Système immunitaire

Une injection dans l'abdomen déclenche chez les souris une spondylarthrite qui gagne les poignets et les chevilles, avec des douleurs, une perte de poids et un rythme jour-nuit désorganisé. 218 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit les gestes en secondes, l'injection dure moins de dix secondes, les contentions hebdomadaires quelques minutes, quand la maladie installée, elle, dure des semaines. Il écrit lui-même que les symptômes avancés ne permettent pas une vie dans de bonnes conditions, ce qui justifie selon lui la mise à mort de tous les animaux, par ailleurs commandée par les examens post mortem.

Objectifs

Les spondylarthrites sont un groupe de maladies inflammatoires qui comprennent l’arthrite réactionnelle, rhumatisme déclenché à la suite d’infection bactérienne (Chlamydia …), la spondylarthrite ankylosante (rhumatisme caractérisé par une ankylose progressive du rachis), le rhumatisme psoriasique et d’autres. Les spondylarthrites touchent 0,5 à 2 % de la population mondiale et se manifestent par des inflammations rachidiennes, articulaires, et extraarticulaires : psoriasis, uvéite et maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Une inflammation intestinale infraclinique a été décrite chez près de 60% des patients avec une spondylarthrite ankylosante. Nos objectifs scientifiques à long terme sont de mieux caractériser les mécanismes de l'immunité mis en oeuvre lors de la progression de la maladie, de proposer et de valider de nouveaux moyens de traitement. A plus court terme, nous étudions l'effet du microbiote et de l’immunité intestinale sur la progression de la maladie.

Bénéfices attendus

Le mécanisme des spondylarthrites humaines implique une interaction entre des prédispositions génétiques et des facteurs déclencheurs durant la vie comme des infections. Les bactéries de l'intestin produisent des substances qui modifient les cellules de l'immunité impliquées dans la spondylarthrites. Afin d’explorer les relations de cause à effet entre les bactéries du tube digestif, les prédispositions génétiques et la progression des spondylarthrites, nous utiliserons des aliment avec prébiotique. Nous explorerons l'immunité de nos souris. Cela permettra à long terme la recherche de nouveaux moyens de prévenir ou traiter les spondylarthrites.

Procédures

L’induction de la maladie se fait par une injection dans l’abdomen qui prend moins de 10 secondes lors d'une contention de moins d'une minute. Il pourra y avoir jusqu’à deux prises de sang la première semaine et une les semaines suivantes, avec la même durée que pour l'injection précédemment décrite. La pesée, le prélèvement de crottes, la mesure du diamètre des articulations demandent des contentions une fois par semaine de quelques minutes.

Impact sur les animaux

La progression des lésions d’arthrite, principalement au niveau des poignets et des chevilles entraine des douleurs et des contraintes de niveau modéré, accompagnés d’une perte de poids et d’une perturbation du rythme d’activité entre le jour et la nuit. L’induction de la maladie se fait par une injection sous cutanée ou dans l’abdomen. Il pourra y avoir jusqu’à deux prises de sang la première semaine et une les semaines suivantes, avec des douleurs et contraintes qui durent quelques minutes. La pesée, le prélèvement de crottes, la mesure du diamètre des articulations demandent des contentions une fois par semaines de quelques minutes. Les études sur le microbiote peuvent provoquer des désagréments digestifs.

Devenir

La très grande majorité de nos expériences comprennent des examens post mortem afin d'obtenir le maximum d'information des expériences. De plus les symptômes de la spondylarthrite avancée ne permettent pas une vie dans de bonnes conditions. Donc la mise à mort concerne tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Comme remplacement partiel, les effets de la prédisposition génétique sont étudiés ex vivo sur des prélèvements post-mortem de souris issues de notre élevage et auxquelles nous n’avons induit la maladie. Une partie des effets des produits des bactéries est étudié in vitro, avec un fermenteur de bactéries et des cellules de l'immunité en culture. Enfin, la mise au point des tests enzymatiques et bactériens pour l’analyse des échantillons se fait in vitro. Sinon, les spondylarthrites sont des maladies complexes qui font intervenir des facteurs génétiques, un déclencheur, et un emballement immunitaire qui s’attaque aux organes ciblés dont les articulations. Ce processus ne peut pas pour l’instant être modélisé en dehors d’un animal.

Réduction

Dans nos expériences avec un suivi clinique, grâce à des calculs basés sur nos données statistiques passées, nous incluons le nombre minimal d’animaux qui permette de détecter avec des chances raisonnables l’effet d’un traitement par nos tests. Le geste technique de mesure des diamètres des articulations est toujours réalisé par la même personne afin de réduire la variabilité de cette mesure. Pour nos expériences courtes qui explorent des mécanismes avec des effets de type tout-ou-rien, le nombre de répétition est réduit entre 4 et 6, en accord avec le type de test statistique utilisé pour valider.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions sanitaires contrôlées qui font que leur déficit immunitaire n’est pas un handicap. Seuls les prélèvements, injections et tests en rapport avec la question scientifique seront faits durant une expérience, et ils seront couplés de façon à ne manipuler les souris qu'un nombre minimal de fois par semaine. Les prises de sang seront faites sous anesthésie générale volatile ou après administration d’un antalgique. La manipulation de nos animaux avant l’induction de la maladie nous permet de les habituer à la pièce d'animalerie, à notre passage et aux manipulations. Cela permet d’avoir des données de références, de diminuer le stress de nos animaux lors des contentions et aux animaux de s’adapter à leurs nouveaux locaux. Les souris sont ramenées dans leur litière et groupe d'origine après chaque intervention. Le geste technique de mesure des diamètres est toujours réalisé par la même personne afin que les souris soient habituées à cette manipulation contraignante et afin de réduire cette durée de contention. Des points limites sont mis en place et des mesures de raffinements sont mises en place selon des critères intermédiaires de cette grille. Notamment, selon ces critères, une alimentation riche et humide leur sera donnée dans la cage en plus des croquettes sèches habituelles.

