Système immunitaire

Savoir si une inflammation passée modifie la réponse des lymphocytes contre une tumeur conduit à utiliser 300 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles boivent une eau additionnée d'antibiotiques pendant cinq semaines, ce qui provoque une inflammation intestinale, une diarrhée et une douleur abdominale transitoires, subissent une biopsie d'oreille d'un millimètre, un rasage du flanc et une greffe sous-cutanée de cellules tumorales, puis une injection de lymphocytes. Le porteur annonce des points limites précoces et un suivi trois fois par semaine, sans détailler ce qui déclenche l'arrêt. Le bénéfice attendu tient en une phrase de huit mots, l'identification de mécanismes permettant un meilleur rejet tumoral.

Objectifs

Le système immunitaire nous protège des infections et de l’émergence de tumeurs, mais pour fonctionner de manière optimale, il doit constamment se préparer et s'entraîner. Lorsqu’on est malade, l’inflammation générée peut toucher nos lymphocytes. Nous explorons comment cet inflammation passée peut influencer la réponse des lymphocytes contre les tumeurs.

Bénéfices attendus

Identification de mécanismes permettant un meilleur rejet tumoral.

Procédures

Injection aprés anesthésie gazeuse (1 fois 2 min/souris) - Injections (1 fois 20sec/souris)- Légère contention et pesée des souris (20s/3 fois par semaine) – Prélèvement de féces (3 fois, durée de l'intervention 30 secondes environ)- -Rasage du flanc des souris sous anesthésie gazeuse (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – Injection sous anesthésie gazeuse, de lymphocytes (1x 2 minutes/souris) - Récolte des fécés : procédure non invasive et rapide (1 fois/ maximun 20s)-Traitement antibiotiques dans l'eau de boisson pendant une durée maximale de 5 semaines.

Impact sur les animaux

-Léger Stress dû aux diverses contentions -Inflammation intestinale transitoire -Problèmes d’hydratation consécutifs à une diarrhée transitoire - Douleur abdominale transitoire -Gêne et léger douleur dues à la présence d'une tumeur sur le flanc de l'animal-Douleur modérée et transitoire lors d'une petite biopsie (1 mm) à l'oreille

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les oraganes seront prélévés pour analyses.

Remplacement

La maturation du système immunitaire est un processus complexe qui implique l'interaction de divers acteurs, tels que le microbiote, le système immunitaire inné et le système immunitaire adaptatif, et ne peut actuellement être étudiée qu'à l'échelle de l'organisme entier. Par ailleurs, nous avons renforcé nos hypothèses et éliminé un grand nombre de pistes en effectuant une recherche bibliographique exhaustive et en réalisant divers tests in vitro, réduisant ainsi de manière significative notre utilisation d'animaux dans notre projet.

Réduction

Nous avons toute l’expertise immunologique et technique. Ainsi, il n’y a pas de mises au point nécessaires. Utilisation de techniques d’analyses multiparamétriques ce qui réduit considérablement le nombre de matériels biologiques nécessaires. Optimisation maximale des échantillons biologiques. Le nombre de souris proposées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Ce nombre a été calculé à partir d’outil statistique. Ce nombre peut encore être réduit si les tests de prises de décisions ne valident pas nos hypothèses avancées. Nous utilisons mâles et femelles ce qui limite considérablement le nombre de souris à générer. Pour éviter d'augmenter le nombre d'animaux, les expériences seront planifiées de telle sorte à béneficier d'un groupe contrôle commun et éviter ainsi de multiplier les groupes contrôles.

Raffinement

- Un suivi quotidien des animaux (zootechnicien +expérimentateur) permettant un repérage rapide des premiers signes de mal être (tel que l’isolement, des mouvements ralentis ou anormaux, présence de selles molles dans la cage). – Des points limites définis et précoces nous permettant d’agir rapidement ont été mis en place. – Anesthésie des animaux lors de manipulations invasives comme l’injection intraveineuse de cellules et ainsi réduire le stress de l’animal et éviter des mouvements de l’animal pouvant le blesser. – Pour favoriser le bien-être des animaux, leur environnement sera enrichi de maisonnettes en cartons pour se cacher et de bâtonnets en coton pour créer un nid. - Pas d’isolement des souris pour respecter au tant que faire ce peu le comportement social des souris. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris, via notamment l’anesthésie gazeuse et un anesthésique local. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

L’ensemble des outils, anticorps pour ce genre d’études sont développés chez la souris. Le stade adulte (souris 2 mois) est choisi de façon à avoir un système immunitaire mature et une flore commensale stable et complète. Mâles et femelles seront utilisés dans cette étude pour minimiser le biais lié au sexe dans nos observations.

Diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratation, perte de poids, état du pelage, prostration : une grille de score décide à quel moment le rat quitte l'étude pour être tué au CO2. 288 rats sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements sanguins et tissulaires. Chacun reçoit jusqu'à huit injections intraveineuses d'anticancéreux sur 25 jours et jusqu'à vingt gavages quotidiens de la molécule testée, avec des tests hebdomadaires mesurant l'allodynie tactile et thermique, c'est-à-dire le seuil auquel un contact non douloureux devient douloureux. Le porteur reconnaît que des rats plus âgés seraient mieux corrélés à la clinique humaine, le cancer étant une maladie du sénior, mais indique qu'ils coûtent cher et sont rarement utilisés dans la littérature.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques. Cette neuropathie est la conséquence d'une altération des nerfs des patients et se caractérise par des fourmillements, des picotements et des douleurs distales et symétriques, altérant la qualité de vie des patients, et pouvant perdurer longtemps après la fin des traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique est très limitée (aucun traitement préventif recommandé et un seul médicament modérément recommandé pour les douleurs associées). Des travaux récents ont mis en évidence l’activation de processus inflammatoires sur des modèles animaux de neuropathies périphériques chimio-induites, avec notamment des modifications de la concentration de marqueurs sanguins pro- ou anti-inflammatoires chez des rats exposés à des anticancéreux neurotoxiques. Ces perturbations ouvrent la piste de la neuroinflammation dans le contexte de ce type de neuropathie. La neuroinflammation et le système immunitaire sont des pistes particulièrement explorées aujourd’hui dans le contexte de la douleur neuropathique contribuant à son maintien au cours du temps, et représentant de nouvelles cibles thérapeutiques. Une nouvelle molécule ciblant ces processus neuro-inflammatoires représenterait un candidat médicament intéressant. De plus cette molécule a déjà été testée dans le contexte de la douleur chez la souris et du cancer chez le rat, et représente ainsi un ligand particulièrement intéressant pour évaluer le rôle du système immunitaire dans le contexte de la douleur neuropathique. L’objectif du projet sera de mesurer l’effet préventif et analgésique de cette molécule chez l’animal vivant (modèles de neuropathies périphériques chimio-induites).

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles de traitement des neuropathies périphériques chimio-induites chez l'animal ciblant la neuroinflammation. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge de ces neuropathies chez les patients est très limitée, avec aucune stratégie préventive recommandée et un seul médicament modérément recommandé pour le traitement des douleurs neuropathiques associées. Ainsi ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement et de prévention des neuropathies périphériques chimio-induites.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections d’anticancéreux. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours pour deux modèles animaux et de 5 sur 9 jours pour un autre modèle animal, par voie intraveineuse, et durée des injections de 10 secondes (max). Tous les animaux recevront des gavages oraux quotidien de la molécule à l’étude pour une évaluation des effets préventifs (20 gavages sur 25 jours pour deux modèles animaux, et 8 gavages sur 9 jours pour un modèle animal), et pour une évaluation des effets analgésiques (3 gavages sur 3 jours pour tous les animaux). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront au maximum 60 minutes pour un animal.

Impact sur les animaux

La neuropathie induite par les anticancéreux sera associée à des douleurs modérées de type allodynie (stimulus non douloureux chez l'animal sain, ex : sensibilité tactile et thermique). Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux par rapport aux animaux contrôles. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille (voir annexe), et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide par inhalation de CO2.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des études afin d’effectuer des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones ou organoïdes. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de ces neuropathies, qui n'est-elle même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'une étude sur la douleur neuropathique, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer, évaluer et valider les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au minimum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Dans ce type d'étude exploratoire, il est difficile de réduire le nombre d'animaux au risque de ne pas pouvoir conclure (perte du bénéfice de l'étude et utilisation inutile des animaux). L'approche statistique reposera sur une méthodologie en bloc d'animaux (n=12). Cet effectif tiendra compte de la variance des paramètres étudiés et de la puissance des tests statistiques. Avec ces effectifs, sur les tests comportementaux, des tailles d’effet importantes supérieures à 1 sont attendues (différence des moyennes entre les groupes de l’ordre de 20 points pour un écart-type de 10), assurant une bonne qualité des résultats.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire (stimulation nociceptive moins intense). Les animaux seront stabulés dans des conditions standards de 3 animaux par cage (800 cm²), dans une salle climatisée (température 22+/-2°C et hygrométrie 50+/-10%) avec un cycle 12:12 et un libre accès à la boisson et à la nourriture. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille, et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide par inhalation de CO2.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies périphériques chimio-induites. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux. Les animaux seront agés de 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6-9 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

