Système immunitaire

Tuées après anesthésie à la fin de chaque procédure pour que leurs organes soient prélevés, 5 274 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les mères gestantes sont enfermées dans un tube de contention sous une lumière vive, trente minutes, trois fois par jour, du treizième au dix-huitième jour de gestation. Leur descendance devenue adulte reçoit sous la peau une injection de cellules tumorales, dont la croissance provoque une douleur locale et une détresse décrites comme modérées. Le porteur qualifie le recours aux animaux d'"incontournable" au motif que la réponse antitumorale engage "l'organisme entier", puis énumère parmi les raisons du choix de la souris ses "coûts réduits", ses cycles de reproduction courts et sa "facilité de transport".

Objectifs

Le stress prénatal (PS) est provoqué par des événements traumatisants (comme le décès d’un proche, la dépression, une agression, une infection, etc.) survenant pendant la grossesse. Il a été observé que le stress prénatal entraîne chez les enfants diverses psychopathologies (telles que la dépression, l'anxiété, l'autisme, la schizophrénie, etc.), des troubles neuro-développementaux, ainsi que des dysbioses intestinales. Le PS peut également avoir divers effets sur le système immunitaire des enfants, notamment en augmentant leur susceptibilité à développer des dermatites et des allergies telles que des inflammations pulmonaires et de l’asthme allergique. L'impact du PS sur le développement du cancer demeure largement inexploré et les mécanismes impliqués restent à élucider. Une étude portant sur une cohorte humaine de 6 millions d’enfants a révélé que les enfants nés de mères ayant subi la perte d'un bébé ou de leur conjoint pendant la grossesse présentaient un risque accru de développer certains cancers liés aux fonctions immunitaires et endocriniennes, comme la leucémie, le cancer des testicules et du foie. Cependant, cette étude n’a pas établi de lien de causalité entre le PS et le cancer. Ainsi, notre projet vise à étudier, à l'aide d'un modèle de stress prénatal développé par notre équipe, les mécanismes par lesquels le PS influence la réponse immunitaire anti-tumorale chez la progéniture. Pour ce faire, nous analyserons l’impact du PS sur la réponse immune antitumorale dans trois modèles murins complémentaires.

Bénéfices attendus

Les facteurs environnementaux peuvent influencer le développement du système immunitaire et avoir un impact durable sur la progéniture, ce qui peut ultérieurement influencer les réponses immunitaires normales et pathologiques. Cette étude sur l'effet du stress prénatal sur la réponse immunitaire de la progéniture chez la souris offre une approche expérimentale pour explorer les mécanismes sous-jacents à ces interactions complexes, en mettant l'accent sur le microbiote. Cela pourrait permettre d'identifier des souches bactériennes ou des métabolites du microbiote qui pourraient être ciblés thérapeutiquement pour traiter les pathologies cancéreuses.

Procédures

Les souris gestantes seront soumises au stress du 13ème au 18ème jour de gestation en utilisant un tube de contention sous une lumière vive pendant 30 minutes, trois fois par jour. La progéniture adulte recevra une injection en sous-cutanée des cellules tumorales. Le modèle implique l'injection sous-cutanées de cellules tumorales murines présentant le même fond génétique que les souris réceptrices immunocompétentes. Ces modèles sont couramment utilisés pour évaluer l'efficacité des thérapies car ils reproduisent la complexité de la physiopathologie observée chez l'homme En cas d’apparition de phénotypes dommageables, notamment des signes d’inflammation excessive ou de dérèglement immunitaire, une intervention rapide sera mise en place. Cela inclut des soins vétérinaires pour évaluer l’état de santé des animaux, ainsi que la mise en œuvre de protocoles d’euthanasie en cas de souffrance excessive ou de détérioration clinique significative. Les signes à surveiller incluent l’amaigrissement, les comportements anormaux (comme la posture courbée ou le poil éparse), ainsi que tout signe de détresse respiratoire ou inflammatoire.

Impact sur les animaux

Le modèle syngénique de tumeurs sous-cutanées chez la souris consiste à injecter des cellules tumorales murines génétiquement compatibles dans des souris immunocompétentes, permettant d'étudier l'efficacité des thérapies dans un contexte physiopathologique proche de l'humain. Ce modèle peut provoquer une douleur légère à modérée au site d'injection, suivie d'une inflammation locale liée à la croissance tumorale. La progression de la tumeur entraîne un stress physique prolongé et une détresse modérée due à des altérations physiologiques et comportementales, telles qu'une perte d'appétit

Devenir

À la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés après anesthésie. Les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire.