Choix des espèces

Notre modèle de souris est celui est qui reproduit le mieux les symptômes de l’arthrite réactionnelle et de la spondylarthrite ankylosante de l’homme. L’âge des souris enrôlées dans cette étude est compris entre 5 et 15 semaines au moment de l’induction. Cet âge permet d’avoir une maturité immunitaire.

1 050 souris vont être utilisées, chacune recevant une injection de cellules de sarcome puis une injection quotidienne de molécules expérimentales à partir du dixième jour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur forme une masse abdominale ou cutanée, réduit la mobilité et affaiblit l'état général jusqu'à la cachexie dans les phases avancées, sur des expériences de dix à vingt jours. Toutes sont tuées sous anesthésie pour que leurs tumeurs soient prélevées et le microenvironnement tumoral analysé. Le porteur annonce un suivi de l'état général, du poids et de la tumeur trois fois par semaine, les lundis, mercredis et vendredis, pour des animaux qu'il décrit comme pouvant s'affaiblir jusqu'à la cachexie.

Objectifs

Les sarcomes des tissus mous sont des cancers rares et agressifs chez l’adulte. Ils ont souvent un mauvais pronostic, et les traitements existants, comme la chimiothérapie, sont rarement efficaces. Des traitements qui stimulent le système immunitaire ont montré un certain potentiel, mais restent peu performants, probablement parce que nous comprenons mal l’environnement autour de la tumeur. Cet environnement contient de nombreux types de cellules. Certaines aident le corps à lutter contre la tumeur, tandis que d’autres favorisent sa croissance. On y trouve également des structures organisées de cellules immunitaires, qui semblent coordonner la défense du corps contre le cancer. Notre projet vise à identifier des gènes spécifiques dans ces cellules et structures qui pourraient favoriser l’action du système immunitaire ou, au contraire, bloquer cette défense naturelle. En testant comment ces gènes influencent la croissance tumorale et la réponse aux traitements, nous espérons découvrir de nouvelles stratégies pour renforcer la défense du corps contre le cancer. En étudiant ces mécanismes, notre projet pourrait permettre de mieux comprendre l’environnement complexe des sarcomes et d’identifier de nouvelles approches pour développer des traitements immunitaires plus efficaces et mieux ciblés.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment le système immunitaire interagit avec les sarcomes des tissus mous. Nous nous intéressons en particulier à la formation et au rôle de structures de cellules immunitaires qui apparaissent dans certaines tumeurs, ainsi qu’aux mécanismes qui empêchent certaines cellules du système immunitaire de combattre efficacement la tumeur. Nous chercherons à identifier des gènes qui pourraient favoriser la formation de ces structures et améliorer l’activation et le recrutement des cellules immunitaires essentielles dans la tumeur. Nous étudierons aussi comment lever les freins qui limitent la réponse immunitaire dans les zones les plus agressives de la tumeur. En combinant des analyses de la localisation des cellules dans les tissus, des modèles animaux et des traitements stimulant le système immunitaire, ce projet pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles pour le traitement des sarcomes et de développer des stratégies combinées pour renforcer la défense naturelle du corps et ralentir la progression tumorale. À terme, ces résultats pourraient être appliqués à d’autres cancers solides, offrant de nouvelles perspectives pour de nombreux patients.

Procédures

Le projet prévoit l’utilisation de 1 050 souris réparties en différents groupes expérimentaux. Chaque animal recevra une injection unique de cellules tumorales, selon deux voies d’administration différentes, réalisée sur animaux anesthésiés pendant environ 2 à 5 minutes. À partir du jour 10, les souris recevront quotidiennement une injection de molécules expérimentales ou d’inhibiteurs, effectuée également sur animaux anesthésiés, pour une durée estimée à environ 2 à 3 minutes par animal. Tout au long de l’expérience, les animaux seront surveillés pour le contrôle de la croissance tumorale et du poids corporel, ce qui nécessitera environ 5 minutes par souris, trois fois par semaine. La durée totale des expérimentations variera selon les groupes, de 10 à 20 jours.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues concernent la croissance tumorale et les interventions expérimentales. L’injection de cellules tumorales, selon deux voies d’administration , pourra entraîner une douleur transitoire, une légère inflammation locale, puis la formation de masses tumorales responsables d’une gêne abdominale ou cutanée, d’une perte de mobilité et d’un affaiblissement progressif de l’état général, pouvant aller jusqu’à une cachexie en phase avancée. Le développement tumoral pourra également induire une diminution de l’appétit et une altération du comportement. Les traitements expérimentaux (inhibiteurs pharmacologiques, protéines recombinantes, anticorps thérapeutiques) nécessitant des injections répétées pourront provoquer une douleur ou une irritation locale, parfois une inflammation, un hématome ou une réaction systémique transitoire (perte d’appétit, amaigrissement, baisse d’activité). La contention et les manipulations régulières représentent une source de stress modéré, pouvant entraîner anxiété et réduction des comportements exploratoires, avec un risque accru lié à la répétition des actes expérimentaux. Certaines étapes requièrent une anesthésie, pouvant induire une hypothermie, une sédation prolongée ou un retard au réveil, effets généralement transitoires mais constituant un inconfort potentiel. L’euthanasie réalisée sous anesthésie n’engendre pas de souffrance.