Jusqu'à vingt prélèvements sanguins, douze injections sous-cutanées, quinze injections intramusculaires et dix injections intraveineuses par animal, puis une exsanguination par ponction cardiaque sous anesthésie : 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'immunisation dure de 90 à 365 jours et sert à fabriquer des anticorps monoclonaux et polyclonaux. Le porteur ramène les nuisances à un "léger stress" de préhension et à une boule inflammatoire de moins de quatre millimètres dans moins de la moitié des cas. Le nombre d'animaux, écrit-il, dépend de la quantité d'anticorps demandée par le client.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de générer des anticorps à partir de souris L’immunisation des souris est réalisé par voie sous-cutanée, intra-veineuse ou par intra-musculaire sur une période de 90 à 365 jours. Cette immunisation va nous permettre de générer des anticorps spécifiques de l’antigène d’intérêt. Ces nouveaux anticorps ainsi produit sont des outils essentiels pour le monde de la recherche et développement. Les résultats obtenus grâce aux anticorps générés que nous avons générés ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la création de nouveaux anticorps monoclonaux et polyclonaux. Les anticorps jouent un rôle crucial dans la recherche scientifique et les applications thérapeutiques. Recherche Scientifique 1- Détection des protéines : Les anticorps permettent d’identifier et de mesurer certaines protéines dans des échantillons biologiques. 2- Analyse des cellules : Grâce à un marquage, les anticorps aident à reconnaître et à trier différents types de cellules. 3- Observation au microscope : Ils sont utilisés pour repérer des structures cellulaires. 4- Purification des protéines : Les anticorps permettent d’isoler des protéines d’intérêt à partir d’un mélange complexe. Applications Thérapeutiques 1- Traitements avec des anticorps monoclonaux : Utilisés contre le cancer, les maladies auto-immunes et certaines infections. 2- Thérapies ciblées : Les anticorps peuvent transporter des médicaments directement vers les cellules malades. 3- Neutralisation des microbes : Ils peuvent bloquer l’action de virus ou de toxines bactériennes pour protéger l’organisme. 4- Stimulation du système immunitaire : Les anticorps peuvent renforcer ou réguler la défense immunitaire pour traiter certaines maladies, notamment le cancer. 5- Outils de diagnostic : Présents dans de nombreux tests médicaux, ils permettent la détection de différentes maladies. 1. . Les anticorps sont des outils puissants en recherche et en thérapeutique en raison de leur spécificité et de leur capacité à se lier à des cibles moléculaires précises. Leur utilisation continue de se développer, ouvrant la voie à de nouvelles approches pour la recherche fondamentale et pour le traitement de maladies.

Procédures

- Prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés, environ 5 min, maximum 20 prélèvements. - Injection en sous-cutané sur animaux anesthésiés, environ 1 minutes, maximum 12 injections. - Injection en intra-musculaire sur animaux anesthésiés, environ 1 minutes, maximum 15 injections. - Injection intra-veineuse sur animaux anesthésiés, environ 20 seconde, maximum 10 injections. - Exsanguination en intracardiaque sous anesthésie, sans réveil.

Impact sur les animaux

Il existe plusieurs effet indésirable pouvant toucher les souris au cours de ces programmes de recherche : La préhension de l’animal lors des prélèvements et des injections pouvant lui entrainer un léger stress. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer l’apparition d’une petite boule inflammatoire dont le diamètre ne dépasse pas 4 mm au maximum dans moins de 50% des cas l’apparition Pour les injections intra-musculaires, une très légère douleur pourrait avoir lieu lors de l’injection avec un adjuvant, une analgésie sera mise en place dans ce cas (buprénorphine dose 0,05 mg/kg)

