (1 semaine) puis à la manipulation et à la contention (2 semaines) sera mise en place afin de réduire le stress lié aux interventions. La douleur et l’angoisse seront systématiquement limitées par l’utilisation d’analgésiques et le recours à l’anesthésie générale lors des procédures invasives. Afin de prévenir cette baisse de température corporelle, les animaux seront placés sur un tapis chauffant pendant au moins une heure (ou jusqu’au réveil si anesthésie générale) après les interventions afin de leur permettre de maintenir une température compatible avec la récupération de leur capacité de thermorégulation. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé dès l’initiation des procédures expérimentales, permettant d’évaluer leur état général (prise alimentaire, comportement social, locomotion, toilettage), et d’intervenir rapidement si nécessaire, notamment via l’aide à l’alimentation ou des ajustements environnementaux. Des critères d’arrêt précis, validés par le SBEA, permettront d’interrompre immédiatement toute expérimentation en cas de dégradation de l’état de santé d’un animal. Tout animal présentant un ou plusieurs de ces signes sera euthanasié sans délai, dans le respect des protocoles en vigueur. Les responsables du projet sont titulaires des autorisations à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Choix des espèces
L’étude des processus de mort neuronale et de neuroinflammation nécessite le recours à des modèles capables d’intégrer l’ensemble des mécanismes physiopathologiques impliqués ces pathologies complexes, qui impliquent différents types cellulaires de différents systèmes physiologiques. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet d’obtenir des résultats exploitables et pertinents au regard de la pathologie humaine. La souris a été choisie en raison de son faible coût, de sa facilité de manipulation, et de sa bonne tolérance aux procédures expérimentales. Le fond génétique C57BL/6J est celui qui présente la meilleure susceptibilité aux modèles utilisés. Ce choix est également justifié par la disponibilité d’outils génétiques adaptés : notre projet repose sur l’utilisation de lignées murines génétiquement modifiées exclusivement disponibles dans ce modèle. Par ailleurs, de nombreux outils moléculaires et immunologiques validés sont disponibles pour cette espèce, rendant possible une dissection fine des mécanismes pathologiques à l’échelle cellulaire. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 10 semaines au début de l'expérience. A ce stade, les souris ont terminé leur croissance et possèdent un système neuronal et immunitaire mature et fonctionnel.
Évaluation de nouvelles molécules à visée thérapeutique ou thérapies dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Les souris dont l'état dépasse les points limites définis par la grille de score sont tuées avant la fin du protocole. 870 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang et les tissus nerveux. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par injection d'un peptide de myéline et d'un adjuvant, ce qui provoque une hypotonie de la queue puis une faiblesse voire une paralysie des membres postérieurs, un repli social et une réduction du toilettage, sur environ 30 jours dans les modèles aigus et jusqu'à 45 jours dans les modèles rémittents. Le suivi passe par des tests de sensibilité à la douleur d'environ cinq minutes, répétés selon la progression de la maladie, et le porteur justifie le recours à la souris par des raisons scientifiques et par un "intérêt pratique", faibles coûts, cycles de reproduction courts et facilité de manipulation.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie auto-immune chronique qui affecte le système nerveux central en détruisant la gaine de myéline entourant les axones. Cette démyélinisation entraîne l’apparition de lésions dispersées dans le cerveau et la moelle épinière, conduisant à une dégénérescence des neurones. Les symptômes varient selon les patients et les zones du système nerveux atteintes, et comprennent des troubles moteurs, sensitifs, visuels, urinaires ou encore des douleurs neurogènes pouvant être associées à des symptômes dépressifs. La maladie évolue souvent par poussées inflammatoires suivies de périodes de rémission plus ou moins marquées. Bien que des traitements existent, leur efficacité est parfois limitée et ils sont associés à des effets secondaires importants, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Ce projet vise à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques en utilisant un modèle murin bien établi d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, qui reproduit plusieurs caractéristiques de la sclérose en plaques humaine. Les animaux reçoivent une injection d’un peptide dérivé de la myéline associé à un adjuvant, ce qui déclenche une réponse inflammatoire du système nerveux central entraînant des symptômes moteurs et sensoriels. L’évolution de la maladie est ensuite suivie par des tests comportementaux pour mesurer la sensibilité à la douleur et les troubles moteurs. Des analyses complémentaires, notamment histologiques et biochimiques, permettent de mieux comprendre les mécanismes en jeu. Le projet inclut également une approche d’imagerie in vivo, non invasive, permettant d’observer l’inflammation et la progression de la pathologie chez l’animal vivant. Cette stratégie globale permettra d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules et d’identifier des biomarqueurs associés à la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules ou associations de molécules dans un modèle murin de sclérose en plaques, en se concentrant sur la réduction des déficits moteurs et des douleurs neuropathiques associés à cette pathologie. En combinant des approches comportementales, biochimiques et d’imagerie non invasive sur l’animal vivant, il permettra de caractériser l’impact de ces traitements sur l’inflammation et la neurodégénérescence. Il s’inscrit dans une perspective de recherche translationnelle avec pour finalité l’identification de traitements plus efficaces et mieux tolérés pour les patients atteints de sclérose en plaques. À court terme, c’est-à-dire pendant la durée du projet, les bénéfices attendus concernent l’identification de molécules ou formulations prometteuses ainsi que l’évaluation comparative de leur efficacité dans des protocoles d’administration variés. Cela permettra de déterminer les doses optimales et les fenêtres thérapeutiques pertinentes, qu’il s’agisse d’une administration préventive ou curative. Le projet favorisera également la détection de synergies d’action entre composés, qui pourraient aboutir à des stratégies thérapeutiques combinées plus performantes. Par ailleurs, l’utilisation d’outils d’imagerie innovants sur l’animal entier contribuera à mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs de la maladie, exploitables pour le suivi non invasif de la réponse au traitement. À long terme, les connaissances générées dans le cadre de ce projet pourraient contribuer au développement de nouveaux traitements destinés à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de sclérose en plaques. Ces avancées pourraient également être transposables à d’autres maladies neuroinflammatoires chroniques, pour lesquelles les approches thérapeutiques actuelles restent limitées. En affinant notre compréhension des mécanismes d’action des molécules testées et en enrichissant les modèles de suivi préclinique, ce travail vise à renforcer le lien entre la recherche fondamentale et les applications cliniques, dans le respect des principes éthiques de l’expérimentation animale et au service d’un enjeu de santé publique majeur.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à un ensemble d’interventions techniques brèves, non chirurgicales, nécessaires à l’induction et au suivi du modèle EAE. Les interventions réalisées lors de l’induction du modèle EAE sont les suivantes : 2 injections sous-cutanées (1 minute au total) sous anesthésie gazeuse et 2 injections intrapéritonéales (15 secondes par injection). Les interventions réalisées lors du suivi du modèle EAE sont les suivantes : manipulation quotidienne des animaux (1 minute), test de la sensibilité à la douleur (animal vigile, sur une durée d’environ 5 minutes et répétée à différents temps selon la progression de la maladie), contention pour administrations de molécules à visée thérapeutique (durée d’intervention de 30 à 60 secondes en fonction de la voie d’administration et à une fréquence établie en fonction du protocole et du schéma thérapeutique choisi), examens d’imagerie non invasive par fluorescence sous anesthésie gazeuse (une à deux fois par animal ; injection du traceur par voie intraveineuse d’une durée de 30 secondes maximum ; durée de la session d’imagerie par fluorescence : 60 secondes maximum), un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum à partir du 18ème jour, durée d’environ 3 minutes). Chaque intervention est conduite par un personnel qualifié, en conditions contrôlées, afin de garantir à la fois le bien-être animal et la qualité des données produites.