Devenir

Les souris seront euthanasiées après anesthésie afin de minimiser toute douleur ou stress. Les tumeurs seront ensuite prélevées pour analyser le microenvironnement tumoral. Cette euthanasie est nécessaire pour permettre la récupération des tissus dans des conditions optimales pour les analyses biologiques et histologiques.

Remplacement

Dans ce projet, nous avons d’abord travaillé sur des échantillons humains en utilisant différentes techniques : imagerie, analyse de l’expression des gènes dans les tissus et analyses à l’échelle d’une seule cellule, ainsi que sur des cellules cultivées en laboratoire. Ces études nous ont permis de mieux comprendre la composition des cellules autour des tumeurs des sarcomes des tissus mous et la formation de structures lymphoïdes tertiaires, qui sont des sortes de "centres de commande" du système immunitaire. Cependant, les cellules cultivées en laboratoire ne reproduisent pas la complexité et l’organisation des tumeurs dans un organisme entier. La formation et le développement de ces structures dépendent d’interactions entre différents types de cellules, de la circulation sanguine et de la présence de tout le système immunitaire. Ces processus ne peuvent pas être étudiés de manière fiable en dehors du corps. De plus, pour tester des traitements qui modifient le système immunitaire, il est nécessaire de travailler dans un organisme vivant afin de prendre en compte les réponses globales du corps et l’évolution de la tumeur. L’utilisation de modèles animaux modifiés génétiquement est également indispensable pour comprendre précisément le rôle de certains gènes dans la formation de ces structures et dans la réponse aux traitements. Ainsi, même si nous avons utilisé toutes les alternatives non animales possibles, les expériences réalisées sur des organismes vivants restent essentielles pour atteindre les objectifs de ce projet et mieux comprendre le microenvironnement tumoral des sarcomes.

Réduction

Le projet prévoit l’utilisation de 1050 animaux au total. Le nombre d’animaux pour chaque groupe expérimental a été déterminé sur la base d’un calcul de puissance, afin de garantir que les résultats obtenus soient fiables et significatifs, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Chaque groupe comprendra un nombre suffisant d’animaux pour permettre des comparaisons entre groupes et réaliser des tests statistiques adaptés afin d’évaluer correctement les différences observées et d’interpréter les résultats de manière robuste. Les expériences seront organisées pour maximiser les informations obtenues à partir de chaque animal. Les protocoles prévoient des répétitions d’expérience afin d’atteindre un nombre de mesures suffisant par groupe, assurant la robustesse et la reproductibilité des résultats. Les tissus prélevés seront également réutilisés pour différentes analyses, ce qui permet d’obtenir un maximum de données biologiques tout en limitant l’usage d’animaux supplémentaires. Enfin, l’ensemble des protocoles sera mis en œuvre dans le respect du bien-être des animaux. Les conditions expérimentales sont conçues pour limiter le stress et l’inconfort, et toutes les mesures nécessaires seront prises pour surveiller régulièrement l’état des animaux et intervenir rapidement si nécessaire. Cette organisation garantit des résultats fiables et interprétables, tout en respectant les principes éthiques et le cadre réglementaire en vigueur.

Raffinement

Les souris commerciales non génétiquement modifiées ainsi que les lignées génétiquement modifiées bénéficieront d’une période d’acclimatation de sept jours avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié au changement d’environnement. Elles seront hébergées en groupes de cinq animaux maximum dans des cages ventilées individuellement de type IIL, conformément aux normes en vigueur. Les cages seront enrichies (matériaux de nidification, abris, objets manipulables) afin de favoriser l’expression des comportements naturels et de réduire le stress. Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, cycle lumineux) seront réglées selon les exigences réglementaires pour l’espèce concernée. Les animaux auront un accès libre à une alimentation standard et à l’eau de boisson. Une surveillance régulière sera réalisée par du personnel qualifié trois fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi), comprenant l’observation de l’état général des animaux, leur poids corporel et l’évolution du développement tumoral. Des points limites prédéfinis seront appliqués afin d’assurer le bien-être animal et d’éviter toute souffrance prolongée. En cas d’atteinte d’un point limite ou d’apparition de signes altérés du bien-être, l’expérimentation concernée sera arrêtée pour l’animal. Des mesures de raffinement seront mises en place : -manipulation douce dans un environnement calme, -familiarisation préalable des animaux aux procédures répétées, -utilisation d’un dispositif chauffant pendant et après l’anesthésie pour prévenir l’hypothermie, jusqu’au réveil complet. L’ensemble du personnel impliqué est formé aux bonnes pratiques expérimentales et applique les exigences éthiques en vigueur tout au long du projet.

