Système immunitaire

La finalité est de constituer chaque année une bibliothèque d'anticorps monoclonaux dirigés contre une quarantaine de cibles, destinés à des tests de diagnostic déjà déployés à l'international. 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à sept injections d'immunogène sur animal vigile et des prélèvements sanguins sous anesthésie toutes les deux à trois semaines, quatre souris étant affectées à chaque cible. La rate est prélevée après la mise à mort, et le porteur reconnaît que des anticorps peuvent être produits sans animaux tout en jugeant ces méthodes moins performantes que l'immunisation in vivo.

Objectifs

Ce projet vise à produire des anticorps monoclonaux destinés à des applications diagnostiques et thérapeutiques ciblant des agents infectieux émergents ou multirésistants, ainsi que des biomarqueurs immunitaires clés, en réponse à des enjeux majeurs de santé publique. Les anticorps monoclonaux, par leur haute spécificité et affinité, sont des outils essentiels pour détecter précocement des pathologies sévères telles que le sepsis, ou pour neutraliser des pathogènes difficiles à contrôler par les traitements classiques. Notre laboratoire s’inscrit dans de nombreux programmes de développement d’outils immunologiques ou d’immunothérapie, avec plusieurs tests rapides de diagnostic déjà déployés internationalement, notamment pour la détection de résistances bactériennes. Ce projet se concentre sur un panel limité et prioritaire d’une quarantaine de cibles annuelles, choisies selon leur impact sanitaire avéré. Par ce projet, nous visons à renforcer la capacité nationale et internationale à détecter rapidement et précisément des agents infectieux critiques et à développer des thérapies ciblées innovantes. Si la quasi-totalité des étapes de production d’anticorps monoclonaux (de leur criblage à leur caractérisation fonctionnelle) peut aujourd’hui être réalisée sans recours aux animaux, la première étape cruciale de leur création reste, en l’état actuel des connaissances, largement dépendante d’un recours à l’animal. L’immunisation in vivo permet en effet une maturation naturelle indispensable à la génération de clones à haute affinité, que les banques synthétiques ou les méthodes alternatives ne parviennent pas encore à égaler en termes de qualité et diversité. Ainsi, le recours minimal à l’animal est strictement limité à cette phase initiale de génération des anticorps. Toutes les étapes suivantes s’appuient sur des systèmes in vitro robustes, avec production en bioréacteurs, assurant une production fiable, reproductible et de haute qualité, sans recourir aux méthodes anciennes par ascite désormais non autorisées.

Bénéfices attendus

À court terme, le projet permettra de générer une bibliothèque d’anticorps dirigés contre une quarantaine de cibles prioritaires sélectionnées en fonction de leur impact clinique et épidémiologique. Ces anticorps seront utilisés pour valider des tests de diagnostic actuellement en développement, notamment des tests de type « point-of-care » destinés à être utilisés directement auprès des patients pour une orientation thérapeutique rapide. Ils aideront aussi à mieux comprendre les interactions immunitaires dans des contextes critiques, comme la réponse inflammatoire liée au sepsis. À plus long terme, les anticorps développés pourront être intégrés dans des dispositifs diagnostics améliorés, combinant rapidité, sensibilité et spécificité, facilitant ainsi la détection précoce d’infections difficiles à contrôler ou de résistances bactériennes émergentes. Par ailleurs, certains anticorps candidats pourront servir en immunothérapie, par exemple pour neutraliser directement des agents pathogènes ou moduler la réponse immunitaire dans des syndromes inflammatoires sévères, offrant ainsi de nouvelles options thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront immunisés en vigile par plusieurs injections brèves (30 à 60 secondes) d’une molécule appelée immunogène, qui correspond à la cible d’intérêt. Des prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés, seront ensuite réalisés à intervalles réguliers (toutes les 2 à 3 semaines) afin de suivre la réponse immunitaire des animaux, c’est-à-dire la production d’anticorps en réaction à l’immunogène. Chaque animal recevra une injection initiale, suivie de trois rappels et de trois injections de boost soit un maximum de sept injections au total. Pour chaque prélèvement, la durée sera très brève (60 secondes par animal).

Impact sur les animaux

Une douleur et/ou une infection au niveau des points d’injections sont susceptibles de survenir : la douleur sera très brève et l’infection peut survenir jusqu’à quelques heures après l’injection. Une douleur légère est possible lors des prélèvements sanguins. Les manipulations peuvent entrainer un stress de certains animaux pendant quelques minutes.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort à la fin du protocole. La production d’anticorps monoclonaux nécessite en effet de prélever la rate des animaux immunisés.

Remplacement

Il existe aujourd’hui des méthodes de laboratoire pour produire des anticorps sans utiliser d’animaux. Ces techniques permettent de fabriquer des anticorps à partir de grandes banques artificielles, en sélectionnant ceux qui semblent capables de reconnaître une cible donnée. Cependant, ces méthodes ont encore des limites importantes : - D’abord, les anticorps produits en laboratoire de cette façon reconnaissent souvent moins bien leur cible que ceux générés naturellement par le système immunitaire d’un animal. En effet, le système immunitaire d’un animal est capable d’améliorer progressivement ses anticorps après contact avec la cible d’intérêt. Ce processus naturel, très complexe, n’est pas encore reproductible en laboratoire avec la même efficacité. Résultat : les anticorps produits par ces méthodes sont souvent moins bons. - Ensuite, ces anticorps sont souvent incomplets (il ne s’agit que d’un fragment), ce qui peut poser problème pour leur stabilité, leur fonctionnement, ou leur utilisation dans des tests standards. Ils sont aussi plus sensibles aux variations de température, de pH ou de conditions biologiques. Leur performance reste donc largement insuffisante dans des situations réelles, comme par exemple pour détecter un agent pathogène dans un échantillon biologique complexe. Dans ce projet, nous avons besoin d’anticorps très efficaces, capables de détecter précisément certaines cibles infectieuses, y compris à de très faibles concentrations. Pour cela, la méthode la plus fiable reste encore l’immunisation d’un animal. Il est important de souligner que l’utilisation d’animaux est strictement limitée à cette première étape de production. Toutes les étapes suivantes sont réalisées en laboratoire par des techniques entièrement in vitro, maîtrisées et reproductibles, sans recourir aux méthodes anciennes par ascite désormais non autorisées.