Impact sur les animaux
Le modèle EAE utilisé dans ce projet entraîne inévitablement des effets indésirables, dont la nature, l’intensité et la durée varient selon la phase de la maladie induite et la sensibilité individuelle des animaux. Les premiers signes cliniques apparaissent généralement entre 8 et 14 jours après immunisation. Ils se traduisent initialement par une hypotonie de la queue, évoluant vers une faiblesse progressive voire paralysie des membres postérieurs, et dans les formes les plus sévères, des atteintes des membres antérieurs, voire un état prostré. Ces troubles neurologiques sont associés à une réduction significative de la mobilité, pouvant générer une inactivité prolongée. Des pertes de poids significatives sont régulièrement observées durant la phase aiguë de la maladie, liées à une réduction de la prise alimentaire et à l’état général affaibli de l’animal. Des troubles du comportement peuvent également apparaître, comme un repli social, une réduction de la toilette ou un stress accru lié à la manipulation ou à la douleur chronique. La durée des effets varie selon les procédures : dans les modèles aigus, les effets s’étendent sur environ 30 jours, tandis que dans les modèles rémittents, les effets peuvent s’étendre sur 45 jours avec une phase de rémission suivie d’une rechute. Tout au long de l’expérimentation, une surveillance clinique quotidienne est assurée selon une grille de score précise. En cas de dépassement des points limites prédéfinis, les animaux sont euthanasiés immédiatement. L’administration de molécules thérapeutiques peuvent engendrer des effets indésirables qui sont difficiles à anticiper. En effet, la plupart des molécules testées sont des molécules en cours de développement dont nous n’avons pas la connaissance. Les injections par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale peuvent entraîner une douleur légère et transitoire. Une surveillance clinique étroite permettra d’en adapter les modalités en fonction des réponses observées. La manipulation, l’administration de la sonde fluorescente et l’anesthésie pour l’imagerie non invasive par fluorescence peuvent provoquer du stress chez l’animal.
Devenir
A l’issue du protocole, les animaux seront mis à mort pour prélever le sang total et/ou pour prélever les tissus nerveux d’intérêt.
Remplacement
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’efficacité pharmacologique de nouvelles molécules ou formulations thérapeutiques dans un modèle murin de sclérose en plaques, en se concentrant sur les troubles moteurs et les douleurs neuropathiques associés à la pathologie. L’utilisation de modèles animaux de sclérose en plaques est incontournable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. De plus, si nous voulons préciser les mécanismes sous-jacents à son développement et l’efficacité de nouveaux développements ou molécules thérapeutiques, l’utilisation d’animaux vivants est, à ce jour, indispensable. Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro, ex vivo ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de la maladie chronique. Des approches alternatives sont toutefois intégrées dans la stratégie globale du projet : - Criblages préalables ex vivo (tests cellulaires sur lignées ou cultures primaires) sont réalisés pour évaluer la cytotoxicité, l’activité anti-inflammatoire ou neuroprotectrice des composés avant toute expérimentation in vivo. Ces tests permettent de réduire le nombre de candidats à tester chez l’animal. - Les données issues de modèles informatiques (in silico) et de banques de données moléculaires sont utilisées pour orienter la sélection des molécules candidates, en amont des procédures expérimentales. Cependant, ces approches ne permettent ni de reproduire l’interaction complexe entre système nerveux et système immunitaire, ni d’évaluer de façon fiable les manifestations cliniques fonctionnelles de la maladie (déficit moteur, sensibilité douloureuse, réponse à un traitement sur l’organisme entier). Ainsi, bien que la réflexion sur le remplacement des modèles animaux soit constante, les connaissances disponibles et les limitations techniques actuelles rendent l’utilisation de modèles murins vivants incontournable pour ce projet. Ces modèles sont, en outre, reconnus pour leur validité scientifique dans le domaine de la sclérose en plaques, et sont largement utilisés dans les recherches précliniques ayant conduit aux traitements aujourd’hui disponibles pour les patients.
Réduction
La stratégie d’expérimentation proposée est basée sur des expériences en mesures répétées (études longitudinales). Cette approche permet à chaque animal d’être son propre contrôle et d’être évalué à plusieurs reprises au cours du temps. Une approche statistique est envisagée par une comparaison des groupes d’animaux. Le nombre d’animaux sera de 10 par groupe de traitement (groupe d’animaux recevant une molécule à tester ou un traitement thérapeutique) et permet dans ces conditions d’obtenir une significativité suffisante pour conclure. L’utilisation d’imagerie sur animal vivant en suivi longitudinal permettra de préciser la nature des modifications physiologiques qui se mettent en place lors du développement de la pathologie et de limiter de manière significative le nombre d’animaux utilisés sur la durée. Les analyses post mortem des tissus prélevés en fin d’étude permettront d’optimiser les résultats obtenus in vivo et d’éviter les répétitions d’expériences. Cette stratégie globale vise à garantir une recherche de haute qualité scientifique tout en respectant les principes éthiques d’utilisation raisonnée des animaux.
Raffinement
Le principe de raffinement est intégré à chaque étape du protocole expérimental et repose sur une combinaison de mesures préventives, d’adaptations techniques et de suivi quotidien individualisé. Avant le début de la procédure les animaux bénéficient de séances d’habituation à l’environnement expérimental, au matériel et aux expérimentateurs. Ces périodes d’adaptation permettent de réduire le stress induit par les manipulations et de faciliter les évaluations comportementales. L’environnement d’hébergement est enrichi avec des matériaux adaptés (igloo, coton, accès facilité à la nourriture) afin de favoriser le confort, le repos et les comportements naturels, en particulier pour les animaux présentant un score clinique élevé. Les animaux sont suivis quotidiennement selon une grille d’évaluation fondée sur des critères comportementaux et physiologiques précis incluant l’état d’hydratation, la posture, la mobilité, la réactivité, l’aspect du pelage et la perte de poids. Cette grille permet une détection précoce des signes de souffrance et une prise de décision rapide quant à la poursuite de la procédure ou à l’application des points limites conduisant à l’euthanasie. La nourriture est adaptée à la condition de l’animal et fournie sous forme de gel pour faciliter la prise alimentaire même en cas de mobilité réduite. L’induction de la maladie et les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress. La manipulation est effectuée par un personnel expérimenté et formé spécifiquement aux procédures utilisées dans le cadre du modèle EAE. L’évaluation de la douleur neuropathique est restreinte aux animaux présentant des scores cliniques faibles afin de ne pas surcharger ceux qui présentent déjà un état avancé de la maladie. L’utilisation de techniques non invasives d’imagerie permet de limiter le nombre d’interventions et d’examens post mortem en suivant les mêmes individus tout au long de l’étude. Cette stratégie contribue à réduire l’inconfort global tout en préservant la qualité des résultats. Un comité de pilotage interne est chargé du suivi scientifique et éthique du projet. Il permettra d’intégrer de nouvelles méthodes de raffinement en fonction des avancées techniques ou des recommandations éthiques récentes. Une veille méthodologique active sera assurée afin d’adapter les procédures en continu et d’améliorer le bien-être animal sans compromettre les objectifs scientifiques.
Choix des espèces
La souris s’est rapidement imposée au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Dans le domaine particulier de la recherche fondamentale et appliquée sur la sclérose en plaques et les pathologies associées (déficit moteurs, douleurs neurogènes...), l’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces, (majoritairement chez la souris) pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales, l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine de la douleur aujourd’hui ont été évalués et validés. Des animaux adultes (8-12 semaines) seront utilisés dans ce projet. Il s’agit d’animaux adultes qui sont généralement choisis dans les études de pharmacologie et qui répondent bien à l’expérimentation. Tous les animaux auront le même âge au début de chacune des études. L’induction de la pathologie chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible, fournissant ainsi des résultats satisfaisants. Ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques.