Remplacement

L'évaluation du statut immunitaire de l'animal est souvent peu représentative de la pathologie humaine. Par conséquent, ces limitations rendent le recours à l'expérimentation animale incontournable, car le stress, la réponse immunitaire et la croissance tumorale sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossibles à reproduire in vitro dans leur intégralité. Cependant, une revue de la littérature sera effectuée pour déterminer si des méthodes de remplacement ont été développées. L'utilisation de l'espèce animale choisie pour ce projet (la souris) permet de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines. De plus, cette espèce présente certains avantages pratiques décisifs justifiant son utilisation dans ce type de projet : coûts réduits, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De surcroît, notre recherche repose sur l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés, ce qui nécessite l'utilisation des souris. Aucune autre espèce animale n'est disponible à cet effet. Il est également important de souligner que chez la souris, nous disposons d'outils précieux tels que des anticorps et des protéines recombinantes indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans notre étude.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans chaque expérience a été calculé à l'aide d'un test statistique qui tient compte de la variance biologique des résultats obtenus dans des expériences réalisées au laboratoire. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, tous les échantillons prélevés sont stockés à -80°C et dans une banque de données, où ils peuvent être réutilisés ultérieurement ou servir de témoins dans d'autres expériences. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 12 animaux par expérience étaient nécessaires. Pour les modèles utilisés, les animaux seront régulièrement suivis dans le temps par des techniques non invasives telles que le suivi du poids et la mesure de la croissance tumorale. L'utilisation de ces techniques non invasives permet d'observer l'évolution d'un seul animal au fil du temps, là où auparavant l'information devait être obtenue par l'euthanasie et l'autopsie de multiples individus à chaque étape d'une seule étude, permettant ainsi de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires. Une analyse rétrospective sera réalisée à la fin de chaque expérience afin de déterminer les possibilités de diminution supplémentaire du nombre d'animaux.

Raffinement

Dès le début de la période d'acclimatation, une surveillance quotidienne des animaux (poids, désydratation, température, respiration, état générale...) ainsi qu'un contact humain quotidien sont assurés. Les conditions expérimentales font l'objet d'un suivi rigoureux du bien-être animal. Des points limites (perte de poids >20%, activité extreme, hypotherlmie, ...) ont été définis pour chaque procédure afin de limiter la souffrance ou l'angoisse des animaux, et toute atteinte à ces limites entraînera l'euthanasie de l'animal. Des mesures seront mises en place pour réduire l'anxiété et l'impact environnemental sur les souris, telles que l'enrichissement de l'environnement avec des cachettes et des objets à ronger. Les animaux seront maintenus dans leur cage avec leurs congénères habituels et auront un accès libre à l'eau potable. Une surveillance quotidienne par le personnel animalier ou l'expérimentateur permettra de détecter toute éventuelle souffrance chez les animaux, comme spécifié pour chaque expérience. À la fin de chaque expérience, une étude rétrospective sera menée afin d'identifier les possibilités d'amélioration des procédures pour réduire la souffrance animale.

Choix des espèces

La souris présente des caractéristiques physiopathologiques similaires à celles de l'espèce humaine. De plus, notre projet de recherche repose sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées. En outre, cette espèce présente divers avantages pratiques essentiels justifiant son utilisation comme modèle dans ce type de projet : coûts réduits, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, manipulation aisée et adaptation adéquate aux conditions expérimentales. Les mères seront soumises au stress du 13e au 18e jour de gestation, conformément à la période décrite dans la littérature pour ce modèle. Ensuite, les progénétures utilisées seront âgées d'au moins 6 semaines, car nous visons à utiliser des animaux adultes et matures. De plus, cet âge est communément utilisé dans la littérature pour ces modèles.

Pour mesurer le rôle d'une hormone du métabolisme du fer dans l'arthrite, 400 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 320 d'entre elles reçoivent deux injections dans l'abdomen à 72 heures d'intervalle qui déclenchent une arthrite, 70 sont gavées deux fois par jour pendant dix jours. Le porteur décrit une inflammation et des douleurs articulaires du septième au onzième jour, terme du protocole, puis un prélèvement de sang par ponction dans le cœur sous anesthésie avant la mise à mort. Il indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % arrête l'expérimentation et déclenche la mise à mort des souris concernées.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune chronique touchant 0,5 à 1% de la population. Cette pathologie dépend du développement d’auto-anticorps et d’un recrutement de cellules inflammatoires dans les articulations, menant à une destruction des os et du cartilage. Des molécules activées par l'inflammation perturbent le métabolisme du fer en régulant l’expression de l’hepcidine. L’hepcidine est un petit peptide circulant, il réduit le fer sanguin en inhibant son absorption par l’intestin et sa libération des tissus de stockage. L’hepcidine est principalement exprimée par le foie, mais des études ont montré une synthèse extra-hépatique de l’hepcidine dans plusieurs organes périphériques. Dans un contexte inflammatoire, l’hepcidine aurait un rôle délétère dans ces tissus puisque localement, elle peut augmenter la rétention du fer toxique et accentuer l’inflammation. En effet, l’hepcidine est une protéine inflammatoire de phase aigue. Cependant, le rôle de l’hepcidine dans la PR, reste à ce jour non élucidé. L’équipe a montré que l’hepcidine est produite au niveau de l’articulation de manière significativement supérieure chez des patients atteints d’arthrite comparés à ceux atteints d’arthrose (maladie articulaire non inflammatoire). Des inhibiteurs d'une des voies de régulation importante de l’hepcidine représentent une nouvelle classe thérapeutique capable de cibler l’inflammation des patients atteints d’arthrite. Ainsi nos objectifs dans ce projet sont d’évaluer d’une part l’implication de l’hepcidine locale dans l’exacerbation de l’inflammation et dans les mécanismes de destruction ostéo-articulaire, et d’autre part, d’évaluer ses consequences sur le métabolisme du fer et sur le développement de la pathologie dans un modèle murin d’arthrite.