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

À ce jour, il n'est pas envisageable de remplacer le modèle in vivo chez la souris pour la génération des anticorps. En effet, la réponse immunitaire est un phénomène complexe qui implique la coopération de multiples types cellulaires, pour lequel il n'existe pas d'équivalent in vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent, émergent, elles ne permettent pas d'obtenir des anticorps de qualité équivalente. Ces technologies de développement d'anticorps in vitro ne sont pas encore matures. Elles nécessitent un équipement spécifique et des réactifs adaptés, et les chances de succès sont limitées, comme le démontre le faible nombre d'anticorps cliniques généré par ces approches alternatives.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque expérimentation est réduit au minimum. Le nombre d’animaux à utiliser est l dépend de la quantité d'anticorps demandé par le client Pour les anticorps polyclonaux, la purification des anticorps requiert une quantité conséquente de sérum, c'est pourquoi nous utilisons généralement 4 souris par immunogène. Pour les anticorps monoclonaux, nous immunisons entre 3 et 6 souris par immunogène. La réponse immunitaire variant d'une souris à l'autre et selon la nature des immunogènes, plusieurs souris sont nécessaires pour générer des anticorps monoclonaux de qualité.

Raffinement

Les souris sont logées dans des cages standard, avec un maximum de 10 animaux par cage et un minimum de 2. Elles bénéficient d'un enrichissement sous forme de tunnels pour améliorer leur environnement. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des souris pour limiter le stress au maximum. De plus, ils sont anesthésiés à l'isoflurane lors de chaque intervention pour minimiser la douleur et le stress.

Choix des espèces

La souris montre une très bonne réponse immunitaire basée sur les anticorps. De plus de nombreux outils existent déjà pour l’utilisation des anticorps générés dans la recherche et le diagnostic. Nous utilisons des jeunes adultes (environ 7-8 semaines) car c'est à cet âge que la réponse immunitaire est optimale.

Des souris immunodéprimées reçoivent des cellules souches sanguines humaines, pour alimenter environ 720 études précliniques de 50 souris en cinq ans, un volume calé sur le plan commercial de l'entreprise. 45 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et celles jugées inaptes aux études sont tuées, les autres pouvant passer dans d'autres projets de l'établissement. L'agent qui détruit les cellules souches de leur moelle osseuse, injecté sans anesthésie, provoque selon le porteur une "forte douleur abdominale disparaissant en quelques heures", et des nouveau-nés sont greffés sous une anesthésie obtenue en les refroidissant sur la glace jusqu'à dix minutes, au risque d'être rejetés par leur mère. Les souris dont le taux d'humanisation reste sous 25 % peuvent être réutilisées dans une formation interne aux gestes techniques, et un nouveau-né mal humanisé peut être humanisé de nouveau, plus âgé.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de greffer des cellules souches sanguines humaines et leurs dérivées chez des souris immunodéprimées, et ainsi permettre la reconstitution d’un système immunitaire humain fonctionnel (ou représentatif d’une pathologie particulière) et pouvant être modifié par traitement, en vue d’essais préclinique chez la souris.

Bénéfices attendus

En greffant des cellules souches humaines, ou leurs dérivées, à des souris immunodéprimées, nous pouvons reconstituer un système immunitaire humain. Ce faisant, nous apportons un modèle d’étude spécifique qui peut jouer un rôle essentiel dans la compréhension et le traitement de pathologies d’importance, comme certaines infections virales (virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ou hépatites), de nombreux cancers ou des maladies inflammatoires (asthme).

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésies. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. L’anesthésie des nouveau-nés sera réalisée par hypothermie avec de la glace pendant maximum 10 minutes. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. L’humanisation inclura l’administration d’un agent, détruisant les cellules souches de la moelle osseuse, sur souris vigile, suivie d’une greffe de cellules souches sanguines sur souris vigiles ou nouveau-nés sous anesthésie sur glace. Ces interventions dureront de quelques secondes à quelques minutes. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux pour l’implantation de dispositifs sous-cutanés, réalisés sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. L’implantation durera moins de cinq minutes et pourra être répétée selon les besoins de l’étude. À l’issue des études, les animaux non intégrés aux essais précliniques seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

L'injection de l’agent détruisant les cellules souches de la moelle osseuse est une étape induisant une forte douleur abdominale disparaissant en quelques heures. Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de plasmides, l’administrations de traitements, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration. La manipulation chez le nouveau-né pourrait engendrer le rejet de la mère.

