Système immunitaire
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- Biologie du développement
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- Système urogénital
L’effet de différents types d’alimentation sur une maladie inflammatoire rénale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
400 souris génétiquement modifiées pour développer une néphropathie à IgA vont être utilisées, toutes tuées à seize semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant douze semaines des croquettes enrichies en algues ou dépourvues de vitamine A, des antibiotiques dans l'eau de boisson trois fois par semaine pendant huit semaines, puis un gavage de bactéries trois fois par semaine pendant quatre semaines. Chaque semaine elles sont isolées cinq minutes dans une cage sans litière pour récupérer leurs urines et leurs fèces, l'opération étant répétée dans la journée si la quantité recueillie ne suffit pas. Le porteur écrit que la maladie ne leur cause aucune nuisance et que l'utilisation de la souris est "indispensable" pour apporter la preuve du concept avant des essais chez les patients.
Objectifs
La néphropathie à IgA (NIgA), une maladie rénale inflammatoire, est la plus courante en France et dans le monde. Elle a été décrite en 1968 par le professeur Berger. À ce jour, il n’existe pas de traitement pour guérir cette maladie, qui est devenue l’une des principales causes de perte de fonction rénale. Cela nécessite des traitements comme la dialyse (qui remplace la fonction des reins en filtrant le sang pour éliminer les déchets et l'excès de liquide) ou la transplantation de rein. La NIgA se produit lorsque le système immunitaire ne fonctionne pas correctement et attaque par erreur certaines protéines du corps. Cela entraîne une accumulation anormale d’une protéine (l'IgA) dans les reins. Avec le temps, cette accumulation provoque une inflammation qui peut endommager les reins et les empêcher de filtrer correctement le sang. Des modèles des souris génétiquement modifiées ont montré qu’elles développent une forme de la NIgA similaire à celle des humains. L'absence d’une protéine spécifique favorise l’accumulation de ces protéines dans les reins, ce qui accélère la progression de la maladie. Les causes exactes de la NIgA ne sont pas encore totalement comprises, mais des facteurs comme l’alimentation et la flore intestinale (l'ensemble des micro-organismes vivant dans notre corps, comme les bactéries) semblent jouer un rôle important. Ce projet de recherche cherche à mieux comprendre l’impact des régimes alimentaires et de la flore intestinale sur l’évolution de la NIgA. Par exemple, il étudie l’effet d’un régime riche en algues, qui modifie la flore intestinale et favorise des bactéries spécifiques. Ces bactéries sont retrouvées en plus grande quantité chez les patients atteints de NIgA. D’autres recherches montrent que l’élimination de la vitamine A de l’alimentation des souris améliore les symptômes de la maladie, en réduisant l’accumulation de protéines du système immunitaire dans les reins. L’objectif global de cette étude est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques basées sur l’alimentation et la flore intestinale. Ces résultats, encore en phase préclinique, pourraient permettre le développement de nouvelles stratégies pour ralentir ou prévenir la progression de la NIgA, ouvrant ainsi la voie à de futurs essais cliniques chez les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués, tels que l’effet de l’alimentation (riche en algues et déficiente en vitamine A) et de la flore intestinale dans une maladie inflammatoire rénale, la NIgA, afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de la NIgA.
Procédures
Pour étudier l'effet de l'alimentation (riche en algues ou carencée en vitamine A) sur la maladie de la NIgA, les souris seront nourries pendant 12 semaines avec des croquettes contenant des algues ou des croquettes dépourvues de vitamine A, disponibles en libre accès. Le poids des souris sera mesuré une fois par semaine pendant 16 semaines. Des prélèvements seront réalisés toutes les deux semaines pour les urines et chaque semaine pour les fèces pendant 16 semaines. Afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et les bactéries de la flore intestinale dans la maladie de la NIgA, les souris recevront des antibiotiques dans leur eau, trois fois par semaine pendant 8 semaines. A l’âge de 8 semaines, elles seront gavées avec des bactéries, trois fois par semaine pendant 4 semaines. Le poids des souris sera également mesuré chaque semaine dès le début de l'étude pendant 16 semaines. Les prélèvements seront effectués toutes les deux semaines pour les urines et toutes les quatre semaines pour les fèces pendant 16 semaines. Dans les deux cas, les prélèvements d'urine et de fèces seront réalisés sur des souris vigiles. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans litière pour effectuer le prélèvement. Les échantillons d'urine seront collectés à l'aide d'une pipette dans la cage, après que les souris aient uriné d'elles-mêmes. Les échantillons de fèces seront également prélevés dans la cage après que les souris aient fait leurs besoins. Si les échantillons sont insuffisants, l'opération sera répétée au cours de la journée. Les prélèvements d'urine et de fèces seront réalisés le même jour. A l’âge de 16 semaines, les animaux seront euthanasiés conformément aux réglementations en vigueur. Un prélèvement sanguin sera effectué directement au niveau du cœur après la mort des animaux, et les reins, le foie, la rate et l’intestin seront récupérés pour analyse.
Impact sur les animaux
Toutes les souris utilisées ne présentent pas de problème de santé lié à la maladie. La NIgA ne cause pas de nuisances pour elles. Les bactéries ne sont pas des bactéries infectieuses. L’administration des antibiotiques n’a pas d’effet négatif sur les souris. Celles-ci ont bien toléré l’alimentation riche en algues. Les seules nuisances possibles pourraient être liées aux gestes du gavage, comme un stress temporaire ou un léger inconfort dû à l’introduction de la sonde gastrique.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude ne peuvent pas être obtenues actuellement par d'autres méthodes de remplacement compte-tenu de la complexité de l’interaction entre le microbiote intestinale et la réponse inflammatoire (L’organisme fabrique des substances chimiques qui produisent une réponse immunitaire pour lutter contre l'infection ou guérir les tissus endommagés), et les effets rénaux qui nécessitent de travailler à l'échelle d'un organisme entier vivant. L'utilisation de modèle murin est donc indispensable pour montrer le rôle du microbiote apportant ainsi la preuve du concept et permettrait d'envisager des essais cliniques chez des patients.
Réduction
Les souris utilisées présentent un faible taux de mortalité. Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Le nombre de souris par groupe a été fixé en tenant compte des différences possibles dans les effets de la NIgA. Ce calcul a été basé sur des résultats préliminaires et sur un calcul statistique.
Raffinement
Dans le respect de la loi des 3R et dans un souci de bien-être animal, des matériaux comme du coton et du kraft seront ajoutés dans les cages pour permettre aux animaux de faire des nids et éviter les comportements stéréotypés. Nous nous assurerons qu'aucun animal ne soit isolé durant l'expérience afin de préserver leurs groupes sociaux. Des seuils de sécurité, définis de manière précoce, ont été établis pour éviter toute douleur, souffrance ou angoisse chez les animaux. Ces seuils, basés sur des critères comme la variation du poids, l’apparence extérieure et les changements de comportement, permettront d’adapter les mesures prises : augmentation des observations, administration d'antalgiques renouvelables toutes les 12 heures, ou euthanasie anticipée si nécessaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel responsable, et les seuils de sécurité seront vérifiés une fois par semaine (état général et pesée). Lorsqu'un geste comme le gavage est effectué, les souris seront surveillées le lendemain pour vérifier leur état général. À la fin de l’expérience, tous les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le modèle murin est le meilleur choix pour développer le modèle de néphropathie à IgA, similaire à celle de la NIgA chez l'homme. Cela nous permettra d'analyser et d'étudier les effets de la maladie avec des interactions entre le régime alimentaire et le rôle du microbiote. Cette espèce présente l'avantage d'être un petit mammifère dont la génétique est bien connue ce qui nous permet d'utiliser un modèle génétiquement modifié bien établi. Pour ce faire, nous utiliserons des souris âgées de 4 semaines, car l'alimentation a un impact sur la composition de la flore intestinale comme montré chez l'homme, dès le plus jeune âge.
Maintien d’un élevage de souris génétiquement modifiées avec phénotype dommageable Rag2KOxTgOT-I et Rag2KOxTgOT-II
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Dépourvues de tout lymphocyte sauf un seul type, ces souris peuvent développer un phénotype dommageable qui se manifeste par des diarrhées, des poils hirsutes et une activité réduite. Elles sont 1 812 à être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Devenues adultes, elles sont remises à la reproduction ou tuées pour prélever leurs lymphocytes, et la totalité de l'effectif est mise à mort au terme du projet. L'élevage ne produit aucun résultat par lui-même, il alimente d'autres protocoles portant sur la protection vaccinale, et le porteur affirme qu'il n'existe à ce jour aucune méthode ou modèle de substitution.
Objectifs
L'objectif scientifique principal de ce projet est d'acquérir une meilleure compréhension de la protection vaccinale et de la réponse immunitaire adaptative face aux infections. A plus long terme, les résultats obtenus lors de ce projet devraient conduire à une amélioration de la protection vaccinale. Les lignées de souris élevées dans ce projet sont immunodéficientes et ne possèdent qu'un seul type de lymphocytes. Ces lymphocytes sont des cellules essentielles dans la réponse immunitaire contre les agents pathogènes et les cellules cancéreuses. Du fait de leur immunodéficience, ces souris peuvent présenter un phénotype dommageable nécessitant un projet d’élevage spécifique avec suivi renforcé et respectueux du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Les souris de ce projet possèdent un seul type de lymphocyte. Cette particularité est essentielle et très utilisée dans les études in vivo sur la réponse immunitaire contre les agents pathogènes et les cellules cancéreuses. Les bénéfices de ce projet résident en la capacité à élever et fournir des souris génétiquement modifiées indispensables à la mise en place à court terme de protocoles de recherche fondamentale visant à une meilleure compréhension de la protection vaccinale et de la réponse immunitaire adaptative face aux infections. A plus long terme, les résultats obtenus lors de ces études devraient conduire à une amélioration de la protection vaccinale.
Procédures
Une fois adulte, les souris seront utilisées soit pour relancer des accouplements, soit mises à mort pour prélèvement de lymphocytes spécifiques.