Bénéfices attendus

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire touchant les articulations qui affecte actuellement en France 0.5 à 1% de la population, ce qui représente plus de 300 000 personnes. De ce fait, une meilleure compréhension de cette pathologie et le développement de traitements ciblés représentent un enjeu de santé publique majeur. Nos données récentes chez les patients ont montré que l’hepcidine, un peptide qui régule le métabolisme du fer, était présente au niveau de l’articulation en conditions d’arthrite et qu’elle pouvait jouer un rôle important dans la pathologie. Ce projet permettra d’apporter de nombreuses connaissances sur le métabolisme du fer local dans la polyarthrite rhumatoïde, un domaine non étudié à ce jour. Parmi les derniers traitements développés, le filgotinib montre des résultats encourageants chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde modérée à sévère. Ce projet nous permettra d’apporter plus de connaissances concernant les mécanismes d’action de ce traitement dans la polyarthrite rhumatoïde. De plus nous apporterons des résultats sur l’impact de ce traitement sur le métabolisme du fer qui intervient dans de nombreux processus physiologiques.

Procédures

320 animaux subiront 2 injections intrapéritonéales réalisées à 72h d’intervalle. Ce geste, rapide (quelques millisecondes à quelques secondes) et indolore pour les animaux, sera réalisé sur animaux vigiles. 70 animaux seront soumis à des gavages deux fois par jour pendant 10 jours (de J0 à J9). Cette technique réalisée en quelques secondes sera réalisée par des personnes expérimentées sur animaux vigiles. L’ensemble des souris subiront également un prélèvement sanguin intracardiaque (quelques secondes) réalisé sous anesthésie avant leur mort.

Impact sur les animaux

Les animaux qui développeront une arthrite peuvent subir une inflammation et des douleurs articulaires à partir de la mise en place de la pathologie (J7) jusqu’à la fin du protocole expérimental (J11).

Devenir

Notre projet nécessite la récupération de prélèvements moléculaires, cellulaires et tissulaires, ce qui ne nous permet pas de garder les animaux en vie après prélèvements. De plus le projet ne nécessite pas de faire une cinétique sur nos animaux. De ce fait, tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure expérimentale.

Remplacement

Notre projet repose sur des études préliminaires réalisées in vitro ayant montré que l’arthrite modulait le métabolisme du fer et que ce dernier avait un impact sur la pathologie. La polyarthrite rhumatoïde étant un système complexe impliquant de nombreux partenaires cellulaires, les études in vitro ne permettent pas de représenter l’ensemble de la pathologie. De ce fait, le modèle in vivo reste le meilleur modèle permettant d’étudier la polyarthrite rhumatoïde dans le cadre de notre projet. Nos résultats in vitro nous permettent de justifier l’intérêt scientifique de notre projet dans un système concret qu’est le système in vivo.

Réduction

Notre projet a été pensé afin de réduire au maximum le nombre d’animaux. Sur un même animal, nous réaliserons des analyses anatomiques (histologie des articulations), cellulaires (analyse des cellules articulaires et circulantes), et moléculaires (dosages). Les techniques utilisées dans notre projet sont des techniques que nous maitrisons et que nous réalisons régulièrement au laboratoire. Les analyses statistiques seront effectuées à l’aide d'un logiciel adapté. Des tests statistiques pertinents seront utilisés.

Raffinement

Notre projet a été conçu afin de limiter le mal-être des animaux. Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, notre étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale. Afin de limiter le stress des animaux, les souris seront acclimatées pendant une semaine suite à leur arrivée dans la zootechnie et avant de débuter l’expérimentation. De plus, elles seront hébergées avec d’autres souris tout au long du protocole (5 souris par cage) dans des cages d’une superficie de 500 cm2 à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Des objets enrichissants seront disposés dans chaque cage pour limiter le stress des animaux. Notre projet nécessite un suivi quotidien du développement de la maladie chez les animaux. De ce fait, nous observerons attentivement les animaux de manière quotidienne et si ces derniers présentent des altérations physiques, des signes de douleur et/ou des comportements anormaux (flan creusé, dos voûté, poils sales, perte de poids, déshydratation, agressivité, prostration…), un analgésique sera administré si necessaire et si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids de plus de 20% est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les animaux concernés seront euthanasiés. A la fin de la procédure, avant l’euthanasie des animaux, un prélèvement intracardiaque sera réalisé. Pour réduire la douleur et le stress des animaux générés par cette procédure, les animaux seront anesthésiés au préalable avec un mélange de kétamine et de xylazine.