Amélioration de la compatibilité donneur/receveur dans un modèle de greffe rénale
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Deux opérations chirurgicales à une semaine d'intervalle, dix prises de sang et neuf prélèvements d'urine sur animal éveillé : 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont les niveaux de souffrance déclarés vont du léger au sévère, une partie des animaux étant opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil. Une partie est tuée pour fournir des lymphocytes, une autre, transgénique, pour donner son rein, les dernières recevant la greffe puis le traitement à évaluer. L'objet déclaré est de valider une protéine chimérique censée bloquer le rejet humoral et élargir l'accès à la transplantation. Le porteur annonce des complications sévères possibles, mauvaise cicatrisation, saignement, infection du site de greffe, tout en affirmant que le rejet lui-même n'est pas douloureux "étant donné que le greffon n'est pas innervé".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque, respiratoire ou rénale terminale constituent des problèmes majeurs de santé publique. La transplantation d’organe est le meilleur traitement, car elle permet d’améliorer la qualité et la durée de vie des patients. Cependant, la morbidité et la mortalité des patients transplantés restent élevées. Cela s’explique notamment par une forme particulière de rejet d’organe, le rejet humoral. Ce dernier est causé par les lymphocytes B qui produisent des anticorps contre les protéines du donneur, exprimées à la surface des cellules de l’organe transplanté. Certains patients possèdent déjà des anticorps contre ces protéines avant la transplantation, parce qu’ils ont été exposés à du matériel génétique étranger à l’occasion d’une transfusion, d’une grossesse ou d’une précédente transplantation. Ces anticorps préexistants compliquent l’accès à la transplantation pour de nombreux patients. Certaines protéines du donneur, très répandues dans la population, sont souvent en cause, car elles sont communes à une grande partie de la population. Actuellement, la seule prise en charge possible de cette immunisation du receveur contre les protéines du donneur repose sur une immunosuppression globale, visant toutes les sous-classes des lymphocytes. Cette immunodépression massive expose le receveur à un haut risque d’infections et de cancers. En outre, certaines cellules productrices d’anticorps ne peuvent pas être ciblées par les thérapeutiques actuelles, ce qui explique l’efficacité médiocre des protocoles existants. Nous avons donc développé une nouvelle protéine chimérique qui permettrait de cibler toutes les populations de lymphocytes B de façon antigène-spécifique, tout en épargnant les lymphocytes qui ne sont pas impliqués dans la production des anticorps contre les protéines du donneur. Notre preuve de concept est que ce traitement avec la protéine chimérique est capable de cibler cette population cellulaire délétère dans un modèle murin d’immunisation in vivo. Dans la continuité de ce projet, nous allons étudier l’efficacité du traitement pour inhiber la réponse humorale et cellulaire contre le greffon dans un modèle murin de transplantation rénale. A la fin de chaque procédure, les animaux seront mise à mort pour prelever leur organes (cellules ou rein) pour la greffe ou pour l’analyse après opération.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra la validation préclinique d’une nouvelle thérapie moléculaire visant à prévenir et à traiter le rejet humoral, afin de faciliter l’accès à la transplantation pour les patients sur liste d’attente.
Procédures
Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - Souris donneuses de Lymphocytes B : 2 injections (15 secondes) et deux prélèvements sanguins (15 secondes) sur souris vigile. - Souris receveuse de lymphocytes B et greffe de rein : 1 injection de cellules (30 seconds), 4 injections de protéine chimérique (15 seconds), 10 prises de sang (10 seconds) et 9 prises d’urines (10 seconds) sur souris vigile, 2 opérations chirurgicales à une semaine d'intervalle (20 minutes chaque opération).
Impact sur les animaux
La greffe d’un organe vascularisé est une procédure délicate. Des complications engendrant des nuisances sévères éventuelles peuvent survenir au cours de la procédure de greffe, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site de la greffe. Ensuite, la complication attendue en cas de rejet du greffon est la perte de fonctionnalité de celui-ci, éventualité qui sera monitorée régulièrement et entrainera la fin de la procédure expérimentale. Ce phénomène de rejet de greffe, en l’absence de complications, n’est pas douloureux pour l’animal, étant donné que le greffon n’est pas innervé.
Devenir
Dans le projet décrit, les souris seront reparties ainsi: - 1ere procédure : les souris seront utilisées pour générer les lymphocytes dirigés vers une protéine du complexe majeur d'histocompatibilité humaine et vers l'ovalbumine. Ces souris seront mises à mort pour purifier le lymphocyte à transférer. - 2ème procédure : Souris transgéniques seront mise à mort pour donner leur rein. - 3ème procédure : Souris receveuse de lymphocytes B immunisants et puis de la greffe de rein. Elles seront mises à mort à la fin de l’expérimentation pour analyse ou lors d'un point limite.
Remplacement
Le rejet humoral nécessite le contact entre la circulation sanguine du receveur et le système vasculaire du donneur. Cette interaction ne peut être étudiée in vitro, et nous ne pouvons pas nous affranchir d’un modèle murin pour aller plus loin dans notre étude préclinique.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire et en utilisant des données préliminaires
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 4 ou 5 selon leur poids et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis. Une attention particulière sera portée au suivi des souris greffées (poids, protéinurie) et à la zone de chirurgie. Lors des chirurgies, les animaux sont injectés avec de la solution saline pour prévenir la déshydratation et un analgésique pour prévenir au mieux les douleurs inhérentes à la procédure de chirurgie. L’ensemble de la procédure de chirurgie est réalisé sur tapie chauffant et avec un champ opératoire et une désinfection préalable et post-chirurgie avec un antiseptique. Lors des mises à mort, une injection préalable de tranquillisant est réalisée pour limiter le stress au moment de la dislocation.
Choix des espèces
Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. Il s'agit d'un prérequis indispensable à toute application de nos approches à l’Homme. De plus, l'utilisation de souris permet l'accès aux modèles transgéniques qui, ici, nous permettent de répondre à des questions précises. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).
Régulation de la distribution leucocytaire par un récepteur activateur porté par les macrophages
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
L'extrémité de la queue coupée aux ciseaux chirurgicaux, des injections dans le ventre et quatre prises de sang espacées de trois à quarante-huit heures : 1 144 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour analyse post-mortem, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les nouveau-nés reçoivent une administration à deux et trois jours de vie, les plus âgées une administration par semaine. L'objectif tient en une phrase : tester le rôle d'un récepteur porté par des cellules immunitaires dans la répartition de ces cellules dans le corps. Ce qui est administré n'est jamais nommé, le gavage apparaît parmi les nuisances sans figurer parmi les procédures, et l'effectif de 1 144 animaux n'est adossé à aucun chiffre.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de tester le rôle d’un récepteur porté par des cellules immunitaires dans la distribution des cellules immunitaires dans le corps.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur le rôle d’un récepteur nommé RANK dans la distribution des cellules immunitaires entre les organes immunitaires et les tissues via le sang. Etant donné que la restriction du mouvement des lymphocytes s’exploite pour le traitement de maladies inflammatoires, ces résultats auront des retombées à long terme sur des applications biomédicales dans le traitement de maladies inflammatoires.