Choix des espèces

Les études utilisent des souris comme modèle expérimental. Cette espèce a été choisie car elle est bien caractérisée pour les recherches sur le microenvironnement tumoral et les réponses immunitaires. Les souris permettent d’étudier de manière fiable les interactions entre différentes populations cellulaires, la formation des structures lymphoïdes tertiaires et l’effet de traitements immunomodulateurs dans un organisme entier, ce qui n’est pas possible avec des modèles in vitro ou ex vivo. Les animaux utilisés ont entre 8 et 12 semaines. Ce stade de développement correspond à des souris sevrées ayant atteint leur taille adulte et possédant un système immunitaire mature. Cela permet d’obtenir des résultats pertinents sur le rôle du microenvironnement tumoral et sur l’efficacité des traitements étudiés. L’utilisation de souris adultes jeunes limite également les variations liées à l’âge et garantit un suivi optimal tout au long des expérimentations. Cette espèce et ce stade ont été choisis pour concilier pertinence scientifique et bien-être des animaux, en utilisant des modèles fiables et reproductibles tout en respectant les exigences éthiques et réglementaires.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est infecté par le virus de l'immunodéficience simienne, puis subit une quinzaine d'anesthésies générales, une quinzaine de prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse et environ sept ablations chirurgicales de ganglions lymphatiques, avec un hébergement individuel une fois infecté. Le porteur attend de l'infection une perte de poids, des diarrhées, une chute des lymphocytes, des nodules palpables et des lésions cutanées, et prévoit de compléter l'alimentation si les anesthésies répétées coupent l'appétit. Il affirme que le macaque est le seul modèle animal reproduisant la maladie humaine et qu'il n'existe "pas d'autre modèle animal" pour le sida, l'objectif restant de comprendre pourquoi certaines cellules immunitaires échouent à contrôler le virus.

Objectifs

Malgré des décennies de recherche, il n'existe toujours pas de vaccin ni de traitement curatif contre le VIH/SIDA. Pour mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans le contrôle de l'infection, nous utilisons deux modèles animaux primates non humains (il s’agit d’animaux d’élevage) infectés par le virus d’immunodéficience simienne (VIS) : • Le singe vert d’Afrique, naturellement infecté par le VIS sans développer la maladie, • Et le macaque cynomolgus, chez qui l’infection par le VIS est pathogène, comme chez l’humain. Un intérêt particulier est porté à un type de cellules immunitaires, les cellules tueuses naturelles (NK, natural killers), qui jouent un rôle crucial dans la réponse antivirale, notamment au sein des tissus lymphoïdes secondaires . Ces tissus, comme les ganglions ou la rate, sont les lieux stratégiques où les cellules immunitaires se rencontrent et s’activent pour organiser la défense de l’organisme. Parmi ces cellules, on retrouve les cellules T, des globules blancs spécialisés qui reconnaissent spécifiquement un agent infectieux et coordonnent la réponse immunitaire. Tout comme elles,ces cellules NK peuvent acquérir des caractéristiques de mémoire et s'adapter fonctionnellement. Il a été d’ores et déjà montré chez le singe vert d’Afrique que les cellules NK adaptatives fortement différenciées se développent dans les tissus lymphoïdes secondaires et contribuent à un contrôle efficace du virus. Il n’y a pas de contrôle chez le macaque cynomolgus. Pour comprendre l'absence de contrôle du virus chez ce dernier, cette étude sera menée sur six macaques infectés par le VIS. Cette étude se concentre sur l’analyse de la charge virale ainsi que l’évaluation de l’ensemble des caractéristiques phénotypiques, tel que leur apparence ou les molécules présentes à leur surface et fonctions des cellules NK dans divers tissus. L’objectif global est de comprendre les conditions qui favorisent ou empêchent la génération de cellules NK efficaces, et d’identifier des éléments précis du système immunitaire sur lesquels on peut agir afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques contre le VIH.

Bénéfices attendus

Cette étude sur le modèle macaque vise à mieux comprendre pourquoi certaines cellules immunitaires, appelées cellules NK adaptatives, sont dysfonctionnelles et incapables de contrôler l'infection par le virus VIS, un équivalent du VIH chez ces animaux. En combinant des expériences en laboratoire et des observations directes sur ce modèle, nous cherchons à découvrir comment ces cellules se développent et comment elles sont régulées. Pour cela, nous utilisons des techniques de pointe, comme la cytométrie de flux et le séquençage de l'ARN à l'échelle d'une seule cellule, afin d'analyser en détail les cellules NK durant l'infection. Ces méthodes nous fourniront des informations précieuses sur la diversité et le rôle de ces cellules dans l’infection. L'objectif à long terme est d'identifier les facteurs qui pourraient rendre ces cellules NK particulièrement efficaces pour éliminer les cellules infectées. Nos résultats pourraient aider à développer de nouvelles stratégies de traitement pour le VIH chez l'humain, en ciblant les réservoirs du virus dans le corps et en contribuant à une rémission durable de l'infection.

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (15 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) et seront regroupés pour limiter les anesthésies. Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus VIS (une fois, 5 min, tous les animaux) - Prélèvements de sang (15 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (3 fois, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait chirurgical de ganglions lymphatiques périphériques (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection: Perte de poids, diarrhée, baisse importante des lymphocytes, observation de nodules à la palpation, lésions cutanées Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entraîner un stress. Nuisances possibles suite à l’ablation de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin d’avoir accès à tous les organes lymphoïdes primaires et secondaires où sont activées les cellules NK.