Choix des espèces

Les modèles murins de polyarthrite rhumatoïde sont couramment utilisés pour étudier la physiopathologie de cette maladie. De plus, le choix d’utiliser des modèles murins a été conforté par le fait que nous possédons de nombreuses connaissances sur ce modèle, nous permettant un plus grand nombre d’analyses possibles. Les souris utilisées seront âgées de 7 à 8 semaines, ce qui est en conformité avec les études publiées utilisant ce modèle murin d’arthrite.

Trois lignées de souris, dont une modifiée pour ne plus produire le sucre alpha-Gal, et des lapins blancs de Nouvelle-Zélande retenus parce qu'ils fournissent de gros volumes de sang : 300 souris et 9 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les souris portent sur le dos une capsule contenant des tiques qui se nourrissent sur elles, ce qui impose un hébergement individuel puisqu'elles arrachent les capsules de leurs congénères et mangent les tiques. Les lapins reçoivent deux immunisations, puis un prélèvement dans la veine de l'oreille et enfin un prélèvement intracardiaque sous anesthésie. Toutes et tous sont tués pour récupérer sang et organes, alors que le calcul de puissance annonçait 33 souris par groupe et que le porteur en retient cinq.

Objectifs

Objectif 1 : Infection des souris pour obtenir des tiques infectées par Borrelia spp. La maladie de Lyme, causée par la bactérie Borrelia spp., est une maladie transmise aux animaux et aux humains qui est en pleine expansion, notamment en Europe, où son incidence a considérablement augmenté ces dernières années, en particulier en France. Comprendre comment les tiques, principaux transmetteurs de cette maladie, sont infectées et comment la bactérie se transmet des animaux ou des humains aux tiques est essentiel pour développer des stratégies de prévention. En infectant des souris avec Borrelia spp., ce projet cherche à générer des tiques infectées de manière contrôlée, afin de mieux comprendre le cycle de transmission et d’examiner les interactions animaux/humains-Borrelia et les tiques. Cette connaissance est cruciale pour identifier de nouvelles cibles permettant d'interrompre la transmission de Borrelia spp. Objectif 2 : Induction d'anticorps spécifiques contre le sucre α-Gal pour protéger contre l'infection par Borrelia spp.Des études antérieures ont démontré que les anticorps contre le sucre α-Gal, générés naturellement en réponse à certains stimuli, peuvent offrir une protection contre divers pathogènes, y compris ceux qui exposent ce sucre à leur surface, comme Borrelia spp. La vaccination avec le sucre ou avec des variantes de la bactérie E. coli qui ne causent pas de maladies et exprimant ce sucre pourrait induire la production de ces anticorps protecteurs. L'objectif de cette partie du projet est de tester cette approche innovante. Si elle s'avère efficace, elle pourrait ouvrir une nouvelle voie pour la prévention de la maladie de Lyme, représentant ainsi une avancée majeure, car aucun vaccin n’est actuellement disponible pour les animaux ou les humains. Objectif 3 : vaccination des lapins pour des études in vitro. Les lapins seront utilisés pour produire des volumes importants de sérum riche en anticorps contre α-Gal et contre E. coli, ce qui est crucial pour les expérimentations complémentaires. Ce sérum permettra de tester en laboratoire, à plus grande échelle, l'efficacité des anticorps produits par les vaccins expérimentaux, garantissant ainsi une meilleure reproductibilité et une plus grande précision dans les résultats. L’utilisation des lapins, qui permettent de récolter un plus grand volume de sérum que les souris, réduit le nombre total d’animaux nécessaires et améliore la qualité des études futures.

Bénéfices attendus

Les tiques sont les principaux transmetteurs de pathogènes provoquant des maladies graves chez les humains et les animaux, comme la maladie de Lyme causée par Borrelia spp. et transmise par les tiques Ixodes. Borrelia burgdorferi est la principale espèce responsable de la maladie de Lyme en Amérique du Nord, transmise par Ixodes scapularis, tandis que Borrelia afzelii est plus courante en Europe, où elle est transmise par l'espèce homologue I. ricinus. Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace contre Borrelia spp., et la lutte contre les tiques repose principalement sur l'utilisation d'acaricides, qui contaminent l'environnement ainsi que les produits animaux destinés à la consommation humaine. De plus, l’utilisation d’acaricides peut entraîner la sélection de populations de tiques résistantes. Étant donné la gravité des maladies transmises par les tiques et l'absence de mesures préventives efficaces, hormis l'évitement des piqûres de tiques, ce projet vise à développer des stratégies de vaccination plus sûres et plus efficaces. En particulier, il cherche à développer des vaccins basés sur le sucre α-Gal, offrant une protection à la fois contre les tiques et contre la maladie de Lyme