Impact sur les animaux
Il se peut qu’en raison de leur immunodéficience, les souris de ce projet présentent un phénotype dommageable caractérisé par une susceptibilité accrue aux agents pathogènes, ce qui peut conduire à l’apparition de signes cliniques d’infection comme une diarrhée, des poils hirsutes ou une activité réduite.
Devenir
A la fin de la procédure, l'ensemble des animaux, soit 1812 souris, auront été euthanasiées pour prélèvement de lymphocytes ou renouvellement d'accouplements.
Remplacement
Ces lignées sont indispensables pour comprendre la réponse immunitaire adaptative lors d'infections ou cancers mais aussi pour l'étude de la protection vaccinale. Jusqu'à présent il n'existe aucune méthode ou modèle de substitution pour ces expérimentations.
Réduction
Un élevage à minima sera maintenu sur la base de 2 accouplements en trio (1 mâle avec 2 femelles par accouplement). Ces derniers seront renouvelés toutes les 26 semaines et un écart de 13 semaines entre la date de démarrage des 2 accouplements sera respecté afin de garantir un niveau de production stable tout au long du projet. Nous utiliserons mâles et femelles comme souris donneuses pour le prélèvement de lymphocytes. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les descendants des accouplements précédents.
Raffinement
Pour limiter leur stress, les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de dômes protecteurs et de matériel pour confectionner des nids. Les souris seront hébergées dans des conditions optimales afin d’éviter toute contamination par des agents pathogènes et seront surveillées quotidiennement. L’apparition de signes cliniques n’est plus constatée depuis le respect de ces conditions d’hébergement strictes. Néanmoins, en cas d’apparition de symptômes, nous adopterons des mesures spécifiques en concertation avec notre vétérinaire référent et apporterons des enrichissements alimentaires et d’hébergement.
Choix des espèces
La souris représente un modèle animal indispensable pour analyser précisément les populations immunitaires et leur état d'activation grâce au grand nombre d'outils et d'anticorps disponibles sur le marché pour cette espèce. Les lignées de souris ciblées permettent d'étudier des réponses immunitaires spécifiques. Il n'existe pas d'autres modèles disponibles pour cela. Des souris âgées de 6 à 12 semaines seront utilisées car elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les individus âgés de 6-8 semaines.
Développement d’une approche vaccinale antitumorale basée sur la délivrance d’ARN messager
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées à l'issue pour prélever leurs organes et mesurer la réponse immunitaire, 510 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 450 d'entre elles et modéré pour 60. Chacune reçoit une ou deux injections sous la peau alors qu'elle est éveillée, puis deux prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur affirme qu'une réponse immunitaire antitumorale mobilise trop de types cellulaires et d'organes pour être étudiée in vitro. L'apport annoncé se limite à disposer de formulations vaccinales de rechange, en complément de celles qui existent déjà.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer les formulations optimales de vaccins thérapeutiques antitumoraux à base d’ARNm capables d’induire une réponse immunitaire détruisant spécifiquement la tumeur. Les vaccins à ARNm actuels sont basés sur des formulations lipidiques contre lesquelles une réponse immunitaire parasite peut se développer. Nous avons mis au point de nouvelles façons d’encapsuler efficacement l’ARNm pour la vaccination tumorale. Ces nouvelles formulations pourront être utilisées en complément de celles déjà existantes.
Bénéfices attendus
La vaccination thérapeutique constitue une immunothérapie anti-tumorale spécifique de la tumeur qui réduit donc grandement les effets indésirables observés lors des traitements de chimio et radiothérapies. Les immunothérapies existantes peuvent également entraîner des effets indésirables graves tels que l'auto-immunité. Le développement d’une vaccination anti-tumorale est donc d’un grand intérêt. L’ARNm, quant à lui, représente une plateforme de vaccination très puissante qui peut être adapté à chaque patient. Bien que les formulations utilisées dans les vaccins contre la covid-19 aient démontré leur efficacité, une réponse immunitaire parasite peut voir le jour si la même particule est utilisée plusieurs fois. Le développement de nouvelles formulations vaccinales permettrait d’éviter cet inconvénient. Ainsi, le bénéfice principal de notre projet est de trouver des formulations vaccinales différentes que l’on pourrait utiliser en complément de formulations déjà existantes.
Procédures
Une ou deux injections seront réalisées sur animal vigile sous la peau. Cette procédure ne dure que quelques secondes. Deux prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie et cela ne durera que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les injections causeront une réaction inflammatoire locale courte et de faible amplitude pouvant induire un inconfort (démangeaisons ou rougeur cutanée) pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue de récupérer différents organes. Leur analyse permettra de conclure quant aux effets sur la réponse immunitaire innée et adaptative des formulations vaccinales.
Remplacement
L’induction d’une réponse immunitaire anti-tumorale efficace nécessite l’implication de plusieurs familles de globules blancs, chacune specialisée dans un type d'actions, qui vont intervenir de façon concertée. Au vu de ce processus complexe et coordonné entre plusieurs types différents de cellules immunitaires et plusieurs organes situés à des endroits distincts dans l'organisme, il n’est pas possible de réaliser l’étude in vitro ou ex vivo. Pour cette raison, l’évaluation du potentiel thérapeutique de nos formulations vaccinales ainsi que l’étude de leur potentiel à induire une réponse immunitaire doit se faire in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux prévus dans ce projet a été calculé à l’aide d’un logiciel spécifique pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles avec un nombre minimum d’animaux. Chaque procédure sera réalisée avec un effectif de 15 souris par condition expérimentale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans des cages enrichies avec des materiaux de nidifications (frisure de carton, coton), des elements à ronger (bâtons ou boule en bois...) et des abris pour limiter le stress des animaux (tunnel...) . Après 4 à 8 jours d’acclimatation et une petite semaine d'habituation, les animaux pourront entrer en expérimentation. Leur état général sera surveillé régulièrement et des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance ont été établis.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car son système immunitaire est bien étudié et il existe de nombreux modèles de cancer chez la souris. les animaux arriveront à l'âge de 6 semaines lorsque leur systeme immunitaire est mature. Après 4 à 8 jours d’acclimatation et une petite semaine d'habituation, les animaux pourront entrer en expérimentation.
Création pour l’étude de pathologies humaines d’un modèle de souris doublement humanisées, par l’introduction d’un système immunitaire humain et d’une xénogreffe de peau humaine
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système urogénital
Irradiées, puis greffées avec des cellules souches humaines, puis opérées trente minutes pour recevoir un fragment de peau humaine dans le dos, 1 263 souris portent ensuite des bandages pendant sept jours. Elles sont enfin infectées par des méningocoques en injection intraveineuse, ce qui déclenche une septicémie : 960 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les 303 autres un niveau modéré. Profondément immunodéficientes par construction, elles sont décrites par le porteur comme "très sensibles aux infections", et l'irradiation peut provoquer des tumeurs à long terme. Toutes seront tuées, aucune ne pouvant être réutilisée, replacée ni adoptée après avoir reçu des cellules humaines et une infection.
Objectifs
L’étude in-vivo des infections invasives à méningocoques nécessite un modèle murin basé sur la greffe d’un morceau de peau humaine sur le dos de souris du fait de la spécificité de la bactérie pour les vaisseaux humains. Lors de la prise du greffon, les micro-vaisseaux humains contenus dans la peau humaine vont se connecter au réseau vasculaire murin. Ainsi, lorsque l’on injecte des bactéries aux animaux, celles-ci vont se fixer sur la paroi des vaisseaux humains du greffon, se multiplier et induire des lésions vasculaires importantes comme dans la pathologie humaine. Toutefois, une limite majeure de ce modèle est qu’il utilise des souris immunodéficientes, qui sont donc incapable de reproduire la réponse immunitaire complète qui se met en place chez l’Homme. L’objectif de ce projet est donc de développer un modèle hybride combinant l’humanisation du système immunitaire et la présence d’un greffon de peau humaine. Des modèles murins disposant d’un système immunitaire constitué de cellules humaines existent déjà. Leur combinaison avec le modèle de greffe de peau humaine permettrait d’améliorer la compréhension de la pathologie infectieuse et des mécanismes qu’elle implique. De plus, ce modèle pourra être utilisé par la suite pour d’autres applications dans lesquelles la communication entre la peau ou les vaisseaux sanguins humains et le système immunitaire et essentiels. On peut par exemple penser à des maladies auto-immunes cutanées.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à obtenir un nouveau modèle animal, qui permettra de caractériser et comprendre les mécanismes d'infection bactérienne ayant une spécificité d’espèce pour l’humain. Il permettra aussi l’étude du rôle du système immunitaire dans ces pathologies et de manière général au niveau de la peau. En effet, la réponse immunitaire lors d’une infection bactérienne joue un rôle dans le contrôle de la progression de la pathologie. Comprendre ces mécanismes d’action constitue une étape essentielle dans l’amélioration de la prise en charge et le traitement des patients au niveau clinique. De plus la présence du système immunitaire humain permettra le développement et l’évaluation de vaccins dans un contexte très proche de la pathologie humaine. Les modèles animaux reproduisant fidèlement la situation humaine sont rares. Ce nouveau et unique modèle murin permettra également de réduire l’utilisation de modèle primate non humain pour l’étude de ces pathologies humaines.
Procédures
Les procédures expérimentales décrites prévoient les interventions suivantes: - irradiation (durée environ 5min, une fois par vie) - prélèvements sanguins sur souris vigile en contention à la main (durée : quelques secondes, fréquence d’un prélèvement tous les 15 jours au maximum) - Injection de cellules (quelques secondes, une fois par vie) - anesthésie chimique et greffe de peau sur le dos par chirurgie (environ 30min, une fois par vie) - port de bandages en période post opératoire (pendant 7 jours, une fois par vie) - infection par des bactérie par injection intraveineuse sur souris vigile dans un tube de contention (infection de 3, 6 ou 16h, une fois par vie)
Impact sur les animaux
Le degré́ de gravité des procédures est considéré́ comme modéré (injections et chirurgie) ou sévère (infection bactérienne systémique). Ainsi, plusieurs effets indésirables sont attendus lors des procédures expérimentales présentes dans ce projet : • Du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. • L’irradiation des animaux peut causer de potentiels effets néfastes à long terme tels que le développement de tumeurs. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). • La piqure de l’aiguille lors des injections pourra entrainer une douleur faible et de courte durée (quelques secondes) • L’excision d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. Cette douleur sera contrôlée par l’utilisation d’analgésiques pendant et après la procédure chirurgicale. • La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. • Lors des expériences d’infection, les animaux infectés développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (>16h post-infection).