Devenir

Le processus d’humanisation pourra être accompagné d’une phase de modulation ou de renforcement in vivo du système immunitaire humain en fonction des objectifs expérimentaux. Cette étape vise à préparer les animaux aux études précliniques envisagées en optimisant la réponse immunitaire du modèle humanisé. Les animaux n’étant pas jugés comme aptes à entrer en étude préclinique en projet de formation ou en projet de recherche interne seront euthanasiés. C’est-à-dire les animaux avec un état de santé jugé moyen et/ou avis vétérinaire défavorable. Dans le cadre d’une utilisation continue, pour réaliser les études précliniques, les animaux pourront être intégrés aux autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Les animaux concernés seront ceux ayant un taux d’humanisation < 25%. Un nouveau-né mal humanisé pourra être nouvellement humanisé en étant plus âgé. La décision est prise par le vétérinaire.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Dans le cadre d’une utilisation continue, les souris humanisées seront impliquées dans des études de recherches précliniques impliquants le système immunitaire. Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 45 000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser environ 720 études précliniques de 50 souris, en se basant sur un taux de succès de l’humanisation de 80%. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

Les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus à partir du sevrage. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (dietgel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles dans le but de synchroniser le cycle œstral de la souris. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement etc) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération est observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire notamment buprénorphine 0,1 mg/kg (voie IP ou SC), administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un rappel sera envisagé toutes les 4–6h selon l’évaluation. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8 mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée, ou tout score clinique dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des humains : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. Depuis de nombreuses années, l'entreprise développe une expertise dans l’humanisation du système immunitaire de multiples souches de souris, notamment les NCG, NXG, NOG et BRG. Fort de cette expérience, il est pertinent de poursuivre le processus d’humanisation sur cette même espèce. La procédure expérimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-nés jusqu'à l'âge de 4-5 semaines, car leur immunité immature favorise la prise de greffe et limite le rejet, garantissant ainsi une reconstitution optimale du système immunitaire humain. À cet âge, le thymus et la moelle osseuse offrent un environnement propice à la maturation des cellules immunitaires humaines, permettant d'obtenir un modèle plus fonctionnel et reproductible.

Une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis jusqu'à quatre injections d'immunothérapie : 1 008 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. La croissance des tumeurs est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, et le porteur indique qu'une crevasse ou une nécrose de la peau peut apparaître en fin de croissance tumorale. L'objectif déclaré est de savoir si une masse musculaire augmentée ralentit des tumeurs colorectales, hépatiques ou des mélanomes en modifiant la réponse immunitaire, avec un potentiel de transfert vers la clinique annoncé comme fort. Une partie des animaux est déficiente pour le gène de la myostatine, ce qui décuple leur masse musculaire, et le porteur décrit la souris comme la seule espèce où de telles mutations s'introduisent facilement.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de déterminer si l’augmentation de la masse musculaire permet de réduire la résistance des tumeurs colorectales, hépatiques et du mélanome à l’action antitumorale des cellules immunitaires en réponse à un traitement par immunothérapie dans des modèles murins de cancer colorectal, de carcinome hépatocellulaire ou de mélanome sous-cutanés chez les mâles et les femelles. Il a été mis en évidence qu’une masse musculaire décuplée chez des animaux déficients pour le gène de la myostatine est associée à une croissance tumorale ralentie et à une formation de polypes intestinaux moindre. Cependant, l’implication potentielle du système immunitaire dans ce processus n’a pas été évaluée et l'impact d'une masse musculaire supérieure sur la réponse à l'immunothérapie n'a jamais été étudiée chez ces souris transgéniques. Nous effectuerons des suivis de croissance tumorale et des isolements de cellules immunitaires infiltrant les tumeurs chez des animaux contôles ou déficients en myostatine traités ou pas par immunothérapie. Diverses équipes nationales et internationales étudient l’impact du cancer sur la perte de masse musculaire et la cachexie mais aucune n’a à ce jour exploré l’effet d’une masse musculaire préservée sur la réponse immunitaire antitumorale en utilisant notamment le modèle de souris déficient pour la myostatine. D'autre part les investigations menées à la fois chez les mâles et les femelles permettront d'évaluer l'effet immunorégulateur du sexe dans l'interaction entre le muscle et le système immunitaire dans un contexte de cancer.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle immunomodulateur du muscle dans un modèle préclinique afin de fournir un rationnel scientifique pour proposer des stratégies adaptées de maintien de la masse musculaire chez la patiente ou le patient atteint d'un cancer digestif ou d'un mélanome dans le but d'améliorer sa réponse à l'immunothérapie et de favoriser des rémissions à long terme. Le potentiel de transfert des résultats de ce projet vers une application clinique faisable est fort.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection d'une solution saline contenant les cellules tumorales d'une durée d'environ 10 secondes et entre 0 à 4 injections d'immunothérapie d'une durée d'environ 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux concernent: - le stress et la légère douleur lors de l'injection des cellules tumorales et des traitements - la douleur modérée possible en fin de croissance tumorale. En effet, l'apparition d'une crevasse ou d'une nécrose de la peau au niveau de la tumeur peut survenir, ce qui est vérifié au cours du suivi des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses cellulaires, biochimiques et moléculaires ultérieures.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, les évaluations de nouveaux agents thérapeutiques en oncologie doivent être réalisées sur les organismes vivants.

Réduction

Si le génotype n'a aucun effet sur l'efficacité de l'immunothérapie lors de l'expérience 2, les expériences suivantes visant à évaluer les modulations précoces de la réponse immunitaire et les réponses immunitaires mémoires ne seront pas réalisées. Aussi, si le sexe n'impacte pas les expériences 1 et 2, un seul sexe sera choisi pour les expériences 3 et 4. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.

Raffinement

L'expérimentateur est formé et expert des modèles tumoraux garantissant des gestes techniques maîtrisés et une manipulation adéquate des animaux. La taille des tumeurs sera mesurée 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse. Cela permettra de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Ce suivi individuel permettra la surveillance du bien-être des animaux qui seront hébergés par groupe de cinq à six dans un établissement agréé. Dans le cas où certaines souris seraient proches d’un point limite, la surveillance deviendra quotidienne. Si un animal présente des signes de souffrance, les mesures nécessaires seront prises pour limiter la souffrance animale et un traitement pourra être administré selon les recommandations d'un vétérinaire.

Choix des espèces

La souris, outre l’avantage lié à ses caractéristiques physiologiques, est la seule espèce animale pour laquelle des mutations génétiques peuvent être relativement facilement introduites et générer ainsi des souris déficientes pour une cible particulière donnée. Ces modèles murins très standardisés permettent une meilleure reproductibilité de nos expériences. Enfin les outils d'évaluation du système immunitaire, notamment les anticorps pour la cytométrie de flux, sont très développés et nombreux chez la souris ce qui permet une investigation approfondie des diverses populations cellulaires d'intérêt. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 12 et 20 semaines d’âge) pour la mise en oeuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et une croissance musculaire stabilisée.

L'expérience s'arrête quand une souris perd 20 % de son poids ou quand sa tumeur cutanée dépasse 17 millimètres de diamètre, s'ulcère ou s'infecte. 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des organes lymphoïdes. Elles reçoivent une à deux injections dans le sinus derrière l'œil, des cellules tumorales sous la peau après rasage, ou une infection par Listeria monocytogenes qui peut provoquer diarrhées et léthargie. Le porteur qualifie ces injections d'actes "ne générant aucun stress", et retient la souris au motif que 99 % de ses gènes sont orthologues à ceux de l'être humain.

Objectifs

Les réponses immunitaires efficaces contre les cellules cancéreuses et les pathogènes sont le résultat de processus cellulaires complexes et hautement coordonnés. Au cours des dernières décennies, d'importants efforts de recherche ont montré que les lymphocytes T jouent un rôle central dans le développement de ces processus. Le développement d'inhibiteurs de points de contrôle immunitaire est apparu comme un mode d'action efficace pour renforcer l'activation des lymphocytes T contre les cellules cancéreuses et à l’inverse pouvant contrôler les réponses auto-immunitaires. Les thérapies basées sur les récepteurs antigéniques chimériques constituent une deuxième approche fructueuse et offrent un moyen unique d'armer les lymphocytes T pour éliminer les tumeurs exprimant des antigènes spécifiques. Cependant, malgré le succès remarquable de l'immunothérapie, tous les patients ne répondent pas aux nouveaux traitements et certains développent des signes cliniques liés à des effets secondaires nocifs. La régulation de l’activation des lymphocytes T implique de nombreux acteurs moléculaires. À cet égard, le ciblage des composants moléculaires impliqués dans la signalisation des cellules T est très prometteur pour contrôler leurs fonctions effectrices. Dernièrement, il a été identifié une molécule appelée Intersectine 2 (ITSN2) qui semble contrôler les niveaux d’expression de récepteurs activateurs présents à la surface des lymphocytes T. L’analyse de la souris déficiente pour l’ITSN2, démontre un phénotype activé des lymphocytes T (mais pas de phénotype dommageable pour la souris). Le but de notre étude est donc d’évaluer dans quelle mesure l’inactivation de l’ITSN2 dans des modèles murins permettent de mieux contrôler le développement de tumeurs, d’infections ou l’apparition de maladies auto-immunes.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôle l’activation des lymphocytes T. Les expériences réalisées avec les modèles murins que nous possédons permettra d’identifier dans quelle mesure l’ITSN2 pourrait être une cible pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses mais aussi dans l’auto-immunité.

Procédures

Les injections intraveineuses en rétro-orbitaire réalisées pour le transfert adoptif seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress. Une à deux injections seront effectuées par souris, la procédure ne durera que quelques minutes. Les injections de cellules tumorales en sous-cutané seront également réalisées sous anesthésie gazeuse ne générant aucun stress et ne prendront que quelques minutes également. La contention pour raser les souris le jour précédant l’injection sous cutanée de cellules tumorales pourra générer un stress de courte durée qui sera minimiser la réalisation du geste par du personnel expérimenté.

Impact sur les animaux

Les injections intraveineuses en rétro-orbitaire réalisées pour le transfert adoptif seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress. Une à deux injections seront effectuée par souris (selon la procédure), la procédure ne durera que quelques minutes. La croissance tumorale pourra conduire à une perte d’appétit, une perte de poids et perte de sociabilité vis-à-vis des congénères. L’infection avec Listeria monocytogenes à des doses sub-léthales, est normalement contrôlé par le système immunitaire des souris de la souche C57BL/6. Les souris pourraient avoir une perte d’appétit, développer des diarrhées et être dans un état léthargique dans les premiers jours suivant l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, les infiltrats cellulaires aux seins des organes lymphoïdes seront analysés. De manière générale, l'analyse des réponses immunitaires nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.

Remplacement

L’étude de processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un contexte tumoral ou auto-immunitaire ne peut être réalisée à ce jour qu’à l’aide de modèles in vivo. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est indispensable.

Réduction

Nous souhaitons étudier des populations cellulaires dont certaines sont rares mais dont la distribution suit une loi normale. Sur la base de nos expériences antérieures et des données de littérature, nous savons que des groupes de 6 animaux, analysés avec un test statistique nous permettent d’obtenir des résultats significatifs et doivent être réalisés en triplicat pour être publiables.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animale de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subi par les souris afin d'obtenir des données qui soient le moins biaisées possible par le "mal être" de l'animal. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (transplantation de cellules tumorales, injection intraveineuse, immunisation). Suite à l’injection de cellules tumorales, de L. Monocytogenes ou à une immunisation, nous porterons une attention particulière à la taille de la tumeur (cas des tumeurs), au poids de l’animal mais aussi à leur posture et leur comportement en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement post injection par les zootechniciens et un score prenant en compte des paramètres tels que l’apparence physique, la capacité à s’alimenter et à s’abreuver, le comportement et la réponse aux stimuli. Pour une souffrance avérée, un traitement analgésique sera mis en place en plus des mesures précédentes qui seront poursuivis. Dans le cas d'une croissance tumorale, en plus des paramètres suivis, l’aspect de la tumeur sera monitoré et les mesures de raffinement seront adaptés. Une perte de poids supérieure ou égale 20% par rapport au début de l’expérience, une tumeur cutanée de diamètre supérieur à 17mm ou une ulcération et/ou infection de celle-ci sera un critère d’arrêt de l’expérimentation. Pour toute expérience nécessitant une manipulation de l’animal, ceux-ci seront anesthésiés avec les méthodes autorisées. Les animaux sont hébergés dans des cages dont la surface est de 500 cm2.

Choix des espèces

Mus musculus, mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide, bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le système immunitaire adaptatif caractérisé par la présence de lymphocytes B et T en interaction avec les cellules dendritiques est issu de l’hématopoïèse laquelle est observée chez les vertébrés uniquement et sur le plan immunitaire, il existe de nombreuses similarités entre l’homme et le modèle souris. Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour les études physiopathologiques de gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge des souris adultes de 7 à 12 semaines seront utilisées.