Procédures

Les souris recevront deux injections sous-cutanées et un maximum de trois prélèvements sanguins ; ces prélèvement dureront 10 minutes, anesthésie comprise.. Les lapins seront immunisés par voie souscutanée avec des variantes d'E. coli qui ne causent pas de maladies ou avec le sucre α-Gal, avec deux injections. Les jours 0 et 14 après la première vaccination, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine auriculaire ; le prélèvement durera 8 minutes, anesthésie comprise. Le jour 30 après la vaccination de rappel, un prélèvement sanguin intracardiaque sera réalisé sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

L'alimentation des tiques pourrait provoquer un inconfort modéré chez les animaux, et ceux-ci pourraient également ressentir un léger inconfort en raison de la pose de la capsule sur leur dos. Aucune souffrance particulière n'est attendue en raison de l'infection, car les souris sont les transmetteurs naturels de Borrelia et ne présentent pas de symptômes. La pose des capsules a été optimisée pour minimiser l'inconfort tout en maximisant les résultats expérimentaux. Cependant, l'expérience sera interrompue en cas d'événements indésirables tels que : (i) un choc anaphylactique dû aux piqûres de tiques ou à l'infection bactérienne ; (ii) une réaction cutanée généralisée affectant les voies respiratoires ou gastro-intestinales après l'immunisation ; (iii) des blessures auto-infligées par les animaux tentant de retirer la capsule ; (iv) des signes graves après l'exposition aux micro-organismes. Les animaux seront surveillés quotidiennement et, si nécessaire, l'expérience sera arrêtée. Les critères d'évaluation incluent une échelle de 3 niveaux, et tout animal atteignant un score de 3 sera mis à mort : (1) infecté sans signe visible ; (2) poils hérissés, activité réduite, légère posture voûtée ; (3) posture voûtée, difficulté à maintenir la position, prostration, respiration superficielle ; (4) décès.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet consiste à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec E. coli ou α-gal-BSA afin d'évaluer les effets protecteurs des anticorps anti-α-Gal contre Borrelia spp., ainsi que la survie des tiques et l'acquisition de Borrelia spp. par ces dernières. Il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de reproduire la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne, ce qui empêche d'analyser adéquatement les effets protecteurs et la colonisation de Borrelia spp. chez les tiques. Pour obtenir un plus grand volume de sérum destiné à des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation supplémentaire de souris. L'immunisation des lapins permettra d'obtenir du sérum anti-α-Gal ou anti-E. coli, offrant un meilleur contrôle sur la qualité, la spécificité et l'affinité des anticorps, ce qui garantit la cohérence et la reproductibilité des expériences. De plus, elle permettra la production d'anticorps à plus grande échelle, répondant ainsi aux besoins expérimentaux spécifiques.

Réduction

Nous utiliserons 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux sera calculé pour être le minimum requis afin d'obtenir les tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Pour développer un test de puissance statistique robuste permettant d’analyser la relation entre les anticorps anti-alpha-gal et la protection, nous avons fixé le niveau de confiance à 5%, en nous basant sur les données publiées disponibles. Nous avons ciblé une puissance statistique de 0,8, en supposant un effet de taille modérée, ce qui indiquait un besoin de 33 souris par groupe pour un test ANOVA. En appliquant le principe des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), nous avons réduit la taille de l’échantillon à 5 souris par groupe afin de minimiser l'utilisation des animaux tout en maintenant des résultats significatifs.Chaque souris peut nourrir jusqu'à 100 larves ou 30 nymphes. Comme les larves sont plus petites et nécessitent moins de ressources que les nymphes, il est possible d'utiliser 100 larves et 20 nymphes par souris, sans affecter leur santé, tout en garantissant un nombre suffisant de larves et de nymphes infectées pour mener à bien les études expérimentales. Environ 30 % des tiques se détacheront sans avoir pris un repas complet ou mourront, ce qui nous permettra d'obtenir 70 larves ou 20 nymphes gorgées par souris. Parmi les 350 larves obtenues, 200 seront élevées jusqu'au stade de nymphe pour obtenir des nymphes infectées par Borrelia, utilisées dans des études in vitro. Les 150 larves restantes seront réparties de la manière suivante : 75 pour la quantification de Borrelia et 75 pour les études d'immunité des tiques, en lien avec l'immunisation des souris et l'infection. Pour les 100 nymphes, 50 seront dédiées à chaque type d'étude similaire. Par conséquent, il faut prévoir 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux a été calculé pour être le minimum nécessaire à l’obtention des tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Les souris seront gardées un maximum de 6 jours, temps nécessaire pour que les nymphes complètent leur repas. Nous avons également calculé le nombre minimal de lapins requis pour obtenir le volume de sérum nécessaire à nos futures expérimentations in vivo.