Devenir
A la fin de ces procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort pour l’analyse et la caractérisation de la physiopathologie et la réponse immunitaire induite. Tous les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent être ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés : ils seront greffés avec des cellules humaines, voire infectés.
Remplacement
Ce projet vise à l’établissement d’un modèle expérimental récapitulant l’ensemble des mécanismes induits par une inflammation (bactérienne, virale, auto-immune) au niveau de la peau ou des vaisseaux sanguins humains. Si des études sur des cellules en culture ou des organes sur puce permettent d’obtenir des informations sur les mécanismes mis en œuvre dans la pathologie, il est encore impossible de reproduire in vitro la complexité de l’organisme et le rôle du système immunitaire. Un modèle murin humanisé peut fournir ce niveau d’information et représente donc un modèle de choix. Par ailleurs, il permet une alternative aux modèles historiques d’études des infections humaines que sont les primates non-humains. En proposant comme alternative la souris humanisée pour le système immunitaire et la peau, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet utilisera des mâles et des femelles. La répartition des animaux sera faite grâce à un outil statistique afin de créer des groupes expérimentaux homogènes. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Les comparaisons entre les groupes expérimentaux seront réalisées et l’effectif des groupes expérimentaux a été déterminé avec l’aide de biostatisticiens. Cela permettra d’utiliser le nombre d’animaux minimum et adapté. Notre expérience sur les procédures mises en œuvre nous a aidé à établir en amont un plan d’étude adapté aux objectifs du projet. Elle nous permet également une optimisation des expériences et une limitation des variabilités inter-individuelles liées au modèle.
Raffinement
L’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques lors de la majorité́ des procédures permet de réduire le stress et la souffrance éventuelle des animaux. De façon générale, les soins post-opératoires tels que des pansements, du gel oculaire, une réhydratation par voie sous-cutanée, une alimentation hydratante et un suivi régulier des animaux sont inclus dans nos protocoles. De manière plus spécifique concernant la procédure de greffe de peau humaine, les animaux sont prémédiqués avec l’injection d’antalgiques. La chirurgie est réalisée sur un tapis chauffant (37°C), sur des animaux anesthésiés. Avant d’être placés en cage de réveil (cage propre placée sous une lampe chauffante), les animaux greffés sont réhydratés. Un gel de réhydratation est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie en supplémentant les gels de réhydratation avec une solution buvable. Si des signes de souffrance persistent 3 jours après la chirurgie (poils hérissés, changements d’expressions faciales, abattement, perte d’activité, perte d’embonpoint…), les animaux sont mis à mort. Durant les 3 premiers jours suivant la chirurgie, une évaluation quotidienne des animaux permettra de détecter des signes éventuels de souffrance et de vérifier l’intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l’animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie. Si l’animal a détérioré son bandage et lésé le greffon de peau humaine, l’animal est mis à mort. Dans le cas des animaux infectés, les cages contiennent systématiquement un dôme, du coton, du gel de réhydratation et la cage est chauffé à l’aide de chaufferettes pour aider au maintien de la température corporelle des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille permettant une manipulation aisée et leur cout est relativement faible. Leur système vasculaire est proche du système vasculaire humain, ce qui permet l’interconnexion des deux réseaux lors de la greffe de peau. De plus, il est possible d’utiliser l’ingénierie génétique pour permettre la génération de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe immunitaire humaine efficace et prolongée. Les souris humanisées pour le système immunitaire sont générées par injection de cellules souches humaines dans des souriceaux nouveau-nés (
Evaluation pré-clinique de thérapies innovantes dans des modèles précliniques de glioblastome chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 705
4 215 rongeurs, 3 510 souris et 705 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, et chacun subit jusqu'à 28 prises de sang, certains aussi jusqu'à 51 séances d'imagerie sous anesthésie et 56 injections sans anesthésie. Tous reçoivent une greffe de tumeur, dans le cerveau lors d'une chirurgie de 30 minutes ou sous la peau, et la tumeur peut provoquer des troubles neurologiques ou des difficultés à se déplacer. Selon les traitements testés s'ajoutent jusqu'à huit ouvertures de la barrière hémato-encéphalique d'une heure au plus, une ablation de la tumeur ou une radiothérapie, et tous sont tués à un temps défini ou dès qu'ils atteignent les points limites, pour des prélèvements après la mort. Le porteur présente les rongeurs greffés comme "en quelque sorte des avatars de patients", et renvoie à des études cliniques ultérieures l'évaluation chez l'humain des traitements qu'il espère identifier.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales primitives et en particulier les glioblastomes sont des cancers très résistants aux traitements anti-tumoraux conventionnels (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie cytotoxique). En effet, la survie globale médiane des patients est comprise entre 12 et 24 mois. De nouveaux traitements sont donc indispensables pour améliorer le pronostic des patients souffrant de glioblastome. Les traitements candidats sont évalués dans le cadre d’essais cliniques longs et coûteux, et le plus souvent négatifs, avant leur approbation pour une utilisation en pratique clinique chez les patients. Compte tenu du nombre important de traitements candidats, notre projet vise l’accélération de l’évaluation de ces traitements innovants candidats et leur hiérarchisation en vue d’essais cliniques chez l’Homme. En effet, une évaluation préclinique rigoureuse permet de réduire le taux d’attrition des essais cliniques.
Bénéfices attendus
Les gliomes et en particulier les glioblastomes (GBM) sont les cancers cérébraux les plus fréquents et les plus graves chez l’adulte. Le pronostic des patients souffrant de glioblastome est réservé (12-24 mois de survie médiane) malgré des traitements lourds. De nouveaux traitements sont donc nécessaires. Le projet présenté ici vise donc à évaluer de nouvelles thérapies dans un contexte le plus biologiquement pertinent grâce à nos modèles de glioblastome qui sont en quelque sorte des avatars de patients atteint de cette maladie. Ultimement, nous visons à identifier de nouveaux traitements actifs contre le glioblastome qui pourront être évalués dans le cadre d'études cliniques chez l'homme.
Procédures
Les animaux auront tous une greffe tumorale cérébrale (30minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) ou une greffe tumorale cutanée (1minute, 1x, animal anesthésié). Tous les animaux auront un suivi par prélèvement sanguin (2minutes, 28x maximum, animal vigile ou anesthésié et analgésié si l'animal est en fin de procédure) et certains par imagerie également (5minutes, 51x maximum, animal anesthésié). Une partie des animaux auront également des traitements administrés par injections simples (1min, 56x maximum, animal vigile) ou par injections nécessitant une chirurgie (30min maximum, 1x, animal anesthésié et analgésié). Les administrations pourront être couplées à une ouverture de la barrière hémato encéphalique (pour que le traitement atteigne le cerveau) (1h maximum, 8x, animal anesthésié) ou à une résection tumorale (30 minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) et;ou à de la radiothérapie (10 minutes, 1 fois, animal anesthésié).
Impact sur les animaux
La greffe de cellule tumorale induit une croissance tumorale qui peut donner des troubles neurologiques ou des difficultés de déplacement. Les chirurgies pourront engendrer une douleur modérée post opératoire ainsi que des risques d’infection. Les anesthésies peuvent engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. Les traitements pourront avoir des effets secondaires comme des diarrhées ou des inflammations aux sites d’injection engendrant une perte de poids. Les piqûres peuvent induire une douleur légère de courte durée au point d’injection. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur légère de courte durée ainsi qu’un hématome. Les imageries pourront induire un léger stress chez les animaux. Le phénotype dommageable des animaux immunodéficients ou immunodéprimés induit une sensibilité accrue aux infections.
Devenir
Pour toutes les procédures, tous les animaux sont euthanasiés à un temps défini (ie quelques jours/heures post traitement etc) ou dès qu’ils atteignent les points limites décrits afin de faire des prélèvements post mortem.
Remplacement
Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes. Il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro ; que ce soit par le biais de cultures de cellules tumorales issues de patients ou bien de culture 2D ou encore 3D. Ces approches in vitro sont réalisées en amont des procédures in vivo pour justifier l'intérêt scientifique. De plus, cet environnement module la biodisponibilité d’une molécule thérapeutique au sein de la tumeur. Aussi, positionner les cellules tumorales cérébrales chez l’animal, dans un microenvironnement tissulaire et moléculaire complexe (cérébral) constitue un modèle d’étude pertinent. Ce dernier se rapproche au maximum des conditions observées chez les patients souffrant de tumeur cérébrale et chez qui les cellules cancéreuses prolifèrent dans du tissu nerveux central complexe.
Réduction
4215 animaux seront utilisés dans ce projet. Les efforts fournis afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sont: i) Seuls les composés efficaces in vitro par rapport aux traitements standards, seront testés in vivo. ii) Les cellules tumorales cérébrales greffées chez l’animal sont visibles par fluorescence ce qui permet de suivre le développement tumoral, cela évite l'euthanasie à différents temps et réduit donc le nombre d’animaux utilisé (iii) La fluorescence des tumeurs permet également de suivre l’efficacité des traitements testés en temps réel ce qui apporte une information supplémentaire à la survie. (iv) Une étude statistique détermine le nombre d’animaux nécessaire minimum pour atteindre un niveau de significativité acceptable. Cela permet de limiter le nombre d’animaux et d’éviter les études ne permettant pas de répondre à une question posée par manque de puissance statistique.