Seize semaines d'un régime riche en sucres, en graisses et en cholestérol rendent des souris diabétiques, avant qu'un régime cétogène, un régime sans glucides ou un supplément de bêta-hydroxybutyrate ne leur soit imposé pendant trois à neuf jours. 1 010 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur répète qu'aucun effet dommageable majeur n'est attendu, tout en indiquant une perte de poids de 10 à 15 % dans les trois premiers jours du régime cétogène et une prise de poids allant jusqu'à 45 grammes sous régime riche en graisses. La mise à mort sert à prélever des cellules rares du foie pour trois techniques d'analyse qu'il juge "indispensables", dont le séquençage de l'ARN cellule par cellule.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie caractérisée par une sensibilité à l'insuline altérée, dont la prévalence augmente à l'échelle mondiale, constituant ainsi une nouvelle forme de pandémie. De nombreuses interventions alimentaires ont été proposées pour améliorer le contrôle glycémique, le régime cétogène émergeant comme l'une des approches les plus répandues. Cependant, malgré les preuves solides soutenant l'efficacité du régime cétogène dans l'atténuation du diabète, son impact sur l'immunité innée, en particulier sur les macrophages hépatiques, reste mal compris. Ce projet vise à étudier l'effet du régime cétogène chez les souris rendues diabétiques sur une période de 16 semaines de régime occidental riche en sucres et en graisses. Dans une première phase de l'étude, nous chercherons à comprendre l'effet de la cétogenèse précoce sur les populations de macrophages hépatiques. Nous utiliserons ensuite ces informations pour explorer comment cette vague de cétogenèse peut remodeler le profil des macrophages hépatiques afin de les rendre plus résilients face au diabète.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira de nouvelles perspectives sur les cellules et/ou les voies métaboliques que nous devons activer pour déclencher la cétogenèse et inverser le diabète. Les résultats auront donc potentiellement des conséquences pour le traitement du diabète de type II.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux pourront avoir 9 jours de régime alimentaire standard (groupe contrôle), 3 jours de régime cétogène, 6 jours de régime cétogène, 9 jours de régime cétogène, 6 jours de régime riche en matières grasses (66 % de graisses, 30 % de glucides), 6 jours de régime sans glucides (30 % de graisses, 0 % de glucides), 6 jours de régime alimentaire standard avec supplément de beta-hydroxybutyrate, 16 semaines de régime alimentaire standard, 16 semaines de régime alimentaire standard suivies de 6 jours de régime cétogène, 16 semaines de régime riche en glucides/lipides/cholestérol avec saccharose/fructose, 16 semaines de régime riche en glucides/lipides/cholestérol avec saccharose/fructose suivies de 6 jours de régime cétogène. Certains animaux auront un prélèvement de sang (sous anesthésie locale (ponction rapide (durée 5 secondes d'une veine de la queue).

Impact sur les animaux

Régime cétogène : Aucun effet dommageable majeur pour les animaux. Les souris peuvent perdre un peu de poids corporel (jusqu’à 10-15% de perte de poids au cours des 3 premiers jours du régime). Il est à noter que des effets modérés sur l'activité physique peuvent être observés en raison de la transition métabolique vers la cétose. Régime riche en graisses : Pas d’effet dommageable majeur pour les animaux. Les souris peuvent prendre du poids progressivement (jusqu'à 45 g) au fur et à mesure des semaines, mais restent globalement en bonne santé. Régime sans glucides : Aucun effet indésirable significatif. Aucune perte de poids. Régime standard avec supplément de BHB : Pas d’effet dommageable notable. Aucune différence significative par rapport aux souris du groupe contrôle. Prélèvement sanguin: Aucune conséquence grave, mais les souris peuvent ressentir un léger stress ou inconfort dû à la contrainte et au prélèvement. La perte de 50 μL de sang ne devrait pas entraîner d'effets indésirables graves, mais un suivi des signes de stress ou d’inconfort sera réalisé. Les souris seront surveillées de près tout au long de l’étude pour s’assurer qu’elles ne subissent pas de souffrances sévères ou prolongées.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques (cytométrie en flux, imagerie, transcriptomique) qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans le foie dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste donx indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le comportement des macrophages du foie soumis à différentes conditions en interaction avec le microenvironnement. Enfin, notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient aussi la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme. Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.

Réduction

Nous utilisons le moins de souris possible pour cette étude. Après leur euthanasie, nous collecterons différents types de tissus et cellules, y compris des cellules rares comme les macrophages du foie, pour des analyses approfondies (par exemple, single-cell RNA-seq). Chaque souris nous permettra d'obtenir une grande quantité d'informations. Le nombre de souris nécessaires a été soigneusement déterminé pour chaque groupe, soit à partir des données disponibles dans la littérature, soit à l’aide d’outils statistiques (calcul de puissance) pour garantir un effectif juste et nécessaire.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour évaluation clinique adaptée. Des point limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, de nombreuses publications mettent en avant le rôle essentiel des modèles murins dans les études précliniques de la cétogenèse, du diabète de type 2 et de la résistance à l'insuline. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales seront adultes / sexuellement matures (âgées de 8 à 10 semaines) au début de la procédure.