Raffinement

Souris : Les souris seront hébergées en groupes de 5 dans leurs conditions habituelles, avec un enrichissement nécessaire à leur bien-être (carrés de coton, maison en plastique). Elles seront surveillées quotidiennement pour détecter tout signe de malaise ou de symptôme. L’application des capsules contenant les tiques sur le dos des souris se fera sous anesthésie pour minimiser le stress et l'inconfort associés à cette manipulation. Une fois les capsules fixées, les souris seront placées dans des cages individuelles, car elles ont tendance à retirer les capsules des autres et à consommer les tiques. Malgré cet isolement, elles continueront de bénéficier des mêmes conditions d'enrichissement (carré de coton, maison en plastique), et, pour pallier leur isolement, des enrichissements supplémentaires, tels que des bâtonnets à ronger, seront ajoutés. Des points limites stricts seront appliqués pour identifier rapidement toute détérioration de leur état de santé, et les souris présentant des signes de douleur ou de détresse inhabituels seront retirées de l'expérimentation et recevront des soins appropriés. Lapins : À leur arrivée, les lapins seront logés dans des cages équipées de plateformes de repos et d’enrichissements spécifiques à leur bien-être, comme des balles, des branches en bois à ronger et des végétaux. Ils seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation pour garantir leur santé et leur confort. Étant sensibles aux manipulations, les lapins seront régulièrement contrôlés et manipulés par le personnel soignant et les expérimentateurs afin de les habituer à la présence humaine et aux différentes interventions. Avant les prélèvements sanguins, les lapins seront familiarisés avec les expérimentateurs pour réduire leur stress, et des techniques de contention douce seront appliquées pendant les prélèvements. L'anesthésie sera utilisée si nécessaire pour toute intervention susceptible de causer de la douleur ou un inconfort important. Des points limites spécifiques seront appliqués pour détecter tout signe de stress ou d'inconfort. Si un lapin montre des signes d'inconfort significatif, il sera retiré de l’étude et recevra des soins adaptés

Choix des espèces

On utilisera trois variantes de souris et une de lapins : Souris très sensibles aux germes, comme la bactérie Borrelia spp, transmise par les tiques. Elles sont donc utilisées pour produire des tiques infectées par cette bactérie. Souris génétiquement modifiées pour qu'elles ne puissent pas produire le sucre α-Gal, mais elles peuvent créer des anticorps spécifiques contre celui-ci. Elles sont importantes pour étudier comment le corps réagit à cette molécule. Souris non modifiées génétiquement. Elles sont utilisées comme groupe de contrôle pour comparer les résultats avec ceux des autres souris et obtenir des résultats plus proches des animaux sauvages. Lapins blancs de Nouvelle-Zélande : Ils sont utilisés car ce sont les meilleurs animaux pour prélever de grandes quantités de sang en une seule expérience, permettant d'obtenir suffisamment d'anticorps contre l'α-Gal pour les recherches. Les souris auront entre 7 et 8 semaines d'âge, et les lapins entre 4 et 5 semaines. Avant de commencer les expériences, une semaine d'adaptation sera accordée aux animaux pour qu'ils s'habituent à leur environnement.

Jusqu'à vingt et une administrations de composés espacées de huit heures, et jusqu'à dix prélèvements de sang obtenus en sectionnant la pointe de la queue. 1 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour recueillir les échantillons. Une dermatite est provoquée par des agents sensibilisants, avec rougeur, gonflement et démangeaisons que les animaux grattent, pour cribler des candidats médicaments anti-inflammatoires. Les anesthésies répétées qu'imposent les applications sur la peau créent une résistance progressive au produit, et le porteur les décrit comme une source importante de stress liée à l'odeur de l'anesthésiant et à la perte de repères au réveil. Il écrit renoncer à toute grille de score parce qu'elle obligerait à maintenir la souffrance de l'animal pour en suivre l'évolution, et prévoit de tuer les souris dès qu'un écart de poids de 2 à 5 % apparaît.

Objectifs

La prévalence (nombre de patients atteints dans la population générale) de la dermatite atopique (eczéma) a triplé en 30 ans dans les pays industrialisés. En France, près de 15% des enfants seraient affectés. La dermatite atopique est une affection de la peau chronique, prurigineuse et inflammatoire, alternant périodes de poussées et périodes d’accalmie. La dermatite atopique se manifeste par une altération de la barrière épidermique qui rend la peau sèche et anormalement sensible à toutes les agressions et est accompagnée d’une sensibilisation aux allergènes, avec une réaction immunitaire excessive. Il n’existe pas actuellement de traitement curatif contre la DA. Les traitements sont exclusivement préventifs (prévention des poussées) et symptomatiques (anti-inflammatoire et antihistaminique + antibiotique et antiviraux en cas de complications). Les anti-inflammatoires utilisés actuellement, les corticoïdes, présentent de nombreux effets indésirables. Il apparaît donc nécessaire de mettre au point de nouveaux traitements ciblant la dermatite atopique. Notre objectif est d’évaluer l’activité anti-inflammatoire de produits pharmacologiques, candidats-médicaments, dans un modèle de dermatite atopique chez la souris. Le développement de candidats-médicaments à partir de modèles moléculaires et cellulaires disponibles requiert une transposition dans des modèles intégrés et complexes. C’est pour cette raison qu’une approche chez la souris est nécessaire pour s’assurer de l’activité anti-inflammatoire des nouveaux candidats-médicaments préalablement sélectionné sur les tests alternatifs disponibles.

Bénéfices attendus

La mesure de l’activité anti-inflammatoire des composés dans un modèle de dermatite permettra de sélectionner les plus efficaces, capables de contrôler l’inflammation locale et promouvoir une résolution de l’inflammation afin de limiter les atteintes des tissulaires sans perturber l’immunité spécifique. Ce projet permet de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs afin de poursuivre leur développement pour le traitement des patients atteint de dermatite.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour l'administrer les composés étudiés. Les composés étudiés seront administrés aux animaux vigils (quelques secondes) 1 à 21 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et pour les administrations intradermiques et les applications topiques. Afin de suivre la concentration sanguine du composé et/ou contrôler les constantes biologiques et les biomarqueurs de l’inflammation au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue sur animaux vigils et sur une période minimale de 72h.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des animaux entrainent un stress léger et de courte durée. Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre des prélèvements sanguins de qualité, rapidement et sans contention. Les anesthésies répétées pour les applications topiques entrainent une résistance progressive à l’anesthésique et sont une source importante de stress des animaux en raison de la forte odeur de l'anesthésiant et de la perte des repères au réveil. L’administration des agents sensibilisants entraine une inflammation locale (rougeur, gonflement) et des démangeaisons suivies de « grattages » de la zone inflammatoire par l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments et les produits pharmacologiques auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire l’innocuité d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les composés les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 (groupes contrôles) à 8 animaux par groupe permettent une analyse statistique efficace des résultats pour la mise en évidence d’un effet anti-inflammatoire ≥30% sur le recrutement des cellules inflammatoires dans la peau ou la production d’anticorps circulant, avec une incertitude inférieure à 5%. Pour les études qui requiert la mesure de la formule sanguine (NFS) pour le suivi des populations leucocytaires dans le sang 8 animaux pour chaque groupe sont nécessaires pour mettre en évidence des variations généralement plus faible. Les tests statistiques utilisés pour les analyses sont dépendant des paramètres analysés. Le choix du test adapté est dicté par la structure des échantillons. D’après notre expérience antérieure et l’évolution des pratiques, nous estimons que 5 composés seront testés chaque année sur une période de 5 ans pour un maximum de 1100 souris dans le cas le plus défavorable.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification », d’un igloo, d’une roue, d’une balançoire et de bâtonnets à ronger. Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine en cas de contraintes temporelles (délai de livraison, délai trop court avant une période de travaux ou avant le vide sanitaire suivant…). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. Les souris seront anesthésiées pour permettre les administrations intradermiques et les applications topiques. Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Un renforcement positif est mis en place après chaque administration par l’ajout de récompenses alimentaires dans la cage (« Mini-gâteries »,). Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des composés, pour mettre en évidence tous signes de toxicité qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La mesure de l’activité anti-inflammatoire est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée dans le cadre du développement des candidats-médicaments et des produits pharmacologiques. Enfin, ce choix permet aussi de bénéficier des nombreux outils disponibles pour cette espèce permettant de caractériser les réponses immunitaires et inflammatoires, mais également le recourt à des animaux génétiquement modifiés dont la disponible est bien plus élevée chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal. La grande majorité des études seront conduites sur des animaux adulte (> 8 semaines) mais certaine études requiert des animaux plus jeune, à l'épiderme plus fin, perméable et sensible afin de mimer au mieux les développements ayant pour cible les enfants.

Une injection intraveineuse unique de vecteur viral, sept à dix prélèvements de sang sous anesthésie selon la durée du suivi, et deux à trois gavages par sonde rigide à bille. 200 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des analyses post-mortem. Il s'agit de savoir si un vecteur de thérapie génique atteint les neurones et les cellules gliales de l'intestin, et si le microbiote intestinal modifie l'efficacité du transfert de gènes. Le porteur écrit que l'injection intraveineuse d'un tel vecteur chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable, alors qu'il fonde le projet sur une lignée de rats dont 30 % développent une réponse immunitaire contre le vecteur, et conclut que le modèle animal demeure "incontournable".