Raffinement
Durant toute la durée de leur vie, les animaux sont logés en groupe afin de favoriser leur bien-être social, l’isolement étant évité autant que possible. Cette approche groupée est cruciale, car les souris, comme de nombreux rongeurs, sont des animaux sociaux et leur isolement peut entrainer un stress psychologique et des comportements anormaux. Elles sont hébergées sur des portoirs ventilés, qui permettent une circulation d'air optimale et un environnement propre. Chaque cage est équipée d’un système d'abreuvement automatique garantissant un accès constant à l’eau et d’un approvisionnement ad libitum en nourriture, ce qui répond à leurs besoins nutritionnels et hydriques tout en permettant une gestion optimale des ressources. Le milieu de vie est enrichi avec au moins deux éléments, tels que des objets manipulables ou des matériaux permettant d'explorer et de satisfaire les comportements naturels des souris, comme le grattage, le fouissage ou la nidification. Cet enrichissement environnemental est essentiel pour prévenir l’apparition de comportements stéréotypés liés à l'ennui ou au stress et pour assurer une qualité de vie optimale tout au long de l’étude. Les animaux sont suivis quotidiennement par des vétérinaires et du personnel qualifié. Lors de procédures susceptibles de provoquer des douleurs modérées à sévères, comme des interventions chirurgicales, les animaux reçoivent une anesthésie générale appropriée et en complément, un analgésique leur est administré en préopératoire et postopératoire pour prévenir toute douleur et minimiser l'inflammation. Pour prévenir les risques d'infections des souris immunodéprimées, les animaux sont hébergés dans des cages propres avec litière, aliment et enrichissement irradiés ainsi que de l'eau osmosée pour boisson. Les injections seront toujours réduite au minimum suivant le composé testé (fréquence et volume), l'alternance des sites sera privilégiée quand cela est possible et les animaux seront anesthésiés si nécessaire pour leur bien être. Un système de points limites est mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort, tant à court qu'à long terme. Ces points limites prennent en compte des critères variés : l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé.
Choix des espèces
Les souris sont choisies dans nos études thérapeutiques en raison de leur petite taille et de leur poids faible. Cette caractéristique permet l’utilisation de quantités réduites de composés cytotoxiques. De plus, ces modèles permettent l’utilisation de volumes expérimentaux limités, facilitant ainsi les études tout en respectant les principes de réduction des animaux dans la recherche. Les souches de rongeurs telles que les souris immunodéficientes sont particulièrement utiles pour leur incapacité à rejeter les cellules tumorales humaines. En parallèle, les souches immunocompétentes sont indispensables pour étudier la croissance tumorale dans un contexte immunologique complet. Les modèles animaux immunodéprimés sont utiles pour explorer l’impact d’un système immunitaire humanisé dans les réponses thérapeutiques contre les cancers. Enfin, les rats, sont choisis ici pour des scénarios nécessitant une plus grande précision chirurgicale. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 mois car le glioblastome est une tumeur de l’adulte chez l’Homme.
Modèles murins de deux maladies inflammatoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 922 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart et sévère pour 153 d'entre elles. Chacune subit une biopsie de l'oreille, certaines reçoivent une sonde de température sous la peau, une injection de bactéries dans le sang, deux prises de sang au niveau de l'œil et onze jours d'injections quotidiennes dans le ventre. L'objectif déclaré est de créer deux modèles de maladies auto-inflammatoires rares. Les traitements "moins toxiques et plus efficaces" annoncés sont renvoyés à un "à terme" sans échéance. Le porteur affirme que l'analyse des animaux est "indispensable" parce que les essais en tubes ne reproduisent pas la complexité des interactions entre l'animal et la bactérie.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de créer deux nouveaux modèles murins de maladie inflammatoire, pour mieux comprendre ces maladies et tester un nouveau traitement. Cesmaladies sont des maladies rares qui ne peuvent pas être étudiées directement en clinique du fait du faible nombre de patients. Le développement de nouveaux traitements dans ces maladies passe par le développement de modèles précliniques dans lesquel il faut tester les nouvelles molécules et les voies d'administration.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme de mieux comprendre les maladies autoinflammatoires étudiées ainsi que l'émergence d'une de ces maladies dans la population humaine au cours de la co-évolution de l'homme avec les agents pathogènes. Finalement, à terme, il pourrait permettre de développer de nouveaux traitements moins toxiques et plus efficaces pour l'homme.
Procédures
Les souris seront soumises à une biopsie sur l'oreille pour la procédure d'élevage. Une seule intervention de ce type qui dure moins de 5 secondes sera réalisée sur chaque animal vigile (2922 animaux maximum). Certains animaux (parties 2 et 3-maximum 153 animaux) subiront une injection sous la peau de 30 secondes maximum pour la mise en place d'une sonde de température, une injection dans le sang d'une durée de 30 secondes maximum, ces deux actes sous anesthésie gazeuse. Les animaux dans la partie 4 (21 animaux maximum) seront sujets à 2 prises de sang au niveau de l'oeil de 30 secondes maximum sous anesthésie gazeuse, d'une injection dans le ventre quotidienne pendant 11 jours sur animaux vigiles, chacune de 30 secondes maximum et d'une injection dans le ventre de 30 secondes maximum sur animal vigile lors de la mise à mort. Tous les animaux (2922 animaux maximum) sont susceptibles de recevoir une à trois injections sous la peau d'analgésiques (30 secondes maximum) sur animaux vigiles. Les animaux dans la partie 5 (14 animaux maximum) auront sous anesthésie gazeuse de la crème appliquée sur des lésions de la peua chaque jour pendant 2 semaines (10 secondes maximum par application).
Impact sur les animaux
Le prélèvement d'un bout d'oreille engendrera une douleur légère de courte durée. Les injections dans le ventre, la mesure de masse, la pose de sonde de température, l'injection dans le sang des bactéries, la prise de sang au niveau de l'oeil, l'application de crème sur les lésions de la peau sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. L'inflammation pourrait conduire à une croissance retardée, à une perte localisée de poils ou à des boutons sur la peau qui pourraient évoluer vers des des plaies, une grosse rate et un gros foie et un sentiment de mal être général associant fatigue générale physique et mentale. L'infection bactérienne pourrait conduire à ressentir les effects de l'infection (inflammation systémique qui se traduit par de la fièvre apparaissant à jour 2 ou 3 post-infection et à un mal être de l'animal).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale car du fait des procédures, il n'est pas souhaitable de les réutiliser. Une partie des animaux mis à mort dans la procédure d'élevage sera utilisé post-mortem pour des prélèvements d'organes hors protocoles dans une démarche de réduction (pas de commandes de nouveaux animaux pour ces prélèvements hors protocoles). Les animaux de génotype pertinent dans la procédure d'élevage seront transférés dans les procédures expérimentales suivantes car tel est le but de cette première procédure et mis à mort à la fin des procédures expérimentales.
Remplacement
L'analyse des animaux est indispensable pour remplir les objectifs du projet et s'assurer d'une efficacité et d'une non-toxicité des nouveaux traitements. Cet protocole fait suite à des tests nombreux et répétés dans des tubes sans implication d'animaux . Ces essais en tubes ne peuvent pas mimer la complexité des interactions entre l'animal et la bactérie rencontrées lors d'une infection, ni la complexité des interactions des médicaments avec les différents liquides biologiques, cellules, organes.
Réduction
De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet pour obtenir le maximum d'informations avec le moins d'animaux. De plus, l'effectif annoncé est maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des "essais pilotes" déterminants et des analyses statistiques en amont pour réduire au maximum le nombre d'animaux sans mettre en péril la validité des résultats. Dans la procédure 5, le contrôle de traitement sera réalisé sur le même animal sur une lésion contrôle située dans une autre zone du ventre de l'animal traité (au lieu d'un autre groupe d'animaux).
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants: 1) habituation à la contention pour minimiser l'angoisse des animaux. 2) Utilisation d'implants pour prendre la température et éviter l'introduction quotidienne de thermomètre de type rectal dans les fesses des animaux. 3) Minimisation de la fréquence de manipulation. 4) Anesthésie lors de chaque gestes potentiellement douloureux (injection sous la peau, dans le ventre, dans le sang, prise de sang au niveau de l'oeil). Les points limites sont définis spécifiquement pour le projet afin de limiter au maximum la souffrance des animaux. 5) Utilisation d'analgesique en cas de trop forte de température. Les protocoles sont calibrés après une étude rigoureuse de la littérature.
Choix des espèces
Il est nécessaire pour les objectifs scientifiques du projet d'étudier un système intégré avec un fonctionnement proche de l'homme. La souris est un modèle animal très pertinent car il est manipulable génétiquement et beaucoup d'outils sont disponibles pour suivre la physiologie de cet animal. L'inflammation dans le modèle souris est très proche de l'inflammation qui peut être observée chez l'homme. Les animaux seront suivis depuis leur naissance jusqu'à leur mort pour la recherche et/ou la surveillance d'un éventuel phénotype dommageable avec une attention particulière au stade néonatal, du sevrage et de l'adulte. Les expériences d'infections débuteront à l'âge de 6 semaines ce qui correspond à l'age adulte. Les traitements (tests de médicaments) commenceront dès 4 semaines qui est l'âge auquel les premiers symptômes sont attendus.
Etude du rôle du microbiote intestinal sur l’efficacité thérapeutique d’un composé pharmaceutique mobilisant les cellules Natural Killer
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Pour savoir si le microbiote intestinal modifie l'efficacité d'une immunothérapie, 6 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Leur flore intestinale est d'abord détruite par antibiotiques dans l'eau de boisson, puis des cellules tumorales leur sont greffées sous la peau ou injectées dans le sang, avant un traitement quotidien pouvant durer quatre semaines. Le porteur décrit comme effets possibles la nécrose et l'ulcération de la tumeur, une paralysie pour les greffes intraveineuses, et une perte de poids. La totalité de l'effectif est déclarée en gravité sévère, le porteur renvoyant à des points limites "précoces" évalués chaque jour, sans indiquer le seuil qui déclenche la mise à mort.