Réduction

Chaque production d’anticorps monoclonal sera réalisée avec un nombre restreint d’animaux : 4 souris seront utilisées par immunogène. Ce nombre a été défini à partir de notre expérience dans ce type de protocole et correspond au minimum nécessaire pour garantir un bon taux de réussite. En effet, une réponse immunitaire insuffisante chez un ou plusieurs animaux peut empêcher la production d’anticorps de qualité. Si trop peu d’animaux sont utilisés au départ, ce risque augmente, ce qui pourrait conduire à répéter toute la procédure, longue et contraignante, avec de nouveaux animaux. Cela irait à l’encontre de l’objectif de réduction. Par ailleurs, les étapes amont du projet (sélection des cibles antigéniques, mise au point des protocoles) ont été réalisées en laboratoire à l’aide de méthodes in vitro, ce qui a permis de limiter le recours aux animaux aux seules phases indispensables de production des anticorps. De plus, toutes les étapes après l’immunisation : criblage sélection, caractérisation fonctionnelle et production à grande échelle sont réalisées sans recours aux animaux, grâce à des techniques in vitro parfaitement maîtrisées et éprouvées. Cette stratégie globale garantit que le nombre d’animaux utilisés est strictement limité au minimum nécessaire, tout en assurant la qualité et la fiabilité des anticorps produits.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des cages collectives, favorisant leurs interactions sociales. Leur environnement sera enrichi avec des abris, des tunnels en carton, du matériel pour construire un nid, et des bâtonnets à ronger. Les procédures susceptibles de causer de la douleur seront réalisées sous anesthésie. Le niveau d’inconfort après l’intervention sera similaire à celui d’une vaccination humaine. Les animaux seront surveillés chaque jour par du personnel qualifié, en charge notamment de détecter rapidement tout signe éventuel de douleur, stress ou malaise. Un ensemble de points limites et de critères d’arrêt est mis en place. Si l’un de ces indicateurs révélait un état anormal, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix largement reconnu pour la production d’anticorps monoclonaux. Elle a été retenue pour sa capacité à induire une réponse immunitaire robuste et reproductible, indispensable pour obtenir des anticorps de haute qualité. Les animaux utilisés seront des souris adultes, car à ce stade le système immunitaire est pleinement mature. Cette maturité est essentielle pour assurer une réponse immunitaire optimale. De plus, les souris sont des petits animaux pour lesquels il est facile d’assurer des conditions de vie stables et contrôlées, et de limiter les situations potentiellement stressantes de par leur environnement, répondant ainsi aux critères éthiques et pratiques.

Chacun des 180 macaques à longue queue de ce projet peut subir une quarantaine d'anesthésies générales, autant de prélèvements sanguins, une trentaine d'écouvillonnages nasaux, trachéaux et rectaux, quatre ponctions de moelle osseuse, quatre biopsies de ganglions et jusqu'à dix lavages broncho-alvéolaires, le tout classé en souffrance modérée. Une puce de télémétrie est implantée sous la peau, et les animaux exposés au SARS-CoV-2 ou à la grippe passent jusqu'à huit semaines seuls en cage. La modification déposée pour cette version ajoute quatre biopsies de peau, quatre biopsies de muqueuse rectale ou buccale et quatre prélèvements de liquide séminal, pour "avoir accès à plus de compartiments". 108 macaques sont tués pour prélever leurs tissus, les 72 autres gardés comme modèles de réinfection ou comme convalescents, avec une réattribution à d'autres études que le porteur n'exclut pas.

Objectifs

La grippe et le Covid sont des maladies respiratoires causés respectivement par les virus influenza et le SARS-CoV-2. La transmission interhumaine de ces virus se fait principalement par l’excrétion de gouttelettes dans l’air (toux, éternuement, parole, respiration).Les personnes à risque et les stratégies thérapeutiques de ces deux maladies étant assez similaires, nous avons choisi de mener nos recherches à l’intérieur d’un seul projet. Actuellement, aucun traitement spécifique ne permet d’atténuer efficacement et systématiquement les maladies causées par le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. De nombreuses personnes notamment les personnes immunodéprimées (personne au système immunitaire fragile) ou âgées sont encore lourdement impactées par la Covid-19 ou la grippe avec des effets secondaires qui demeurent importants. De plus, dans le cas du SARS-CoV-2, l’émergence continuelle de variant d’intérêt (VOC) et l’absence de vaccins efficaces contre l’ensemble de ces variants anciens ou émergents nécessite le développement permanent de nouveaux traitements par immunothérapie. Dans le cas de la grippe, les souches qui circulent en hivers sont différentes d’une année sur l’autre. Cette diversité impose d’ajuster chaque année la composition du vaccin pour y introduire les souches les plus récentes en circulation et qui circuleront aussi probablement dans les mois suivants. De plus, ces virus saisonniers diffèrent en termes d’impact sur la population et de sévérité. Le développement de nouveaux traitements thérapeutiques nous permettrait de mieux faire face à une épidémie de grippe en cas de faible efficacité du vaccin. Dans ce contexte, nous testerons différentes types de traitements comme des anticorps permettant d’améliorer la réponse adaptive ou ciblant directement les virus du SARS-CoV-2 ou les virus grippaux. La mise en place de traitements par immunothérapie efficaces contre ces virus respiratoires pourrait aussi représenter une alternative capable de stimuler la réponse immunitaire en cas de baisse d’efficacité des vaccins (population immunodéprimée, apparition d’une souche génétiquement très éloignée…). Ces traitements sont en phase de développement préclinique et la démonstration d’une efficacité dans notre modèle macaque permettrait une avancé en phase clinique. MODIFICATION : Nous avons effectué des modifications pour pouvoir prélever plus de type d’échantillons différents lors des étude de biodistribution pour avoir accès à plus de compartiments.

Bénéfices attendus

Les molécules thérapeutiques qui auront montré des résultats satisfaisants chez le primate non-humain pourront à court terme être utilisés lors d’essais cliniques chez l’Homme. Elles pourront notamment, à long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés à grande échelle et ainsi protéger la population mondiale contre les virus respiratoires tels que le SARS-CoV2 ou la grippe.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - Anesthésie générale (40 fois environ, 30min, tous les groupes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (4 fois environ, 5 minutes, tous les groupes) - Infection par le virus de la grippe ou de la covid (1 fois, 15 minutes, groupes exposés) - Prélèvement de sang (40 fois environ, 5 minutes, tous les groupes). - Prélèvement de moelle osseuse (4 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Biopsie de ganglions lymphatiques (4 fois environ, 30 minutes, groupes exposés) - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux ET RECTAUX (30 fois environ, 2 minutes, tous les groupes) - Lavage broncho-alvéolaire (10 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Prélèvement de LCR (liquide cérébrospinal) (4 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, tous les groupes) - Imagerie in vivo (10 fois environ, 45 minutes, tous les groupes) - Pléthysmographie (mesure de l'ensemble des volumes pulmonaires) (10 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Hébergement individuel (1 fois, 8 semaines maximum, groupes exposés) - MODIFICATIONS : -Biopsie de peau (4 fois maximum, 30 minutes)-Biopsie de muqueuse rectale ou buccale (4 fois maximum, 20 minutes). -Prélèvement de liquide séminal (4 fois maximum, 20 minutes, animaux de l’étude pilote)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux traitements: Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza ou le SARS-CoV2 : Fatigue, difficultés respiratoires, fièvre, déshydratation, troubles de l’appétit. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Les nuisances sont peu attendues chez les animaux traités. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélever différents tissus et procéder à des analyses (charge virale, lésions pulmonaires…). L’autre partie des animaux sera conservée pour servir de modèle de réinfection ou d’animaux convalescents. Il n’est pas exclu que ces animaux soient réattribués à d’autres études après avis vétérinaire.

Remplacement

L’objectif est d’évaluer la protection induite par différents traitements par immunothérapie contre des virus respiratoires comme le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. Ce type d’évaluation nécessite un modèle expérimental proche de l’Homme, permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorales, cellulaires) et les changements induits suite au traitement et à l’infection virale. A ce jour, le macaque est le modèle qui représente le mieux ces infections respiratoires chez l’Homme. Du fait de sa proximité génétique avec l’Homme, les cibles des immunothérapies sont aussi exprimées chez le macaque, et pas nécessairement dans le modèle des petits animaux. Toutefois, les traitements par immunothérapie évalués ont été préalablement testés in vitro et dans un modèle de petits animaux avant d’être testés chez le PNH.

Réduction

Les études pilotes de distribution et persistance du traitementse font sur 2 animaux et nous permettent de sélectionner les traitements par immunothérapie les plus pertinents, la dose et la voie d’administration. Nous maitrisons les modèles de grippe et de SARS-CoV-2, cette expérience nous permets d’utiliser des contrôles historiques dans les études d’efficacité ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux contrôles tout en permettant une analyse statistique robuste. Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

L’ensemble des interventions et les prélèvements seront réalisés regroupés au maximum et sous anesthésie générale des animaux. Une diversification de l’alimentation et complémentation de celle-ci pourra être instaurée en cas d’une baisse de l’alimentation due à des anesthésies répétées Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être appliquée par une désinfection et une analgésie locale. L’implantation de puce permettant un suivi régulier de la température peut induire une réaction tel qu’un gonflement et un suintement de la plaie. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique comme une désinfection et une analgésie locale. L’administration des traitements pouvant entrainer une réaction locale comme des démangeaisons et douleurs, une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. L’exposition aux virus influenza et SARS-CoV2 peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. Si apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé.. Une grille de score sera utilisée pour le suivi de l’infection chez l’animal. Les modèles d’infection par le SARS-CoV2 ou par les virus grippaux chez le macaque sont déjà mis au point dans notre département. Des grilles de score avec des points limites ont déjà été établis et utilisés au sein de notre département lors de différentes infections avec ces virus. L’hébergement se fera en groupe pour les études pilotes. Pour les études d’efficacités, les animaux seront mis en individuel pour la période d’adaptation avant l’exposition virale. Suite à l’exposition et une fois la production virale terminée, ils seront remis en groupe. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie. Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition virale.

Choix des espèces

Les modèles de petits animaux comme la souris ne sont pas un hôte naturel du SARS-CoV-2 et des virus influenza et leur le système immunitaire est très différent de celui de l’humain. Toutefois, la majorité des candidats sont déjà testés dans un modèle petit animal ou in vitro avant d’être testés chez le macaque PNH. Le macaque a été choisi comme modèle animal, car il présente une réponse immunitaire et physiopathologique semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections respiratoires similaires. A ce jour, a été mis au point un modèle d’infection efficace des macaques cynomolgus par voie respiratoire. Les macaques sont d’excellents modèles pour reproduire la forme non sévère des maladies COVID19 et grippes, ils sont donc pertinents pour tester des molécules thérapeutiques. Ces espèces représentent le modèle le plus pertinent réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de traitements par immunothérapie contre les virus respiratoires : la réponse immunitaire et la réponse aux traitements sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire est maitrisés chez ces espèces contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires comme le furet. La grippe et le Covid infectant des personnes de tout âge en clinique, nous pouvons réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature, donc au minimum 2 ans. Enfin, les traitements candidats pourront être évalués chez des adultes lors des essais cliniques donc il est plus pertinent d’utiliser des animaux ayant un système immunitaire similaire.

Rasées sur le dos, puis enduites chaque jour pendant cinq jours d'une crème qui provoque rougeurs, épaississement de la peau et desquamation, 100 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de la peau et des organes. Vingt d'entre elles sont gavées trois jours de suite, quarante reçoivent des injections quotidiennes d'un anticorps ciblant la molécule CD146 ou d'un placebo. Le projet cherche à savoir si cette molécule intervient dans le psoriasis et si la bloquer soulage la maladie, ainsi que l'athérosclérose qui l'accompagne souvent. Le porteur cite des études cliniques déjà menées sur des patients psoriasiques, les juge descriptives, et affirme qu'il n'existe "aucune alternative à l'animal" pour étudier cette maladie.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la physiopathologie du psoriasis et à évaluer cette molécule comme cible thérapeutique dans le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Bénéfices attendus

Plusieurs études cliniques portant sur des patients psoriasiques ont été menées antérieurement pour évaluer les niveaux d’expression de la molécule d'adhésion cellulaire CD146/MCAM sur des biopsies de peau, quantifier les concentrations de sa forme soluble dans le sang ou pour étudier les différentes sous-populations leucocytaires exprimant ce marqueur cellulaire dans le sang. Cependant, ces études restent descriptives et ne permettent pas d’évaluer le rôle du CD146 global, du CD146 endothélial ou du CD146 exprimé par certaines cellules du système immunitaire sécrétrices de la cytokine proinflammatoire interleukine 17 dans la pathogenèse du psoriasis. Contrairement à notre projet qui compare des souris mutées ou non pour CD146, ces études ne permettent pas d’étudier les voies de signalisation régulées par CD146. De plus, ces études cliniques n’ont pas évalué l’effet de thérapies ciblant CD146. Ainsi, ce projet permettra d'identifier des mécanismes moléculaires régulés par CD146 dans la pathogenèse du psoriasis. Il permettra aussi d'évaluer dans un modèle murin le bénéfice thérapeutique d'anticorps monoclonaux ciblant CD146 pour traiter le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Procédures

Tous les animaux du projet seront rasés une fois sur le dos (2 minutes par souris). Ils recevront un traitement sous la forme d'une application quotidienne de crème sur le dos pendant 5 jours (30 secondes par application). 20 souris seront gavées avec une solution diluée dans de l'huile de maïs une fois par jour pendant 3 jours (30 secondes par gavage). 40 souris recevront des injections quotidiennes d'un traitement ciblant CD146 ou un placebo pendant 5 jours (30 secondes par injection). Un prélèvement sanguin sera effectué sur toutes les souris (30 secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

20 souris seront gavées une fois par jour pendant 3 jours avec une solution à base d'huile de maïs. Bien que le gavage ne soit pas douloureux, cela pourrait tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de sa répétition et de la contention. Les souris seront rasées sur le dos, ce qui pourrait générer un stress. L'application d'un traitement à base de crème sur la peau des souris pour induire le psoriasis devrait entraîner une inflammation associée à à l'apparition de rougeurs, un épaississement de la peau et une desquamation en plaques. Ce traitement peut entraîner une déshydratation et une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.