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Malheureusement, l’utilisation de fortes concentrations d’AAVr chez l’Homme peut parfois induire une réponse immunitaire importante entrainant une perte d’efficacité du traitement et dans certains cas des effets secondaires graves voire létaux. Le microbiote intestinal exerce une influence sur plusieurs fonctions physiologiques de l’hôte et en particulier sur les fonctions digestives (immune, barrière épithéliale, système nerveux entérique (SNE)). L’ensemble de ces fonctions/composantes cellulaires contribue à l’efficacité ou représente une cible des thérapies géniques. De plus des études récentes suggèrent une modification de la réponse de la thérapie génique par le microbiote intestinal. Dans ce contexte, la capacité de la thérapie génique à cibler les constituants cellulaires du SNE (neurones ou cellules gliales) ainsi que le rôle joué par le microbiote intestinal en tant qu’acteur de l’efficacité de ce ciblage reste à définir. Dans ce projet nous proposons d’étudier la relation entre le microbiote/SNE et les vecteurs AAV chez le rat pour : - Evaluer la capacité de l’AAV à transduire le système nerveux entérique et notamment les cellules gliales et les neurones entériques. Ceci permettrait d’ouvrir des perspectives thérapeutiques ciblant les atteintes du SNE observées dans de nombreuses pathologies chroniques digestives ou extradigestives ou dans des maladies rares altérant les fonctions digestives (Crohn, désordres intestinaux liés à la myopathie de Duchenne). - Déterminer si la composition du microbiote intestinal peut prédire l’efficacité du transfert de gènes ou contribuer à sa réponse thérapeutique. Un AAVr de sérotype 9 sera utilisé dans un premier temps car il présente un tropisme neuronal susceptible de transduire le SNE. Ce sérotype est actuellement utilisé en clinique et autorisé sur le marché pour le traitement de pathologies neuromusculaires. D’autres sérotypes tels que l’AAV6 ou l’AAVrh10 décrits pour la transduction de cellules gliales et neuronales pourront également être testés. Ce choix sera fait à partir de résultats obtenus in vitro sur des cellules gliales entériques de rats.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de documenter les interactions entre les vecteurs AAV, le système nerveux entérique et le microbiote.

Procédures

Dans ce projet et selon les groupes, les animaux seront suivis soit sur 1 mois, soit sur 3 mois. Les rats recevront une injection unique de solution saline ou d’un vecteur viral en Intraveineuse. La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront réalisés régulièrement pendant toute la durée du protocole soit 7 pour les suivis 1 mois et 10 pour les suivis 3 mois. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. Pour l’exploration fonctionnelle digestive, un gavage sera réalisé. Le temps d’intervention est d’une dizaine de secondes et sera réalisé 3 fois en tout, avant injection du vecteur puis à + 1mois et + 3 mois et 2 fois pour les animaux suivis 1 mois.

Impact sur les animaux

Pour les prélèvements sanguins et les injections de vecteur AAV en intraveineuse, les animaux seront sous anesthésie gazeuse. Les animaux ressentiront, au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguin et au point d’injection de l’intraveineuse due à la pénétration de l’aiguille. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur AAV chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Le gavage nécessite une contention de l’animal qui n’a donc plus de liberté de mouvement pendant la procédure qui va durer 10 secondes. De plus l’introduction de la sonde (rigide avec bille) génère également un inconfort pour lui. Néanmoins afin de générer un minimum d’inconfort et de stress, le geste sera pratiqué par un expérimentateur qui maitrise cette technique. Pour le prélèvement de sang, la toute petite incision pratiquée à l’extrémité de la queue avec l’aiguille 22G doit induire une douleur à l’animal. Cependant, l’application d'un anesthésique local avant le prélèvement va limiter cette douleur. Pour l'euthanasie, le prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave n’engendrera pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement se fera au moment de la mise à mort des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

Lorsque les stratégies de transfert de gène à l’aide d’AAV ont été transférées en clinique, des effets indésirables liés à une réponse immune ont été rapportés pouvant prévenir l’efficacité du transfert de gène. Ces effets n’avaient pas été documentés dans les modèles animaux. Depuis, nous avons développé au laboratoire un modèle de rat Sprague-Dawley, qui présente une réponse immunitaire anti-AAV pouvant prévenir l’efficacité du transfert de gène comme observée chez l’Homme. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire ces réponses immunitaires in vitro avec un système immunitaire combiné à des cellules d’autres organes (également transduits par le vecteur de thérapie génique). Le modèle animal demeure donc incontournable.

Réduction

Chez l’Homme, l’efficacité du transfert de gène varie d’un individu à l’autre et peut être liée au déclenchement d'une réponse immunitaire dirigée contre le vecteur. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire où environ 30% des rats injectés avec l’AAV9 perdent l’expression du transgène et présentent une réponse immunitaire dirigée contre le vecteur. Pour les analyses qui seront réalisées ici (biodistribution du vecteur, analyses biochimiques et analyses histologiques, analyse du microbiote intestinal), le nombre d’animaux par groupe (n=20) est donc basé sur nos expériences précédentes lors desquelles nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille.. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en termes d’animaux à inclure. Afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables, le nombre d’animaux par groupe devra être porté à au moins 20 .

Raffinement

Le bien-être animal passera par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Chez l’Homme, l’efficacité du transfert de gène varie d’un individu à l’autre et peut être liée au déclenchement d'une réponse immunitaire dirigée contre le vecteur. A l’heure actuelle, cette variabilité et la réponse immunitaire associée ne peut pas être reproduite in vitro dans les modèles organoïdes. Toutefois, elle a été constatée dans 2 études précédentes réalisées au laboratoire dans un modèle de rats SD. Après injection systémique d’AAV9, 30% des rats SD perdent l’expression du transgène et présentent une réponse immunitaire cellulaire et humorale dirigée contre le vecteur et contre le produit du transgène. A notre connaissance, le rat SD est le seul model de rongeur qui reproduit les observations faites chez l’Homme. Les rats seront injectés entre 7 et 8 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature.