Système immunitaire
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- Biologie du développement
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- Système gastrointestinal
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- Système urogénital
Efficacité et toxicité de candidats médicaments impliqués dans le traitement du cancer [MODIFICATION]
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
15 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la plupart tuées à l'issue. Immunodéficientes, immunocompétentes ou dotées d'un système immunitaire ou d'un foie humanisé, elles reçoivent selon les études des greffes de tumeurs humaines ou murines, des injections répétées de candidats médicaments, des injections de plasmides qui peuvent provoquer des troubles cardio-respiratoires, et pour certaines une castration, des prélèvements vaginaux quotidiens ou des séances d'imagerie. Parmi les risques de la chirurgie, le porteur cite le cas où "la souris se réveille en cours de procédure". 1 200 souris sont déclarées réutilisées, et le porteur prévoit que des souris n'ayant subi qu'une partie de la procédure puissent passer dans un projet de formation interne aux gestes techniques. Il indique enfin qu'aucune approche statistique n'a fixé l'effectif, prévu pour 309 études de 50 souris et estimé d'après les années antérieures, avec une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines sur des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé. Différentes stratégies d’implantation des tumeurs pourront être mises en œuvre en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser sa toxicité et l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la fonctionnalité de candidats médicaments dans des modèles se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'humain.
Procédures
[MODIFICATION] Identification par puce électronique : 2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les administrations de traitements ou de cellules seront réalisées par injections qui pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux pour la castration, l’implantation de fragments de tumeurs et/ou de dispositifs sous-cutanés, réalisés sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. L’implantation durera environ 8 minutes et pourra être répétée selon les besoins de l’étude. Concernant la castration, celle-ci durera moins de 10 minutes. Le suivi de la croissance tumorale pourra se à l’aide d’un pied à coulisse pour une durée de quelques secondes et/ou par imagerie pour une durée comprise entre 10 et 45 minutes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Impact sur les animaux
[MODIFICATION] -Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, hémorragie, un défaut du système d’anesthésie / analgésie (ex : la souris se réveille en cours de procédure), un état clinique détérioré au réveil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements ou de cellules cancéreuses : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : anémie, hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en prévention). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne voire potentiellement douleur si présence de tumeurs au niveau abdominal. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions, au développement des tumeurs et des éventuelles métastases. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux en fin d'étude, ayant atteints les points limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 15480 souris seront utilisées, couvrant une période de 3 ans et permettant de réaliser 309 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction de la variabilité de croissance historique sur un modèle déterminé.
Raffinement
En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant de creuser, se cacher et réaliser un nid. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles pour synchroniser le cycle œstral. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, elles bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. [MODIFICATION] Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un relais dans l’eau de boisson pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement sous anesthésie sans réveil, suivi d’une euthanasie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Des mesures pour éviter tout stress au moment de l’euthanasie sont prévues. Les points limites sont définis selon l’état général (score clinique), perte de poids ou volume tumoral.
Choix des espèces
90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. De plus, le métabolisme des souris présente des similarités avec celui des humains, ce qui permet de prédire la distribution, biotransformation et élimination d’un médicament. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang. Les animaux humanisés avec des cellules modifiées seront inclus à partir de 5 semaines, âge auquel la greffe de cellules dans le sang est la plus efficace.
Evaluation du potentiel allergique et de sensibilisation de novo de la graine de chanvre in vivo, en comparaison à un allergène fort et un allergène faible chez la souris Balb/cJRj
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
220 souris Balb/cJRj vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et chacune est anesthésiée et rasée avant chaque sensibilisation, répétée quatorze jours de suite ou une fois par semaine pendant six semaines selon les protocoles. L'allergène, graine de chanvre, noisette ou épinard, leur est appliqué par un patch posé sur le dos ou après grattage de la peau du ventre, l'étude pilote évaluant l'usage du papier de verre. Trois à dix jours après la dernière sensibilisation, un gavage doit déclencher l'allergie, avec des tremblements, une chute de la température corporelle et des douleurs à l'estomac possibles. Le porteur écrit que ce travail "permettrait de pouvoir prédire ou bien d'avoir une indication du niveau de risque encouru par les consommateurs de graine de chanvre".
Objectifs
Les allergies alimentaires sont un problème de santé publique qui connait une augmentation en termes de prévalence et de sévérité ces dernières années. Les allergies sont répandues et ont été classées comme la quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ce projet prend part dans un contexte de transition de régime alimentaire visant à utiliser de nouvelles sources de protéines comme la graine de chanvre. Il est possible de rentrer en contact avec la graine de chanvre par le biais de deux voies majeures : orale et cutanée. La consommation de la graine de chanvre est en plein essor de par son fort intérêt nutritionnel et peut se faire au travers de la farine, de barres énergétiques, de pâtes, de biscuits, de boissons ou encore de yaourts. D’autre part, un contact cutané est possible à travers l’huile ou des crèmes à base de graine de chanvre, utilisées en cosmétiques. La recherche sur les allergies à la graine de chanvre est essentielle, d’une part car les allergènes déjà connus dans les fleurs et le pollen de chanvre peuvent se retrouver dans la graine et d’autre part par la présence de protéines de stockage dans la graine, connues pour leur fort potentiel allergène. Afin de prévenir les possibles allergies qui pourront être liées à la graine de chanvre, il est alors nécessaire d’évaluer son potentiel allergique par rapport à un allergène fort, ici la Noisette ainsi qu’un allergène faible, l’épinard. Dans le cadre de l’allergie, deux manifestations majeures peuvent avoir lieu, i) une sensibilisation de novo, ce qui veut dire devenir allergique à la graine elle-même ou ii) une réaction dite croisée par le biais d’une similarité entre les protéines de la graine de chanvre et d’autres protéines allergènes. La connaissance de la capacité de sensibilisation de novo des protéines est importante pour appréhender et anticiper les risques allergiques futurs. Actuellement, il n'existe aucune connaissance sur la capacité de sensibilisation de novo de la graine de chanvre dans une population générale Non Allergique, malgré l'exposition croissante de la population à la graine de chanvre par le biais des aliments et des cosmétiques. Ce projet sera donc tourné sur le potentiel de sensibilisation de novo de la graine de chanvre.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel allergénique et plus précisément de sensibilisation de novo de la graine de chanvre en comparaison avec un allergène fort, la Noisette connue pour induire des allergies et un allergène faible, l’Epinard qui n’est pas connu pour induire beaucoup d’allergies. Ceci permettrait de pouvoir prédire ou bien d’avoir une indication du niveau de risque encouru par les consommateurs de graine de chanvre ou de produits contenant des graines de chanvre et ainsi de prédire le risque de voir une personne devenir allergique à la graine de chanvre par la suite. De plus, ce projet permettra une compréhension plus approfondie des mécanismes immunologiques associés à une sensibilisation à la graine de chanvre.
Procédures
Toutes les souris seront anesthésiées et rasées au préalable de chaque sensibilisation. Les souris seront sensibilisées quotidiennement avec la pose d’un patch, ou 1 fois par semaine pendant 6 semaines avec la pose d’un patch pendant 3 jours ou bien par grattage et application transdermale de l’allergène sur l'abdomen. Le déclenchement des symptômes de l'allergie sera effectué par un gavage, respectivement 3, 10 ou 7 jours après la dernière sensibilisation. Pour un gavage oral, la durée des interventions correspond au temps d’administration (soit environ 10 secondes). Pour les applications épicutanées avec la pose du patch ou transdermale avec le grattage sur l’abdomen, la durée d’intervention correspond au temps d’anesthésie soit 15 à 20 minutes environ. Selon la procédure, les souris auront également un prélèvement d'une goutte de sang à l'extrémité de la queue 1 fois par semaine (de la sensibilisation 3 à la sensibilisation 6) soit 4 prélèvements au total. Ce geste dépend du débit sanguin et dure environ 30 secondes. Pour l’étude principale, les mêmes interventions que pour l’une des procédures de l’étude pilote seront réalisées et les temps d’interventions seront donc similaires.
Impact sur les animaux
Lors de ce protocole, il est possible que les souris aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués : les méthodes de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances en raison de la répétabilité des gestes (14 jours consécutifs ou 1x par semaine pendant 6 semaines) mais aussi de par la présence d’un patch sur le dos, des démangeaisons dues au rasage et des irritations dues au patch, un inconfort abdominal suite au grattage lors de la sensibilisation transdermale, des symptômes liés à la mise en place de l’allergie provoqués par le gavage oral (tremblements, chute de la température corporelle, douleurs stomacales), ainsi que les anesthésies gazeuses répétées. La prise de température par voie rectale peut également entrainer un inconfort pour les souris.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l’allergie et ainsi valider nos modèles.
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques complexes et en particulier le système immunitaire. Dans l’allergie, de multiples types cellulaires peuvent être impliqués et leurs interactions peuvent avoir un rôle dans la physiopathologie. De plus, l’allergie alimentaire est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux et en particulier les souris peuvent adéquatement reproduire.
Réduction
Des protocoles d’allergie alimentaire sont régulièrement réalisés au sein du laboratoire, mais aucun protocole utilisant la graine de chanvre ou la Noisette n’a encore été fait. De ce fait, il est impossible de faire un test de puissance. Néanmoins, en se basant sur des tests statistiques et sur la variabilité individuelle lors des anciens protocoles, le nombre de souris pour l’étude principale avec un allergène fort et un allergène faible a été déterminé à 12 souris par groupe soit 48 souris au total par sexe. Cette procédure sera répétée une deuxième fois avec les mêmes 4 groupes de 8 souris par sexe pour s’assurer de la reproductibilité du protocole. Pour l’étude pilote, le nombre de souris a été réduit à 10 par procédure soit 30 souris au total par sexe. Nous anticipons des écarts nets entre les différentes procédures testées, avec des réponses contrastées de type "tout ou rien". Cette amplitude attendue des effets justifie le recours à un effectif réduit, tout en permettant d’identifier le protocole le plus prometteur dès cette première phase. Pour l’étude principale, ce nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place des procédures expérimentales d’analgésie (avec notamment l'injection d'anti-inflammatoire) et d’anesthésie permet de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront hébergées avec au moins 3 enrichissements (dôme, tube et coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi une étude pilote sera effectuée sur un nombre de souris restreint pour appréhender les méthodes de sensibilisation, l’effet de l’application du patch et l’utilisation du papier de verre et afin d’affiner et de choisir au mieux, le protocole qui sera appliqué par la suite ainsi que pour appréhender la prise en charge de la douleur le cas échéant. Une attention particulière sera portée à la détection précoce des signes de douleur ou de mal-être chez les animaux. Des points limites adaptés ont été définis pour garantir que tout changement significatif d’état de santé d’un animal déclenche une réévaluation. Un arbre décisionnel encadre les actions à mener : surveillance renforcée, tentative de soulagement, puis prise de décision, avec le responsable du bien-être animal et le vétérinaire si l’état de l’animal ne s’améliore pas. En cas de souffrance persistante ou jugée irréversible, l’animal sera retiré du protocole et mis à mort. Cette approche vise à limiter la souffrance et à respecter les principes éthiques de l’expérimentation animale.
Choix des espèces
La souche de souris utilisée constitue un modèle de choix, reconnue dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette souche. Aujourd'hui, il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent pour le moment reproduire adéquatement. Ainsi, le modèle animal ici est un élément nécessaire pour modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système lors d’une allergie. Les souris auront 3 semaines de vie à la réception et 4 semaines de vie en début de procédure. Quatre semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.
Rôle des cellules dendritiques dans l’activité antitumorale des cellules NK
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules de lymphome dans la veine de la queue, sur animal vigile, puis jusqu'à quatre injections intrapéritonéales. Le porteur indique que les cellules tumorales se disséminent dans tout l'organisme et peuvent se développer dans le foie ou le cerveau, ou provoquer une paralysie par atteinte de la moelle osseuse. Aucun médicament contre la douleur ne leur sera administré, ces substances modifiant le système immunitaire étudié et risquant de "fausser les résultats".
Objectifs
Le cancer est une maladie grave qui touche des millions de personnes chaque année dans le monde, et reste l’une des principales causes de décès. Ces dernières années, de nouveaux traitements appelés immunothérapies, qui utilisent les défenses naturelles de notre corps, ont permis de mieux soigner certains cancers et d’augmenter la durée de vie des patients. Ces progrès sont possibles grâce à une meilleure compréhension du système immunitaire, en particulier grâce à des études chez la souris dont le fonctionnement est proche de celui de l’humain. Parmi les cellules du système immunitaire, les cellules Natural Killer (ou cellules NK) sont très importantes : elles sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Malheureusement, dans beaucoup de cas, ces cellules deviennent moins efficaces au fil du temps, comme si elles s’épuisaient. Notre projet cherche à comprendre pourquoi les cellules NK perdent leur efficacité face au cancer. Dans un modèle de lymphome chez la souris que nous avons développé, les cellules NK réagissent d’abord bien aux tumeurs, mais finissent par devenir inactives. Nous pensons que certaines cellules du système immunitaire appelées cellules dendritiques (ou DCs), ainsi que d’autres cellules proches, produisent des substances (les cytokines) qui aident à maintenir l’activité des cellules NK. Mais, quand la tumeur grandit, elle perturbe ce soutien, ce qui rend ces dernières moins efficaces. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour étudier de plus près les échanges entre cellules NK et cellules dendritiques au cours du processus tumoral. Grâce à ces recherches, nous espérons mieux comprendre comment les cellules NK s’épuisent face à un cancer, quel rôle les cellules dendritiques jouent dans ce processus, et surtout, comment agir pour renforcer les cellules NK. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour améliorer les traitements contre le cancer.
Bénéfices attendus
Les immunothérapies, qui stimulent le système immunitaire pour qu’il combatte le cancer, ont profondément changé la manière de traiter certains cancers. Malheureusement, ces traitements ne fonctionnent pas chez tous les patients, et beaucoup meurent encore prématurément de la maladie. Il est donc essentiel de mieux comprendre pourquoi ces traitements échouent parfois, pour les améliorer et sauver plus de vies. Notre projet s’inscrit dans cet objectif. Nous cherchons à comprendre pourquoi certaines cellules du système immunitaire, appelées cellules NK, s’épuisent et deviennent moins actives face aux tumeurs. Nous étudions le rôle dans ce processus de leur dialogue avec un autre type de cellules immunitaires, les cellules dendritiques (ou DC). Les connaissances que nous allons acquérir dans ce projet pourraient ouvrir de nouvelles pistes pour rendre les immunothérapies plus efficaces, et ainsi augmenter les chances de guérison des patients atteints de cancer.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique des cellules tumorales dans la veine de la queue d’une durée de quelques secondes. La manipulation des souris pour les pesées ou la contention représentera un stress de courte durée pour les souris. Les animaux inclus dans les différentes procédures subiront au maximum 4 injections intrapéritonéales de courte durée.
Impact sur les animaux
Un inconfort temporaire sera induit par l’injection de cellules tumorales dans une veine de la queue, effectuée sur des animaux éveillés, pouvant entraîner un léger stress ou une petite douleur passagère. Les manipulations nécessaires pour peser les animaux ou les maintenir immobiles provoquent un stress de courte durée. Les injections intrapéritonéales de certains produits peuvent générer un léger stress ou une petite douleur passagère. Le développement des tumeurs elles-mêmes peut entraîner des douleurs chez les animaux. En effet, l'injection par voie intraveineuse des cellules tumorales entraîne leur dissémination dans tout l'organisme, ce qui peut favoriser le développement tumoral dans des organes vitaux (foie, cerveau) ou entrainer une paralysie suite à l’atteinte de la moelle osseuse. D'autres effets indésirables peuvent être observés tels qu'une perte de poids ou une modification du comportement (prostration).
Devenir
A la fin de chaque procédure, la totalité des animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse par divers protocoles. La quasi-totalité aura reçu une injection de cellules tumorales.
Remplacement
Dans ce projet, nous avons besoin de mesurer différentes réactions du système immunitaire pendant un développement de tumeur, directement dans un organisme vivant. Cela s’explique par la complexité du système immunitaire, qui repose sur de nombreuses interactions entre différents types de cellules. Ces échanges sont essentiels au bon développement des réponses immunitaires et à leur capacité de réagir face à une tumeur. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle vivant complet, comme la souris, pour pouvoir observer ces mécanismes dans leur ensemble, dans des conditions proches de la réalité. Les modèles alternatifs dans l’état actuel des connaissances ne permettent pas d’étudier les interactions complexes entre cellules immunitaires dans le développement tumoral du lymphome.
Réduction
Nous ferons tout pour utiliser le moins d’animaux possible dans ce projet, tout en garantissant la qualité des résultats. Pour cela, nous travaillerons avec une souche de souris, qui a l’avantage de donner des résultats plus homogènes entre les individus. Cela nous permet de limiter le nombre de souris à 3 ou 10 par groupe, selon les expériences. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une approche statistique garantissant la fiabilité des résultats obtenu. Chaque expérience sera reproduite plusieurs fois (jusqu’à 2 fois), car la croissance des tumeurs peut varier d’une souris à l’autre. Une première expérience, dite "pilote", nous servira à trouver la bonne dose de la molécule utilisée pour éliminer certaines populations de cellules immunitaires , et à vérifier son effet dans le temps. Cette étape sera faite seulement 2 fois maximum, et si elle fonctionne dès le premier essai, nous n’aurons pas besoin de la refaire, ce qui permettra de réduire encore le nombre d’animaux utilisés. Enfin, si lors des expériences principales aucune différence n’est observée entre les groupes traités et les groupes témoins, nous pourrons réduire le nombre de répétitions pour ces derniers, ce qui contribuera encore à limiter l’utilisation d’animaux dans l’ensemble du projet.
Raffinement
Pour éviter au maximum le stress des animaux, ils seront maintenus en petits groupes stables, composés de souris compatibles entre elles. Elles auront également du matériel pour faire des nids et se cacher, ce qui contribue à leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé chaque jour, en observant leur poids, leur apparence et leur comportement. Si des signes de souffrance ou de détresse apparaissent, des seuils d’alerte précis ont été définis pour intervenir rapidement, selon une grille d’évaluation adaptée à chaque type de procédure. Certaines injections seront faites sur des animaux éveillés, mais elles seront réalisées avec soin par du personnel formé et expérimenté, pour réduire au minimum la gêne ou le stress. Pendant les séances d’imagerie, les animaux respireront un gaz anesthésiant pour les endormir légèrement. Cela permet qu’ils ne bougent pas et qu’ils ne ressentent pas de stress pendant l’examen. Enfin, dans ce projet, nous ne pourrons pas utiliser de médicaments contre la douleur, car ces substances modifient le fonctionnement du système immunitaire et risqueraient de fausser les résultats. Nous veillerons donc à limiter l’inconfort et la souffrance au maximum par des mesures correctives adéquates.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus adapté pour ce type d’étude, car elle se reproduit rapidement, sa taille est pratique pour la recherche, et son patrimoine génétique est bien connu. Cela nous permet de réaliser des manipulations précises, y compris avec des souris génétiquement modifiées, indispensables pour nos expériences. Le fonctionnement de l’organisme de la souris est assez proche de celui de l’humain, en particulier pour ce qui concerne le système immunitaire. Étudier la souris nous aide donc à mieux comprendre les mécanismes immunitaires chez l’homme. Nous utiliserons des souris des 2 sexes âgées de 7 à 30 semaines, car, à cet âge, leur système immunitaire est arrivé à maturité. Pour éviter les différences liées à l’âge au sein d’un même groupe, nous veillerons à ce que les souris d’un même groupe aient au maximum 2 semaines d’écart, ce qui garantit une meilleure fiabilité des résultats.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques dans le modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
1 836 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à soixante-seize administrations de composés et jusqu'à soixante-dix-neuf injections au total sur une étude de vingt-quatre jours. 816 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 816 un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélèvements. L'inflammation du système nerveux central qui leur est provoquée entraîne des douleurs pendant huit jours et un déficit moteur modéré à sévère selon le degré de paralysie, sur commande de laboratoires clients qui fournissent les molécules à tester. Le porteur indique que les études menées sous le projet précédent n'ont mis en évidence aucune molécule prometteuse dans cette pathologie.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie auto-immune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central. Une inflammation liée à un mécanisme auto-immunitaire est à l'origine d'une dégénérescence progressive de la gaine de myéline entourant les fibres nerveuses des neurones. Ce phénomène est à l’origine du ralentissement ou de l’arrêt de la conduction nerveuse induisant une faiblesse musculaire, des troubles de la motricité, de la vision, etc. La sclérose en plaques représente la première cause de handicap sévère non traumatique chez les jeunes adultes. L’âge moyen de début des symptômes est en effet 30 ans. Environ 110 000 personnes sont touchées en France avec 4 000 à 6 000 nouveaux cas par an. D’une manière générale, les causes de la maladie ne sont pas bien identifiées et l’origine exacte de la pathologie reste inconnue. De même, aucune thérapie n’existe à l’heure actuelle pour soigner cette pathologie très invalidante. C’est pourquoi l’étude de nouvelles molécules thérapeutiques est nécessaire. Les molécules thérapeutiques en développement ont pour objectif d’agir sur 3 axes : optimiser la stratégie anti-inflammatoire, favoriser la remyélinisation et la neuroprotection. Pour le traitement de la poussée, l'activité anti-inflammatoire des corticoïdes (anti-inflammatoires) accélère la rémission et permet de réduire le taux de rechutes à court terme. La phase pré-clinique qui consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur est une étape essentielle dans le développement de médicaments. Ce projet fait suite au projet #21592 arrivé à échéance. Il a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire en comparaison avec une molécule de référence et d’obtenir une efficacité égale, voire supérieure à celle-ci.
Bénéfices attendus
Un traitement anti-inflammatoire permet de diminuer cette phase inflammatoire qui mène à la destruction des axones et gaines de myélines. Les traitements disponibles à ce jour ne permettent pas de guérir la maladie, des injections d'anti-inflammatoires permettent de traiter les symptômes et peuvent prévenir les poussées qui reviennent par intermittences. Ce type de forme évolue par poussées, avec des épisodes de rémission plus ou moins long entre celles-ci contrairement aux formes progressives qui évoluent de façon continue, indépendamment des poussées. Dans les formes progressives de la maladie, l’efficacité des traitements n’est pas définitivement démontrée et semble au mieux très partielle. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie. Les études réalisées sur la précédente DAP n’ont pas permis de mettre en évidence des molécules prometteuses dans cette pathologie.
Procédures
Administrations de composés: maximum 76/souris (30 secondes/souris); Prélèvements de sang: maximum 4 prélèvements/souris (3 prélèvements sur animaux vigiles 1x/semaine et 1 prélèvement sous isoflurane en terminal, 1 minute/souris); Induction de la maladie: 3 injections/souris (30 secondes/souris, injection du premier jour sous isoflurane). Cela représente au total maximum 79/souris injections au cours d’une étude de maximum 24 jours avec 14 jours de traitements préventifs.
Impact sur les animaux
Ce projet va permettre d’induire un modèle expérimental transitoire d’inflammation du système nerveux central chez la souris. Plusieurs injections seront nécessaires (solutions immunogéniques et molécules thérapeutiques à tester) et induiront des douleurs légères de courte durée. L’inflammation induite (mimant celle rencontrée chez l’homme lors de sclérose en plaque) sera à l’origine de douleurs de faibles à modérées (selon le stade de développement de la maladie) sur 8 jours et un déficit moteur (sur maximum 48h) de modéré à sévère (selon le degré de paralysie) selon l’efficacité ou non de la molécule thérapeutique testée. La douleur chez l’animal pourra induire malnutrition, faim, soif et stress même si des mesures seront mises en place pour limiter ces nuisances au maximum. Ces signes cliniques ont été observés chez moins de 5% dans la DAP précédente.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques et d’analyser l’effet des différentes molécules testées.
Remplacement
Nous proposons de mettre en place un modèle de sclérose en plaques chez la souris afin de tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies: une thérapie composée d’un seul médicament (monothérapie) ou de plusieurs molécules (combinaison thérapeutique). La dose du composé est choisie en fonction des études in vitro réalisées par le laboratoire donneur d’ordre. Nos clients s’engagent, par signature d’une clause du contrat, à ce que la toxicité des composés ainsi que le véhicule fourni soient validés in vitro sur des modèles pertinents. La dose optimale choisie correspond à la dose induisant un meilleur effet thérapeutique avec le moins d’effets indésirables. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires. Les études in vitro ne permettent pas l’étude du système nerveux/immunitaire intervenant dans la maladie. L’exploration des différentes fonctions physiologiques impliquées dans la pathologie demande l’étude d’un organisme complet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire (nombre validé par l’expérience acquise des dernières années sur ce modèle, il a été augmenté à 12 par groupe dû à la variabilité inter-individu observée), pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour limiter les nuisances au maximum et détecter les premiers signes de douleur au moment de l’expérimentation. Des points limites prédictifs ont été mis en place, si des animaux présentent des signes de souffrance (surveillance renforcée) au cours de l'étude, un analgésique sera administré. La surveillance renforcée d’un animal implique 2 visites par jour (une visite en début de matinée et une autre l’après-midi). De plus, en cas de mobilité réduite ou de perte des poids des animaux, des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajoutés dans les cages.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifique, pratique et éthique : - Mammifères proches de l’Homme: plus de 90 % des deux génomes correspondent à des régions portant des gènes de même fonction et dans le même ordre. Seulement 1 % des gènes murins n’a aucun équivalent chez l’homme et il existe de grandes analogies entre les deux espèces dans les systèmes et leur fonctionnement . - C'est l’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique et pour les études précliniques, selon les références bibliographiques. La méthodologie envisagée est aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Le modèle est basé sur les publications (protocoles d’induction, grille d’évaluation de la maladie) afin d'éviter de refaire des études préliminaires. De plus ce modèle est maîtrisé depuis plusieurs années au laboratoire. Les animaux utilisés seront âgés de 7 semaines à 10 mois afin d’avoir un système immunitaire développé et mature. La sclérose en plaque étant une maladie neuro-dégénérative qui peut se déclarer en majorité chez des individus âgés, il est pertinent de réaliser des études chez des souris à un âge avancé (de 4 - 10 mois).
Etude du filtrage de la lymphe par les cellules du ganglion lymphatique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
2 160 souris vont être utilisées, dont des nouveau-nés gavés deux jours puis trois jours après leur naissance, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour analyse post-mortem. Le génotypage impose une biopsie de tissu et sépare chaque portée de sa mère pendant une dizaine de minutes. Les résultats attendus portent sur la régulation du filtrage de la lymphe par le ganglion lymphatique, avec des retombées annoncées à long terme sur la vaccination des personnes âgées. Le porteur écrit que la biopsie se fait "sur animal vigile ou anesthésié en fonction de l'âge du prélèvement", sans dire à partir de quel âge l'anesthésie est jugée utile.
Objectifs
Le ganglion lymphatique est équipé de systèmes de filtrage de molécules apportées par la lymphe afin de générer des réponses immunitaires contrôlées, par exemple contre des virus. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre la régulation des deux filtres en place, un pour les petites molécules et un pour les grandes molécules. La capacité du ganglion lymphatique de laisser passer les petites molécules mais non les grandes est importante car les petites sont souvent inoffensives alors les grandes molécules sont des virus ou encore des bactéries contre lesquelles il faut se protéger.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation du filtrage de la lymphe apportant des molécules dans le ganglion lymphatique qui pourraient éventuellement nécessiter une réponse immunitaire protectrice. Ces résultats auront des retombées à long terme sur la vaccination, notamment chez les personnes âgées où le système de filtrage semble défectueux.
Procédures
Des souris nouveau-nés sont soumises à un gavage à jour 2 et à jour 3 (durée < 1 min). Une biopsie de tissu est effectuée sur animal vigile ou anesthésié en fonction de l’âge du prélèvement (durée < 1 min). Les souris sont soumises à une injection sur animal vigile (durée < 1 min).
Impact sur les animaux
Pour le génotypage, une séparation de la mère et de sa portée pendant quelques minutes (10 au maximum), ainsi qu’une contention légère pour chaque animal sont nécessaires, cela peut donc être une source de stress pour les animaux. Une douleur légère de courte durée peut être ressentie lors du prélèvement de tissu effectué sur animal vigile ou anesthésié en fonction de l'âge. Le gavage et l’injection sur animal vigile peuvent être source de stress et de l’anxiété pendant quelques secondes et une douleur légère peut être ressenti lors de l’injection.
Devenir
Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire ou par les organoïdes.
Réduction
Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible stress ou inconfort sont entrepris. Les point limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour connaitre la régulation du système de filtrage de la lymphe vers le ganglion lymphatique et de mieux comprendre la fonction d’un récepteur dans création du filtre pour les petites molécules. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des ganglions lymphatiques. Chez la souris, les structures des ganglions sont bien connues et en plus semblent identiques à l’homme. De plus, la souris étant bien étudiée du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour ces travaux qui reposent sur des modifications génétiques. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux intervenir dans le développement le du système immunitaire.
Processus neuroinflammatoires et interactions intestin cerveau : Rôle des acides gras polyinsaturés pour traiter l’alcoolodépendance – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune gavée quotidiennement pendant deux semaines et soumise à trois tests portant sur la mémoire, l'anxiété et la sociabilité. Les procédures impliquent des niveaux de souffrance légers à modérés. Le modèle repose sur une consommation d'alcool laissée au choix des souris, ce qui, écrit le porteur, augmente le stress et l'agressivité entre elles, et l'étude mesure ensuite si un régime enrichi en oméga-3 limite les effets du sevrage. Les géniteurs, gardés le temps de produire les cohortes, sont mis à mort à la fin des reproductions, et le bénéfice annoncé, une modification des pratiques cliniques pour les 23 millions d'Européens dépendants, est renvoyé à des travaux ultérieurs de partenaires cliniciens.
Objectifs
L'Europe est la région du monde où la consommation d'alcool est la plus élevée, avec environ 23 millions d'Européens dépendants à l'alcool. Cette dépendance constitue un trouble psychiatrique fréquent, pour lequel les traitements restent largement insuffisants. Pour combattre efficacement ce fléau, il est essentiel de mieux comprendre la physiopathologie liée à la consommation d'alcool. En effet, le niveau de consommation d’alcool est un mauvais prédicteur du risque individuel à développer des atteintes graves. Par exemple, le risque de développer une cirrhose du foie chez les grands buveurs varie considérablement et ce indépendamment de la quantité d'alcool consommée. Cela reflète une grande variabilité dans les réponses individuelles à la consommation d'alcool au sein de la population. Cette vulnérabilité se manifeste particulièrement lors de la phase de sevrage chez les patients atteints de troubles liés à la consommation d'alcool (TCA). Elle se caractérise par une présence accrue de facteurs inflammatoires associés à une aggravation des lésions cérébrales, une rigidité cognitive accrue et un besoin compulsif de consommer de l'alcool. Ce projet cherche à comprendre pourquoi certaines personnes sont plus vulnérables aux effets de l’alcool que d’autres. Nous pensons que cette différence est liée aux interactions entre le système immunitaire, et le cerveau. L’objectif est d’analyser l’inflammation dans le cerveau et le reste du corps lors du sevrage et de voir si les oméga-3, connus pour leurs effets anti-inflammatoires, peuvent améliroer les effets du sevrage et réduire le risque de rechute. Pour cela, nous testerons ces effets sur des souris modèles de dépendance à l’alcool.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’identifier les facteurs de vulnérabilité associés à la rechute après une période d’abstinence dans les troubles liés à la consommation d'alcool. De plus, il a pour objectif de déterminer si les oméga-3 (acides gras polyinsaturés n-3) peuvent limiter les risques de rechute chez les patients alcooliques. En l’occurrence il apportera des données objectivées quant à la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans les effets neuroprotecteurs des oméga-3, ce qui est nécessaire pour informer les professionnels de santé et modifier les pratiques cliniques. Ainsi, les oméga-3 pourraient être utilisés chez les patients en stratégie add-on (prévention primaire et secondaire) en association avec l’abstinence pour améliorer la résilience chez les patients. Nos partenaires cliniciens du projet mettront en œuvre les approches en s'appuyant sur nos résultats précliniques. Ainsi notre projet a une forte valeur translationnelle et de transfert de connaissances vers l'homme en plus de générer des nouvelles connaissances dans la physiopathologie de la vulnérabilité à la rechute après sevrage à l'alcool, qui concerne prêt de 60% des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à un gavage gastrique quotidien pendant 2 semaines. Le gavage gastrique est très rapide, il ne dure que quelques secondes. Une collecte de sang sera réalisée au début et à la fin de la période d’abstinence. La collecte de sang est très rapide, pas plus d'une minute. Les tests comportementaux seront réalisés à l'âge adulte pendant quelques minutes, avec 3 tests par animal. Le but de ces tests comportementaux est de regarder l'impact sur la mémoire, l'anxiété, et la sociabilité. Les animaux seront pesés une fois par semaine, pendant la procédure, cela dure moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Le modèle de choix de consommation d'alcool présente un risque d'augmentation de stress et d'agressivité sur les animaux, cependant aucune mortalité n'est documentée sur ce modèle. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées notamment durant les tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les régimes utilisés n'ont pas d'effets délétères sur la santé générale des animaux et ne sont pas toxiques. La contention et le gavage durent quelques secondes et engendre un stress léger sur les animaux, sans altération de leur état général.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort, afin de récupérer les structures et /ou cellules nécessaires du cerveau et du corps pour réaliser les analyses post-mortem dans le cadre des questions scientifiques posées dans le projet. Les géniteurs sont conservés pour permettre de générer les cohortes. A la fin des reproductions, les géniteurs seront mis à mort.
Remplacement
L’étude du rôle de la neuroinflammation, et de l'axe intestin-cerveau dans l'hétérogénéité des troubles de consommation d'alcool nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les mécanismes neurobiologiques et le rôle des oméga-3 dans les troubles de consommation d'alcool, pour ainsi mettre en place des approches nutritionnelles comme traitements préventifs pour améliorer la réussite du sevrage. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Les expériences ne peuvent pas être effectuées dans des modèles computationnels ou encore chez l’homme, car aucune de ces approches ne permet de réaliser toutes ces expériences chez un même sujet. Le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des troubles de consommation d'alcool reste une nécessité expérimentale majeure.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures cérébrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. De plus grâce à des études menées précédemment dans notre laboratoire montrent que pour avoir une puissance statistique suffisante, nous avons montré que 15 souris et les transgéniques sont nécessaire par groupe pour générer des données robustes statistiquement par groupe.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement dans leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
Ces données sur l'effet des oméga-3 (acides gras polyinsaturés n-3) sur le cerveau et la neuroinflammation chez la souris permettra d’affiner les données existantes en les croisant avec les nouvelles données générées. Par ailleurs, les cellules immunitaires du cerveau de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun, ce qui conduit à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat, car notre laboratoire dispose de nombreuses lignées transgéniques, ce qui n’est pas le cas chez le rat. Ce choix s'inscrit dans une démarche de réduction d'animaux. L’utilisation des souris transgéniques est essentielle pour comprendre précisément le rôle des oméga-3 dans ces cellules cérébrales. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines, âge correspond à l’âge adulte chez l’homme, moment auquel débutera la consommation d’alcool. Les tests comportementaux débuteront ensuite sur des animaux âgés de 16 semaines. À partir de 21 jours, les souris transgéniques recevront un régime enrichi en oméga-3, correspondant à la période de sevrage où elles commencent à s’alimenter de manière autonome.
Impact des microplastiques alimentaires sur la réponse inflammatoire intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles boivent pendant 78 jours une eau chargée en microplastiques, et la moitié d'entre elles reçoit en plus un agent chimique qui déclenche une colite, quatre fois cinq jours à quinze jours d'intervalle, avec douleurs, saignements rectaux et perte de poids. Le dernier jour, 180 souris subissent une coloscopie sous anesthésie, puis toutes reçoivent une ponction de sang dans le cœur avant d'être tuées par dislocation cervicale. Le porteur écrit que ce traitement est "sévère mais nécessaire" pour étudier les mécanismes de l'inflammation intestinale, et annonce qu'il baissera la dose au cycle suivant si elle s'avère trop forte.
Objectifs
Les microplastiques sont de minuscules particules, environ 70 fois plus fines qu’un cheveu, que l’on retrouve sous diverses formes (fragments, fibres, films, billes…) et compositions chimiques. Présents partout dans l’environnement, ils s’accumulent dans tous les écosystèmes, entraînant une ingestion involontaire par l’Homme évaluée à environ 52 000 particules par an. Notre projet vise à comprendre comment les microplastiques ingérés affectent le système immunitaire et l’inflammation intestinale. Nous évaluerons leur capacité à induire une inflammation intestinale, seuls ou en combinaison, dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce travail permettront de mieux comprendre par quels mécanismes, les microplastiques affectent la santé de l’intestin et dans quelle mesure ces derniers sont responsables de l’aggravation de l’inflammation de l’intestin. Les résultats nous permettront aussi de déterminer si certains microplastiques sont plus néfastes que d’autres. De tels résultats sont indispensables pour comprendre comment la pollution environnementale influence notre santé digestive et pour proposer de nouvelles approches thérapeutiques aux patients chroniques afin de freiner la progression de la maladie et d’améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Ce projet comporte 4 interventions : (1) L’administration des microplastiques via l’eau de boisson dans les biberons, pendant toute la durée du projet (78 jours) sur 320 animaux (tous sauf les contrôles), (2) le traitement pro-inflammatoire pour induire l’inflammation intestinale sera réalisé sur la moitié des animaux (200) avec un agent chimique administré dans l’eau de boisson 4 fois, à raison de 5 jours tous les 15 jours. (3) La coloscopie, examen de quelques minutes (10 maximum), sera réalisé sur 180 animaux le dernier jour du protocole sous anesthésie générale. (4) Un prélèvement de sang intracardiaque (3 minutes) sera réalisé sous anesthésie générale sur la totalité des animaux juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
L’administration des microplastiques via l’eau de boisson ne devrait pas induire de nuisance pour les animaux et ne pas provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif des animaux. Le traitement pro-inflammatoire (200 animaux) induit des inconforts, de la douleur, une perte de poids liée à une diminution de la prise alimentaire et/ou des saignements rectaux. Ce traitement est sévère mais nécessaire pour étudier les mécanismes de l’inflammation intestinale. Ce modèle est maîtrisé par le laboratoire depuis longtemps et le protocole proposé a été validé dans un projet précédent. Nous savons repérer les symptômes rapidement afin de limiter la souffrance des animaux. La coloscopie (180 animaux) et le prélèvement sanguin intracardiaque (tous les animaux) seront réalisés sous anesthésie générale suivis immédiatement de la mise à mort par d’une dislocation cervicale. Il n’est pas attendu d’effets indésirables de ces interventions pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort après la dernière intervention afin de récupérer les différents organes.
Remplacement
La toxicité des microplastiques a été étudiée in vitro sur des modèles de cellules épithéliales intestinales et cellules immunitaires. Néanmoins, ces modèles in vitro ne permettent pas, actuellement de reproduire entièrement le processus d’inflammation intestinale. En effet, la complexité de la physiologie intestinale implique plusieurs systèmes cellulaires distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal. Les réponses inflammatoires sont des processus temporels et évolutifs impliquant tous les organes liés ou non au tube digestif dont les ganglions lymphatiques et la rate. Ainsi, aucun modèle in vitro ne peut actuellement se substituer aux modèles animaux pour étudier de manière fiable et intégrée les mécanismes sous-jacents à notre question de recherche.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre de souris par groupe, à savoir 40 souris par groupes réparties dans 10 groupes, soit un total de 400 souris, pour obtenir la puissance statistique suffisante pour toutes les analyses prévues, conformément aux exigences éthiques en expérimentation animale. Sur la base des données issues de la littérature scientifique et de nos données précédentes, les test statistiques réalisés ont donné un nombre d'animaux à 40 par groupe afin d'obtenir la puissance statistique nécessaire pour réaliser à la fois les analyses in vivo (colite expérimentale, endoscopie rectale) et post mortem (profil immunitaire par cytométrie en flux, analyses transcriptomiques, microbiote intestinal, histologie, dosages biologiques) aux deux points finaux prévus dans le projet. Les expériences ont été conçues afin de réaliser un maximum d’analyses différentes compatibles sur les mêmes animaux afin d'en réduire le nombre tout en ayant suffisamment de matériel pour réaliser les différentes analyses. Cette approche intégrée vise à maximiser les données obtenues par individu et à limiter au strict minimum le nombre total d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées, avec à disposition des copeaux de bois, des cabanes en métal pour se cacher et grimper, et des buchettes de bois pour usure des dents. Pour éviter toute source extérieure de contamination en plastique, les enrichissement en carton et plastiques ne seront pas utilisés. Les coloscopies et prélèvements intracardiaques se feront sous anesthésie générale (isoflurane 4% à l’induction puis réduite à 2% en maintien), sans réveil. Une procédure d’estimation et de suppression de la douleur est mise en place en amont. Pendant la colite, l’activité de la maladie sera scorée quotidiennement. De plus, les animaux seront surveillés deux fois par jour pour détecter des signes éventuels de mal-être (prostration/mouvements, yeux fermés/grimace, dos voûté, aspect du pelage, déshydratation). Le point limite est fixé selon ce score et les signes éventuels de mal-être (Annexe 3). A la fin de ce protocole, les animaux seront mis à mort et les organes prélevés permettront des analyses biologiques. Le modèle de colite expérimentale est un modèle maîtrisé par le laboratoire depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement pro-inflammatoire est aussi très dépendante de l’environnement (microbiote intestinal). Si la dose s’avère trop sévère au premier cycle, elle sera réduite pour les cycles suivants. Grâce à notre expertise, nous sommes en mesure de repérer très rapidement les signes cliniques de la maladie afin d’intervenir sans délai et de limiter au maximum la souffrance animale.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix dans l’étude des maladies inflammatoires de l’intestin. Le modèle d’inflammation par agent chimique est très largement utilisé en raison de sa simplicité d'administration (dans l'eau de boisson), de la facilité de contrôle du dosage (pour déterminer la gravité) et de la durée courte d’analyse du processus inflammatoire et de « récupération ». En matière d’étude préclinique, ce modèle reste le modèle de choix couramment décrit dans la littérature. Les souris utilisées auront 8 à 9 semaines. Le projet démarrera après deux semaines d’acclimatation. Ce stade correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au passage au stade « Jeune Adulte», ce qui correspond aux besoins du projet, les patients étant majoritairement de jeunes adultes.
Evaluation de l’effet thérapeutique de la cytokine IL-34 humaine dans des modèles de maladies inflammatoires chroniques chez la souris NSG humanisée
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Dépourvues de système immunitaire fonctionnel par construction génétique, les souris NSG utilisées ici reçoivent des cellules humaines qu'elles ne peuvent pas rejeter. 280 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Irradiation sur animal vigile, injection intraveineuse de cellules humaines, prélèvements sanguins derrière l'orbite de l'œil toutes les deux semaines, instillation intra-rectale d'un mélange de produits, pose de mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale, le suivi courant de la cinquième à la vingtième semaine de vie. Le porteur conclut que le passage à ces animaux dits humanisés est "indispensable" pour évaluer une molécule dont les essais sur cellules humaines ont déjà donné, selon lui, des résultats prometteurs.
Objectifs
L'objectif est d’étudier l’effet thérapeutique d’une molécule régulatrice afin d'approfondir notre compréhension des mécanismes d’action de cette molécule sous sa forme native et de les comparer à des formes modifiées dans des modèles de maladies inflammatoires, dont la composante immunitaire est bien décrite. Ce projet fait suite à de précédents travaux au sein de notre équipe et vise ici à tester la meilleure molécule modifiée et ses versions améliorées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’intérêt thérapeutique de cette molécule humaine dans de nouveaux modèles de maladies inflammatoires, ainsi que de confirmer les résultats obtenus précédemment par l’équipe en testant notre molécule modifiée favorite ainsi que ses formes améliorées et optimisées pour une possible utilisation en clinique.
Procédures
Irradiation des souris vigiles (1 fois, 3 minutes/souris) ; Injection des cellules humaines par voie intraveineuse sur souris vigiles (1 fois, 5 minutes/souris) ; Prélèvements sanguins des souris sous anesthésie gazeuse (2 fois les 3-4 premiers mois puis tous les deux semaines, 5 minutes/souris) ; Instillation de mélange de produits en intra-rectal sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes/souris) ; Injection des traitements en intraveineuse (1 fois, 5 minutes/souris) ou en intra-péritonéale (1 fois/jour pendant 10 jours, 2 minutes/souris) sur souris vigiles ; Mise en place des mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale (1 fois, 30 minutes/souris)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés 1. À l'injection de cellules humaines (douleur) ; 2. A l’injection intra-rectale d’un mélange de produits (douleur) ; 3. Intervention chirurgicale pour la mise en place de mini-pompes sous la peau (douleur, saignement) 4. Injection des traitements en intraveineuse ou intra-péritonéale ; 5. Au prélèvement sanguin réalisé derrière l'orbite de l'œil (douleur, saignement). Ces interventions sont réalisées sous anesthésie générale (gazeuse) et/ou analgésie (pré et post-opératoire pour les mini-pompes) pour pallier aux différentes douleurs rencontrées par les animaux, même si elles peuvent néanmoins conduire à une douleur légère et de courte durée, ainsi qu'à un stress.
Devenir
A la fin de l’expérience, tous les animaux seront autopsiés afin d’effectuer des prélèvements d’organes/tissus ce qui justifie l’euthanasie de chaque souris.
Remplacement
Malgré des résultats prometteurs dans les études fonctionnelles in vitro de la molécule native et des molécules modifiées sur cellules humaines, ceux-ci sont limités par l'absence de contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire. Le passage aux modèles in vivo chez des animaux dit « humanisés » (proche de l’homme, car mimant le système immunitaire humain) est indispensable pour évaluer l’effet de cette molécule humaine et de ces nouvelles formes modifiées.
Réduction
Pour ce projet, le nombre minimum d’animaux sera utilisé et analysé par le biais de tests statistiques, permettant d’obtenir des résultats robustes et significatifs. Nous prévoyons d’utiliser au maximum 280 animaux répartis sur 3 protocoles différents. Si nous n’observons pas d’effet in vivo lors de premiers tests (groupe de 3 à 4 souris par expérience), les expériences ne seront pas reproduites et la totalité des souris ne sera donc pas utilisée.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux maximum et auront des formes d’enrichissements à leur disposition (Sizzle nest, tube, dôme) afin de réduire leur stress. Dans tous les protocoles mis en œuvre, les interventions invasives et les interventions chirurgicales plus longues seront effectuées sous anesthésie gazeuse et analgésie ou sous anesthésie générale associée à une analgésie pré et post-opératoire. Les animaux seront suivis quotidiennement dès le début du protocole, au niveau du poids et de l’apparition de signes cliniques. Enfin, des points limites ont été mis en place et seront appliqués en cas de souffrance de l’animal.
Choix des espèces
Ce projet a pour but d’étudier une molécule humaine dans une perspective thérapeutique. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal capable d’accueillir des cellules humaines. Nous avons choisi la souris car certaines lignées particulières n’ont pas de système immunitaire fonctionnel, ce qui permet d’y greffer des cellules humaines sans qu’elles soient rejetées. La souris est également un animal couramment utilisé en recherche, car elle se reproduit facilement, son hébergement est bien maîtrisé et sa manipulation est relativement simple. Les souris recevront les cellules humaines lorsqu’elles auront 4 à 5 semaines, un âge où elles sont assez robustes pour supporter la procédure. Elles seront ensuite suivies jusqu’à environ 16 à 20 semaines, âge auquel leur croissance est terminée et leur poids est stable. Cela facilite les manipulations, comme l’injection des traitements ou les prélèvements d’échantillons, tout en assurant un suivi attentif de leur bien-être.
Etude du rôle de l’IL10 dans l’augmentation des NK après traitement par anti VEGFR2 chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une greffe de cellules tumorales puis une injection de traitement, chacune d'une minute, résument à elles seules les procédures décrites pour 60 souris. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes sont tuées à l'issue. La tumeur ainsi implantée peut réduire leur mobilité et leur capacité à se nourrir, et provoquer des nécroses cutanées que le porteur qualifie de très rares, ce qui laisse le protocole tenir en deux minutes de manipulation par animal quand la croissance tumorale, elle, court sur toute la durée de l'étude. Les 60 souris sont mises à mort pour analyser le microenvironnement de leur tumeur.
Objectifs
Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Plusieurs études se sont déjà attachées à identifier le rôle des différents globules blancs au cours d’un cancer et d’autres études ont montré que la chimiothérapie pouvait moduler les proportions des différentes populations de globules blancs. L’immunothérapie est une catégorie de traitement très prometteur, notamment dans le cancer colorectal mais les conséquences de tels traitements sur les globules blancs restent à déterminer précisément afin de potentiellement améliorer leur efficacité. Le but de ce projet est d’étudier comment l’interaction entre 2 acteurs immunitaires impacte le reste de la réponse immunitaire au sein de la tumeur.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - 2 administrations de 60 secondes chacune pour administrer un traitement unique et afin de permettre le développement d’une tumeur
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à 2 injections de 1 minute chacune. L’administrations du traitement n’est pas connue pour être particulièrement douloureuses, particulièrement sous anesthésie. L’injection des tumeurs pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. Il est parfois possible d’observer la formation de nécroses cutanées mais elles sont très rares dans le modèle choisi pour cette étude et cette durée d’étude. Les injections sur animaux vigiles pourront entrainer du stress. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (60) pour analyse du microenvironnement tumoral.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. 10 animaux par groupe seront utilisés pour évaluer l’impact ou non de ces différents traitements sur le système immunitaire. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être importantes, nous répèterons les expériences 3 fois de manières indépendantes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 10 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Chaque animal sera examiné et pesé 3 fois par semaine, tout le long de l’expérimentation. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. L’injections de cellules tumorales sera réalisée sous anesthésie. Aucune douleur associée à ce geste n’est donc attendue. L’injection de traitement sera réalisée sur des souris vigiles. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.
Choix des espèces
Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de par l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 14 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature
Étude de la réponse immunitaire associée aux cellules dendritiques et lymphocytes T dans le microenvironnement tumoral du mélanome cutané
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1 244 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, presque toutes tuées à l'issue, quinze restant en accouplement continu pour entretenir les lignées. 148 reçoivent sur les oreilles un analogue de la vitamine D pendant trois jours pour déclencher un mélanome, 540 une injection intradermique de cellules dendritiques dans les deux oreilles, 556 des injections intrapéritonéales d'immunothérapie deux fois par semaine pendant deux semaines. Le porteur annonce inflammation, démangeaisons et rougeur des oreilles, et une mise à mort dès que la tumeur atteint un centimètre cube. Il justifie le recours aux souris par le fait que le microenvironnement tumoral engage plusieurs organes, ce qui rend selon lui l'expérience in vivo "nécessaire", onze lignées génétiquement modifiées étant mobilisées.
Objectifs
Le mélanome cutané est un cancer se développant à partir de mélanocytes cancéreux, les cellules pigmentées de la peau. Le système immunitaire est généralement en mesure d’éliminer les cellules tumorales. Toutefois, les cellules tumorales peuvent perturber la réponse immunitaire de manière à favoriser leur propre croissance, ce qui impacte négativement le pronostic des patients atteints de mélanome cutané. Ce cancer de la peau est hautement agressif, premièrement à cause de son potentiel à métastaser, et deuxièmement par sa fréquente résistance à la plupart des immunothérapies et thérapies ciblées utilisées aujourd’hui. Notre laboratoire s'intéresse à une molécule qui possède un rôle pro-tumoral dans le microenvironnement tumoral associé au mélanome cutané. Cependant, les cellules et molécules impliquées dans la réponse immunitaire pro-tumorale sont encore mal connues. Le projet vise donc (1) à étudier dans un modèle murin de mélanome cutané, l’impact de cette molécule sur les différentes sous-populations cellulaires immunitaires ; (2) à identifier et étudier la fonction des sous-populations cellulaires immunitaire induite par cette molécule ; et enfin (3) à évaluer et améliorer l’effet du blocage de cette molécule associée à une thérapie déjà utilisée pour soigner les mélanomes cutanés chez l'humain. Afin de répondre à ces questionnements, nous étudierons la réponse immunitaire au niveau du microenvironnement tumoral associé au mélanome cutané ainsi que dans les ganglions lymphatiques drainant la tumeur et dans le sang.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à approfondir notre compréhension de la réponse immunitaire impliquée dans le développement du mélanome cutané. Par ailleurs, ces nouvelles connaissances sur les différentes sous-populations cellulaires immunitaires dans le microenvironnement tumoral pourraient nous permettre éventuellement de la moduler en agissant sur ces types cellulaires spécifiques. De plus, cette étude permettra également d'évaluer le potentiel d’une nouvelle cible thérapeutique afin d’améliorer la survie des patients atteints de mélanome cutané.
Procédures
Lors de la 1ère partie, 148 souris au maximum seront anesthésiée par voie gazeuse et traitées pendant une durée de 3 jours (le traitement est d'une durée d'environ 30 secondes) afin d'induire un mélanome cutané. Pour la 2ème partie du projet, 540 souris seront anesthésiées et injectées par voie intradermique avec des cellules immunitaires au niveau des deux oreilles, et gardés pendant 7 jours (l'injection est d'une durée de 6 minutes). Enfin, la 3ème partie concernera 556 souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale 2 fois par semaine pendant 2 semaines (durée de 20 secondes) avec une immunothérapie combinée.
Impact sur les animaux
Une minorité des animaux de 2 lignées de souris utilisées (moins de 30% des effectifs) est susceptible de développer un phénotype dommageable se traduisant par l'apparition de tumeurs spontanées non pigmentées et à croissance rapide, un suivi particulièrement attentif sera mis en place. L'application d'analogue de ka vitamine D sur les oreilles des animaux sous anesthésie gazeuse légère engendrera un léger stress d'une courte durée. (Lors des transferts des cellules dendritiques, les animaux donneurs seront de la même espèce, du même sexe et du même fond génétique que les animaux receveurs (qui recevront l'injection de ces cellules) éliminant les risques de rejet. Néanmoins, cette procédure engendrera un léger stress et douleur d'une courte durée sur les animaux receveurs et une inflammation au niveau des oreilles, accompagnées de démangeaisons et d'une rougeur. Les injections intrapéritonéales d'anticorps sur d'autres modèles ont déjà été réalisées par le passé dans notre équipe, et nous n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection et un stress du à la contention sera ressenti pendant un temps court ( quelques secondes). Le traitement avec des anticorps devrait faire régresser la tumeur mais une rougeur pourrait apparaitre sur la peau recouvrant la tumeur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales afin de prélever les différents organes ou tissus nécessaires à l'étude de la réponse immunitaire dans le mélanome cutané. permettent de maintenir les lignées utilisées dans ce projet de recherche. Au maximum 15 animaux seront utilisés pour les expérimentations en utilisation continue, pour avoir 5 accouplements en continu.
Remplacement
Les lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet vont nous permettre d'étudier des gènes ou des cellules dont l'implication dans le mélanome a été suggéré in vitro par notre laboratoire ainsi que d'autres. Les phénomènes impliqués dans le mélanome cutané mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires qui composent l'ensemble du microenvironnement tumoral. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Afin de différencier les rôles de différentes cellules et molécules pouvant être impliquées dans le développement du mélanome, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 11 lignées de souris différentes et d'un maximum de 1204 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions statistiquement significatives. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro ont été réalisées afin d’éliminer certaines hypothèses et de mieux définir les expériences à effectuer sur les modèles in vivo.
Raffinement
Tous les animaux feront l'objet d'une observation quotidienne basée sur leur apparence générale, leur posture et leur comportement. Tous les animaux intégrés dans une procédure expérimentale seront soumis à l'application de points limites définis, stricts et spécifiques de ce projet. En cas de signes cliniques tels qu'un dos courbé, un pelage ébouriffé, une absence de réaction aux stimuli ou encore une inflammation ou une infection au niveau des sites d'injection, l'animal sera retiré de l'étude et pourra recevoir des soins selon l'avis du vétérinaire. Si l'état de l'animal est jugé critique (blessure importante par exemple), une euthanasie immédiate sera pratiquée. Pour les souris développant des tumeurs cutanées, un suivi renforcé sera assuré quotidiennement. Le volume tumoral sera mesuré à l'aide d'un pied à coulisse et l'euthanasie sera réalisée si la taille de la tumeur atteint 1 cm3. Toutes procédures pouvant induire douleur ou stress chez l'animal sera effectuée sous anesthésie légère gazeuse, n'engendrant qu'un stress léger de courte durée dû à la contention. Les animaux seront hébergés en groupe et auront un accès constant à de l'eau et de la nourriture pendant toute la durée de l'expérience.
Choix des espèces
Les mécanismes cellulaires dans le microenvironnement tumoral du mélanome cutané impliquent plusieurs organes différents (peau, ganglions lymphatiques, etc.) et ces interactions inter-organes nécessitent plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre la croissance tumorale, l'implication du système immunitaire et à terme, identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.
Rôle de la communication cytokine-microbiote dans l’homéostasie intestinale : étude de la physiologie et de la régénération de l’intestin du poisson zèbre
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
À quatre jours de développement, des larves de poisson zèbre ont l'intestin sectionné en deux sous anesthésie, geste que le porteur chiffre à dix secondes. 29 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 645 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 11 205 un niveau modéré et 1 350 un niveau sévère. La mortalité annoncée après cette section intestinale atteint environ 20 %, et le porteur prévoit que certains inhibiteurs testés altèrent la régénération, ce qui pourrait encore l'augmenter. 16 725 individus restent vivants au titre de l'élevage des lignées, les autres sont tués par surdose d'anesthésique après cinq séances d'observation au microscope, pour analyse post mortem.
Objectifs
Les cytokines sont des acteurs essentiels du système immunitaire, assurant la communication intercellulaire grâce à des récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules cibles, qui transmettent leur signal. Produites principalement en réponse à un agent infectieux (virus, bactérie ou constituant) par les cellules lympoides innées (ILC), elles agissent comme médiateurs de l’immunité. La colonisation intestinale par les micro-organismes commensaux (organismes vivant dans l’hôte sans lui nuire) débute avec l’ingestion de nourriture et s’intensifie avec l’introduction d’aliments secs dans l’alimentation des poissons. Cytokines et microbiote participent à des processus cellulaires comme la prolifération, la mort et la migration des cellules. Ils jouent aussi un rôle clé dans l’inflammation et la fonction de barrière intestinale, qui empêche le passage du contenu (microbes, toxines, etc) de l’intestin vers l’intérieur du corps. Cependant, leurs interactions restent mal comprises, notamment durant la physiologie normale et la régénération après une lésion grave de l’intestin. L'objectif principal du projet est d'étudier le rôle de l'interaction entre les cytokines et le microbiote dans la physiologie et la régénération de l'intestin après une blessure qui laisse l'intestin non fonctionnel. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons le poisson-zèbre, qui est largement utilisé dans les études biologiques. Ce modèle offre des avantages uniques, tels que sa transparence durant les premiers stades de développement, permettant d’observer les conséquences des interactions entre le microbiote et les cytokines dès les premiers jours de vie. Il présente également une grande capacité de régénération, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les facteurs déterminant une régénération tissulaire réussie. L’identification de ces facteurs et la compréhension de leurs mécanismes moléculaires ont pour but d’apporter des connaissances utiles à la régénération intestinale humaine après une lésion.
Bénéfices attendus
La régénération est la capacité à restaurer un organe ou un tissu endommagé par une blessure ou une dégénérescence. Cependant, les mammifères, y compris les humains, ont un potentiel régénératif limité, qui diminue avec l'âge. En conséquence, les dommages graves subis par de nombreux organes essentiels sont irréversibles, ce qui entraîne des problèmes de santé potentiellement mortels. Bien que l'on ait longtemps pensé qu'il avait été perdu au cours de l'évolution, le potentiel régénératif semble persister à l'état latent et pourrait être réactivé. Il est donc très important et utile d'identifier les mécanismes fondamentaux de la régénération chez les espèces qui sont naturellement capables de se régénérer efficacement. Le poisson zèbre, en raison de sa remarquable capacité à régénérer la plupart de ses organes, est devenu un modèle de référence en biologie régénérative. Il a révélé que certains mécanismes de régénération sont conservés chez les mammifères et pourraient être réactivés, ouvrant la voie à des approches innovantes en médecine humaine (doi: 10.3390) Ce projet vise des avancées significatives pour la santé humaine et la médecine régénérative en étudiant le rôle clé des cytokines et du microbiote dans la guérison intestinale. À court terme, il pourrait améliorer notre compréhension des maladies intestinales telles que les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) et, à long terme, inspirer des traitements innovants pour les lésions graves, réduisant la nécessité d'interventions chirurgicales complexes. Cela bénéficierait non seulement aux humains mais aussi à d'autres espèces, tout en approfondissant nos connaissances scientifiques sur les interactions entre notre corps et les micro-organismes.
Procédures
À 4 jours après la fécondation, les larves subiront une intervention : une partie de leur tube digestif, située près de leur sortie uro-génitale, sera coupée en deux parties après qu’elles aient été profondément anesthésiées (La coupe de l’intestin ne prend pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Une fois remises, les larves seront de nouveau anesthésiées (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) pour être observées au microscope sans stress. Cette observation sera répétée 5 fois jusqu’à leurs 10 jours de développement. Certaines larves seront prélevées après observation et euthanasiées avec une forte dose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. D’autres larves recevront des substances (appelées "drogues" en termes scientifiques) qui pourraient influencer la régénération de l’intestin. Ces drogues seront directement administrées dans l’eau des larves pendant une durée qui est fonction de la drogue mais connue de la littérature. Ensuite, les larves sont remises dans une eau sans droque. Elles seront également observées par imagerie pour voir si ces substances ont un effet (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) Au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. Enfin, nous ferons grandir des larves dans un environnement stérile, sans microbes grâce à un milieu contenant des antibiotiques. À 5 jours, elles subiront aussi une coupure de l’intestin sous anesthésie (pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Ces larves seront ensuite placées avec d’autres larves élevées dans un environnement normal (sans antibiotique), contenant des microbes. Ces larves seront observées 5 fois sous le microscope sous anesthésie (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) jusqu’à leurs 10 jours de développement. Comme précédemment, au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Il est possible que certaines lignées créées présentent des phénotypes dommageables entraînant par exemple des scolioses prématurées ou des problèmes de reproduction. Pour génotyper le poisson, il est nécessaire de prélever du tissu par biopsie (ici, un prélèvement de quelques millimètres de la queue), ce qui induit une douleur légère lors de l’incision. L’intervention ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement de très faible taille induit une gêne légère dans le déplacement, la régénération de la nageoire étant complète en moins de 5 jours. Suite à la coupe de l’intestin, les poissons peuvent ressentir une gêne pour la nage. Le taux de mortalité est autour de 20% suite à cette chirurgie. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement Suite à nos travaux issus d’une autre autorisation, nous ne rencontrons pas de mortalité dû aux antibiotiques présents dans le milieu.dû aux antibiotiques présents dans le milieu. En ce qui concerne l'utilisation d'inhibiteurs, leur utilisation a déjà été rapportée dans des articles de recherche utilisant des larves de poisson zèbre. Nous appliquerons donc les traitements (concentration et durée d'exposition) décrits dans la littérature. Nous nous attendons à ce que certains inhibiteurs altèrent le processus de régénération, ce qui pourrait potentiellement entraîner une augmentation de la mortalité après une blessure.
Devenir
A l’exception de la première procédure d’élevage de poissons utilisés ensuite dans les procédures suivantes, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Pour notre projet, nous nous appuyonsà la fois sur sur des données déjà accessibles au public et sur nos propres données de séquençage de l’ARN issues du modèle poisson-zèbre. Cettetechnique permet d’identifier et de quantifier le matériel génétique à un moment précis Actuellement, la culture in vitro de l’intestin et sa colonisation par un microbiote restent actuellement impossibles. Par ailleurs, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Il est donc difficile de trouver un remplacement efficace et suffisamment proche des mécanismes que nous souhaitons étudier.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les tailles des lots ont été déterminées en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les observations ont été définies selon notre expérience et celle de collaborateurs. Les expériences sont généralement courtes, et les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute intervention, chirurgicale (biopsie de la queue pour l’identification, coupe de l’intestin pour le projet) ou non chirurgicale (imagerie). Pour déterminer le génotype, nous mettons en place l’écouvillonnage (prélèvement d’ADN contenu dans le mucus par frottement de la peau avec un coton) en parallèle de la coupe de queue. Cela permettra de comparer les résultats et d’évaluer si cette méthode, moins invasive, est aussi fiable. À terme, elle pourrait remplacer le finclip. Tout le matériel utilisé sera stérilisé ou décontaminé pour limiter les risques d’infection et favoriser la cicatrisation. Après intervention, les poissons seront placés 24 h dans un bac équipé d’un séparateur transparent, sur fond de galets, contenant un milieu avec analgésique et antifongique. La cicatrisation est obtenue en 1 jour et la régénération de la queue en 5 jours. La coupe prend moins de 30 secondes hors de l’eau. Un suivi du réveil et du bien-être est réalisé selon une grille validée par l’animalerie. Pour la coupe intestinale, la larve est anesthésiée. L’intervention dure 10 secondes. Du matériel stérile à usage unique est utilisé. Après la chirurgie, l’animal est placé dans un milieu contenant un antiseptique. La cicatrisation s’observe en 2 jours, avec un suivi selon une grille établie avec le SBEA. En cas de signe de mal-être d’un poisson, nous agirons pour réduire le stress / douleur.. L’animal est mis à mort si son état le nécessite. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Grâce à cela, les animaux n’ont pas besoin d’être génotypés. Il suffit d’observer les larves très jeunes (autour de 4 jours après la fertilisation des oeufs) pour visualiser l’expression du gène d’intérêt et sélectionner ainsi les animaux.
Choix des espèces
Notre compréhension du rôle des cellules, des gènes de l'hôte et du microbiote dans le développement des organes des vertébrés reste limitée chez les mammifères. Ces modèles rendent difficile la manipulation précise de l'environnement et le suivi en temps réel du développement intestinal. Pour dépasser ces obstacles, nous utilisons le poisson zèbre, un modèle qui allie ses atouts naturels aux avancées technologiques. Partageant 70 % de ses gènes avec l'Homme, le poisson zèbre est idéal pour étudier le développement des vertébrés grâce à sa facilité de manipulation génétique, sa descendance abondante, sa transparence et son développement rapide hors de l’organisme maternel. Ce modèle permet également d'explorer les interactions spécifiques au microbiote et les mécanismes de régénération cellulaire. Enfin, les similitudes immunitaires entre poissons et mammifères renforcent son intérêt scientifique. Pour l’élevage, nous aurons besoin d’animaux de 5j jusqu’à 18 mois. Des protocoles expérimentaux autres que les techniques d’élevage s’effectueront sur des larves de 4 jours jusqu’à 10 jours. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoce.
Utilisation à visée thérapeutique de bactéries pour induire des structures lymphoïdes tertiaires dans des modèles murins de cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 598 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent des cellules tumorales qui forment des tumeurs du poumon, jusqu'à quatre injections de bactéries, jusqu'à six injections d'anticorps et, pour les porteuses de tumeurs, une à deux séances d'imagerie sous anesthésie par semaine pendant trois à cinq mois. Le porteur indique que les bactéries peuvent provoquer une douleur modérée et une difficulté à se mouvoir et à s'alimenter, et que les tumeurs peuvent entraîner douleur, perte de poids et réduction de la mobilité, les souris atteignant un point limite étant alors tuées. Le but est de savoir si ces bactéries font apparaître dans les tumeurs des amas de cellules immunitaires qui renforceraient les immunothérapies, et le porteur qualifie la souris de "modèle nécessaire et indispensable" pour les étudier.
Objectifs
Les immunothérapies, notamment les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ou ICI), ont révolutionné le traitement de plusieurs cancers solides, dont le cancer du poumon. Cependant, seuls jusqu'à 40 pour cent des patients atteints d'un cancer du poumon obtiennent une réponse après traitement par ces immunothérapies. Des recherches récentes ont montré que la présence, dans les tumeurs, de petits groupements de cellules immunitaires appelés "structures lymphoïdes tertiaires" (ou TLS) est liée à une meilleure réponse à ces traitements. Ces structures se forment en cas d’inflammation et disparaissent une fois l’inflammation résolue. Il a été récemment montré qu’une molécule, issue de certaines bactéries, pouvait provoquer l’induction de TLS dans les poumons de souris. Ce projet vise donc à tester si certaines bactéries peuvent, elles aussi, induire la formation de ces structures, et si cela améliore l’efficacité des immunothérapies dans des modèles murins de cancer. Nous chercherons aussi à comprendre les mécanismes impliqués dans la formation et la maturation des TLS, dans l’objectif, à long terme, de développer de nouvelles stratégies pour renforcer l’efficacité des traitements chez les patients atteints de cancer.
Bénéfices attendus
En France, le cancer du poumon touche plus de 50 000 personnes chaque année et est responsable de près de 33 000 décès. Il représente également un coût économique majeur estimé à plus d’un milliard d’euros par an pour le système de santé. Malgré les avancées en immunothérapie, notamment avec les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ICI), seulement environ 40 pour cent des patients atteints d’un cancer du poumon répondent favorablement à ces traitements. Ce projet vise à renforcer l’efficacité des immunothérapies. Il reposera sur un modèle de cancer du poumon chez la souris, dans lequel des bactéries seront administrées soit à titre préventif (comme une vaccination), soit à titre curatif (après l’apparition de la tumeur). L’objectif est d’évaluer leur capacité à induire des structures immunitaires dans les tumeurs, appelées structures lymphoïdes tertiaires (TLS), et à améliorer la survie des souris. Le projet permettra de déterminer : 1) si ces bactéries améliorent la survie des souris et induisent la formation de TLS ; 2) si l’effet thérapeutique de ces bactéries est dû à la formation des TLS ; 3) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’effet thérapeutique de ces bactéries 4) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’induction et de la maturation de TLS. Les résultats de ce projet pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteints de cancer, soit en utilisant directement ces bactéries comme traitement, soit en développant de nouvelles molécules capables de stimuler la formation de TLS dans les tumeurs. Cette approche pourrait s’appliquer non seulement au cancer du poumon, mais aussi à d’autres types de cancers dans lesquels la présence de TLS est associée à un meilleur pronostic
Procédures
Les animaux seront soumis à : des injections pour administrer les cellules tumorales (animal vigil ou anésthésié, 1 à 2 fois, 1 minute), des injections pour administrer les bactéries (animal vigil, 1 à 4 fois, 1 minute), un suivi par imagerie (animal anesthésié, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois, 15 minutes) avec injection au préalable de produit de contraste (animal vigil, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois maximum, 1 minute) pour les animaux avec tumeurs, une injection d'une substance qui agit sur le système nerveux (animal vigil, 2 fois, 1 minute) ainsi qu'une injection d’anticorps dans certains cas (animal vigile, jusqu’à 6 fois au maximum, à raison de 2 fois par semaine pendant 3 semaines au maximum, 1 minute).
Impact sur les animaux
Les manipulations des animaux pourront induire un stress. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les injections répétées peuvent induire un risque de péritonite. L’injection de bactéries pourra engendrer une réponse inflammatoire générant une douleur modérée à l’animal associée à une difficulté de se mouvoir et s’alimenter. L’injection de cellules tumorales pourrait engendrer une gêne à se mouvoir. L'imagerie in vivo sera effectuée sous anesthésie et pourra engendrer une baisse de la thermorégulation. Ces administrations et anesthésies pourront également engendrer une gêne respiratoire transitoire. L'induction de tumeur pourra induire une douleur modérée, une perte de poids ainsi qu'une réduction de la mobilité.
Devenir
Les souris injectées avec des cellules tumorales développeront des tumeurs pulmonaires. Dès l’apparition de signes cliniques indiquant l’atteinte d’un point limite défini, elles seront euthanasiées afin de prévenir toute souffrance inutile. Les autres animaux seront euthanasiés à des temps définis expérimentalement pour permettre le prélèvement d’organes. Ces échantillons seront utilisés pour analyser la réponse immunitaire induite, notamment l’organisation locale du système immunitaire suite à l’injection de bactéries ou en réponse à la présence de cellules tumorales.
Remplacement
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du BCG (Bacillus Calmette-Guérin), une souche atténuée de Mycobactérium Bovis, et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo.
Réduction
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du traitement et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé par un calcul de puissance statistique et réduit au strict nécessaire pour atteindre les objectifs sans compromettre la validité des résultats. En raison de la variabilité de la croissance tumorale entre les souris, 7 souris par groupe seront utilisées dans les expériences suivant l’effet des traitements sur la survie et la progression tumorale (jusqu’à atteinte d'un point limite ou au maximum 3 mois après la dernière injection de cellules tumorales). Pour étudier la présence et le stade de maturation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS), 3 souris par groupe seront utilisées à chaque point temporel. Afin d’établir les cinétiques d’induction et de maturation des TLS, 5 souris par time point seront nécessaires. Les analyses par cytométrie nécessiteront quant à elles 7 souris par groupe et par point temporel. Les écarts attendus entre les groupes devraient garantir une puissance statistique suffisante malgré la taille restreinte des groupes. Pour les expériences nécessitant des souris survivantes, 20 animaux seront inclus initialement pour assurer un nombre suffisant de survivantes, qui seront ensuite soit réinjectées avec des cellules tumorales, soit euthanasiées pour récupérer les cellules immunitaires. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie, permettant des mesures répétées sur un même animal. Chaque expérience sera répétée au moins 2 fois afin d’assurer la reproductibilité des résultats, conformément aux bonnes pratiques expérimentales. Au total, 3 598 animaux seront utilisés dans ce projet
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des portoirs ventilés dans un environnement A2 et ne seront expérimentés qu'après une semaine minimum de stabulation. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (hébergement individuel limité à la fin des expériences s’il ne reste qu’une seule souris survivante dans la cage) en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec 2 des enrichissements ci-après : 6 à 10 bâtonnets de coton, 1 à 2 rouleau en carton ou 1 à 2 maisonnette. La taille des cages est variable, permettant d’héberger jusqu’à 12 souris, tout en respectant la densité réglementaire. Dans les situations nécessitant un hébergement individuel de l’animal (dernier animal dans la cage), il bénéficiera d’un enrichissement en plus et il sera vérifié par le responsable du Bien-Être Animal de l'animalerie pour valider son hébergement individuel. Les conditions de températures et d'hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Dans la réalisation de ce projet, l'ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie). Tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum les nuisances. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. L'évolution tumorale sera suivie et mesurée. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les animaux seront vérifiés quotidiennement. Ils seront également pesés au minimum deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de la procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie).
Choix des espèces
L’utilisation de souris comme modèle est un outil précieux pour étudier les structures lymphoïdes tertiaires (TLS), car leur système immunitaire fonctionne de manière similaire à celui des humains, en particulier pour les réponses immunitaires innée et adaptative. Malgré quelques différences, la souris reste un modèle pertinent pour comprendre comment se forment les TLS et comment les cellules immunitaires interagissent avec les cellules cancéreuses dans le microenvironnement tumoral. Le modèle de cancer que nous utiliserons a déjà permis d’observer des TLS chez la souris. De plus, il existe de nombreux outils expérimentaux adaptés à ce modèle, comme des anticorps spécifiques ou des cellules tumorales modifiées permettant le suivie de la croissance tumorale par imagerie, ce qui facilite les analyses. Enfin, plusieurs protocoles déjà validés chez les souris commerciales femelles non génétiquement modifiées permettent de mener les expériences efficacement, sans augmenter le nombre d’animaux, ce qui est essentiel dans une démarche préclinique responsable. Les animaux seront reçus à l'âge de 7 ou 11 semaines puis mis en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire mature. Les animaux seront identifiés par un code couleur et le nombre de points fait aux feutres sur la base de la queue de l'animal.