Système immunitaire

Pour tester des composés candidats contre l'arthrite rhumatoïde et l'arthrite psoriasique, 434 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus. L'inflammation articulaire est provoquée par une injection intra-péritonéale ou par deux injections intradermiques espacées de dix-huit jours, suivies de traitements administrés par voie intraveineuse, sous-cutanée, orale ou topique, avec dépilation sous anesthésie. Raideur articulaire et douleur à la mobilisation sont attendues, et de la nourriture en gel est déposée dans la cage pour limiter les déplacements des souris arthritiques. Aucun antalgique ne leur sera administré, le porteur indiquant qu'il interférerait avec l'effet attendu des composés testés, la souffrance restant encadrée par une grille de score et un point limite.

Objectifs

Les maladies inflammatoires ostéo-articulaires sont parmi les pathologies douloureuses et invalidantes les plus courantes et les plus répandues dans le monde, dont la prévalence devrait augmenter principalement en raison de l'augmentation de l'espérance de vie. Ces pathologies sont le plus souvent difficiles à repérer, mais peuvent avoir des répercussions sur l’état psychologique des personnes affectées par les douleurs chroniques qu’elles engendrent, et à plus long terme sur la vie professionnelle. On estime que 25 % des personnes atteintes d’ostéo-arthrite sont incapables d'accomplir leurs activités quotidiennes. De plus en plus de références indiquent maintenant que l'inflammation, locale et systémique, est à l'origine de dommages aux articulations et aux os. L'objectif du projet est d'évaluer la pharmacocinétique et l'efficacité thérapeutique de nouvelles thérapies dans le domaine des maladies inflammatoires ostéo-articulaires telles que l'arthrite psoriatique ou l'arthrite rhumatoide. Les propriétés immunomodulatrices, anti-inflammatoires et anti-fibrotiques de ces nouveaux composés seront évalués afin de pouvoir les considérer comme nouvelles modalités de thérapies dans le traitement des maladies inflammatoires ostéo-articulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques dans le contexte des pathologies inflammatoires ostéo-articulaires, telles que la polyarthrite rhumatoide ou la spondylarthrite ankylosante. L'objectif est d'analyser les effets des traitements candidats dans la résolution de la pathologie. Les résultats attendus pourraient avoir un impact direct sur la prise en charge des patients en offrant de nouvelles options thérapeutiques. Ces traitements pourraient non seulement réduire la douleur et l’inflammation, mais également prévenir la progression des lésions articulaires, améliorant ainsi la qualité de vie des patients. L’identification de traitements plus efficaces permettrait également de limiter la dépendance des patients aux traitements traditionnels, souvent lourds et invasifs.

Procédures

Les souris recevront une injection intra-péritonéale pour induire le modèle sur souris vigile (

Impact sur les animaux

Ce projet, bien que conçu pour minimiser l'impact sur les animaux entraine des nuisances ou effets indésirables inhérents à la mise en œuvre de modèles d'arthrite psoriatique ou d'arthrite rhumatoide. Ces modèles peuvent entraîner une inflammation articulaire et des douleurs au niveau des membres. Les symptômes comprennent des signes cliniques dans ces modèles tels que la raideur articulaire et une douleur à la mobilisation. Chaque animal sera étroitement surveillé quotidiennement en aveugle tout au long de l'étude et leur état sera évalué d’après une grille de scores, selon des paramètres physiologiques, des critères d’apparence physique et de comportement général, afin d’intervenir tôt dans la prise de décision de la poursuite du protocole. Une grille de score est établie pour les deux modèles incluant un point limite pour chaque modèle. L’utilisation d’antalgiques n’est pas envisageable, elle interférerait avec l’effet attendu des outils thérapeutiques. Chez l’animal arthritique, nourriture et boisson seront apportées sous forme de gels placés dans la cage en cas de nécessité, afin de limiter les déplacements.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tissus et réaliser des analyses ex vivo.

Remplacement

La recherche menée dans ce projet vise à développer des approches thérapeutiques innovantes pour traiter l'arthrite psoriatique et l'arthrite rhumatoïde. Les modèles in vitro et les simulations informatiques constituent des alternatives précieuses et seront exploitées dans les phases préliminaires. Ces méthodes contribueront à réduire le nombre d’animaux nécessaires en éliminant en amont les composés inefficaces ou potentiellement toxiques. Cependant, ces approches ne peuvent pas reproduire les processus biologiques complexes d’un organisme vivant, tels que les interactions immunologique ou l'inflammation ostéo-articulaire. Ce niveau de précision est indispensable pour garantir la robustesse et la transposabilité des résultats à un contexte clinique. Tous les efforts seront faits pour réduire leur nombre au strict minimum nécessaire et pour limiter leur inconfort par des soins appropriés et des critères d’arrêt clairs.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base d’analyses statistiques rigoureuses. Le nombre d’animaux sera de 8 par groupe de traitement. Des pratiques spécifiques seront mises en œuvre tout au long du projet pour limiter le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre les objectifs scientifiques : 1/ Études pilotes : Des expériences préliminaires seront réalisées sur un petit nombre d’animaux (24 pour la détermination des paramètres d’induction des modèles et 32 en incluant un traitement de référence pour chaque modèle) afin de tester la faisabilité des protocoles, valider les doses initiales des molécules et affiner les paramètres expérimentaux. Cela permettra d’optimiser les protocoles avant leur mise en œuvre à plus grande échelle. 2/ Modélisation informatique et études in vitro : Avant toute expérimentation in vivo, des approches in silico et des cultures cellulaires seront utilisées pour sélectionner les molécules ou formulations les plus prometteuses. Cette étape éliminera les composés inefficaces ou trop toxiques, réduisant ainsi les tests inutiles sur les animaux. 3/ Partage et réutilisation des tissus : Les prélèvements biologiques (sang, tissus, etc.) seront maximisés pour chaque animal afin de réaliser plusieurs analyses complémentaires. De plus, lorsque possible, les tissus prélevés pourront être partagés entre différentes études ou projets collaboratifs. 4/ Suivi longitudinal grâce à des techniques non invasives : L’utilisation de l’imagerie in vivo (bioluminescence, fluorescence) permettra de suivre l'inflammation au fil du temps, limitant la nécessité d’euthanasier des animaux à des points intermédiaires pour des analyses sanguines et histologiques. Les études seront conçues pour maximiser la qualité des données tout en limitant le nombre d’animaux : Les expériences pourront inclure des groupes de contrôle négatifs et positifs réduits, mais suffisamment représentatifs pour des comparaisons statistiquement valables. Une randomisation stricte des animaux dans les différents groupes sera appliquée pour minimiser les biais expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien être (alimentation, boisson, comportement général, grille de scores spécifiques au protocole...). Un enrichissement dans la cage (igloo et carrés de coton) permettra d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Dans le cadre de l’évaluation des seuils tactiles ou thermiques, les animaux seront apportés dans la salle d’expérimentation pour des séances d’habituation, se déroulant sur les deux journées consécutives précédent le début de la procédure. Durant ces sessions, les animaux seront mis en présence de l’expérimentateur et du matériel utilisé afin de les familiariser à cet environnement. Dans la mesure du possible, la même salle d’expérimentation sera utilisée tout au long de la procédure expérimentale. Leur poids sera évalué régulièrement, au minimum 3 fois/semaine, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse. L'utilisation d'analgésiques n'est pas réalisable sur ces modèles car apporterait un biais expérimental mais des points limites ont été définis afin de limiter la souffrance des animaux. Afin de limiter le stress et la douleur des animaux, les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés. Approches de fin d’étude respectueuses : Utilisation de méthodes approuvées pour garantir une euthanasie rapide et sans douleur avec vérification systématique de l’absence de conscience avant toute analyse post-mortem. Maximisation des données par animal : Réalisation de multiples analyses sur les tissus collectés pour limiter le recours à des animaux supplémentaires. Tous les intervenants sont formés à l'expérimentation animale et aux techniques d’imagerie et standardisation des procédures pour garantir la reproductibilité des résultats et minimiser les variations entre opérateurs. Cette stratégie de raffinement vise à améliorer le bien-être animal à chaque étape du projet, tout en maximisant et fiabilisant les données obtenues par animal. Elle repose sur des techniques avancées, une gestion rigoureuse des conditions expérimentales, et une surveillance constante du bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle expérimental de choix pour l'étude des maladies inflammatoires comme l'arthrite rhumatoïde et psoriasique. Les souris possèdent un système immunitaire bien caractérisé et similaire à celui des humains, permettant une extrapolation pertinente des mécanismes immunologiques étudiés. La disponibilité de lignées consanguines facilite l’exploration des réponses immunitaires spécifiques et des mécanismes d’action des traitements testés. Elles permettent de reproduire les caractéristiques cliniques, histopathologiques et immunologiques de ces pathologies, facilitant l’étude des mécanismes sous-jacents et l’évaluation de traitements thérapeutiques. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~7-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. En effet, il est bien établi dans la littérature que l'induction d’une inflammation menant au développement de maladies ostéo-articulaires chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible. Dans le cas de notre étude, ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques. Il s'agit également du stade auquel les animaux sont les moins susceptibles de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale.

Toutes tuées pour que leur cerveau soit prélevé, 60 souris de quatre à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection de kaïnate déclenche chez elles des crises convulsives généralisées, cotées sur l'échelle de Racine, suivies d'un état épileptique puis de crises récurrentes. S'y ajoutent la pose d'un cathéter intraveineux et une incision du cuir chevelu avec fraisage du crâne pour installer une fenêtre crânienne, opération de trente minutes dont les animaux ne se réveillent pas. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro, ex vivo, in silico ou sur puce microfluidique ne reproduit la complexité en jeu, et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

L’épilepsie pharmacorésistante reste un défi thérapeutique majeur, notamment dans les formes sévères associées à des crises prolongées ou récurrentes. Le cannabidiol (Epidiolex®) et la fenfluramine (Fintepla®) ont montré une efficacité clinique dans certaines formes d’épilepsie pédiatrique (syndromes de Dravet et de Lennox-Gastaut), mais leurs mécanismes d’action restent mal compris, et leur efficacité dans d'autres contextes épileptiques n’a pas été pleinement explorée. Par ailleurs, des études chez la souris ont montré un rôle spécifique des récepteurs cannabinoïdes de type 2 (CB2) dans les mécanismes de protection dans le contexte d’épilepsie pédiatrique. Cependant, leurs effets sur les altérations neurovasculaires associées aux crises, notamment sur la barrière hématoencéphalique (BHE), restent peu étudiés. La BHE joue un rôle central dans le contrôle de l’environnement cérébral, et sa perturbation est maintenant reconnue comme un acteur clé dans la genèse et la chronicisation de l’épilepsie. Des études ont montré que les crises épileptiques induisent une ouverture de la BHE, facilitant l’infiltration de cellules immunitaires et de composants plasmatiques pro-inflammatoires dans le parenchyme cérébral, ce qui peut aggraver l’excitabilité neuronale. L’utilisation du modèle murin d’épilepsie induite par injection systémique de kainate chez la souris permet de reproduire de manière fiable des crises convulsives aiguës suivies d’un état épileptique et d’une phase chronique avec crises récurrentes, mimant certains aspects de l’épilepsie humaine. Ce modèle est largement validé pour l’étude des mécanismes physiopathologiques de l’épilepsie et pour l’évaluation préclinique de nouvelles approches thérapeutiques. Il est donc particulièrement adapté pour étudier l’impact de traitements antiépileptiques sur la restauration de l’intégrité de la BHE, la modulation de la neuroinflammation et les interactions neurovasculaires. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer si l’activation du système sérotoninergique et/ou du système endocannabinoïde (récepteurs CB2) est capable de préserver l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et l’infiltration immunitaire dans le contexte des crises épileptiques pédiatriques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont significatifs. Il vise à évaluer l’effet thérapeutique d’un agoniste sélectif des récepteurs cannabinoïdes de type 2 (CB2) dans un modèle préclinique bien établi d’épilepsie induite par le kaïniate. En particulier, le projet se concentre sur l’impact de ce traitement sur l’intégrité et la perméabilité de la barrière hématoencéphalique (BHE), qui joue un rôle central dans la physiopathologie de l’épilepsie, notamment dans les formes pharmacorésistantes. Ce travail pourrait permettre de mieux comprendre le rôle des récepteurs CB2 dans la modulation de l’inflammation neurovasculaire et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le contexte de l’épilepsie pédiatrique. À terme, il pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches de traitement non seulement pour les patients pédiatriques mais aussi ceux atteints d’épilepsie réfractaire.

Procédures

Type d’interventions, nombre et durée : 1. Induction du modèle d’épilepsie: Cette procédure dure environ 1 à 2 heures par animal (1 seule fois). 2. Pose d’un cathéter intraveineux (10 minutes/souris ; 1 fois). Intervention légère sous anesthésie générale avec analgésie préopératoire. 3. Chirurgie pour la mise en place d’une fenêtre crânienne sous anesthésie générale et analgésie (30 minutes/souris ; 1 fois). 4. Traitements pharmacologiques expérimentaux (durée 2 minutes, 1 fois/jour).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, l’induction du modèle d’épilepsie est susceptible d’entraîner des effets indésirables chez les souris. Ces effets incluent des crises convulsives généralisées (évaluées selon l’échelle de Racine), une altération de l’état général (perte de poids, hypomotricité), ainsi qu’un stress aigu durant la phase d’induction. Cette phase est considérée à sévérité modérée, et restera strictement encadrée par des critères de surveillance clinique renforcée de la part des expérimentateurs, avec mise en place de points limites clairs pour interrompre l’expérience en cas de souffrance excessive. Cette étude prévoit également une chirurgie pour la mise en place d’une fenêtre crânien. Cette procédure est associée à une nuisance modérée, incluant une incision cutanée et un fraisage du crâne. Une anesthésie générale et une analgésie préopératoire sera systématiquement administrée pour réduire au minimum la douleur et le stress liés à cette intervention. Cette dernière intervention sera sans réveil. Les traitements pharmacologiques expérimentaux ne sont pas connus pour induire de toxicité aiguë aux doses prévues, mais une surveillance spécifique de la part des expérimentateurs sera mise en place pour détecter d’éventuels effets indésirables (notamment sédation excessive, modifications cardiovasculaires ou comportementales). L’ensemble des procédures expérimentales respectera les recommandations du 3R, avec un effort particulier sur le raffinement (analgésie systématique, suivi clinique rapproché, intervention immédiate en cas de souffrance non anticipée) et une justification du nombre d’animaux utilisés.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveau pour analyses ultérieures.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’un agoniste sélectif des récepteurs CB2, en comparaison avec la traitement utilisé en clinique, sur l’activité épileptique et l’intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE) dans un modèle in vivo d’épilepsie pharmacorésistante. À ce jour, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire fidèlement la complexité des interactions neurovasculaires, immunitaires et électrophysiologiques impliquées dans l’épilepsie et ses comorbidités, en particulier en ce qui concerne la dynamique de la BHE en situation pathologique. Les systèmes cellulaires en culture (cultures primaires, co-cultures ou organoïdes cérébraux) permettent d'étudier certains mécanismes moléculaires isolés, mais ils sont incapables de modéliser les crises épileptiques dans leur dimension systémique (réseau neuronal global, perfusion cérébrale, réponse immunitaire périphérique, comportement animal, etc.). De même, les modèles in silico ou les approches sur puce microfluidique ne peuvent pas intégrer la dimension spatiotemporelle et multifactorielle des altérations observées in vivo, notamment l’impact du traitement pharmacologique sur les paramètres physiologiques globaux. L’utilisation d’un modèle animal avec induction d’un status épileptique, est donc indispensable pour répondre à la problématique scientifique posée. Ce modèle est bien caractérisé, cliniquement pertinent et permet d’étudier de manière intégrée les effets d’un traitement sur les crises épileptiques, les altérations de la BHE, l'inflammation cérébrale et les effets comportementaux. Ainsi, aucun substitut expérimental ne permet aujourd’hui d’acquérir les données nécessaires avec un degré de pertinence biologique équivalent, ce qui justifie le recours à un modèle animal pour ce projet.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Tout d’abord, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives comme l’IRM permet de réduire le nombre d'animaux utilisés ; de cette manière, les procédures utilisées ont été réfléchies de manière à les rendre compatibles entre elles (nous utiliserons d’abord l’IRM –technique non invasive- et le lendemain l’imagerie biphotonique chez la même souris, ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre de souris à utiliser dans le projet). Ainsi, nous avons conçu ce projet de façon à ce que les mêmes souris nous permettent d’obtenir des résultats sur l’inflammation vasculaire, la perméabilité de la BHE, la réponse immunitaire des cellules résidentes du cerveau (microglie) et les phénomènes d’infiltration leukocytaire (rolling et adhésion de leukocytes circulants aux parois vasculaires).

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, il est prévu l'utilisation d’analgésie péri-opératoire et post-opératoire ainsi que d'anesthésie pour toute procédure chirurgicale et imageries. Les points limites adaptés à l’étude ont été établis; une grille de score (grimace-scale) sera utilisée. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par les expérimentateurs 7/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l'angoisse, la souffrance de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et en immunologie. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris se rapproche de celui de l'homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la dynamique de microglie dans les conséquences des crises épileptiques. Les animaux transgéniques utilisés seront âgés de 4 à 6 semaines et auront un poids d'environ 12-18 g. Nous réaliserons nos modèles sur des jeunes souris afin de pouvoir mimer la pathologie épileptique pédiatrique.

Un lupus provoqué par une injection unique dans le péritoine, une arthrite par deux injections intradermiques, une colite chimique : 540 souris sont soumises à ces modèles inflammatoires puis à des séances d'imagerie de trente minutes, cathéter posé sous anesthésie profonde, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue. Le porteur veut valider un agent de contraste couplé à un anticorps pour visualiser sans biopsie les agrégats immunitaires qui se forment dans les tissus enflammés. Il décrit pourtant, pour la colite, une diarrhée, des saignements et une souffrance de durée possiblement prolongée sur plusieurs jours, et fixe la mise à mort à plus de 20 % de perte de poids ou à un score de grimace supérieur à 1,5.

Objectifs

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des agrégats immunitaires de quelques centaines de micromètres qui se développent dans les tissus sous l'effet d'une inflammation chronique. En temps normal, ces TLS possèdent probablement de nombreux avantages en permettant de générer une réponse immunitaire locale. Néanmoins, dans des situations d'inflammation chronique ces structures entretiennent la pathologie présentée. Il a ainsi pu être démontré chez l'homme que la présence de TLS était associé à un mauvais contrôle de la pathologie au cours de rhumatismes inflammatoires, de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin ou de pathologies auto-immunes. Afin de visualiser l'inflammation en imagerie, il est possible d'utiliser des agents de contraste magnétiques pouvant être détectés par des techniques d'IRM ou d'imagerie à particules magnétiques (une modalité d'imagerie récemment introduite qui repose sur la détection du signal émis uniquement par les microparticules d'oxyde de fer, et qui permet la réalisation d'une étude corps entier, contrairement à l'IRM) et sélectivement dirigées contre un marqueur inflammatoire spécifique de la structure d'intérêt. Les TLS sont entourées de cellules vasculaires très spécialisées, qui expriment un motif appelé PNAd. Ce motif est reconnu par un anticorps spécifique, qu'il est alors possible de coupler à l'agent de contraste afin de permettre la visualisation des TLS par une approche d'imagerie. Un nouvel agent de contraste biocompatible a récemment pu être développé, ouvrant ainsi la voie à une translation à l'homme. Nous souhaitons donc valider cette approche d'imagerie moléculaire des TLS en utilisant ce nouvel agent de contraste couplé à un anticorps dirigé spécifiquement contre PNAd dans différents modèles précliniques de pathologies inflammatoires ou auto-immunes. Ceci permettrait de valider la possibilité d'une imagerie moléculaire de l'inflammation chez l'homme, par l'utilisation de ce nouvel agent de contraste.

Bénéfices attendus

La présence de TLS au sein des sites inflammatoire a pu être démontrée comme associée à un mauvais pronostic, y compris sous traitement immunomodulateur. L'évolution de la présence et du nombre de TLS a également pu être associée à la réponse thérapeutique. Actuellement, l'identification des TLS au sein d'un organe d'intérêt repose sur l'analyse microscopique du tissu après réalisation d'une biopsie. Cette technique présente de nombreuses limites. Il s'agit en effet d'un examen invasif, avec un risque de complication (hémorragie du site de ponction, perforation...) non négligeable, ce d'autant plus si l'on souhaite évaluer l'évolution des TLS au cours du temps et donc répéter les examens. De plus, l'analyse d'une biopsie n'apporte qu'une information parcellaire et ne permet pas une analyse complète de l'organe d'intérêt. Outre l'absence de vision d'ensemble, le risque de faux négatif est donc important. Enfin, la réalisation d'une biopsie est un examen destructeur, qui empêche donc le suivi d'une structure donnée au cours du temps. Pour toutes ces limites, il apparaît aujourd'hui nécessaire de développer une technique non invasive permettant l'étude, le suivi et la caractérisation des TLS. Le développement et la validation de notre agent de contraste utilisable en IRM dans différents modèles de pathologies inflammatoires permettrait ainsi d'ouvrir la voie de l'imagerie non invasive de l'inflammation en pratique clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront suivis aux interventions suivantes : induction d'un modèle de lupus par injection intra-péritonéale unique (30 secondes) ou induction d'un modèle d'arthrite par deux injections intradermiques sous anesthésie profonde (5 minutes chaque) ; pesées quotidiennes (durée inférieure à 5 minutes) ; pose d'un cathéter pour l'administration de l'agent de contraste sous anesthésie profonde (environ 15 minutes) ; réalisation d'examens d'imagerie avec injection de l'agent de contraste (environ 30 minutes) ; injection d'un traitement par voie intra-péritonéale (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les modèles de colite utilisés sont susceptibles d'occasionner des effets indésirables chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience dans l'utilisation de ce modèle et des données de la littérature, nous savons que le modèle de colite est susceptible de produire une diarrhée et des des saignements. Il est susceptible d'entraîner une perte de poids chez les animaux, un inconfort physique et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours). Le modèle de lupus est susceptible d'entraîner une ascite, puis l'apparition de douleurs articulaires. L'effet le plus sévère de ce modèle rapporté dans la littérature est la survenue d'un saignement pulmonaire. Néanmoins, les souris utilisées ici, ne présentant pas ce type d'évènement. Le modèle de polyarthrite est susceptible de produire des douleurs et gonflements articulaires. La réalisation de l'imagerie, accompagnée de la pose d'un cathéter veineux peut se traduire par une douleur au point d'injection, une inflammation, une infection du site, une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer l'affinité de l'agent de contraste ciblant PNAd sur des cultures de cellules endothéliales. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier l'affinité de l'agent de contraste pour sa cible moléculaire à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales décrites ci-après sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures utilisant le même type d'animaux et les mêmes modèles de colite, ainsi que selon les données de la littérature et la sensibilité/spécificité des méthodes utilisées. En fonction de l'expérimentateur (expérience, habitilité) et du taux de mortalité obtenu (notamment pour les modèles de colite), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Enfin, l'utilisation de techniques non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en répétant les analyses d'image à différents temps. Pour le modèle de colite, un calcul du nombre de sujets nécessaire a pu être réalisé à partir des données antérieures de l'équipe (8 sujets par groupe, inflaté à 12 pour tenir compte de pertes potentielles ; 16 sujets pour la modulation par un traitement) pour une puissance de 80% et un risque de première espèce de 5%. Concernant les autres modèles, l'utilisation d'une telle modalité d'imagerie n'y a jamais été réalisée. Nous considérons donc qu'il s'agit d'une étude pilote, et qu'il n'est pas possible de réaliser un calcul du nombre de sujets nécessaires.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel ou igloo, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge (points limites cités plus loin). La douleur sera évaluée par utilisation de la par l'utilisation de la mouse grimace scale. Les animaux seront pesés quotidiennement (points limites cités plus loin). Les animaux des groupes colites ou présentant des arthrites bénéficieront d'une coupelle de croquettes humidifiées pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture ad libitum. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort si : perte de poids > 20% ; le score moyen de la mouse grimace scale est supérieur à 1.5 ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant la pose du cathéter, l'injection des particules ou la perfusion intracardiaque, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Les animaux présentant une déshydratation seront réhydratés. Les animaux présentant des signes de douleur ou d'inconfort (mouse grimace scale > 0.5, isolement, horripilation, respiration rapide) recevront une antalgie. Au cours des différentes procédures expérimentales, les animaux recevront une antalgie, une anesthésie générale, une anesthésie locale.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude des TLS en conditions inflammatoires. Il faut également noter que la cible de notre traceur (PNAd) est un motif conservé entres espèces, autorisant une translation rapide des résultats obtenus de la souris à l'homme. Dans les modèles de colite, les souris utilisées seront des souris mâles âgées de 8 semaines, stade optimal pour l'induction du modèle. Le modèle de lupus utilisera des souris femelles de souche BALB/c ou C57BL6/J âgées de 8 semaines. En effet, les souris mâles ne présentent pas de phénotype lupique. Le modèle d'arthrite fera appel à des souris DBA/1 de 8 semaines, selon les données de la littérature. Le modèle de vieillissement fera appel à des souris Swiss âgées de 68 semaines, et de 8 semaines pour les contrôles.

36 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, huit d'entre eux étant tués pour le prélèvement d'organes et vingt-huit réutilisés dans d'autres procédures du projet ou d'autres études. Chacun subit jusqu'à huit prises de sang dans une même journée, vingt-cinq au total sur douze semaines, trois prélèvements de ganglions de trente minutes, et pour certains un prélèvement de moelle osseuse. Les anesthésies s'enchaînent sur vingt-quatre heures, dont une de deux heures et, pour une seconde procédure, une de huit heures, que le porteur reconnaît inconfortables. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace un système immunitaire complet, ce qui rend selon lui l'usage d'animaux non-humains "indispensable".

Objectifs

Les immunothérapies sont des traitements qui agissent sur le système immunitaire du patient pour lutter contre la pathologie. Dans le cadre du cancer, les immunothérapies ont pour objectifs de réactiver le système immunitaire affaibli par la tumeur. Dans le cadre des maladies auto-immunes ou maladie inflammatoire chronique, les immunothérapies ont pour but d’inhiber ou de réguler le système immunitaire. Malgré des avancées et plusieurs immunothérapies efficaces, les patients non-répondeurs/en rechutes sont nombreux. Il est donc essentiel de continuer de chercher d’autres combinaisons de thérapie pour améliorer les soins actuels dans le cancer ou maladies inflammatoires chroniques ou aigues.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’une part d’évaluer la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’un produit destiné à la médicamentation humaine permettant ainsi d’anticiper un schéma d’administration, valider l’intérêt thérapeutique et d’estimer d’éventuels effets secondaires liés à l’injection de ce médicament. La biodistribution de la molécule thérapeutique d’intérêt dans les tissus permettra de renforcer ces données.

Procédures

Les animaux seront soumis à des anesthésies pour effectuer une injection intraveineuse de la molécule thérapeutique d’intérêt, à plusieurs prélèvements : - sanguins (au maximum 8 dans une même et seule journée, 25 sur la totalité de la procédure expérimentale sur 12 semaines maximum) durée 15 min -de ganglions (3, avant et pendant le traitement,) durée 30 min. Des animaux pourront avoir un prélèvement de moelle osseuse (durée 30 min). Des anesthésies prolongées seront effectuées (maximum 2 heures pour une procédure et 8h pour une seconde) lors de l’injection intraveineuse et le prélèvement de ganglions.

Impact sur les animaux

Les protocoles d’anesthésie répétés sur 24h, et notamment une anesthésie prolongée de 2h, lors de l’injection de la molécule pour évaluer la pharmacodynamique seront inconfortables et à ce titre, les animaux spécifiquement lors de cette journée seront suivis de manière accrue et l’inconfort le plus adéquatement maîtrisé. Une légère douleur peut être induite par le prélèvement de moelle osseuse, qui sera traitée par antalgique.

Devenir

Les protocoles utilisés dans cette étude permettent une réutilisation de 28 des animaux dans ce projet après accord du vétérinaire et du SBEA pour une nouvelle procédure. Effectivement, un même animal pourra être réutilisé dans une autre procédure de cette même étude, mais également dans un protocole d'une autre étude. Les 8 animaux (ré-)utilisés pour évaluer la biodistribution de la molécule seront mis à mort pour permettre le prélèvement de différents organes, ces animaux auront pû précédemment étre utilisés dans une procédure expérimentale légère ou modérée.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires, sur des lignées cellulaires, sur des cellules et biopsies humaine (ex vivo) ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule. Des analyses computationnelles de banques de données humaines et animales ont également permis de confirmer la cohérence des traitements étudiés. Les résultats obtenus lors d’études préliminaires in vivo chez la souris nous permettent maintenant d’étudier la molécule de façon plus précise chez le primate non humain.

Réduction

Ce genre de protocole chez le macaque ne peut être réalisé comme une étude statistique, en effet, dans le respect de la règle des 3R et d’un point de vue éthique, nous limitons le nombre d’animaux au strict minimum,. Cependant, compte tenu de la variabilité individuelle, un nombre minimal d’animaux est essentiel pour obtenir une relevance scientifique quant à l’interprétation des résultats obtenus et l’identification d’un éventuel effet thérapeutique tout en réalisant de manière fiable une étude Pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule. Dès que cela est possible, les animaux seront réutilisés entre les différentes procédures expérimentales de la même molécule ou d’une autre molécule, cela permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé dans ce projet. Lors de l’étude, les animaux seront leur propre contrôle. Si une dose testée répond à toutes les attentes, les autres doses ne seront pas étudiées. Une étude bibliographique approfondie de l’art antérieur sera effectuée pour espère trouver cette dose. Si une molécule n’a pas un profil satisfaisant pour passer en essai clinique chez l’homme, l’étude complémentaire au niveau tissulaire ne sera pas effectuée.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées chez le macaque sous anesthésie. La douleur sera dans la mesure du possible évitée par injection d’analgésique Les animaux sont hébergés avant et après protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Les primates non humains, et plus précisément les macaques dans cette étude, représentent l’espèce animale de choix comme modèle préclinique étant donné leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’Homme. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes dont le système immunitaire est alors mature.

Jusqu'à trente injections intrapéritonéales, une par jour, sur des souris éveillées : 646 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. S'y ajoutent une à deux instillations intranasales sous anesthésie, trois prises de sang, une injection intraveineuse, une chirurgie de vingt minutes, puis un lavage broncho-alvéolaire et une perfusion intracardiaque terminale. Le travail cherche à comprendre comment se forment dans le poumon des cellules immunitaires résidentes, étape présentée comme utile à de futurs vaccins contre le cancer du poumon. Sur les alternatives, le porteur avance que les modèles in vitro ne miment pas les réponses immunitaires, que l'expérimentation animale est "indispensable" et qu'"aucune méthode alternative n'existe".

Objectifs

Le but des vaccins anti-tumoraux est d’induire des cellules immunitaires capables d’éliminer les cellules tumorales. Des travaux ont montré que dans le cancer du poumon, il est important d’induire localement des cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans cet organe, car ces cellules résidentes sont connues pour avoir une protection plus rapide et plus efficace du fait de leur localisation. Ces cellules ne peuvent être générées que par une voie de vaccination intranasale et non systémique ( sous-cutanée ou intramusculaire). L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes qui favorisent la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes, après vaccination intra-nasale.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance dans la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans les poumons, permettra de développer et d’optimiser des vaccins anti-tumoraux pour traiter les cancers du poumons.

Procédures

Injection par voie intra-nasale : 1 ou 2 fois à 2 semaines d'intervalles, sur animaux sous anesthésie générale, durée: 30min. Injection par voie intra-péritonéale d’anesthésique sur souris vigiles: 1 ou 2 injections à 2 semaines d'intervalles,durée: 10secondes/injection. Injection par voie intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : entre 13 et 30 injections ( 1 injection/ jour sur une période de 13 à 30 jours),durée 10 secondes/ injection. Prélèvement de sang: x3 sur souris anesthésiées,durée 1-2 min. Injection intraveineuse de produit : 1 fois sur animaux sous anesthésie générale,durée: 30 secondes. Injection d'analgésique par voie sous-cutanée sur souris vigiles : x1 fois, durée 10 secondes/injection. Prélèvement du lavage broncho alvéolaire (x1fois), perfusion intracardiaque et prélévement du poumon (x1fois) sur animaux sous anesthésie générale,durée totale environ 30 min. Chirurgie sur animaux sous anesthésie,durée 20 min.

Impact sur les animaux

La vaccination par voie intranasale peut induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoire (traitée par un analgésique) et risque d’infection et problème de cicatrisation ( traitée avec un antiseptique locale).

Devenir

mise à mort pour récupérer les organes en vue d’analyse de la réponse immunitaires

Remplacement

L’analyse des réponses immunitaires après vaccination, dans différents organes au cours du temps, ne peut être évaluée que dans des organismes entiers. Les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement muqueux pulmonaire. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme. Aucune méthode alternative n'existe.

Réduction

Les paramètres expérimentaux (doses, cinétiques) ont été déterminés selon des données déjà publiées. Basé sur des études déjà publiées et avec l’aide d’un logiciel de calcul d’effectifs, nous avons déterminé un nombre d’animaux minimum pour avoir assez de matériel et garantir une analyse statistique fiable. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les injections intranasales, les prélèvements de sang, les injections intraveineuses, et la chirurgie sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des analgésies pre et post-opératoires sont prévues ainsi que des solutions antiseptiques pour la cicatrisation. Tous les vaccins et traitements sont préparés dans des formulations validées pour des administrations chez l’animal et ne sont pas décrits comme toxiques aux doses utilisées. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteint d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris, car nous avons des vaccins déjà utilisés et validés dans cette espèce pour induire une bonne réponse immunitaire dans les poumons ainsi que tous les outils et techniques d’analyse adéquats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car le système immunitaire est développé et mature.

Greffées d'une tumeur sous la peau sous anesthésie gazeuse, puis piquées jusqu'à quatorze fois par des micro-aiguilles chargées d'immunothérapie, 3 974 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs tissus. Le porteur signale une gêne au site d'implantation de la tumeur, avec difficulté à se déplacer dans la cage. L'objet est de produire les données précliniques d'un essai clinique sur le mélanome localisé de stade IIB et IIC, dont la prise en charge actuelle laisse un fort risque de rechute. Le RNT annonce des lignées "génétiquement modifiées et immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale", puis affirme que ces mêmes modèles permettront de valider les observations "dans un système immunocompétent".

Objectifs

En 2020, 1,5 million de cancers de la peau ont été diagnostiqués dans le monde, dont environ 325 000 mélanomes. En France, on dénombre 18 000 nouveaux cas par an, avec un pic d’incidence entre autour de 50 ans, avec 2 000 décès enregistrés en 2018. Les stades localisés IIB et IIC, caractérisés par un mélanome épais et/ou ulcéré sans métastase, affichent des taux de survie à 10 ans de 82% et 75%, mais présentent un risque de rechute élevé, comparable à celui des stades IIIB avec métastases ganglionnaires. Le traitement repose sur la chirurgie, complétée par des thérapies adjuvantes. L'immunothérapie néo-adjuvante (donnée avant la chirurgie) est maintenant couramment utilisée chez les patients ayant des métastases régionales (ganglions envahis) macroscopiques car elle a démontré une efficacité supérieure aux thérapies adjuvantes (mêmes traitements mais données en post-opératoire avec un nombre de récidive significativement diminué versus les traitements adjuvants). Un essai clinique évalue actuellement l'efficacité d'une immunothérapie systémique en néo-adjuvant pour les stades IIB/IIC. Une technologie innovante et prometteuse, non encore utilisée en clinique consisterait à utiliser des micro-aiguilles pour administrer localement des anticorps bloquant les points de contrôle immunitaires, stimulant une réponse immunitaire dirigée contre les antigènes tumoraux sein des ganglions de drainage du mélanome, tout en limitant les effets indésirables systémiques. Ce projet vise à produire des données précliniques pour un essai clinique sur l’utilisation des micro-aiguilles comme traitement local pour les mélanomes de stades IIB/IIC. La recherche fondamentale (in vitro) et préclinique (modèles animaux) évaluera l’efficacité de cette stratégie sur les réponses immunitaires et biologiques. Les résultats attendus incluent une réduction de la masse tumorale, une meilleure stimulation des lymphocytes infiltrant les tumeurs et au sein des ganglions de drainage, une rétention prolongée des anticorps au site tumoral et une diminution des effets indésirables systémiques par rapport aux traitements conventionnels, administrés par voie systémique. Les modèles souris recevront une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, permettant d’obtenir un modèle rapide et reproductible, avec une mesure de la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, les mélanomes de stades IIB/IIC sont pris en charge par la chirurgie (exérèse large) puis par un traitement adjuvant par immunothérapie et biopsie des ganglions sentinelles. Cette prise en charge entraine de nombreuses récidives à plus ou moins long terme ainsi que des effets indésirables parfois irréversibles. L’un des objectifs de ce projet serait d’ajouter une immunothérapie néo-adjuvante à la prise en charge de ce type de mélanomes localisés en identifiant dans un même temps les réponses immunitaire et biologique secondaires à l’administration par micro-aiguilles (en péri- ou intra-tumoral). Les objectifs secondaires sont multiples et impliquent la caractérisation du microenvironnement tumoral, le profil de toxicité (local et systémique) et la distribution tissulaire/ganglionnaire des administrations péri- et intra-tumorales par rapport à l’administration conventionnelle en IP chez le modèle animal. A plus long terme, ces travaux pourront servir de base à une nouvelle approche thérapeutique chez l’Homme, dans la prise en charge du mélanome localisé et améliorer ainsi leur espérance de vie.

Procédures

Greffes de tumeurs en sous-cutanée sous anesthésie générale gazeuse (durée de 15 minutes, n=1). Injections directes (2 minutes) ou via les micro-aiguilles (5 minutes) de molécules d’immunothérapie (n maximal=14). Prélèvement de sang sous anesthésie générale (n=1 ou 2 pour certains animaux, durée de 10 minutes).

Impact sur les animaux

La mise en place de modèles tumoraux peut induire une gêne modérée au niveau du site d’implantation de la tumeur (difficulté à se déplacer dans la cage, douleur à l’injection) ; les greffes sous-cutanées et les injections peuvent induire une douleur localisée légère de courte durée ; la contention lors des mesures des tumeurs peuvent induire du stress léger et transitoire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro modélisant de manière suffisamment robuste pour analyser les effets de ces traitements par différentes voies d’administration ainsi que sur le devenir de molécules au sein du modèle rongeur. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendant l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostic et thérapeutiques. L’utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. Ce projet nécessite également de travailler sur un modèle animal qui permet de maintenir les interactions immunitaires entre les différents organes.

Réduction

Les études préliminaires vont permettre d’identifier les toxicités ou résistances éventuelles, ce qui permettra de tester nos hypothèses dans les meilleures conditions en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les techniques d’imagerie utilisée dans ce projet vont permettre un suivi longitudinal sur le même individu, sans passer par l’autopsie de l’animal et permettant donc une réduction du nombre d’animaux utilisé. Pour les procédures expérimentales, le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence une différence significative sur les paramètres étudiés. Le nombre d’animaux à utiliser dans chaque procédure dépendra des résultats d’expériences précédentes sur les mêmes immunothérapies.

Raffinement

Les animaux seront surveillés tous les jours. Les injections de cellules tumorales se feront sous anesthésie générale tandis que les injections d’immunothérapie se feront à l’aide d’un anesthésique locaLes souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus précocement possible l’apparition de problèmes de santé. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées. Des points limites stricts et suffisamment précoces seront appliqués. Les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasie seront réalisées dans une troisième pièce. Les souris sont hébergées en groupes sociaux pour respecter leur caractère grégaire et réduire leur angoisse.

Choix des espèces

Bien que pertinentes, nos approches in-vitro, à savoir les cellules en cultures, sont le fruit d’un système « isolé ». Ils ne sont, de ce fait, pas extrapolables à la réalité de la clinique et nécessitent pour cela d’être confirmés in-vivo sur le modèle animal le plus adapté. En effet, il est nécessaire de vérifier cet effet dans un organisme entier incluant les interactions avec le microenvironnement tumoral et le devenir des molécules à l’intérieur d’un organisme vivant. La souris représente l’animal classiquement décrit dans la littérature, pour ce type d’expérimentation. Nous utiliserons des lignées génétiquement modifiées et immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale. L’utilisation de ces modèles nous permettra de valider nos observations dans un système immunocompétent, ce qui est essentiel pour envisager un développement chez l’Homme par la suite. Comme ce qui est classiquement décrit dans la littérature pour ce type d’expérimentations, les animaux utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines, âge auquel apparait cette maladie.