Procédures
Des souris nouveau-nés sont soumises à une administration à jour 2 et à jour 3 (durée < 1 min). Des souris juvéniles adultes sont soumises à une administration hebdomadaire (durée < 1 min). Les souris adultes sont soumises à une injection (durée < 1 min) par voie intrapéritonéale et à des prélèvements sanguins répétés. Chaque intervention est de courte durée (< 1 min) avec un potentielle douleur légère ne nécessitant pas d’anesthésie. Des prélèvements sanguins sont effectués 4 fois, avec un intervalle de 3h à 48h, chaque prélèvement dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Une douleur légère de courte durée peut être ressentie par l’animal lors du prélèvement de l’extrémité de la queue à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicale. Le geste dure moins d’une minute par animal. Le gavage, l’injection par voie intrapéritonéale et la prise de sang par la veine caudale peuvent être source de stress et de l’anxiété pour l’animal pendant quelques secondes.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la distribution des cellules du système immunitaire dans le corps ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être étudiés de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe social dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant un possible stress ou inconfort sont entrepris. Les point limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour connaitre la régulation de la distribution des cellules du système immunitaire entre les différents tissues via le sang et de mieux comprendre la fonction d’un récepteur dans ce contexte. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des mécanismes de contrôle de la distribution qui sont bien connues chez la souris et en plus semblent identiques à l’homme. De plus, la souris étant bien étudiée du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour ces travaux qui reposent sur des modifications génétiques. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux intervenir dans le développement du système immunitaire.
Impact d’une infection à Listeria monocytogenes du cerveau sur l’immunité cérébrale et la neurodégénérescence. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Les souris dont le score d'encéphalite atteint 4, ou qui perdent plus de 20 % de leur poids, sont mises à mort. 1 474 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une partie reçoit des Listeria directement dans le cerveau sous anesthésie, une autre subit l'induction d'une encéphalite auto-immune qui peut la paralyser sept à quinze jours, et un troisième groupe passe tous les quinze jours pendant sept mois un test de mémoire dans un labyrinthe et un test d'équilibre sur cylindre rotatif. L'identification de cibles thérapeutiques contre les troubles cognitifs qui suivent une infection cérébrale reste annoncée au conditionnel, quand la paralysie des membres et la perte de poids figurent, elles, au protocole.
Objectifs
Nous cherchons à définir l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur la santé cérébrale après l’infection. En effet, les altérations du système immunitaire cérébral sont susceptibles de favoriser ou au contraire protéger le cerveau contre des dommages ultérieurs, notamment les maladies neuronales et neurodégénératives telles que la sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson. Ce projet permettra à la fois d’étudier comment s’effectue la réparation du système immunitaire cérébral après la résolution d’une infection ainsi que les mécanismes menant à une sensibilité accrue ou diminuée aux futurs dommages neuronaux.
Bénéfices attendus
Sur un plan des connaissances scientifiques, nous chercherons à déterminer les rôles respectifs du système immunitaire cérébral (microglie) et périphérique (monocytes provenant du sang) dans la réponse aux infections du système nerveux central, ainsi que leur rôle dans l’apparition de troubles cognitifs après l’infection. La comparaison des séquelles neurologiques induites en présence ou absence de la microglie et/ou des monocytes permettra de mettre en évidence le rôle de chacune de ces populations immunitaires dans les séquelles neurologiques apparaissant après la guérison de l’infection. Nous chercherons à mettre en évidence les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’apparition de ces troubles cognitifs, pour comprendre comment les cellules immunitaires ayant joué un rôle dans la résolution de l’infection cérébrale (microglie ou monocytes recrutés) peuvent ensuite adopter un phénotype dommageable pour le bon fonctionnement cérébral. L’identification de ces mécanismes permettrait de mettre en évidence des cibles thérapeutiques utiles dans le traitement des séquelles neurologiques post-infectieuses.
Procédures
Procédure 1 : les animaux seront soumis soit à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), soit à une injection intracérébrale (Y COMPRIS UNE INJECTION DANS LE CERVEAU) sous anesthésie générale (durée d’environ 10 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Procédure 2 : les animaux seront soumis à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils subiront 1 injection cutanée et intrapéritonéale sous anesthésie gazeuse (générale, durée des 2 injections : environ 5 minutes) pour induire la réponse auto-immune, et une dernière injection intrapéritonéale (durée d’environ 30 secondes) pour achever l’induction de la réponse autoimmune, sur animal vigile. Procédure 3 : les animaux seront soumis à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils seront soumis à des tests cognitifs tous les 15 jours pendant 7 mois, consistant en un test de mémoire (trouver la bonne sortie parmi plusieurs qui se ressemblent, un test durant environ 30 minutes) et un test moteur (rester le plus longtemps possible sur un cylindre rotatif, durée d’environ 15 minutes).
Impact sur les animaux
Dans l’ensemble des procédures l’infection induit un degré de souffrance : perte de poids, « sickness behaviour » et atteinte cérébrale qui peut parfois induire des paralysies des pattes des souris. Dans la procédure n°1, un niveau de douleur modéré sera à prendre en compte suite à l’inoculation intracraniale de bactéries, qui sera pris en charge par antalgiques. L'INJECTION DE LISTERIA MONOCYTOGENES DANS DES REGIONS CEREBRALES SPECIFIQUES PEUT INDUIRE DES TROUBLES NEUROLOGIQUES LIE AU SITE D'INJECTION. LES SOURIS SERONT SURVEILLEES QUOTIDIENNEMENT AFIN DE DETECTER TOUT SYMPTOME NEUROLOGIQUE GRAVE. Dans la procédure n°2, l’induction d’encéphalite autoimmune est susceptible d’engendrer une perte de mobilité par paralysie des membres, d’une durée variable entre 7 et 15 jours selon la littérature. Dans la procédure n°3, au cours du vieillissement des souris de souche 5xFAD on notera l’apparition de signes associés à la maladie d’Alzheimer tels qu’une perte de mémoire et des capacités d’interaction sociale diminuée. Ces troubles apparaissent progressivement, à partir de 6 mois d’âge environ.
Devenir
Les procédures nécessitent toutes une mise à mort des animaux à la fin de la procédure afin d’étudier leurs organes par diverses techniques. Il n’y aura donc pas d’animaux laissés en vie à la fin du projet.
Remplacement
L’étude de l’interaction entre le système immunitaire et le fonctionnement du système nerveux central nécessite un hôte animal car les mécanismes d’interaction entre ces 2 systèmes cellulaires complexes ne peuvent pour l’instant pas être modélisés in vitro. En particulier pour comprendre les séquelles induites par une infection et les conséquences à long terme, il est absolument nécessaire de mener les études dans un hôte animal qui est capable de régénérer les tissus altérés.
Réduction
Pour l’observation du comportement des animaux, nous suivrons dans le temps les mêmes individus, ce qui permet 1) d’augmenter la puissance statistique de l’étude et 2) éviter de mettre à mort un animal après un unique test comportemental (sauf pour le test du labyrinthe de Barnes car les animaux s’habituent à ce test au fil du temps) . Pour les études de la réponse immunitaire au sein du cerveau, le cerveau des souris disséquées sera séparé en 2 hémisphères, un hémisphère étant utilisé pour l’analyse histologique par immunofluorescence et l’autre pour la cytométrie en flux. Cela permettra de diminuer par 2 le nombre de souris nécessaire pour ces expériences. Afin de vérifier que les 2 hémisphères cérébraux ne réagissent pas de manière différente à l’infection nous vérifierons l’absence de différence entre les analyses effectuées sur les hémisphères droits et gauches. Nous utiliserons également des souches de Listeria monocytogenes dites « fortement neuroinvasive » qui induisent de manière très reproductible une infection du système nerveux central après gavage. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux inoculés par rapport à l’inoculation des classiques souches de laboratoire de Listeria qui n’induisent une infection du système nerveux central que dans une petite proportion des animaux inoculés. Les effectifs des populations de souris auxquelles nous aurons recours sont établis en tenant compte des tests statistiques permettant d’obtenir une significativité du résultat obtenu (test de Mann-Whitney (deux groupes non appariés), Wilcoxon (deux groupes appariés) ou ANOVA (plus de deux groupes) pour les comparaisons de valeur avec faible effectif, se basant sur une distribution non gaussienne des résultats).
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. L’état général des animaux sera suivi. Les paramètres observés seront : poil ébouriffé, apparence corporelle/body condition, expression faciale/mouvement. Une aide à la thermorégulation sera mise en place dans toutes les cages pour éviter l’hypothermie : abri en carton, matériel de nidification (coton/papier) et chaufferettes. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) et mise à disposition d’eau gélifiée sera entreprise pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané). Les animaux présentant un état pathologique trop avancé (score de 2 pour un paramètre de la grille proposée par le comité d’éthique, ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou un score d’encéphalite ≥ 4) seront mis à mort. LES ANIMAUX SERONT EGALEMENT MIS A MORT EN CAS D'APPARITION DE SYMPTOMES NEUROLOGIQUES GRAVES SUITE A UNE INJECTION CEREBRALE STEREOTAXIQUE ET CEUX POUVANT AUSSI EMPECHER UNE ALIMENTATION ET UN ABREUVEMENT EFFICACES. La douleur induite par l’injection intracrâniale sera limitée en injectant les souris avec un antidouleur (buprénorphine) avant et après l’injection, qui se fera sous anesthésie gazeuse et en appliquant un anesthésique local sur la zone à injecter. Le stress induit par l’encéphalite autoimmune (paralysie → difficulté d’accès à la nourriture, de thermorégulation, de nettoyage) sera limité en multipliant les source d’accès à la nourriture et à de la gélose hydratante au niveau du sol de la cage, ainsi qu’en chauffant les cages avec des chaufferettes pour aider la thermorégulation des souris. Les animaux seront pesés le jour précédant l’infection puis, au minimum, à partir du jour 3 quand les animaux commencent à perdre du poids du fait de l’infection. La pesée aux deux premiers jours ne sera pas systématique et dépendra de l’état apparent de l’animal. Cela permettra de limiter les manipulations à un moment où les animaux ne perdent pas de poids d’après notre expérience.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire, un grand nombre d’outils et de lignées transgéniques ayant été développés pour étudier la réponse immunitaire des souris. Il s’agit également d’un bon modèle en neurosciences, les souris ayant certaines capacités cognitives suffisamment développées pour étudier l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur des fonctions neuronales ciblées pour ce mammifère. Nous utiliserons des souris adultes, pour ne pas interférer avec les phénomènes de neurodéveloppement dans notre étude. Les souris adultes seront âgées de 2 à 9 mois, les plus âgées (6 à 9 mois) seront utilisées pour 1) le suivi à long-terme des conséquences de l’infection, et 2) pour étudier le phénomène de neurodégénerescence dans les souris 5xFAD qui commencent à développer des troubles à partir de l’âge de 6 mois.
Etude du rôle protecteur des cellules dendritiques conventionelles de type 1 dans des modèles murins de cancer du sein
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Injectées dans la glande mammaire, dans la veine ou derrière l'œil, 1 826 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Une partie reçoit des cellules tumorales, dont la croissance peut gêner les déplacements et faire ulcérer la peau, et la taille de la tumeur est mesurée de façon répétée sous anesthésie. Il s'agit de comprendre comment une catégorie de cellules immunitaires, les cellules dendritiques de type 1, coordonne la défense contre le cancer du sein. Le porteur écrit que les interventions se limitent à des manipulations courtes réalisées sous anesthésie, tout en déclarant pour une partie des animaux un niveau de souffrance sévère.
Objectifs
Ce projet prolonge un travail précédent qui vise à mieux comprendre comment certaines cellules du système immunitaire, appelées cellules dendritiques de type 1, aident le corps à se défendre contre le cancer. Ces cellules ne détruisent pas directement les cellules cancéreuses. Leur rôle est plutôt de coordonner la réponse immunitaire, un peu comme un chef d’orchestre. Elles activent d’autres cellules du système immunitaire, notamment : • Des globules blancs capables de tuer les cellules cancéreuses ; • D’autres cellules qui participent aussi à cette défense. Sans elles, le système immunitaire a plus de mal à repérer et attaquer les tumeurs, même avec l’aide de traitements comme l’immunothérapie. Leur rôle important a été démontré dans des études chez l’animal, et des recherches chez des patients, notamment atteints de cancer du sein, suggèrent qu’elles peuvent aussi avoir un effet protecteur. Des traitements qui ciblent ces cellules sont actuellement en test, et les résultats sont prometteurs. Ces cellules sont efficaces car elles montrent aux globules blancs ce qu’ils doivent attaquer, en leur présentant des fragments de cellules cancéreuses, appelés antigènes. Elles envoient aussi des messages chimiques qui attirent d’autres cellules immunitaires vers la tumeur et les aident à mieux fonctionner. Mais certaines questions restent encore sans réponse : • Comment aident-elles les globules blancs à s’installer dans la tumeur ? • Ont-elles aussi un effet sur d’autres cellules immunitaires ? Pour y répondre, nous utilisons des modèles expérimentaux chez la souris, dans lesquels nous induisons le développement de tumeurs en injectant des cellules cancéreuses. Ces outils nous permettent de : 1. Voir si ces cellules aident les globules blancs à bien se positionner pour attaquer la tumeur ; 2. Comprendre comment elles les activent ; 3. Étudier si elles influencent aussi d’autres cellules impliquées dans la défense contre le cancer. En comprenant mieux leur fonctionnement, nous espérons contribuer au développement de traitements anticancéreux plus efficaces et mieux ciblés.
Bénéfices attendus
Notre projet identifiera à court terme chez la souris des marqueurs, groupes de gènes et mécanismes associés aux fonctions protectrices des celles dendritiques conventionnelles de type 1 contre le cancer. Leur conservation chez l’homme sera évaluée en déterminant leur valeur pronostique par réanalyse des données publiques provenant de patientes atteintes de cancer du sein. Cela pourrait nous aider à identifier de nouvelles caractéristiques des réponses immunitaires associées à une évolution plus favorable de la maladie et à mieux comprendre comment cela fonctionne. Une autre étape importante sera à moyen terme de transposer les résultats obtenus chez la souris aux cellules humaines. Pour ce faire, nous allons utiliser nos techniques de culture de cellules souches humaines, qui nous permettent de générer et de manipuler en laboratoire un grand nombre de cellules dendritiques de type 1. Ces recherches devraient nous aider à mieux comprendre comment ces cellules fonctionnent chez l’homme et comment elles peuvent être exploitées pour améliorer les traitements du cancer, notamment dans le cadre du développement de vaccins thérapeutiques basés sur l’activation optimale de la réponse immunitaire antitumorale.
Procédures
Les interventions prévues dans le cadre de ce projet se limitent à des manipulations courtes, réalisées sous anesthésie, et classées au-dessus du seuil réglementaire. Elles sont décrites ci-dessous. Les animaux recevront une ou plusieurs injections d’anticorps et/ou de cellules, effectuées sous anesthésie générale dont la durée est inférieure à une minute. Certaines souris recevront également une injection unique de cellules tumorales, réalisée sous anesthésie générale. Cette intervention, d’une durée d’environ cinq minutes. Au cours du suivi expérimental, la mesure de la taille tumorale sera réalisée de manière répétée, sous anesthésie légère. Cette manipulation, très brève (quelques secondes), permet de suivre l’évolution de la tumeur tout en limitant le stress pour l’animal.
Impact sur les animaux
L’anesthésie utilisée pour les injections dans les souris est de courte durée (5 minutes). Elle est appliquée avant des injections dans la glande mammaire ou intraveineuse. Cela peut provoquer un léger stress pendant quelques secondes. Dans de rares cas, surtout avec une certaine lignée de cellules tumorales, la taille de la tumeur peut gêner la mobilité des souris et présenter des signes d’ulcération au niveau de la tumeur..L'injection dans la veine située derrière l'œil, même sous anesthésie peut causer de la douleur legère de courte durée qui sera réduit au minimum à l’aide d’un anesthesiant local.
Devenir
Dans le but de réaliser les analyses histologiques, immunologiques et moléculaires sur les différents organes d’intérêt, la mise à mort des animaux est nécessaire afin de permettre leur prélèvement. Cette étape est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Au total, l'ensemble des animaux du projet sera concerné.
Remplacement
Ce projet nécessite de mesurer différents éléments de la réponse du système immunitaire lors de la lutte contre le cancer. Les interactions entre les cellules du système immunitaire entre elles et avec les cellules tumorales sont très nombreuses et complexes, et pour mieux les comprendre il est indispensable de les étudier dans des modèles in vivo et aucun modèle in vitro ou ex vivo disponible à l’heure actuelle ne permet d’étudier la complexité des interactions (mobilisation et activation) entre cellules dendritiques et autres cellules de l’immunité.
Réduction
Le nombre de souris pour chaque groupe et chaque procédure a été soigneusement calculé en cohérence avec les principes éthiques de réduction, c’est-à-dire pour ne pas être excessif, mais être suffisant à permettre une analyse statistique fiable des résultats, en fonction de notre expérience sur la variabilité des réponses au sein de chaque groupe expérimental et entre groupes.
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, ceux-ci seront maintenus en groupes sociaux stables, formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Les injections de molécules ou de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie gazeuse de facon à limiter au maximum le stress des animaux. L’apparence des animaux et leur activité, la taille de la tumeur , seront observées quotidiennement et le poids des souris mesuré tous les 3 jours, afin de determiner un score permettant de d’identifier de manière précoce et prédictive des signes de souffrance et mettre en places de mesures correctives adéquates comme l’accès à la nourriture et à l’eau facilité grâce à la mise à disposition de gel diététique, l’ajout d’enrichissements supplémentaires pour nidation, une fréquence d’observation augmentée, ou une mise à mort précoce. L’ensemble des manipulations réalisées sur animaux vigiles (examen du site d’injection, suivi du poids) sera realisé par du personnel compétent et experimenté afin de réduire au maximum le stress lié à ces gestes.
Choix des espèces
Les souris sont le modèle idéal pour ce type d'études parce qu'elles se reproduisent rapidement, ont une taille pratique pour les expériences, et leur génétique est bien connue. Pour les recherches que nous prévoyons, il est parfois nécessaire d'utiliser des souris génétiquement modifiées. Le corps des souris fonctionne de manière assez similaire à celui des humains, ce qui permet de transposer les conaissances acquises sur le fonctionnement chez l’Homme. Des souris âgées de 8 à 15 semaines seront utilisées car elles ont un système immunitaire mature et leurs glandes mammaires sont pleinement développées. Pour éviter que des différences d’âge ne faussent les résultats, nous veillons à ce que l'écart d'âge entre les souris d'un même groupe ne dépasse pas 2 semaines.
Identification des gènes bactériens du méningocoque nécessaires à la colonisation vasculaire dans un modèle murin humanisé par xénogreffe de peau.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Sévèrement immunodéficientes, donc très sensibles aux infections, les 275 souris de ce projet reçoivent une greffe de peau humaine sur le dos, à la place d'un morceau de leur propre peau. Elles vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance sévère et toutes tuées à l'issue. Après une chirurgie de trente minutes, sept jours de bandage qui gêne leurs mouvements et quatre semaines d'attente, elles sont infectées au méningocoque dans un tube de contention, et développent une septicémie qui les fait passer d'une baisse d'activité à la prostration en seize heures. Le porteur précise qu'elles ne peuvent être ni réutilisées, ni replacées, ni adoptées, parce qu'elles portent de la peau humaine et une infection.
Objectifs
Le méningocoque est une bactérie pathogène de l’homme responsable de septicémies (infections généralisées) et de méningites (infections du système nerveux). Ces infections graves sont souvent associées à des séquelles importantes, et restent parfois mortelles (10-20% des cas) malgré les traitements disponibles. Le pouvoir pathogène du méningocoque réside dans sa capacité à « coloniser » les vaisseaux sanguins humains. Après 24 à 48 heures, ce processus aboutit à la destruction du vaisseau colonisé. Nous cherchons à étudier la colonisation vasculaire, étape cruciale lors de ces infections. Nous nous intéressons notamment à deux phénomènes : aux gènes bactériens nécessaires à la colonisation vasculaire ainsi qu’à l’environnement rencontré par la bactérie lors de la colonisation. 2 objectifs imbriqués sont attendus pour ce projet : 1) L’identification des gènes importants pour la colonisation vasculaire à des temps d’infection court et long 2) La validation de ces gènes L’identification des gènes importants pour la colonisation passe par la réalisation d’une analyse des 1600 gènes non essentiels de la bacétrie après passage dans notre modèle animal. La validation des gènes importants sera réalisée via des expériences de compétition individuelle entre la souche d’intérêt et deux souches de contrôle dans notre modèle animal. Nous espérons qu’une meilleure compréhension des mécanismes d’infection permettra l’amélioration des traitements disponibles.
Bénéfices attendus
Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est à ce jour le seul et unique modèle murin permettant de reproduire chez la souris les grandes caractéristiques des infections invasives à méningocoque observées chez l’homme, à savoir la fixation et la multiplication des bactéries sur la paroi des vaisseaux sanguins, entrainant le déclenchement d’une septicémie. A court et moyen terme, ce projet nous permettra : • D’étudier les déterminants bactériens impliqués dans la mise en place du phénomène de colonisation vasculaire • De mieux caractériser l’environnement dans lequel la bactérie évolue lors de l’infection A long terme nous espérons que ce projet permettra l’amélioration des traitements des infections invasives à méningocoques chez l’homme en permettant une prise en charge précoce plus efficace.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans cette étude sont greffés avec de la peau humaine. Le greffon est implanté sur le dos de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale d’une durée d’environ 30min réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux portent un bandage pour protéger le greffon pendant 7 jours. Une fois les bandages enlevés et au minimum 4 semaines après l’implantation du greffon, les animaux seront utilisés dans 1 type d’expériences : des expériences où les animaux sont infectés par l’injection de bactéries. Les injections se feront sur des animaux vigiles placé dans un tube de contention pendant 2min. Les animaux sont infectés pendant 6 ou 16 heures puis une ponction de sang. La souris est immobilisée pendant 2 minutes.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des différentes procédures expérimentales présentes dans ce projet : • du fait de leur degré d’immunodéficience sévère, ces animaux sont très sensibles aux infections • le retrait d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine est une chirurgie qui entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. • La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. • Lors des expériences d’infection par le méningocoque, les animaux infectés par l’injection de bactéries développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (plus de 24h post-infection). L’introduction de l’aiguille lors de l’injection entraine une douleur légère de courte durée. Nos procédures ne dépasseront pas 16h post-infection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils sont greffés avec de la peau humaine et infectés par le méningocoque.
Remplacement
Du fait de la spécificité du méningocoque pour les cellules humaines, la majorité des études portant sur cette bactérie utilise des cultures in vitro de cellules humaines infectées, sur lesquelles la bactérie peut se fixer. Il est cependant encore impossible de reproduire in vitro la complexité et dynamique du système vasculaire et son interaction avec le système immunitaire. Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est le seul à ce jour à fournir ce niveau de complexité et représente donc un modèle de choix pour l’étude des infections invasives à méningocoque.
Réduction
Le calcul des effectifs des groupes d’animaux de cette étude s’est fait sur la base du retour d’expérience d’une précédente étude où nous avons pu identifier plusieurs causes potentielles de perte d’animaux lors de nos expériences, ainsi qu’avec l’expertise de biostatisticiens : 1. Une mort prématurée lors de la chirurgie de greffe de peau : hémorragie, non réveil de l’animal 2. Une mauvaise évolution du greffon au cours du temps conduisant à l’exclusion de l’animal : lésions de grattage, diminution importante de la taille 3. Une mauvaise qualité du greffon : présence de peu de vaisseaux humains 4. Une mort prématurée de l’animal lors des infections Une étude pilote sera réalisée sur 5 animaux, pour optimiser la technique de séquençage. Une étude pilote sera également mise en place pour confirmer la taille du goulot d’étranglement, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. Cette étude repose sur 10 souris utilisées dans une procédure sévère d’infection du modèle murin. Les 1600 gènes non essentiels sont testés pour le criblage par groupes de 400 souches bactériennes, en raison des limitations de notre modèle animal. La variabilité technique conduit à ce qu’une souche bactérienne se retrouve dans le sang dans 80% des cas. Nous pouvons estimer que le nombre nécessaire d'animaux est de 80 par groupe. La procédure nécessite donc un effectif total de 160 animaux, afin de mesurer des effets de taille forts à très forts. Concernant la validation individuelle des gènes candidats établis précédemment, nous supposons ici que les effets à chercher sont forts. Pour un gène candidat, 5 souris seront suffisantes. Nous estimons que 10 gènes bactériens apparaitront comme nécessaires à la colonisation bactérienne, après le criblage haut débit. Cela nous conduit donc à estimer pour cette procédure un effectif total de 50 animaux. Toutes les procédures conduisant à la mise à mort des animaux, aucune des procédures ne permet la réutilisation d’animaux.
Raffinement
Souris immunodéficientes Les animaux immunodéficients étant considérés comme ayant un « phénotype dommageable », ceux-ci seront hébergés dans une animalerie au statut sanitaire adapté. Xénogreffe de peau humaine : Utilisation d’antalgique avant la chirurgie. La chirurgie (~30 min) est réalisée sur des animaux anesthésiés, et les animaux placés sur un tapis chauffant (37°C) pour éviter la baisse de leur température corporelle. Avant de placer les animaux greffés dans leur cage de réveil, ceux-ci sont réhydratés par une injection de sérum physiologique. Les animaux sont ensuite placés dans une cage de réveil, propre et placée sous une lampe chauffante. Un gel de réhydratation enrichi en sucres est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie. Si des signes de souffrance persistent 2 jours après la chirurgie malgré le traitement (poils hérissés, changements d’expressions faciales, abattement, perte d’activité …), les animaux sont mis à mort. Les animaux sont évalués quotidiennement les 5 premiers jours suivant la chirurgie pendant le port de leur bandage afin de détecter des signes éventuels de souffrance et vérifier l’intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l’animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie. Si l’animal a détérioré son bandage et lésé le greffon de peau humaine, l’animal est mis à mort. Une fois le bandage enlevé, l’évolution des greffons est suivie hebdomadairement pendant 4 semaines. Infection par le méningocoque : Les animaux infectés ont ensuite placés dans des cages contenant des gels de réhydratation enrichi en sucres et dont la moitié du sol de la cage est chauffé à l’aide de chaufferettes pour aider au maintien de la température corporelle des animaux infectés. Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérience. Hébergement : Les animaux ayant subi une xénogreffe de peau humaine sont hébergés au nombre de 4 maximum par cage dans des cages contenant du coton et un igloo.
Choix des espèces
Cette étude utilise des souris car le système vasculaire de la souris est proche du système vasculaire humain. De plus les modèles immunodéficients disponibles chez cette espèce en font le modèle le choix pour la xénogreffe de peau humaine. Les greffes de peau humaine sont réalisées chez des souris adultes immunodéficientes âgées de 6 à 12 semaines, période pendant laquelle la prise du greffon est maximisée selon nos observations. Les expérimentations sont ensuite réalisées 4 semaines minimum après la chirurgie, période nécessaire à une bonne prise du greffon.
ATOPID : impact d’un déficit immunitaire sur la dermatite atopique et la marche atopique, Etude de la marche atopique chez les souris DOCK8-/-
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
Anesthésiées quinze minutes, rasées, la peau du dos abrasée au ruban adhésif, 360 souris reçoivent chaque jour pendant quatorze jours un patch chargé d'ovalbumine, la protéine de l'œuf. Une partie d'entre elles porte l'inactivation du gène DOCK8, qui altère leur système immunitaire et sert ici à modéliser un eczéma d'enfant. S'ajoutent un gavage oral et un isolement de vingt minutes pour la récolte des fèces, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, avec démangeaisons, rougeurs, œdème, lésions de grattage et inflammation possible de l'œsophage. Toutes sont tuées à la fin, organes et fluides prélevés pour mesurer les biomarqueurs de l'eczéma et de l'allergie alimentaire, et "valider nos modèles".
Objectifs
Les déficits immunitaires monogéniques sont des maladies génétiques induisant une altération du fonctionnement du système immunitaire (susceptibilté aux infections, auto immunité, cancers, allergies) Les déficits immunitaires avec allergie désignent une sous-catégorie de déficits immunitaires primitifs rares associés à des manifestations allergiques (eczéma, allergies alimentaires, asthme). Sur les 500 déficits immunitaires répertoriés, environ 50 gènes liés aux déficits immunitaires avec allergie ont été décrits, les plus fréquents incluent le déficit en STAT3 (syndrome de Job-Buckley), DOCK8, WAS, et IPEX . Outre les allergies, les déficits immunitaires avec allergie se manifestent par des infections potentiellement graves, des maladies auto-immunes, cancers, retards de croissance et anomalies osseuses et du tissu conjonctif. Ces déficits restent souvent sous-diagnostiqués, surtout lorsque les signes se limitent à une manifestation allergique isolée sans infection. Le retard diagnostique peut avoir des conséquences importantes sur le pronostic de ces patients en retardant une prise en charge adaptée (antibioprophylaxie, greffe) et en aggravant éventuellement le risque infectieux. L’eczéma associé aux déficits immunitaires avec allergie semble souvent précoce mais ses caractéristiques cliniques et sa physiopathologie sont mal connus. En particulier, les différences entre l’eczéma associé aux deficits immunitaire et l’eczema classique ne sont pas connues ainsi que les différences concernant la survenue d’autres manifestations allergiques (asthme, allergie alimentaire, marche atopique= survenue successive de manifestations allergiques au cours du temps : eczema, asthme, allergie alimentaires). Une meilleure connaissance de la l'eczema associé aux deficits immunitaires permettrait un diagnostic plus précoce des deficits immunitaires avec allergie (en particulier au sein de la population atteinte d'eczema) et une meilleure compréhension des mécanismes de la marche atopique dans les déficits immunitaires et l'eczema atopique. L’objectif de ce projet est de déterminer si le deficit immunitaire impacte la sévérité et la physiopathologie de l'eczéma et de la survenue d'allergie dans un modèle murin DOCK8 -/-.
Bénéfices attendus
Nous espérons mettre en évidence les caractéristiques cliniques, les mécanismes fondamentaux et les biomarqueurs associés à l’eczéma associé aux déficits immunitaires, ainsi que la sévérité et l'évolution des manifestations allergiques associées (allergie alimentaire, marche atopique). Cela permettra de mieux identifier les enfants atteints de déficit immunitaire, de les dépister plus précisément, et de faciliter une prise en charge plus ciblée (traitements systémiques ciblés, allogreffe de moelle).
Procédures
Anesthésie (15 min), rasage (5 min), tape striping (1 min) application journalière pendant 14 j, d’un patch contenant l'allergène de l'oeuf (ovalbuline) (5 min) isolement pour la récolte des feces (20 min) gavage oral (2 min)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont la gêne liée la présence d’un patch sur le dos qui peut induire des grattages, les symptômes liés à la mise en place de la DA (démangeaisons, rougeurs, oedème et lésions de grattage), les anesthésies gazeuses peuvent induire une hypothermie, une hypotension, une hypoventilation ou une hypoxémie, les gavages oraux peuvent induire une inflammation de l’œsophage
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation. Leurs organes et fluide biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l'eczéma atopique ou de l'allergie alimentaire et ainsi de valider nos modèles.
Remplacement
Dans le cadre de l’étude de l'eczéma atopique (DA), il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales (peau, intestin, poumon).
Réduction
En effectuant un test de puissance , nous avons besoin de 12 animaux par groupes afin d’obtenir un score de sévérité de la DA (three item severity score (TIS) statistique et avoir assez de matériel biologique pour effectuer des coupes histologiques et des mesures des biomarqueurs immuns de la DA dans la peau et dans le serum. De plus, ce nombre d'animaux permettra d'obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d'analyses statistiques .
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Les interventions ( rasage, tape stripping et patch) seront réalisées sous anesthésies. L’évaluation des points limites sera réalisée quotidiennement tout au long de l'étude et est basée sur la présence de signes cliniques notables et sévères . En présence de 3 signes cliniques notables ou 1 seul signe clinique sévère, le responsable service du bien être animal et le responsable de l’étude analyseront l’animal et prendront la décision de laisser l’animal au sein du protocole en accord avec la cellule du bien-être animal ou de procéder à la mise à mort de l'animal
Choix des espèces
Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur l'eczéma atopique en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la peau, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de l'eczema, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris sensibilisées avec des allergènes spécifiques permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Les souris seront âgées de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à l'eczema chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie.
Évaluation d’un anticorps ciblant les cellules sénescentes et la réponse immunitaire dans des modèles de vieillissement pulmonaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Laissées vieillir jusqu'à dix-huit ou vingt et un mois, les souris de ce projet développent tumeurs, fibroses rénales, cataractes, alopécies et plaies cutanées, et le porteur anticipe qu'un cinquième d'entre elles mourra de mort naturelle avant la fin. 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes. Chacune reçoit six injections en trois mois, trois prélèvements sanguins de 200 microlitres, trois collectes d'urine, de fèces et de poils, et douze pesées. Des points limites précoces sont annoncés dès les premiers signes de souffrance, alors que la dégradation liée à l'âge constitue ici le matériau même de l'expérience.
Objectifs
Ce projet fait partie d'une étude plus globale de caractérisation du rôle d’une réponse immunitaire face à des cellules abîmées ou stressées par le vieillissement dites sénescentes. Nous avons observé que bloquer un composé présent sur les cellules sénescentes par un anticorps avait un effet bénéfique sur la survie des animaux et le développement des maladies liées à l’âge, notamment la fibrose pulmonaire. Cet effet est conservé jusqu’à un an après l’arrêt du traitement. Le sujet de cette étude est de comprendre le mécanisme de maintien de l’effet vaccinal induit par cet anticorps.
Bénéfices attendus
Par cette étude on s’attend à avoir une meilleure compréhension mécanistique des interactions entre le système immunitaire et les cellules sénescentes au cours du vieillissement. Cela pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement les cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âge incluant le cancer. Les résultats de cette étude devraient nous permettre de mieux développer l’anticorps et d’envisager des essais cliniques de phase précoce chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injections: chaque animal recevra 6 injections, réalisées toutes les deux semaines pendant une durée de 3 mois. Prélèvements sanguins : chaque animal fera l’objet de 3 prélèvements de 200 µL, réalisés une fois par mois pendant la durée de l’étude (3 mois). Collecte d’urine, de fèces et de poils : chaque animal sera soumis à une collecte mensuelle, soit 3 collectes au total. Pesées : chaque animal sera pesé une fois par semaine, soit 12 pesées sur la durée de l’étude. Ces interventions sont réalisées sur l’ensemble des 200 animaux inclus dans le projet.
Impact sur les animaux
Le phénotype âgé favorise l’apparition de nombreuses maladies. Entre 18 et 21 mois, nous anticipons une perte de 20 % des animaux par mort naturelle. Les souris âgées peuvent ainsi développer : des tumeurs, de la fibrose rénales, des cataractes, des alopécies et des plaies cutanées Les injections peuvent provoquer une très légère douleur et de l’inflammation sur le site d’injection et l’animal peut ressentir un stress au moment de la contention.
Devenir
Afin de caractériser l'effet de notre vaccination notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les différents organes des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder à l’euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire, cellulaire et histologique est indispensable pour évaluer les effets de notre anticorps sur le vieillissement cellulaire.
Remplacement
Nous avons montré in vitro que certaines cellules sénescentes (cellules stressées ou endommagées qui s’accumulent avec le vieillissement) produisent des molécules capables de bloquer l’action du système immunitaire. L’utilisation d’un anticorps spécifique a permis de restaurer cette action et de limiter le développement de la fibrose, avec un effet bénéfique sur la survie des souris. Ces résultats ont été observés à la fois dans des modèles de fibrose induite et chez des souris âgées. Ces expériences ont permis d’identifier les doses efficaces et le bon moment d’action de l’anticorps. Nous souhaitons désormais comprendre comment ce traitement agit dans un organisme complet, en particulier chez des animaux âgés, où les cellules sénescentes apparaissent naturellement. Les interactions entre cellules immunitaires et cellules sénescentes sont complexes et impliquent plusieurs organes. Aucune méthode in vitro ne peut reproduire cette complexité. Seule une étude chez l’animal permet de savoir si le traitement réduit bien la présence de cellules sénescentes, réactive le système immunitaire, et limite les maladies liées à l’âge tout en améliorant la santé à long terme.
Réduction
Pour cette étude, nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer une taille d'effet attendue et ajuster en conséquence le nombre d'animaux nécessaires en utilisant des données préliminaires. Cela garantit des résultats fiables, tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Nous mettons en place plusieurs mesures pour réduire la douleur, le stress et la souffrance : Suivi quotidien : Les animaux seront observés chaque jour à l’aide d’une grille clinique. En cas de dégradation de leur état, la fréquence du suivi sera augmentée. Cohésion sociale : Les animaux seront hébergés par petits groupes compatibles, afin de préserver leur bien-être social tout au long de l’étude. Habituation : Une phase d’habituation à la manipulation est prévue avant les interventions, afin de limiter le stress lors des gestes expérimentaux. Points limites précoces : Des seuils d’arrêt clairement définis seront appliqués dès l’apparition des premiers signes de souffrance, pour éviter toute douleur inutile. Suivi longitudinal : Un suivi dans le temps permettra de détecter précocement d’éventuels signes de mal-être, notamment par le contrôle du poids, du comportement et de l’état général. Alimentation adaptée : En cas de difficultés de déplacement ou de prise alimentaire, de la nourriture humidifiée sera mise à disposition directement dans la cage. Utilisation d'une méthode d'anesthésie (la plupart des animaux expérimentaux). Enrichissements supplémentaires : matériaux à manipuler (copeaux de bois compacts) et des objets à déplacer (bâtonnets) Toutes ces mesures sont mises en place pour limiter la souffrance, améliorer le confort des animaux, et garantir des conditions expérimentales éthiques et rigoureuses.
Choix des espèces
Le modèle murin a une physiologie proche de l’homme (squelette osseux, poumons) et un cycle de vie relativement court. Chez la souris, les mécanismes de réparation et de dérégulation de la physiologie des tissus sont très bien décrits. Ils permettent une analyse précise de l'ensemble des phases mises en jeu au cours de ces évènements biologiques. Le modèle murin choisi est le seul nous permettant une approche intégrative des processus impliqués dans les maladies liées à l’âge. En effet, il permet d’étudier de façon concomitante les cellules immunitaires, les cellules sénescentes et l’avancement des maladies.