Objectifs
Chaque année, le cancer touche des millions de personnes et cause de nombreux décès dans le monde. Malgré des avancées majeures dans la compréhension du développement des cancers et l’identification de nouvelles thérapies révolutionnaires pour les patients ces dernières années, nombre d’entre eux se voient confronter à des échecs thérapeutiques. L’enjeu pour la recherche est donc d’identifier de nouveaux médicaments et d’explorer les mécanismes de résistances aux traitements. Un sujet de recherche important aujourd’hui est l’étude du lien entre le microbiote (la flore intestinale dans notre tube digestif), unique à chaque patient et considéré comme un organe, le système immunitaire et le cancer. Le microbiote joue un rôle clé dans le bon fonctionnement de nos défenses immunitaires. Les immunothérapies, traitements qui manipulent le système immunitaire pour attaquer les cancers, ont montré des résultats prometteurs. Cependant, elles ne fonctionnent pas toujours pour tous les patients et peuvent provoquer des effets secondaires graves. Des recherches récentes cherchent à mieux comprendre quels microbes du microbiote pourraient améliorer l’efficacité et la tolérance des immunothérapies. L’objectif est de rétablir un microbiote équilibré chez les patients pour optimiser les traitements. Nous testerons des molécules capables de mobiliser un certain type de cellules du système immunitaire capables d’éliminer les cellules tumorales. Ce projet vise à évaluer comment le microbiote intestinal peut influencer l’efficacité de ces immunothérapies innovantes.
Bénéfices attendus
Le cancer est l'une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. Les immunothérapies, traitements qui renforcent le système immunitaire pour attaquer les cancers, ont montré des résultats prometteurs. Ce projet permettra de comprendre l'impact du microbiote intestinal sur l'effet thérapeutique d'un composé d'immunothérapie à court terme et de proposer à long terme de rétablir un microbiote équilibré chez les patients pour optimiser les traitements.
Procédures
Traitement antibiotique dans l’eau de boisson modifiant la flore intestinale. Greffe de cellules tumorales (1 injection) sur animaux vigiles ou sous anesthésie gazeuse; Administration de composés thérapeutiques (maximum 1 fois /jour pendant 4 semaines maximum) sur animaux vigiles; Administration d’une molécule ciblant une sous population de cellules immunitaires (1 injection)
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère lors de l'injection des cellules tumorales en sous-cutanée ou en intraveineuse. Stress et douleur légère lors de l'administration du composé thérapeutique par injection intra-péritonéale (administration dans la cavité péritonéale c’est-à-dire l’espace entourant les organes abdominaux). Stress et douleur légère lors de l'administration de la molécule ciblant une sous population de cellules immunitaires en intrapéritonéal. Inconfort lors de la manipulation de l'animal vigile pour les gestes de tonte du flanc et pesée. Stress lié à la modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la répartition aléatoire des animaux en groupes expérimentaux. Possibilité d'effets indésirables sévères liés au développement tumoral : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux). Possibilité d'effets indésirables sévères liés aux composés thérapeutiques: Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux lorsque l'une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d'organe ou de tumeur au cours de l'étude ; Atteinte d'un point limite justifiant l'euthanasie ; Fin de l'étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d'un composé thérapeutique antitumoral en fonction de la flore intestinale d’un individu visant à réactiver le système immunitaire implique d'être dans un système biologique complexe. Les modèles in vitro ou ex vivo dans l’état actuel des connaissances ne permettent pas de répondre à cette question. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal dans le cadre de ce projet. Nous avons cependant testé ces molécules en amont in vitro dans les modèles cellulaires et pu ainsi sélectionner celles qui seront utilisées dans ce projet sur l’animal comme les plus prometteuses.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules ont été préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité ont été choisies pour être évaluées chez l'animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été également déterminées dans un projet dédié et ont permis de sélectionner les conditions optimales de greffe tumorale et de calculer grâce à un outil statistique le nombre minimum d'animaux nécessaires permettant d’observer un effet statistique significatif. Seulement si nous observons une différence biologique lors d’une première expérience, nous répèterons l’expérience trois fois afin d’en assurer la fiabilité, la robustesse et la significativité.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal de notre établissement. Toutes les souris seront maintenues en portoirs ventilés. Les injections de cellules tumorales intraveineuses seront effectuées sous anesthésie gazeuse et avec application d’un anesthésique local. Des points limites précoces relatifs à l'apparence/comportement de l'animal, à l'aspect et au volume de la tumeur ainsi qu'à la perte de poids seront suivis et évalués de manière quotidienne, tout au long de l'étude. Ils pourront justifier la mise en place de mesures correctives adaptées comme l’introduction d'enrichissements supplémentaires, une surveillance accrue, une mise à disposition de nourriture humidifiée ou gélifiée, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique sur les lésions cutanées, une administration d’analgésique ou une mise à mort précoce. Les gestes techniques réalisés sur animaux vigiles seront réalisés par du personnel compétent et expérimenté.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l'homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l'analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l'existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l'efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l'étude, âge auquel le système immunitaire de l'animal est décrit comme mature.
Infection des moustiques Aedes avec des virus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Anesthésiées, des souris préalablement infectées par la dengue, le chikungunya ou Zika sont offertes à deux cents moustiques femelles qui se gorgent de leur sang. 1 800 souris immunodéficientes vont ainsi être utilisées, 1 560 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 240 un niveau modéré, avec une incision d'un millimètre pratiquée au même endroit de la queue chaque jour pendant sept jours pour suivre la charge virale. Le porteur reconnaît qu'un repas sanguin artificiel sur membrane existe, et l'écarte parce que 40 % des moustiques s'y nourrissent contre 80 à 100 % sur un animal vivant. Toutes les souris sont tuées, tantôt encore sous anesthésie à la fin du repas sanguin, tantôt une fois les prélèvements faits, ce que le porteur présente comme un moyen de limiter la durée de l'infection.
Objectifs
Les virus transmis par les insectes (arthropod-borne viruses, arbovirus) et en particulier ceux transmis par les moustiques, tels que le virus de la Dengue, Chikungunya et Zika, représentent un problème majeur de santé publique. En effet on estime à plus de 390 millions le nombre de nouvelles infections par le virus de la Dengue chaque année et près de 40 % de la population mondiale est considérée « à risque ». A ce jour, les principales mesures de santé publiques mises en place reposent sur le contrôle de la population des insectes vecteurs, cependant l’impact réel de ces procédures sur la transmission des virus n’a pas encore été déterminée. Lors du cycle de réplication et de transmission de ces virus, le moustique n’est pas un intermédiaire passif. Pour être transmis avec succès à un hôte vertébré non infecté, les arbovirus doivent franchir plusieurs étapes clés et traverser des barrières anatomiques chez les moustiques, notamment l'épithélium de l’intestin, la dissémination vers des tissus secondaires et l'infection des glandes salivaires. Au cours de ce processus complexe, qui s’étend sur plusieurs jours, le virus dépend de facteurs cellulaires du vecteur moustique et est exposé à son système immunitaire. De nouveaux virus transmissibles par les moustiques émergeant chaque année, il devient urgent d’étudier et de comprendre les bases moléculaires de la transmission de ces virus afin de pouvoir la contrôler. Dans cette optique nous cherchons à comprendre les mécanismes mis en place chez ces insectes lors de l’infection virale, qui permettent leur résistance. Une meilleure connaissance du fonctionnement de l’immunité des moustiques permettrait d’envisager l’utilisation de méthodes basées sur le renforcement de la résistance des populations naturelles de ces derniers, afin de réduire la propagation de ce type de maladies. Le cycle de transmission de ces arbovirus débute par l’infection du moustique au cours d’un repas sanguin sur un hôte infecté. Afin de mieux comprendre les interactions vecteur- virus au cours de la transmission de ce dernier, il est important de s’approcher au plus des conditions naturelles d’infection. Ainsi, l’infection du moustique se passe par voie orale, lors d’un repas sanguin sur une souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus dans ce projet sont de mieux comprendre les interactions hôte vecteur afin de mettre en place des stratégies permettant de lutter efficacement contre ces maladies
Procédures
Repas sanguin infectieux – Acquisition du virus. Les souris sont infectées par du virus. Les animaux sont ensuite anesthésiés puis utilisés pour infecter des moustiques. Après le repas sanguin des moustiques sur la souris, les souris sont mises à mort. Repas sanguin infectieux – Transmission du virus. Les animaux sont anesthésiés puis utilisés pour nourrir des moustiques infectés. Du sang est ensuite prélevé sur les animaux sous anesthésie générale gazeuse en réalisant une incision (1mm) au niveau de la queue. L’opération est répétée pendant une durée totale maximum de 7 jours au même emplacement afin de mesurer l’évolution de la virémie. Les animaux sont ensuite mis à mort selon les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
La prise en charge des souris s’appuie sur l’évaluation du comportement, de l’état corporel, de l’apparence physique, de la nutrition et de l’expression des souris. Après infection par les virus les souris développent la maladie, elles sont surveillées quotidiennement. Si une souris présente des symptômes de souffrance, par exemple perte de poids, prostration, poil hérissé, isolation, alors elle est mise à mort avant que les symptômes de la maladie soient trop dommageables pour l’animal et entraînent une souffrance.
Devenir
A l'issu du repas sanguin infectieux ou après avoir collecté les échantillons nécessaires à la mesure de la virémie, les souris sont mises à mort selon les méthodes réglementaires afin de limiter au maximum la durée d'infection et les chances de développer des symptômes délétères.
Remplacement
L’infection de moustiques par un arbovirus peut se faire de plusieurs manières ; (1) par ingestion d’un repas sanguin contenant le virus ou (2) par micro-injection directe du virus dans le thorax du moustique. Afin de mieux comprendre les interactions vecteur-virus au cours de la transmission de ce dernier, il est important de se rapprocher au plus des conditions naturelles d’infection. Dans ce contexte-là, l’infection des moustiques par micro-injection est donc à exclure et un mode d’infection plus « naturel » est nécessaire. Il existe à ce jour deux méthodes pour infecter des moustiques par voie orale, voie naturellement empruntée par le virus dans la nature. Le repas sanguin artificiel, consistant en une capsule chauffée contenant le mélange sang et virus recouverte d’une membrane, et le repas sanguin sur un hôte vertébré. A ce jour, les repas artificiels ne sont pas totalement au point et sont globalement moins efficaces que les repas sur animaux. En présence d’un repas artificiel sur membrane, environ 40 % des femelles moustiques se nourriront contre 80 à 100 % lorsqu’elles sont présentées à un animal vivant. De plus, les repas artificiels ne reproduisent pas l’ensemble des facteurs de l’hôte présents lors d’une infection naturelle qui peuvent influencer l’efficacité de l’infection chez le moustique (microbiote, signaux d’attractivité de l’hôte, réponse de l’hôte etc…) . Dans le cadre de nos projets de recherche, l’utilisation d’un hôte vertébré est donc nécessaire. Les primates et les rongeurs sont les seuls vertébrés disponibles pour l’étude de l’infection par les arbovirus. Les primates devant toujours être évités lorsqu’une alternative existe, nous travaillerons donc avec des rongeurs. Parmi les espèces de rongeurs possibles, la souris s’avère le choix le plus pertinent pour nos expériences pour les raisons suivantes : - des lignées mutantes de cette espèce supportent le développement des virus que nous étudions - les souris étant utilisées pour ce type d’expériences depuis plusieurs décennies par différents laboratoires dans le monde, les protocoles d’infection sont bien établis - les moustiques du genre Aedes, bien que naturellement anthropophiles, sont tout de même capables de se nourrir sur cette espèce.
Réduction
Les expériences que nous menons visent à mettre en évidence des différences dans la prévalence des moustiques infectés (nombre de moustiques infectés / nombre de moustiques s’étant nourris sur une souris infectée) et/ou dans leur charge virale (quantité de virus par moustique infecté) entre différentes populations de moustiques. Afin d’observer des différences statistiquement significatives, il est nécessaire d’analyser un nombre minimum de moustiques. Étant donné que le nombre de moustiques pouvant se nourrir sur une même souris est limité, nous avons conçu nos expériences de manière à minimiser autant que possible le nombre de souris utilisées, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour l’analyse de nos résultats.
Raffinement
Les souris utilisées étant immuno-déficientes, elles sont élevées et maintenues en groupes sociaux sur portoirs ventilés dans une animalerie SOPF (Specific and opportunistic pathogen free) et bénéficient de frisure de carton ainsi que de tunnels. Lors d’une expérience d’infection, le nombre exact de souris nécessaires à l’expérience est déplacé dans le laboratoire environ 24 heures avant l’infection afin de leur permettre de s’acclimater et de diminuer le stress du reste de la procédure. Elles sont transférées en groupe sociaux à l’intérieur de cages ventilées disposant de frisure de carton ainsi que de tunnels. Elles sont ensuite placées sur portoirs ventilés à l’intérieur du laboratoire pour la durée de l’expérience. Afin de permettre aux moustiques de se nourrir et de limiter le stress des souris, les souris utilisées pour le repas sanguin infectieux sont anesthésiées au préalable. Le nombre de moustiques qui vont se gorger sur l’animal sera strictement contrôlé (200 femelles maximum). A la fin du repas sanguin, les souris encore sous anesthésie sont mise à mort. Durant leur séjour dans le laboratoire, la prise en charge des souris s’appuie sur l’évaluation du comportement, de l’état corporel, de l’apparence physique, de la nutrition et de l’expression des souris. Si une souris présente des symptômes de souffrance, par exemple perte de poids, prostration, poil hérissé, isolation, alors elle est mise à mort.
Choix des espèces
Le virus de la Dengue ne se réplique pas dans les souris de souches les plus communes et la plupart des arbovirus s’y réplique difficilement, il est donc nécessaire d’infecter des souris immuno-déficientes afin de détecter une virémie suffisamment élevée pour infecter des moustiques. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 3 à 4 semaines pour les infections avec le virus de la Dengue qui nécessite que les animaux aient un système immunitaire peu développé et des souris adultes âgées de 5 à 15 semaines pour les infections avec les virus Chikungunya et Zika qui peuvent infecter des individus possédant un système immunitaire plus mature.
Etude du role de l’immunité humorale dans la réponse aux immunothérapies dépendante du microbiote intestinal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune peut recevoir une tumeur greffée sous la peau, jusqu'à quatre gavages de matière fécale ou de bactéries, un traitement antibiotique, jusqu'à dix injections d'immunothérapie, cinq injections destinées à détruire certaines de ses cellules immunitaires, une irradiation de dix minutes et jusqu'à huit prises de sang. Le porteur décrit des tumeurs qui limitent la mobilité et provoquent une douleur locale modérée, des diarrhées et des pertes de poids, pour une question de recherche fondamentale sur le rôle des anticorps dirigés contre les bactéries intestinales dans la réponse aux immunothérapies. Pour justifier l'effectif, il n'avance qu'un chiffre, huit animaux par groupe, sans jamais le rapporter au total de 6 196 souris demandées.
Objectifs
De plus en plus de preuves indiquent que le microbiote intestinal influence fortement l'immunité antitumorale et les réponses cliniques aux immunothérapies dans le traitement du cancer. Notre laboratoire a montré que la dysbiose, une composition altérée du microbiote intestinal, peut réduire l'efficacité des immunothérapies et contribuer à la résistance au traitement contre le cancer. Alors que les interventions microbiennes telles que la transplantation de microbiote fécal peuvent restaurer les communautés bactériennes intestinales bénéfiques et améliorer les réponses aux traitements, les patients peuvent développer des réponses immunitaires contre ces bactéries transplantées. Notre hypothèse générale est que la liaison sélective d'anticorps spécifiques des bactéries commensales ou transplantées façonne la composition du microbiome intestinal et dicte la réussite de la transplantation de microbiote fécal, via des mécanismes immunitaires qui peuvent moduler l'efficacité des immunothérapies.
Bénéfices attendus
Nous émettons l’hypothèse que l'immunisation du patient contre certaines bactéries intestinales ou bactéries transplantées lors de transplantation de microbiote fécal, entraine leur élimination, avec l'intervention de différents mécanismes immunitaires. En évaluant la modulation de la réponse immunitaire de manière microbiote-dépendante, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de résistance ou la réponse aux immunothérapies chez les patients atteints de cancer. Cette compréhension permettrait aussi de montrer que la présence d’anticorps spécifiques contre certaines bactéries du microbiote constitue un biomarqueur de la réponse aux immunothérapies. De plus, cela pourrait aider à comprendre la réussite ou l’échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner certaines résistances, et de pouvoir sélectionner des patients qui ne présentent pas de réponses en anticoprs contre certaines bactéries bénéfiques du donneur. Enfin, cela permettrait d’optimiser l’utilisation des immunothérapies, et d’éclairer les interactions entre l’immunité et le microbiote intestinal, pouvant au final influencer les décisions cliniques et donc de traitement des patients.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation d'une tumeur par injection sous cutanée (une fois, d'une durée d'1 minute), l'administration orale (n=4 au maximum, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie par injection (10 fois maximum, durée 1 minute). Les déplétions de neutrophiles, du complément ou des lymphocytes B seront réalisées par injection (n=5, durée 10 secondes). Pour une des procédures, une unique irradiation sera réalisée (durée 10 minutes) sera faite. Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés (n=8 au maximum, durée 2-3 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress lié aux manipulations. Les gavages oraux pour procéder à la transplantation de microbiote fécal et aux gavages de bactéries pourront provoquer un inconfort pour la souris. Il y a un risque de diarrhée légère car les souris recevront un traitement antibiotique de courte durée. Il y a aussi un risque de perte de poids post-transplantation de microbiote, post traitement par antibiotique ou post greffe de tuùeur . Les injections peuvent provoquer des douleurs légères et transitoires et seront donc faites sous anesthésie locale. Les tumeurs peuvent provoquer une limitation modérée de l'activité et de la mobilité des souris et une douleur locale modérée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiées soit en fin de procédure afin d’analyser les organes post-mortem.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo. En effet, l'utilisation d'organoïdes n'est pas possible car les organoïdes reproduisent un tissu ou organe mais ne peuvent reproduire l’interaction du système immunitaire intestinal avec l’environnement tumoral après stimulation par le microbiote. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet d'une transplantation de microbiote fécal sur différentes composantes de l'immunité. Seul un organisme entier permet d’étudier cela, avec un système immunitaire et une génétique proche de l'Homme comme la souris.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé pour optimiser les ressources tout en garantissant des résultats fiables. D'après nos études antérieures et des analyses statistiques, nous avons besoin de 8 animaux par groupe pour obtenir des différences significatives.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être avec un régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement de la souris et l’éventuelle mise en place de mesure d'analgésie si les animaux présentent une souffrance, voire d'euthanasie si les animaux atteignent les points limites. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale. Toutes les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières (au moins une fois/semaine). Les points limites seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordre scientifique. La génétique est proche de celle de l’Homme et bien connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques en oncologie, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cet âge-là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.
Caractérisation et recherche d’indicateurs de la santé globale de vaches de race Holstein et Normande durant leur phase d’élevage et autour de leurs vêlages
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Suivies de leur première mise à la reproduction jusqu'à leur réforme, 270 vaches Holstein et Normande enchaîneront ce projet et les expérimentations qui le prolongeront, sans être tuées dans le cadre de celui-ci. Les procédures sont d'un niveau de souffrance léger : prises de sang, tonte de poils, écouvillonnages buccaux et rectaux, réalisés une fois chez les génisses et deux fois autour de chaque vêlage, l'animal bloqué au cornadis. S'y ajoutent une pesée hebdomadaire et une notation de l'état corporel chaque mois. Le porteur présente la santé comme un caractère "clé pour la durabilité tant environnementale qu'économique de l'élevage, ainsi que pour son acceptabilité sociétale", ce qui situe l'objet du projet du côté des performances du troupeau autant que du côté des vaches elles-mêmes.
Objectifs
La santé a longtemps été considérée sous la forme d’un caractère binaire : l’animal est sain ou malade au regard d’une affection ou d’une maladie donnée, à un instant donné. Toutefois, l’état de santé général est multifactoriel et évolutif. Il possède un fort impact sur le bien-être de l’animal, de même que sur ses performances et sa longévité. De ce fait, il s’agit d’un caractère clé pour la durabilité tant environnementale qu’économique de l’élevage, ainsi que pour son acceptabilité sociétale. Dans une optique de re-conceptualisation de la santé pour prendre en compte son caractère continu, explorer les mécanismes biologiques qui la caractérisent, et étudier ses liens avec les autres caractères, un collectif de scientifiques a défini ensemble les contours d’une nouvelle expérimentation de long terme en bovins laitiers. L’objectif de ce projet est d’obtenir une caractérisation biologique fine et longitudinale des différentes couches de la variabilité individuelle (génétique, épigénétique, microbiote, mais aussi physiologique et immunologique) tout au long de la vie de l’animal (et pas face à une maladie ou un pathogène donné à un moment donné), en se plaçant dans deux systèmes d’élevage contrastés « de demain » (herbager pâturant vs stabulation permanente). Cela permettra d’établir des liens entre les paramètres mesurés et la santé de l’animal, à court et à long terme, aussi bien du point de vue clinique que sur la base des variations de ses performances continues (croissance, alimentation, niveau d’activité…). Afin de pouvoir distinguer ce qui, dans la variabilité individuelle observée est liée à la génétique des animaux par rapport aux conditions environnementales, un effectif d’animaux important sera nécessaire.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet des avancées de connaissances scientifiques, avec une meilleure caractérisation des phénotypes mesurés (variabilité individuelle, sensibilité environnementale, évolution au cours du temps), et des relations qui les unissent, aussi bien entre eux qu’avec les évènements de santé et les performances zootechniques, afin d’identifier les synergies et les compromis entre fonctions et leurs impacts sur la longévité des vaches dans deux systèmes d’élevage très contrastés en terme de challenges.
Procédures
Pour la caractérisation fine des animaux, des prélèvements sanguins, de poils et de microbiotes seront effectués 1 fois au cours de l’expérimentation sur les génisses, et deux fois sur les vaches à chaque vêlage (avant et après). Les animaux sont alors maintenus au cornadis. Les mesures de poids (une fois par semaine pour les vaches, une fois toutes les deux semaines pour les génisses) se feront sans geste technique autre que le déplacement et la contention des animaux. Pour la mesure de la note d'état, les vaches seront maintenues au cornadis une fois par mois. Voici le temps estimé pour chaque acte : Prise de sang : 2 minutes Mesure du poids : 1 minute Mesure de la note d'état : 5 minutes. Le prélèvement des poils et des microbiote dure quelques secondes. Il est réalisé au même moment que la prise de sang, sans nécessiter de contention supplémentaire.
Impact sur les animaux
Les prélèvements prévus (prises de sang, tonte de poils et écouvillonnages buccaux et rectaux) seront réalisés dans le cadre d'une contention adaptée au poids des animaux (animal bloqué dans une cage ou aux cornadis). Cette contention, ainsi que la simple présence humaine et la manipulation associée peuvent générer un stress ponctuel chez l'animal. Le prélèvement en lui-même (en particulier le prélèvement sanguin) peut générer sur le moment une douleur limitée et fugace. De par les interventions d'élevage, une phase d'imprégnation à l'homme est réalisée dès la naissance de chaque veau. Cela réduit grandement le stress généré par la présence de l'homme lors des prélèvements, d'autant que ce sont les mêmes personnes qui interviennent. Il n'est attendu aucun dommage ni effet indésirable à moyen ou long terme. Il n'y a pas de mise à mort des animaux.
Devenir
Les procédures n’entravent pas le devenir de l’animal et n’ont qu’un effet limité et de court terme sur son bien-être. Aussi, l’ensemble des animaux inclus dans cette expérimentation va poursuivre une vie normale d’un animal de renouvellement dans un troupeau de bovins laitiers. La suite de leur vie fera l’objet de nouvelles expérimentations poursuivant celle-ci.
Remplacement
Les mécanismes étudiés mettent en jeu des interactions complexes au sein de l’hôte qu’il est impossible de reproduire dans un modèle cellulaire, de culture d’organe ou in silico.
Réduction
Les analyses statistiques prévisionnelles, intégrant de l’espérance d’écart entre traitements et la variabilité inter vaches connue, ont permis de définir le nombre minimum d’animaux nécessaires par lot expérimental, à savoir un effectif de 80 vaches par lot. La pluri-annualité de cette expérimentation permet d’autre part de réduire l’effectif nécessaire chaque année et limite les besoins en renouvellement, donc la réforme des animaux.
Raffinement
Différentes mesures ont été prises afin de raffiner ce protocole. Tout d’abord, les différentes mesures ont été regroupées sur les mêmes temps, même si ce n’était pas toujours le moment optimal pour chaque paramètre pris séparément, afin de limiter le nombre d’interventions sur les animaux. Ensuite, chaque intervention a été pensée de manière à limiter les nuisances pour les animaux (limitation des volumes de sang prélevés, utilisation de vacutainer pour minimiser la douleur, utilisation de tondeuse vétérinaire silencieuse pour limiter le stress…) Les procédures impliquées dans le projet sont de sévérité légère et appliquées par des opérateurs expérimentés. Les conditions d'hébergement et d'alimentation répondent aux normes d’élevage. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. La prophylaxie et le traitement des animaux en cas d’affection ne sont pas modifiés par la mise en œuvre du projet. Tout animal présentant un trouble de santé sera soigné en fonction de la pathologie conformément aux pratiques de l'élevage, et, au besoin, le vétérinaire praticien sera consulté. Les animaux sont gardés en vie en fin d'expérimentation
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est le bovin. Il s’agit de femelles de race Holstein et Normande, grandes races laitières françaises (et internationale pour la Holstein). Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Les animaux seront des femelles bovines laitières suivies depuis leur première mise à la reproduction (13 mois d’âge) jusqu’à leur réforme, soit du stade génisse au stade vache.
Etude du rôle de Myd88 et de la dérégulation de NF-kappaB dans la lymphomagenèse des lymphocytes B
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Ni réutilisables pour d'autres expériences ni adoptables, selon le porteur, 2 550 souris seront toutes tuées à l'issue de procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles développent spontanément un lymphome B vers dix à douze mois, avec grossissement de la rate, et sont mises à mort dès qu'elles perdent plus de 20 % de leur poids ou présentent une altération du poil, des selles, de la respiration ou de la posture. Chacune subit une biopsie de peau, une à cinq injections dans l'abdomen, trois gavages et une prise de sang par mois à partir de six mois d'âge. Le porteur conclut qu'il est "indispensable" de valider chez l'animal des mécanismes mis en évidence sur lignées cellulaires, ces lignées ne rendant pas compte du dialogue entre cellules tumorales et environnement immunitaire.
Objectifs
Ce projet a pour objectif global de découvrir de nouveaux traitements ou combinaisons de traitements contre les lymphomes non-Hodgkiniens B, cancers qui se développent dans certaines cellules de notre systèmes immunitaire, les lympohcytes B. Au sein de notre laboratoire, nous nous intéressons plus particulièrement aux mécanismes de transformation des lymphocytes B en cellules tumorales. Pour ce faire nous développons des modèles de souris transgéniques d'hémopathies malignes de type lymphomes B. Notre premier objectif est de mieux comprendre les processus de transformation des lymphocytes B. Le second objectif vise à mieux comprendre le dialogue entre les cellules B transformées et leur micro-environnement cellulaire. A partir des résultats obtenus sur les deux premiers objectifs, nous testerons de nouvelles thérapies ou combinaisons thérapeutiques ciblant à la fois les cellules B tumorale et leur micro-environnement.
Bénéfices attendus
Aborder la problématique des lymphomes B et, notamment l’étude des phases précoces de la lymphomagenèse B, est impossible au plan expérimental chez l’humain. Les modèles murins génétiquement modifiés de lymphomes B humains sont donc indispensables pour élucider les conséquences in vivo d’oncogènes putatifs, pour en disséquer les mécanismes moléculaires et pour tester de nouvelles modalités thérapeutiques. Au travers de notre projet, nous voulons mieux distinguer les premières étapes de la transformation B et ses conséquences sur le micro-environnement immun. Nous testerons différentes combinaisons thérapeutiques ciblant à la fois les cellules tumorales B et le micro-environnement afin de le « ré-éduquer » à la reconnaissance de la tumeur.
Procédures
Les injections intra-péritonéales entraîne une douleur légère de courte durée. Selon les procédures, l'animal subira 1 à 5 injections avec une fréquence d'une injection par mois. La biopsie cutanée en vue de réaliser les analyses génétiques entraîne une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang entraine une douleur légère de courte durée et sera réalisé tous les mois à patir de 6 mois d'âge. Le stress des animaux est limitée car nous réalisons tous ces geste sous anesthésie. L'administration orale est réalisée sur animal vigile et entraîne un stress de courte durée. Les 3 gavages sont réalisés en début d'expérimentation tous les 2 jours (J0, J2, J4)
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques réalisées sur les différents modèles animaux entraînent le développement spontané de tumeurs de type lymphome B. L’apparition de ces tumeurs à l’âge de 10-12 mois entraîne une augentation du taux d'immunoglobuline dans le sang et une augmentation de la taille de la rate. Une surveillance quotidienne permettra de suivre l'état général des animaux (comportement individuel et collectif) ainsi que l'évolution de la maladie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Ils ne peuvent pas être réutilisés pour d'autres expériences, ni adoptés.
Remplacement
L'établissement de lignées cellulaires a largement permis d'améliorer nos connaissances de la biologie du cancer. Mais le cancer est une pathologie complexe avec des intéractions entre les cellules cancéreuses et les cellules normales environnantes (telles que les cellules du système immunitaire) qui participent à la prolifération et la survie des cellules tumorales, à l'angiogenèse et à la formation de métastases. Considérer l'organisme dans son ensemble est donc nécessaire en cancérologie. De ce fait, il est indispensable de valider ou d'invalider in vivo les mécanismes de transformation mis en évidence in vitro sur lignées cellulaires, ceci grâce à l'utilisation de modèles animaux. Ces modèles apportent ainsi la possibilité d'appécier la dynamique du processus transformant au cours du développement de la cellule B et de tester in vivo de nouvelles molécules chimiothérapeutiques afin d'identifier celles avec un vrai potentiel thérapeutique chez l'homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs analyses histologiques, cellulaires, moléculaires et génétiques seront réalisées à la fois sur le sang et plusieurs organes (moelle osseuse, rate, reins, foie). Les expériences sont organisées dans un ordre précis, avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Pour plus de détails, une partie de ces organes sera systématiquement fixée pour des analyses tissulaires et cellulaires. Le reste des cellules sera congelé en vue d’extraction d’ARN, d’ADN ou de protéines. Le maintien des lignées sera réduit au strict minimum en réalisant des accouplements entre couples parfaits afin de limiter la génération d'animaux sans intérêt pour le projet.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. De plus, l’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie). Les animaux sont manipulés par du personnel formé et qualifié. Lors de la manipulation quotiduenne, une grille de score sera mise en place pour un meilleur suivi des animaux Les prélèvements de sang et de queues seront tous réalisés sous anesthésie générale gazeuse et par du personnel qualifié maitrisant ces gestes. Les animaux sont maintenus sous surveillance jusqu’à leur réveil. L'observation régulière des animaux et le suivi de leur comportement permettra d’avoir un contrôle sur leur état de santé. Un protocole de gestion de la souffrance est établi et mis en place dès que le score établi lors des surveillances quotidiennes le prévoit.
Choix des espèces
L'établissement de lignées cellulaires a largement permis d'améliorer nos connaissances de la biologie du cancer. Mais le cancer est une pathologie complexe avec des intéractions entre les cellules cancéreuses et les cellules normales environnantes (telles que les cellules du système immunitaire) qui participent à la prolifération et la survie des cellules tumorales, à l'angiogenèse et à la formation de métastases. Considérer l'organisme dans son ensemble est donc nécessaire en cancérologie. De ce fait, il est indispensable de valider ou d'invalider in vivo les mécanismes de transformation mis en évidence in vitro sur lignées cellulaires, ceci grâce à l'utilisation de modèles animaux. Ces modèles apportent ainsi la possibilité d'appécier la dynamique du processus transformant au cours du développement de la cellule B et de tester in vivo de nouvelles molécules chimiothérapeutiques afin d'identifier celles avec un vrai potentiel thérapeutique chez l'homme. Les souris constituent le meilleur modèle d'étude de la cancérogenèse grâce à leur petite taille, leur capacité de reproduction (temps de gestation de 21 jours, nombre de bébés par portée intéressant), leurs similarités physiologiques et moléculaires avec l'Homme et leur génome en totalité séquencé. Cela en fait d'ailleurs une espèce de référence reconnue dans le domaine de la recherche internationale. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, âgées au minimum de 7 à 8 semanes, âge où la lymphopoïèse est mature. Dans le cadre de toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés s’ils présentent des signes de souffrance repérés grâce à la surveillance quotidienne et la grille de score : perte de poids >20%, aspect physique externe altéré (aspect du poil, selles, respiration) et anomalies du comportement (dynamisme, posture), développement de tumeur au niveau de la rate ou des ganglions.
Impact du ciblage des macrophages dans la physiopathologie et le traitement de la Leucémie Aigue Myéloide chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Chaque souris est contenue treize fois, reçoit une injection de cellules leucémiques, subit six prélèvements sanguins, cinq injections dans l'abdomen et dix gavages consécutifs. 1 472 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour tester des molécules censées reprogrammer les macrophages contre la leucémie aiguë myéloïde. Le porteur décrit des douleurs modérées liées aux prises de sang et aux injections répétées, un inconfort au gavage avec irritation possible de l'œsophage, et une perte de poids après l'injection des cellules cancéreuses. Les calculs qu'il présente portent sur des groupes de huit à dix souris répétés trois fois, sans que le total de 1 472 animaux soit rapporté à ces effectifs.
Objectifs
Les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) touchent environ 3 personnes sur 100 000 chaque année en France. Malgré les traitements comme la chimiothérapie et les greffes de cellules souches, et même si 50 à 80 % des patients entrent en rémission, des cellules cancéreuses restent souvent présentes et peuvent provoquer des rechutes plus tard. Récemment, des chercheurs ont découvert que certains types de cellules immunitaires appelées macrophages jouent un rôle important dans la progression des LAM. Selon l'environnement autour des tumeurs, ces macrophages peuvent être de deux types principaux : 1. Les macrophages M1, qui sont anti-tumorales et combattent les tumeurs. 2. Les macrophages M2, qui sont pro-tumoraux et peuvent aider les tumeurs à se développer. Les macrophages peuvent changer de fonction en réponse à leur environnement, ce qui ouvre des possibilités pour de nouvelles thérapies. Étant donné l'importance des macrophages pro-tumoraux dans la leucémie, nous souhaitons tester dans ce projet plusieurs approches pharmacologiques pour reprogrammer les macrophages en macrophages anti-tumoraux dans des souris leucémiques et ainsi améliorer le traitement de référence. Ainsi, l'ensemble des résultats obtenus nous permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le contexte de la leucémie aigue myéloide et par conséquent améliorer la survie des patients atteints de leucémies.
Bénéfices attendus
Grâce à ce modèle in vivo de leucémie, nous pourrons 1/ déterminer l'importance des cellules immunitaires, et notamment des macrophages, dans la physiopathologie de la leucémie aigue myéloide mais également 2/ développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires afin de les réactiver dans le but d'améliorer la prise en charge de la leucémie chez l'homme.
Procédures
1- Contentions répétées des souris (13 fois, 30 secondes / Souris) 2- Injection de cellules leucémique chez la souris (1 fois, 20 sec /souris) 4- Prélèvements sanguins avant traitement (J0 et J10) puis tous les 5 jours durant la durée du traitements (20 jours), soit 6 prélèvements/souris (30 sec / souris) 5- Injections intrapéritonéales répétées (5 injections/souris sur 5 jours, 30 sec/souris) 6- gavages répétés (10 gavages/souris sur 10 jours, 1 min /souris)
Impact sur les animaux
1/Stress légers liés à la préhension et la contention des animaux, 2/Perte de poids suite à l’injection des cellules cancéreuses et aux différents traitements, 3/Stress et douleurs modérées liées aux prélèvements sanguins répétés, 4/Stress et douleurs modérées liées aux injesctions intrapéritonéales répétées avec possibilité d'inflammations locales, 3/Inconfort et douleurs modérées liées aux gavage répétés avec possibilité d'irritation de l'œsophage.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort afin de réaliser l'ensemble des analyses biologiques et biochimiques nécessaires à l'obtention des résultats
Remplacement
Les seuls modèles à notre disposition à ce jour sont des lignées cellulaires leucémiques de patients ou de souris isolées à partir d’animaux malades. Néanmoins, Il a été montré que les propriétés tumorales, sécrétrices et fonctionnelles de ces lignées diffèrent in vitro et in vivo d’où la nécessité d’induire la leucémie chez l’animal pour son étude. Ainsi et après avoir caractérisé et testé in vitro les meilleurs traitements ayant des effets capable de reprogrammer les macrophages en système in vitro, il est maintenant nécessaire de réaliser des expériences chez le rongeur afin d‘avoir une approche plus physiologique. Nous pourrons ainsi déterminer si ces molécules peuvent améliorer les effets de la chimiothérapie dans un modèle murin de leucémie. Nous étudierons aussi le rôle de l’environnement tissulaire (interaction cellulaire, interaction cellule-microenvironnement et surtout réponse du système immunitaire) dans la réponse à ces drogues. Le passage chez l‘animal est une étape cruciale pour le développement potentiel de ces molécules chez l‘Homme afin de proposer une alternative à l'échec thérapeutique des traitements actuels.
Réduction
Nous avons décidé de réaliser deux procédures dans le but de réduire le nombre d'animaux. Ainsi, la première procédure permettra d'établir la meilleure dose à utiliser de nos traitements d'intérêt sur un nombre minimal de souris et établira la preuve de concept d'efficacité de nos molécules à potentialiser les effets de la chimiothérapie de réference. L’objectif de cette procédure est donc de démontrer un effet notable de nos molécules sur la réduction de la masse tumorale en combinaison avec le traitement de référence . L'utilisation d'un logiciel de statistique recommande des groupes de 8 souris chacun afin d'établir cette preuve de concept. La seconde procédure établira statistiquement l'intérêt de moduler la polarisation des macrophages afin d'améliorer le traitement de référence . Afin d'établir le nombre de souris à utiliser, nous avons utilisé un logiciel pour faire des prévisions statistiques. Ainsi, ce logiciel recommande des groupes de 10 souris chacun et de répéter au moins 3 fois l'expérience. Nous avons donc décidé de constituer des groupes de 10 souris et de répéter l'expérience trois fois de manière indépendante. Si les résultats s’avèrent statistiquement significatifs dès la deuxième expérience, nous stopperons l'expérimentation et nous ne ferons pas la 3ème expérience.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et matériel de nidification). Des points limites précoces et adaptés notamment appuyés sur la mesure de marqueurs sanguins qui permettent de suivre précocement de la progression de la pathologie et de limiter la gravité des procédures seront mis en place. Si les efficacités de nos molécules sont démontrées avant les 20 jours de traitements, les procédures de traitements et de prélèvements seront arrêtées.
Choix des espèces
Nous souhaitons évaluer la capacité de molécules capables de réactiver le système immunitaire dans le but d'améliorer les traitements actuels de la leucémie aigue myeloïde. Dans cet objectif, le modèle murin est le plus à même de reproduire un système immunitaire complexe. L'injection des cellules leucémiques s'effectuera à l'âge de 6 semaines, âge correspondant à l'âge optimal de prise tumorale.