Remplacement

Les expériences uniquement in vitro ne peuvent pas refléter le comportement de la cellule dans son contexte physiologique, ni mimer les conditions de fonctionnement d’un organisme entier. C’est pourquoi les études in vivo sont nécessaires. Le modèle primateest, pour toutes ses similarités avec l’humain, le plus adapté aux études physiopathologiques. Par ailleurs, pour le SIDA, il n’existe pas d’autre modèle animal que celui-ci. Par opposition aux études menées chez l’humain infecté par le VIH, l’utilisation des modèles primates où l’infection est pathogène, comme chez l’humain, nous permet d'analyser et de comparer, en absence de traitement, les réponses cellulaires dans différents tissus en plus du sang, notamment la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques, l’intestin, le foie et la rate qui jouent un rôle dans la pathogenèse. Le modèle du macaque cynomolgus permet donc d’analyser les interactions hôte/virus dans des contextes contrôlés (virus, timing) facilitant ainsi l’identification des caractéristiques propres à l’organisme qui influencent sa réponse face au virus. Par ailleurs, seul le modèle animal permet d’analyser les interactions virus/hôte dès les premiers jours post-infection (période qui généralement est impossible à étudier chez l’humain infecté par le VIH), or il est connu que les temps précoces suites à l’infection sont fortement impliqués dans la régulation des réponses immunes et l’établissement des réservoirs viraux. Il est donc très important d’étudier cette période précoce pour mieux comprendre les facteurs responsables de l’induction d’un contrôle viral efficace.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude sont réalisées en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique. Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale avec un soutien thermique pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (patés pour singe, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. En cas d’apparition de réaction locale, un traitement symptomatique pourra être instauré. Les animaux sains seront hébergés en groupe. Les animaux infectés seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté. Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.

Choix des espèces

Le macaque est le seul modèle animal, qui, lorsqu’il est infecté par le SIV présente une physiopathologie comparable à celle observée chez l’humain infecté par le VIH. C’est le modèle animal le plus pertinent pour étudier et comprendre les mécanismes de transmission du virus et de développement du SIDA chez l’Humain. Cela fait d'eux un modèle précieux pour étudier pourquoi le système immunitaire est dysfonctionnel pour lutter contre le SIDA. Les recherches se concentrent sur les singes adultes, car leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de protection. En étudiant ces animaux, les scientifiques espèrent découvrir des pistes pour renforcer la réponse immunitaire contre le VIH chez l'humain.

Une chirurgie d'une heure et demie sous anesthésie interrompt puis rétablit l'irrigation du cœur de chaque animal, suivie de six injections d'analgésique sur trois jours. 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leur cœur soit récupéré et analysé. Le projet cherche à préciser le rôle des macrophages dans la cicatrisation du muscle cardiaque après un infarctus, et notamment dans la résorption de la cicatrice. Le résumé décrit jusqu'à sept injections d'un "produit non douloureux" sans dire lequel, et justifie les effectifs par l'expérience antérieure de l'équipe sans donner de calcul ni de nombre d'animaux par groupe.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’étudier la phase de cicatrisation du muscle cardiaque à la suite d’un infarctus du myocarde en s’intéressant plus particulièrement au rôle des macrophages, une population de cellules immunitaires impliquée à la fois dans l’élimination des cellules lésées et dans les mécanismes de réparation tissulaire. Si la cicatrisation constitue, en principe, un processus bénéfique visant à restaurer l’intégrité tissulaire, elle peut également avoir des effets délétères sur l’organe concerné. Dans le contexte de l’infarctus du myocarde, la formation initiale de la cicatrice permet de contenir les dommages ; toutefois, à long terme, elle peut évoluer vers une fibrose pathologique, caractérisée par le remplacement progressif du tissu musculaire par un tissu fibreux non contractile. Ce remodelage fibrotique altère la fonction cardiaque et peut conduire à une insuffisance cardiaque. Plus l’étendue de la fibrose est importante, plus la perte de fonction myocardique est sévère. On sait que les macrophages jouent un rôle essentiel, généralement bénéfique, à la fois dans les premières étapes de la cicatrisation, mais aussi dans la phase de résorption du tissu cicatriciel et dans la limitation de la fibrose. Notre objectif est de mieux comprendre, dans le détail, le rôle exact de ces cellules et leur mécanisme d’action. + Quelle est l’importance réelle des macrophages dans la cicatrisation du myocarde à la suite d’un infarctus ? + Les macrophages ne formant pas une population parfaitement homogène, quelles sont les caractéristiques de ceux impliqués dans la résorption de la cicatrice ? + Quels sont les mécanismes cellulaires intervenant dans la résorption de la fibrose par les macrophages ? Ces connaissances fondamentales pourraient, à terme, être appliquées à des objectifs médicaux comme la mise au point de traitements des séquelles cicatricielles de l’infarctus du myocarde.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous approfondirons notre compréhension du rôle des macrophages dans la cicatrisation cardiaque post-infarctus. Nous nous attacherons notamment à distinguer les fonctions spécifiques des macrophages adultes par rapport à celles des macrophages résidents d’origine embryonnaire. Cette étude nous permettra de préciser leur implication non seulement dans le processus de cicatrisation initiale, mais également dans la résorption de la cicatrice, la revascularisation des tissus lésés, ainsi que dans la modulation de l’hypoxie cellulaire associée. Bien que ce projet relève, pour l’instant, principalement de la recherche fondamentale, il s’inscrit clairement dans une perspective médicale. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la guérison du cœur après un infarctus pourrait, à long terme, nourrir des approches plus appliquées en recherche clinique. Actuellement, l’intervention médicale post-infarctus repose essentiellement sur une prise en charge rapide, visant à limiter les lésions aiguës. Cependant, si la cicatrisation qui s’ensuit est indispensable à court terme, elle peut engendrer des effets délétères à long terme, notamment par l’excès de tissu fibreux non contractile. Notre étude pourrait ainsi contribuer, à terme, au développement de stratégies thérapeutiques destinées à contrôler l’extension du tissu cicatriciel et à favoriser la régénération d’un myocarde fonctionnel.

Procédures

1) Injection de produit non douloureux (quelques secondes par animal) entre une et 7 fois (sur une période de 10 jours) 2) Injection de produit non douloureux (une minute par animal) 2 injection 30 mn et 5 mn avant la mise à mort 3) Intervention chirurgicale sous anesthésie provoquant un infarctus cardiaque transitoire. Fréquence et durée :intervention unique, d’environ 1 heure 30 minutes par souris 4) Injections d’analgésie : 6 injections sur 3 jours (toutes les 12 heures) en post-opératoire sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les injections même lorsqu’elles sont répétées, n’entraînent qu’une gêne légère et de courte durée pour les animaux, les produits administrés n’étant pas douloureux. Concernant les interventions chirurgicales, l’ischémie induite au cours de l’intervention est transitoire, et les animaux récupèrent rapidement, généralement dans les 24 heures suivant la chirurgie, sans signes de pathologie ni de souffrance post-opératoire. En conclusion, l’ensemble des procédures envisagées n’induiront qu’un inconfort modéré et transitoire, maîtrisé par des mesures adaptées d’analgésie et de soins post-opératoires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer et analyser le cœur.

Remplacement

L’étude du fonctionnement du cœur et des mécanismes de cicatrisation après un infarctus ne peut être réalisée que sur l’animal vivant, aucun modèle in vitro ne permettant, à ce jour, de reproduire de façon fiable la complexité de ces processus. Il n’existe pas non plus de système artificiel capable de refléter fidèlement le fonctionnement global du système immunitaire d’un organisme adulte. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour cette recherche. Il permet de reproduire de manière réaliste l’interruption de l’irrigation cardiaque, le microenvironnement tissulaire post-lésionnel, ainsi que la réponse immunitaire, à la fois locale et systémique, impliquant le recrutement cellulaire via la circulation sanguine. Ce modèle offre également la possibilité d’étudier directement les interactions entre les macrophages et d‘autres cellules cardiaques.

Réduction

Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en s’appuyant sur notre expérience antérieure ; - en fonction de la nature des expériences et des paramètres à mesurer, - en tenant compte de la variabilité attendue de ces paramètres. En particulier, les résultats obtenus lors d’un précédent projet ont montré que les différences observées entre les lots contrôles et expérimentaux étaient importantes et permettaient l’utilisation d’un nombre relativement restreint d’animaux pour chaque lot. Ceci permettra de produire des résultats fiables et interprétables, avec une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Pour la chirurgie, outre l’anesthésie, une analgésie sera effectuée par injection juste avant l’opération et durant les 72 heures suivant l’opération pour limiter au maximum les douleurs post-opératoires. Le réveil se déroulera en cages individuelles, au calme. La cage sera munie d’un tapis chauffant pour lutter contre l’hypothermie post-opératoire. Du gel alimentaire sera ajouté dans la cage pour faciliter la prise alimentaire durant les premiers jours suivant la chirurgie. Les animaux seront suivi de manière régulière pour évaluer leur état de santé. Des points limites spécifiques et précoces seront estimés (apathie, perte de poids, aspect du pelage) pour permettre une intervention rapide afin d’éviter ou de minimiser la douleur, si nécessaire.

Choix des espèces

- Les souris sont des petits mammifères qui partagent de nombreuses similarités avec l’homme. - Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche - Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux - On peut utiliser des individus de lignées consanguines, ce qui permet une meilleure homogénéité dans nos populations, et on peut trouver d’énormes bases de données (ex : génétiques) et utiliser de nombreux réactifs spécifiques de cette espèce (ex : anticorps). - De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier les macrophages. - Les procédures chirurgicales, y compris les médicaments les plus efficaces (anesthésiques et analgésiques) et les doses à injectées, sont parfaitement connus. L’étude des effets de l’infarctus dans les différentes conditions expérimentales se fera à l’âge adulte (après 6 semaines). Le but est de produire un modèle proche de la pathologie humaine qui est une maladie de l’individu adulte. Chez la souris, la maturité sexuelle est atteinte à environ 6 semaines, cet âge est donc considéré comme le début de l’âge adulte.

Les tumeurs greffées peuvent s'ulcérer et s'infecter, et l'irradiation de 210 secondes qui précède la greffe de moelle peut endommager l'intestin, les poumons ou le cerveau. 670 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses post-mortem, sans qu'aucune soit maintenue en vie. Chaque souris reçoit une injection de cellules tumorales sur animal éveillé, puis un traitement tous les trois jours pendant dix-huit jours, une partie subissant une seconde greffe de tumeur huit à douze semaines après l'irradiation. Le porteur ne nomme pas la protéine étudiée et renvoie au long terme la possibilité d'explorer des molécules qui en modifieraient l'activité chez des patients.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’une nouvelle protéine dans la réponse antitumorale. Le contrôle de la croissance des tumeurs chez les patients dépend de l’activation d’une réponse immune efficace contre les cellules cancéreuses. Cela passe par le déclenchement d’une réponse immunitaire. Les protéines responsables de cette activation ne sont pas totalement connues. Nous avons récemment identifié une nouvelle protéine centrale dans l’activation de l’immunité. Ce projet a pour but de comprendre son rôle dans le contrôle des tumeurs. A terme, il est possible que les résultats de cette étude permettent de mettre au point des thérapies d’activation de l’immunité chez les patients atteints de cancers solides tels le mélanome ou le cancer du poumon. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de cette protéine immunitaire dans le contrôle du cancer.

Bénéfices attendus

La réponse immune antitumorale n’est pas totalement comprise. Nous avons récemment découvert une protéine nécessaire aux premières étapes d’activation du système immunitaire. Ce projet propose d’analyser son rôle chez la souris. À long terme, ce projet pourrait apporter la preuve que notre protéine d’intérêt joue un rôle dans l’organisme dans la protection antitumorale, ouvrant la voie à l’étude de cette protéine chez les patients. Nous pourrons ensuite explorer des stratégies thérapeutiques utilisant des molécules modifiant l’activité de cette protéine pour activer la réponse immune antitumorale.

Procédures

Toutes les interventions se font sur animaux éveillés. Dans un premier lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées aux animaux (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 injection tous les 3 jours pendant 18 jours maximum (durée de chaque geste inf à 10 sec). Dans un second lot, les animaux seront irradiés (durée : 210 sec), puis injectés avec des cellules immunitaires (durée : 10 sec). 8 à 12 semaines après, ils seront injectés avec des cellules tumorales (durée 10 sec) puis recevront un traitement anticancer à raison d’1 injection (durée 10sec) tous les 3 jours pendant 18 jours maximum. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur certains de ces animaux. Dans un troisième lot, les animaux seront irradiés (durée : 210 sec), puis injectés avec des cellules immunitaires (durée : 10 sec). 8 à 12 semaines après, ils seront injectés avec des cellules tumorales (durée 10 sec) puis recevront un traitement anticancer à raison d’1 injection (durée 10sec) tous les 3 jours pendant 18 jours maximum. Une seconde injection de cellules tumorales sera réalisée sur ces animaux (durée : 10 sec). Un prélèvement sanguin sera réalisé sur certains de ces animaux.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales, ainsi que des traitements au moyen d’une aiguille entraîne une douleur transitoire due à la piqure. Les potentiels effets indésirables de la greffe de moelle seront estimés lors d’une expérience pilote avec un petit nombre d’animaux. Il s’agit cependant d’effets indésirables très rares. La greffe de moelle osseuse implique une irradiation préalable du receveur afin d’éliminer ses propres cellules de moelle osseuse. Cette étape, bien que nécessaire, induit une toxicité significative : elle peut endommager des tissus non ciblés comme l’intestin, les poumons ou le cerveau, et affaiblir considérablement le système immunitaire, rendant l’animal plus vulnérable aux infections opportunistes. Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Greffer une tumeur chez une souris peut avoir des effets négatifs sur sa santé. Avec le temps,l’animal peut parfois perdre du poids, manger moins et avoir du mal à se déplacer, si la tumeur est volumineuse ou mal placée. La tumeur peut dans certains cas s’ulcérer, s’infecter.

Devenir

Aucun animal maintenu en vie. Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Des expériences en laboratoire ont montré que notre protéine immunitaire joue un rôle clé dans l’activation des défenses immunes de l’organisme. Quand cette protéine est absente, les cellules ne réagissent plus aux signaux censés déclencher une réponse immune. Le projet cherche maintenant à comprendre comment cette protéine aide le corps à lutter contre les tumeurs, en utilisant des souris comme modèle vivant. Même si des méthodes alternatives comme la culture de cellules ont été utilisées, l’étude sur l’animal reste essentielle pour observer la réponse immunitaire dans son ensemble, telle qu’elle se produit dans un organisme complet et fonctionnel. Cette réponse n’est pas observable avec des méthodes impliquant de la culture cellulaire.

Réduction

Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet sera de 670 souris. Le nombre de souris a été réduit en effectuant une première expérience permettant de déterminer le modèle tumoral et le régime de traitement le plus adapté à notre étude. Le reste de l’étude sera effectuée uniquement avec ce modèle et ces conditions expérimentales. De plus, la dernière expérience ne sera réalisée que si le modèle tumoral choisi en dans la première expérience présente un rejet complet des tumeurs. Le nombre de souris utilisées dans chaque groupe a été réduit au strict minimum nécessaire. En utilisant 10 souris par groupe, les chercheurs peuvent détecter des différences significatives entre les groupes avec une grande fiabilité. Pour s’assurer que les résultats sont reproductibles, l’expérience sera refaite une seconde fois avec le même nombre d’animaux.

Raffinement

Les souris sont manipulées sans stress par des personnels compétents. Le bien être des souris sera suivi quotidiennement. Les points limites conduisant à l’euthanasie des souris seront précoces et prédictifs pour l’apparition d’une douleur. Le suivi et la détermination des points limites est effectué en utilisant une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche antitumorale : souches murines parfaitement définies et modèles génétiquement modifiés, avec de grandes similarités entre les systèmes immunitaires humains et murins qui permet de transposer nos découvertes dans le modèle murin chez l’humain. De plus, nous avons documenté de manière robuste l’existence de notre protéine d’intérêt chez l’humain et chez la souris. Souris adultes ( >6 semaines) car leur réponse immune antitumorale est active.

Greffées d'un mélanome murin sous anesthésie, irradiées quatre minutes, puis reconstituées par injection de cellules immunitaires, 3 978 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit ensuite trois injections d'immunothérapie espacées de deux jours au moins. Le développement tumoral peut entraîner perte de poids, anémie, déshydratation et ulcération de la tumeur. Le porteur écrit que ces souris ne peuvent être "éthiquement" ni réutilisées, ni adoptées, du fait de l'injection de cellules cancéreuses, et prévoit de les tuer toutes.

Objectifs

Les lymphocytes T CD8 sont des cellules essentielles de notre système immunitaire, capables de reconnaître et d’éliminer spécifiquement les cellules cancéreuses ou infectées, assurant ainsi une protection durable contre les maladies. Leur activité est régulée par des protéines appelées checkpoints immunitaires, qui peuvent freiner ou limiter leur action. Ces checkpoints sont aujourd’hui au cœur des stratégies d’immunothérapie contre le cancer, permettant de stimuler le système immunitaire pour mieux attaquer les tumeurs. Cependant, les mécanismes précis par lesquels ces protéines modulent les réponses immunitaires restent encore mal connus. Pour mieux les comprendre, il est indispensable d’utiliser des modèles animaux qui prennent en compte la complexité des interactions entre les différentes cellules dans l’environnement tumoral. Notre projet se concentre sur l’étude de checkpoints immunitaires qui jouent un rôle clé dans la régulation des lymphocytes T CD8 humains et vise à identifier les modalités moléculaires et cellulaires par lesquelles ces molécules contrôlent l’activité anti-tumorale de ces cellules.

Bénéfices attendus

Notre étude pourrait révéler comment certaines tumeurs développent des résistances aux traitements et aider à élaborer de nouvelles stratégies pour renforcer l’efficacité des immunothérapies actuellement développées.

Procédures

Des cellules tumorales de mélanome murin seront implantées de façon unique à des souris anesthésiées et analgésiées, sur une durée de 10 secondes. Les animaux seront ensuite soumis à une irradiation durant 4 minutes afin de permettre une reconstitution de leur système immunitaire par injection unique de cellules immunitaires spécifiques des cellules tumorales implantées, sous anesthésie, durant 10 secondes. Les souris vigiles pourront ensuite être traitées ou non par 3 injections d’immunothérapie par intervalles de temps espacés d’au moins 48 heures, chaque injection durant 10 secondes.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales est susceptible de causer ponctuellement une douleur modérée. Le développement tumoral peut engendrer des effets indésirables tels que perte de poids, anémie, déshydratation. Les tumeurs présentent également un risque d’ulcération. L’irradiation des souris engendre un stress de courte durée. L’injection de cellules immunitaires est susceptible de causer ponctuellement une douleur modérée.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort car elles ne peuvent pas être éthiquement réutilisées, remplacées ou adoptées, du fait de l’injection de cellules cancéreuses. Toutefois, une partie des souris mises à mort permettra d’effectuer des prélèvements d’organes post-mortem, et ainsi mener des expériences ex vivo en plus des données pré-cliniques qu’elles fourniront.

Remplacement

Bien que le projet inclue des expériences in vitro permettant d’étudier l’activité des cellules immunitaires sur des cellules tumorales, ces tests ne peuvent reproduire que partiellement la complexité des processus biologiques ayant lieu dans un organisme vivant entier. En effet, la réponse immunitaire contre une tumeur fait intervenir de nombreux mécanismes qui se déroulent selon une chronologie et dans des tissus variés, de l’activation des lymphocytes dans les organes lymphoïdes secondaires à leur déplacement vers la tumeur. Les modèles in vivo restent donc indispensables pour comprendre ces processus dans leur globalité et obtenir des résultats fiables afin de les transposer aux cancers chez l’être humain.

Réduction

Les effets biologiques présentent une variabilité statistique qui doit être impérativement limitée afin de pouvoir conclure de façon fiable à partir de résultats expérimentaux. Ainsi, à partir de valeurs extraites de la littérature scientifique, nous avons calculé à l’aide de tests statistiques le nombre minimal d’animaux nécessaires à la réalisation d’expériences robustes. Nous avons obtenu une taille d’échantillon de 26 animaux par groupe. Ce nombre pourra être réduit au cours du projet, sur la base de la réévaluation de la variabilité des effets biologiques mesurés.

Raffinement

Les animaux sont manipulés à l’aide de leur abri, ou bien dans le creux de la main, de façon à limiter l’anxiété et le stress lors des manipulations, conformément aux recommandations du NC3R. L’analgésie locale préalable à l’injection des cellules tumorales et des cellules immunitaires permet de supprimer la douleur liée à la piqûre. La surveillance accrue lors de la phase de développement tumoral, avec évaluation du bien-être animal à l’aide d’une grille de scoring, permet de prévenir la souffrance des animaux. En cas d’effets indésirables modérés, des mesures de renutrition et réhydratation sont prévues. En cas d’effets indésirables graves, les souris sont euthanasiées. Le transport adapté ainsi que les différentes sources d’enrichissement contribuent à réduire le stress autour de l’irradiation. L’hébergement en conditions SOPF (exempt de pathogène spécifique ou opportuniste) ainsi que les mesures d’asepsie (utilisation d’équipements de protection individuels, portoirs ventilés individuellement) permettent de réduire le risque infectieux transitoire des animaux, le temps que leur système immunitaire se reconstitue. L’irradiation des souris engendre un stress de courte durée, pris en charge par un transport adapté et un enrichissement de l’hébergement, ainsi que des mesures de protection et d’asepsie le temps de la reconstitution du système immunitaire. L’injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse est susceptible de causer ponctuellement une douleur modérée, qui est prévenue par l’administration d’un analgésique.

Choix des espèces

Le modèle d’étude choisi est le modèle murin, dont la physiologie, notamment du point de vue du système immunitaire, permet la transposabilité des résultats pré-cliniques à la médecine humaine. Les souris seront incluses en procédure à partir de l’âge de 7 semaines, à partir duquel leur système immunitaire est considéré comme mature.