Remplacement

Nous étudions l'implication de la molécule d'adhésion cellulaire CD146, également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la pathogenèse du psoriasis. Cette pathologie autoimmune implique différents types cellulaires (kératinocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, cellules du système immunitaire), avec de nombreuses interactions biochimiques et cellulaires. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle in vitro, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier cette maladie.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires pour générer les effectifs de chaque groupe utilisé dans les procédures expérimentales, nous utiliserons des souris issues d'accouplements homozygotes et nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles, le psoriasis touchant chez l'humain autant les hommes que les femmes. En l'absence de toute étude antérieure sur le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 dans le psoriasis chez la souris, nous évaluerons son implication dans cette pathologie en comparant des groupes de 10 souris entre eux, effectif minimal déterminé par une approche statistique pour mettre en évidence de potentielles différences significatives.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux issus des établissements d'élevage. Les souris seront observées avant d’initier le protocole et les animaux présentant des symptômes type infection seront écartés des protocoles. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés. Les animaux seront pesés une fois par jour et observés deux fois par jour pour prévenir tout risque de déshydratation liée à leur traitement. Les animaux seront hébergés en groupe avec un enrichissement. Les animaux disposeront de nestlets, nids à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l ’environnement et matériaux de nidification, ainsi que de tunnels afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité et en procurant un sentiment de sécurité à l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, sa manipulabilité génétique permet d'analyser l'effet de mutations du gène cible sur la pathogenèse du psoriasis. La souris permet également d'évaluer l'effet d'un traitement thérapeutique ciblant une protéine d'adhésion cellulaire potentiellement impliquée dans le psoriasis et une comorbidité associée, l'athérosclérose. Les souris utilisées seront âgées entre 8 et 16 semaines. Un âge compris entre 8 et 16 semaines est couramment utilisé dans la littérature pour ce modèle induit de psoriasis car l'épaississement de l'épiderme, l'érythème et la desquamation sont clairement visibles à cet âge là. De plus, cette tranche d'âge a permis de mettre en évidence dans plusieurs études les effets thérapeutiques chez la souris de différents traitements utilisés pour soigner le psoriasis chez l'homme.

Trois ou quatre injections et jusqu'à sept prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse par animal : 36 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des analyses post-mortem. Ils reçoivent de fortes doses d'un vecteur viral de thérapie génique, puis une molécule qui détruit une partie des cellules immunitaires de leur foie. Le projet existe précisément parce que ces doses abîment le foie des patients et font perdre aux rats l'expression du gène transféré. Le porteur écrit pourtant que l'injection intraveineuse du vecteur "est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable", et ne décrit aucune conséquence de la destruction des cellules hépatiques.

Objectifs

Les virus adéno-associés recombinants (AAVr) sont de petits virus modifiés utilisés comme « véhicules » pour transporter des gènes dans les cellules. Ils servent aujourd’hui dans plusieurs thérapies géniques, notamment pour traiter des maladies de l’œil, du foie, des muscles ou du système nerveux. Sept traitements basés sur ces vecteurs sont déjà disponibles pour les patients. Pour certaines maladies plus complexes, il faut injecter de grandes quantités d’AAVr. Mais à fortes doses, ces traitements peuvent provoquer des effets secondaires, en particulier au niveau du foie, qui peut être endommagé. Notre équipe a mis au point un modèle de rat pour mieux comprendre ce problème. Nous avons injecté de fortes doses d’AAVr contenant un gène fluorescent . Nous avons observé que certains rats perdaient l’expression de ce gène dans leur foie, comme cela se produit parfois chez les patients. On ne sait pas encore si cette perte vient d’une toxicité directe ou d’une réaction du système immunitaire. L’objectif de notre étude est donc d’analyser le rôle des cellules immunitaires du foie dans cette toxicité. Pour cela, nous utiliserons une molécule (le clodronate) capable d’éliminer certaines de ces cellules. En parallèle, nous testerons des versions « inoffensives » du gène fluorescent pour disposer d’un bon contrôle.

Bénéfices attendus

Le projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes responsables de l’immuno hépatotoxicité observée chez les patients après utilisation de fortes doses d’AAVr dans des modèles précliniques. Cette étude pourrait contribuer à mieux comprendre et mieux anticiper l’impact potentiel de l’immunotoxicité du transfert de gènes sur l’efficacité et la sécurité du traitement dans les essais cliniques.

Procédures

24 rats subiront trois injections ainsi que 3 prélèvements sanguins. 12 rats subiront quatre injections et 7 prélèvements sanguins. Des protocoles d'anesthésie et d’analgésie seront mis en place selon la procédure. Les injections et les prélèvements sanguins se dérouleront sous anesthésie gazeuse de courte durée (environ 5 à 10min). L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens animaliers et le vétérinaire.

Impact sur les animaux

Pour les prélèvements sanguins et les injections, les animaux seront sous anesthésiés gazeuse. Les animaux ressentiront au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguin et au point d’injection , due à la pénétration de l’aiguille. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Pour l'euthanasie, que ce soit pour la perfusion hépatique terminale ou le prélèvement sanguin terminale au niveau de la veine cave, cela n’engendrera pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L’enjeu majeur des protocoles de thérapie génique développés à l’aide de virus consiste à s’affranchir de la réponse immunitaire anti-vecteur observée chez l’humain. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire in vitro un système immunitaire et encore moins de le combiner avec des cellules d’autres organes (également transduits par le vecteur de thérapie génique). Le modèle animal demeure donc incontournable. Pour ce protocole précis, nous avons choisi un modèle de rat , car c’est le seul modèle de petit animal, qui développe une réponse immunitaire contre le virus et une immunotoxicité vis-à-vis du virus similaire à celle observée chez l’humain.

Réduction

Chez l’homme, l’apparition d’une réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique ainsi que son intensité varient d’un individu à l’autre. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire où environ 60% des rats injectés développent une réponse immunitaire. Le nombre d’animaux par groupe 6 est donc basé sur nos expériences précédentes lors desquelles nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille, pour les analyses qui seront réalisées ici (biodistribution du vecteur, analyses biochimiques et analyses histologiques). Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en termes d’animaux à inclure. Afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables, le nombre d’animaux par groupe devra être porté à au moins 6.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Le bien-être animal passera également par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. Récemment, nous avons développé un modèle de rat dans lequel nous observons une réponse cellulaire et de l’hépatotoxicité après injection de fortes doses de vecteur. Ce modèle semble reproduire les effets secondaires observés chez l’homme dans les essais cliniques après injection à forte dose. L'utilisation du rat est donc justifiée par la preuve de concept de modélisation de la réponse immune et de l’hépatotoxicité. De plus, l’utilisation du modèle rat permet de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Les rats seront injectés entre 7 et 8 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature.

2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une réaction allergique leur est provoquée, avec une inflammation locale ou généralisée, un inconfort respiratoire transitoire et une baisse de la température corporelle mesurée trente minutes après chaque administration d'antigène, puis elles reçoivent des substances une à deux fois par semaine pendant cinq à huit semaines et subissent deux à trois prélèvements sanguins. La mise à mort sert à prélever poumons, intestin, peau et ganglions, le porteur indiquant que ces analyses ne peuvent pas être faites sur des animaux vivants. L'objet reste l'optimisation d'une molécule immunomodulatrice, dont il compare plusieurs versions pour la rendre "plus facile à produire", tout en affirmant qu'aucune alternative au modèle murin n'est disponible et que la souris demeure "incontournable".

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre et d’optimiser une approche innovante pour traiter les allergies. Il repose sur trois grands axes : 1.Observer comment une molécule testée agit sur certaines cellules du système immunitaire, en particulier celles qui fabriquent les anticorps. 2.Vérifier si cette approche pourrait prévenir ou soulager les différents allergies, en l’essayant dans différents modèles d’allergie chez la souris. 3.Améliorer cette stratégie en comparant plusieurs versions de la molécule, pour la rendre plus efficace, mieux tolérée, plus stable dans le temps et plus facile à produire.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’explorer une approche immunomodulatrice innovante dans un contexte allergique, et de caractériser de manière approfondie les mécanismes immunitaires sous-jacents, afin de mieux comprendre leur implication dans l’efficacité thérapeutique. Ces pathologies, en forte augmentation dans les pays industrialisés, touchent aujourd’hui jusqu’à 30 à 40 pourcents de la population mondiale et représentent un fardeau important en termes de santé publique et de coût socio-économique (arrêts de travail, baisse de qualité de vie, consommation de soins). En étudiant les effets immunologiques de cette approche, notamment sur la production d’anticorps et la régulation de la réponse immunitaire, ce projet a pour objectif d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques, plus efficaces, mieux tolérées et adaptées aux besoins des patients allergiques. Les retombées attendues concernent principalement la santé humaine, avec un potentiel impact à long terme sur la prévention et la prise en charge des maladies allergiques. Ce projet contribue également à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation immunitaire, ce qui pourrait bénéficier à d’autres pathologies inflammatoires ou auto-immunes.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions non chirurgicales, réparties sur plusieurs semaines selon le modèle expérimental. Celles-ci incluent des administrations de substances (1 à 2 fois par semaine, quelques minutes, sur une période totale de 5 à 8 semaines, sur animaux vigiles ou sous anesthésie courte), la mesure des paramètres respiratoires (1 fois pendant le projet, environ 20 minutes, sur animaux vigiles avec contention douce) et des prélèvements sanguins (2 à 3 fois par animal sur l’ensemble du protocole, environ 5 minutes, sur animaux vigiles).

Impact sur les animaux

L’induction d’une réaction allergique chez les souris peut provoquer une réponse inflammatoire locale ou généralisée, pouvant entraîner une gêne physique passagère, ainsi qu’un état temporaire de mal-être. Selon le modèle allergique utilisé, cette réaction peut également s’accompagner d’un inconfort respiratoire transitoire. Par ailleurs, cette phase d’induction est susceptible de provoquer une baisse modérée de la température corporelle (stress thermique), nécessitant une surveillance spécifique. Les nuisances attendues incluent le stress lié à la contention temporaire nécessaire pour les injections et administrations, ainsi qu’à la réalisation de mesures de paramètres respiratoires. Ces manipulations peuvent entraîner un inconfort transitoire, sans conséquences durables pour les animaux. Les prélèvements sanguins répétés, indispensables pour le suivi de la réponse immunitaire, peuvent occasionner une douleur brève ainsi qu’un risque localisé d’irritation ou d’hématome. La contention temporaire nécessaire à ces procédures est également susceptible de générer un stress ponctuel, en raison de la restriction de mouvement qu’elle implique.

Devenir

À l’issue des différentes procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés afin de permettre la récupération des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Cette étape est indispensable pour atteindre les objectifs du projet, qui nécessitent l’étude fine des organes impliqués dans les réponses allergiques (poumons, intestin, peau, ganglions, etc.). Les prélèvements post-mortem permettent de réaliser des analyses de type histologique, immunologique, transcriptomique ou moléculaire, qui ne peuvent pas être effectuées sur des animaux vivants sans entraîner une souffrance importante ou des biais expérimentaux. L’euthanasie est donc justifiée scientifiquement et a été retenue comme la seule solution éthique permettant d’obtenir des résultats fiables tout en respectant le bien-être animal.

Remplacement

La souris est un modèle valide en immunologie et particulièrement dans les études visant à mieux décrire les mécanismes modulant la réponse immunitaire. Aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'est disponible pour cette recherche. Avant d’avoir recours à l’expérimentation animale, des approches alternatives ont été utilisées en amont du projet, notamment des cultures cellulaires et des tests de stimulation in vitro pour étudier certaines voies de signalisation. Ces modèles ont permis de mieux cibler les conditions expérimentales, de réduire le nombre d’animaux nécessaires et d’optimiser les doses utilisées. Toutefois, ces approches ne permettent pas d’évaluer l’efficacité globale d’une immunothérapie ou l’impact d’une modulation immunitaire dans le cadre d’une pathologie systémique comme l’allergie. La souris a donc été retenue comme modèle, en raison de sa pertinence en immunologie et de la disponibilité de lignées transgéniques bien caractérisées, qui permettent une exploration fine des mécanismes impliqués. Ainsi, malgré les efforts de remplacement mis en œuvre, l’utilisation d’un modèle murin reste à ce jour incontournable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, un total de 2064 souris est prévu sur une durée de 5 ans. Ce nombre représente le minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, tout en respectant le principe de réduction inscrit dans la règle des 3R. Le nombre d’animaux par groupe expérimentale a été défini à partir de calculs de puissance statistique, en se basant sur les données issues de nos travaux antérieurs, afin de garantir une puissance suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives. Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures de réduction ont été mises en œuvre : Optimisation des protocoles expérimentaux à partir de données issues de cultures cellulaires et d’études préliminaires in vitro. Planification raisonnée des groupes expérimentaux, en tenant compte à la fois de l’objectif scientifique et des contraintes de stabulation. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux impliqués, sans compromettre la validité scientifique des résultats attendus.

Raffinement

Des mesures spécifiques sont appliquées à chaque étape du protocole pour réduire douleur, stress et souffrance. Une surveillance clinique quotidienne est effectuée, incluant l’observation du comportement dans l’environnement habituel afin de détecter précocement tout signe de mal-être. Lors de la phase d’induction allergique, une chute de température corporelle pouvant survenir (stress thermique), une mesure systématique est réalisée 30 minutes après l’administration de l’antigène. Un suivi clinique quotidien est effectué. Des critères d’arrêt stricts sont définis. Les prélèvements sanguins répétés sont réalisés à l’aide de techniques peu invasives, et la contention est brève et maîtrisée afin de minimiser la gêne. Les animaux sont hébergés en groupe dans des portoirs ventilés, à température et hygrométrie contrôlées, avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, et un cycle lumineux de 12 heures par jour. L'environnement est enrichi. L’ensemble de ces mesures vise à réduire au strict minimum les contraintes imposées aux animaux, en garantissant leur bien-être tout en assurant la fiabilité et la qualité des données expérimentales. Les procédures peuvent générer un inconfort passager lié à la contention ou aux manipulations, sans effets durables. Toutes les interventions seront réalisées par du personnel expérimenté, dans des conditions visant à limiter le stress et à préserver le bien-être des animaux.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris dans ce projet se justifie par son statut de modèle validé en immunologie, particulièrement adapté aux études portant sur les mécanismes de régulation du système immunitaire et le développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie. La souris offre une excellente reproductibilité des résultats, grâce à sa standardisation génétique, à la disponibilité d’outils immunologiques spécifiques, et à l’existence de nombreux modèles expérimentaux bien caractérisés. Les animaux seront utilisés à un stade adulte jeune, entre 6 et 8 semaines d’âge. Ce choix correspond à un stade de développement où le système immunitaire est pleinement mature, ce qui est essentiel pour étudier les réponses immunitaires induites dans le cadre du projet.

616 souris se répartissent en quatre groupes selon ce qu'elles subissent : 136 reçoivent deux injections d'air sous la peau, 208 sont infectées par voie orale après cinq jours d'antibiotiques, 160 sont infectées par inhalation sous anesthésie profonde, et 112 développent une inflammation intestinale provoquée par un produit ajouté à leur eau de boisson. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes sont tuées à l'issue, un prélèvement sanguin terminal précédant le retrait des poumons et des intestins. Le porteur décrit pour les dernières des selles molles ou sanglantes après cinq à sept jours de traitement, une perte de poids et une baisse d'activité. L'objet est de vérifier si une protéine identifiée in vitro joue le même rôle dans un organisme vivant, le porteur affirmant que le recours à un "organisme entier" reste "indispensable" pour cette question.

Objectifs

Le système immunitaire possède un premier niveau de défense, appelé immunité innée, qui réagit très rapidement lorsqu’un microbe entre dans le corps. Ce système reconnaît certains éléments typiques des microbes (comme ceux produits par les bactéries) et déclenche une réaction de protection, souvent sous forme d’inflammation, pour limiter l’infection. Certaines substances produites uniquement par les bactéries jouent un rôle important dans cette réaction. Pour qu’elles soient détectées par les cellules du corps, elles doivent d’abord entrer à l’intérieur de celles-ci. Notre équipe a récemment identifié une protéine qui pourrait agir comme une porte d’entrée, permettant à ces substances de pénétrer dans les cellules. Ce rôle a déjà été observé lors d’expériences en laboratoire. L’objectif de ce projet est maintenant de vérifier si cette « porte d’entrée » joue le même rôle dans un organisme entier, dans différents contextes d’inflammation. Pour cela, nous utiliserons d’abord un modèle d’inflammation localisée sous la peau, afin de mieux comprendre comment cette réponse se met en place. Nous étudierons ensuite la réaction inflammatoire dans les poumons, un organe souvent exposé aux bactéries, notamment dans des maladies comme la mucoviscidose. Enfin, nous nous intéresserons à l’intestin, un environnement naturellement riche en bactéries, pour voir si cette voie est impliquée dans des maladies intestinales chroniques, comme la maladie de Crohn. Là encore, des bactéries spécifiques seront utilisées pour déclencher une inflammation et tester le rôle de la protéine étudiée. En complément, un modèle d’inflammation intestinale chronique sera utilisé pour observer si l’absence de cette protéine aggrave ou au contraire limite l’inflammation intestinale, reproduisant des situations proches de maladies humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines substances produites par des bactéries déclenchent une réaction inflammatoire dans le corps. En identifiant le rôle d’une protéine potentiellement responsable du passage de ces substances à l’intérieur des cellules, le projet permettra de mieux comprendre un mécanisme fondamental de la réponse immunitaire. Les bénéfices attendus sont à la fois scientifiques et médicaux. Sur le plan fondamental, ce travail permettra d’expliquer un processus mal connu, essentiel à la détection des bactéries par le système immunitaire. Sur le plan médical, ce projet pourrait aider à mieux comprendre certaines maladies inflammatoires chroniques (comme la maladie de Crohn) ou certaines infections respiratoires (comme celles observées dans la mucoviscidose), en identifiant de nouvelles cibles potentielles pour réguler l’inflammation. À terme, ces connaissances pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques, visant à limiter une inflammation excessive sans affaiblir la capacité du corps à se défendre contre les microbes.

Procédures

136 animaux recevront deux injections d’air en sous-cutanées ainsi qu’une injection d’un traitement (qui dureront 1 minute) et également une injection dans la cavité abdominale (30 secondes). Toutes ces injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Au cours du suivi, les animaux seront pesés le lendemain de l’injection d’air et si une diminution de poids de plus de 10% est visible, elles seront pesées quotidiennement pendant la fin de l’expérience (la pesée dure environ 30 secondes). 208 souris seront traitées avec un mélange d’antibiotiques pendant 5 jours. Puis les souris recevront une injection dans la cavité abdominale (30 secondes). Le lendemain, elles seront infectées par voie orale avec une suspension bactérienne (30 secondes). Au cours du suivi, les animaux seront pesés quotidiennement (la pesée dure environ 30 secondes) pendant la durée de l’expérience. 160 souris recevront une injection dans la cavité abdominale (30 secondes). Puis le lendemain, elles recevront une injection afin d’avoir une anesthésie profonde (30 secondes), puis les souris seront infectées par inhalation sous anesthésie (1 minute). Finalement, une inflammation intestinale sera provoquée chez 112 souris en leur administrant un traitement dans l’eau de boisson. Toutes les souris auront un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les gestes réalisés dans ce projet peuvent provoquer un stress temporaire ou une douleur légère au point d'injection. Certains traitements peuvent entraîner une réaction du corps qui se manifeste par une fièvre ou une sensation de mal-être. Pendant les infections bactériennes, les souris pourront ressentir certains effets liés à l’infection, comme de la fièvre quelques heures après l’exposition, et un état de fatigue ou d’inconfort. Selon la zone touchée, les animaux pourront présenter une irritation dans la gorge et de l’inconfort digestif ou des voies respiratoires. Cela peut entraîner une baisse de l’appétit, une perte de poids et une déshydratation. Lorsque l’inflammation touche l’intestin, les animaux peuvent ressentir de la douleur ou un inconfort digestif, ce qui peut provoquer du stress. On peut alors observer des selles plus molles ou des traces de sang, généralement après 5 à 7 jours de traitement. Cela s’accompagne souvent d’une perte de poids et d’une réduction de l’activité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de prélever des organes indispensables à l'analyse (poumons, intestins). Cette étape est nécessaire pour obtenir des données biologiques impossibles à collecter in vivo.

Remplacement

Des tests réalisés en laboratoire ont déjà été réalisés et ont permis de confirmer le rôle de la protéine d’intérêt au niveau cellulaire. Cependant, les analyses en dehors d’un organisme ne permettent pas de reproduire la complexité du système immunitaire. L’utilisation d’un organisme entier reste indispensable pour comprendre le rôle de cette protéine.

Réduction

De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet afin de limiter au maximum le nombre de répétitions tout en garantissant la robustesse des résultats. De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Le nombre d'animaux est calculé au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.

Raffinement

Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation des souris à la contention (i.e. la manipulation de souris) (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser l'angoisse des souris lors de l'expérience . 2) Anesthésie gazeuse pour chaque acte potentiellement douloureux pour la souris 3) Minimisation de la fréquence de manipulation. 4) Les souris seront surveillées quotidiennement (quand cela est necessaire) et individuellement pendant la durée de l’expérimentation. Leur poids et leur état général sera suivi. Toute souris arrivant à un point limite sera immédiatement retirée de l’étude, anesthésiée sous anesthésie générale gazeuse et euthanasiée. Les doses de traitement et la fréquence d’administration des molécules résultent de plusieurs retours d’expériences bibliographiques.

Choix des espèces

Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo, vertébré Mammifère) avec un fonctionnement immunitaire et hormonal reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain. La souris en est un modèle idéal pour l’étude des délétions de gènes comme utilisé dans ce projet. La souris est un modèle très utilisé pour étudier les maladies inflammatoires, que ce soit pulmonaires ou intestinales. Elle présente de nombreux avantages : les chercheurs disposent de nombreux outils adaptés à cette espèce pour mesurer l’inflammation et des modèles expérimentaux déjà bien connus, comme celui de l’inflammation intestinale. De plus, la souris réagit de manière similaire à l’humain pour ce qui concerne certaines réponses immunitaires. Tout cela en fait un modèle particulièrement adapté à ce projet. Les expériences débuteront à l’âge de 6 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature.