Système immunitaire

Injection de cellules tumorales au premier jour, puis deux fois par semaine une injection de marqueur et une imagerie du corps entier sous anesthésie, pendant quatre semaines au plus : 894 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tumeurs pulmonaires qui se développent peuvent occasionner une gêne respiratoire. Toutes sont tuées pour analyses post-mortem, l'objet étant de comprendre comment des macrophages vieillissants favorisent le cancer du poumon chez les personnes âgées. Le calcul annoncé, vingt-quatre souris par condition et cinq génotypes comparés, laisse de côté les trente souris consacrées au seul choix de la lignée de cellules tumorales.

Objectifs

Le cancer du poumon est la première cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Il est particulièrement fréquent chez les personnes âgées : 50 % des cas sont diagnostiqués chez des patients de plus de 70 ans. Nous souhaitons donc étudier le développement du cancer du poumon dans le contexte du vieillissement. Les macrophages sont un type de cellules du système immunitaire inné, ce qui signifie qu'ils peuvent réagir rapidement et immédiatement à des menaces telles que l'invasion d'agents pathogènes. Il est également connu que les macrophages se trouvent souvent à proximité de tumeurs en développement. Récemment, des chercheurs ont découvert que dans le cancer du poumon, les macrophages sénescents s'accumulent et favorisent la croissance de la tumeur et la progression de la maladie. La sénescence est un état souvent observé dans les cellules des personnes et animaux âgées. Les cellules sénescentes cessent de se diviser, accumulent des dommages et changent de morphologie et de fonctionnalité. On ne sait toutefois pas comment ces macrophages "âgés" contribuent au développement des tumeurs pulmonaires. Pour répondre à cette question, nous utiliserons différents modèles génétiques de souris qui provoquent un vieillissement accéléré spécifiquement dans les macrophages pulmonaires, mais pas dans les autres cellules du tissu. Nous étudierons le développement de tumeurs chez ces souris et les caractéristiques différentielles des macrophages jeunes et vieux dans ce contexte. Globalement, ce projet vise à découvrir comment les changements liés à l'âge dans le système immunitaire inné contribuent au développement de tumeurs pulmonaires, ce qui ouvrira la voie à de futurs traitements anticancéreux potentiels adaptés aux personnes âgées.

Bénéfices attendus

Le cancer du poumon est responsable de la plupart des décès liés aux tumeurs dans le monde. L'âge élevé est l'un des principaux facteurs de risque de son développement et de sa progression, 50 % des cas étant diagnostiqués chez des patients âgés de plus de 70 ans. On sait que les macrophages pulmonaires sénescents, qui s'accumulent au cours du vieillissement de l'organisme, jouent un rôle pro-tumorigène dans le carcinome pulmonaire non à petites cellules, le type de cancer du poumon le plus courant. Mais jusqu'à présent, on ne comprend pas comment ils contribuent au développement de la tumeur. Dans ce projet, nous visons à identifier les caractéristiques des macrophages sénescents qui favorisent la croissance des tumeurs pulmonaires. Cela nous aidera à comprendre pourquoi les organismes âgés sont plus enclins à développer des tumeurs pulmonaires et quel rôle le système immunitaire inné joue dans ce processus. À long terme, ce projet permettra d'accroître nos connaissances sur la manière de prévenir la progression du cancer dans des conditions de vieillissement du système immunitaire et de développer des options de traitement immunothérapeutique spécifiquement adaptées aux personnes âgées. Étant donné que les macrophages sont des cellules résidentes dans tous les tissus et que le vieillissement est un facteur de risque pour de nombreuses maladies, nous nous attendons à ce que ce travail ait un large impact et soit pertinent au-delà du cancer du poumon.

Procédures

Chaque animal recevra une injection de cellules tumorales au début de l'expérience (durée du geste : environ 10 secondes). À partir du troisième jour après l'injection, la taille de la tumeur sera contrôlée deux fois par semaine, ce qui nécessite l'injection d'un produit de marquage (durée du geste : inf à 10 sec) et la réalisation d'une imagerie non invasive du corps entier sous anesthésie (durée de l’anesthésie :10 minutes). La durée maximale de l'expérience est de 4 semaines.

Impact sur les animaux

L'injection intraveineuse de cellules tumorales et l'injection de produits de marquage pour l’imagerie peuvent provoquer une douleur légère et transitoire au point d'injection. Les animaux auxquels on a injecté des cellules tumorales développeront des tumeurs pulmonaires qui pourront occasionner une gêne respiratoire.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nous nous intéressons à la réponse systémique du système immunitaire au développement de tumeurs pulmonaires. Cette réaction ne peut être étudiée que dans un organisme entier, avec une circulation lymphatique et sanguine intacte, une hématopoïèse active (formation de nouvelles cellules immunitaires par la moelle osseuse) et des poumons fonctionnels. l De nombreuses méthodes requises pour le projet proposé ainsi que des modèles génétiquement modifiés pour nos protéines d'intérêts ne sont disponibles et établis que chez la souris.. En outre, les parallèles entre le vieillissement murin et humain, la composition immunitaire du microenvironnement tumoral et les types de cellules immunitaires dans les poumons sont bien établis dans la littérature, ce qui fait de la souris un organisme modèle approprié. Dans la mesure du possible, nous utiliserons des alternatives in vitro à l'expérimentation animale, telles que la co-culture de macrophages et de cellules tumorales. Nous disposons déjà de premiers résultats utilisant ce système in vitro (sphéroïdes, formés à partir de la co-culture de cellules tumorales et de macrophages), qui renforcent nos hypothèses. Cependant, ce système est trop simplifié pour comprendre pleinement les adaptations que les macrophages du poumon et d'autres composants du système immunitaire subissent in vivo en réponse au développement de tumeurs. En outre, nous prévoyons de remplacer la microscopie in vivo par des approches d'imagerie ex vivo, qui réduisent le nombre de procédures sur les animaux vivants, mais qui nécessitent toujours l'induction et la surveillance de tumeurs in vivo.L'expérimentation animale ne peut donc pas être entièrement remplacée par des alternatives in vitro.

Réduction

Nous avons déterminé, sur la base d'expériences déjà réalisées avec des tests statistiques, que nous avons besoin de 24 souris par condition expérimentale. Nous les répartirons en 3 groupes d'expériences indépendantes de 8 animaux chacune afin d'obtenir des résultats aussi robustes que possible. Nous étudierons 5 génotypes différents ainsi que des souris non modifiées génétiquement, y compris des contrôles correspondants pour chacune de ces conditions. Nous aurons besoin de 3 séries d'expériences pour l'analyse des tissus post-mortem. De plus, nous devons tester trois lignées différentes de cellules tumorales pour trouver celle qui donne le meilleur résultat expérimental. Cela nécessite 30 souris. Pour réduire le nombre d'animaux à utiliser, nous employons un plan d'étude longitudinal basé sur l'imagerie par bioluminescence pour mesurer la croissance tumorale, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Pour l'analyse post-mortem, le tissu pulmonaire sera réparti entre plusieurs méthodes d'analyse afin de permettre une utilisation optimale de chaque animal impliqué dans l'expérimentation animale.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. La lignée cellulaire tumorale qu’on utilisera permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence (mesure non invasive, faite deux fois par semaine, pendant maximum 4 semaines). Nous pèserons également les souris deux fois par semaine pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction d’une grille de score adaptée à notre projet. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.

Choix des espèces

Les souris sont le modèle de choix pour les expériences dans le domaine de l'immunologie des tumeurs. Cette recherche nécessite un contexte génétique bien défini et des modèles génétiquement modifiés, qui ne sont disponibles que chez cette espèce. En outre, les parallèles entre le vieillissement murin et humain, la composition immunitaire du microenvironnement tumoral et les types de cellules immunitaires dans les poumons sont bien établis. Tous ces éléments font de la souris le seul organisme modèle approprié pour notre projet. Des souris adultes seront utilisées pour toutes les expériences, ce qui est nécessaire pour étudier un système immunitaire mature. Comme nous étudions les effets du vieillissement sur le développement des tumeurs, nous utiliserons des souris dont l'âge se situe entre 8 semaines (jeunes adultes) et 24 mois (adultes âgés).

4 524 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont greffées sous la peau du flanc, puis viennent des injections dans l'abdomen quatre jours par semaine pendant trois semaines, et pour un groupe une irradiation de sept minutes trente sur animal vigile suivie d'une greffe de moelle osseuse. Le porteur écrit que les traitements ne provoquent pas d'effets indésirables, et indique par ailleurs que l'irradiation entraîne diarrhée et perte de poids pendant plusieurs semaines et qu'une nécrose peut apparaître sur la tumeur en fin d'expérience. Aucun antalgique n'est prévu pour ces souris porteuses de tumeurs, le porteur s'appuyant sur des recommandations internationales en cancérologie expérimentale pour leur substituer un suivi rapproché et des points limites précoces.

Objectifs

Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles patrouillent dans les tissus qu’elles échantillonnent à la recherche de signaux de danger (infection, tumeur), et sonnent l’alerte en activant dans les ganglions lymphatiques les lymphocytes T spécifiques de l’origine du danger. La mise en place d’une réponse des lymphocytes T est essentielle à la lutte contre les tumeurs, Une réponse immunitaire efficace et les stratégies actuelles d’immunothérapies visant à augmenter la réponse T reposent donc sur deux fonctions essentielles des cellules dendritiques : la migration et l’échantillonnage. Nous avons identifié une protéine qui est naturellement activée par les signaux de danger dans les cellules dendritiques au cours d’une réponse immunitaire, et qui augmente leur migration in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée chimiquement par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (thérapies qui stimulent le système immunitaire afin d'éliminer la tumeur). . Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seul ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si la molécule A1 peut être utilisée pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminants dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Dans un premier lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 3 semaines au maximum. Dans un second lot, des souris vigiles seront irradiées pendant 7min30. Les souris seront anesthésiées pour recevoir une injection de cellules de moelle osseuse (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois au– durée anesthésie inf 5 min) Puis les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 2 semaines. Dans un 3ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour pendant 2 jours. Un prélèvement de sang par la sera effectué juste avant la mise à mort des souris. Dans un 4ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules fluorescentes seront injectés aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 6ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie

Impact sur les animaux

Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements sont non toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris. Leur administration entrainera une légère douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même.

Devenir

Dans toues les procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes moléculaires associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre projet est basé sur une suite d’étapes expérimentales dont les résultats conditionnent le passage à l’étape suivante. Nous ne procéderons à l'étude de la manière dont la réponse immunitaire est précisément affectée par le traitement que dans le groupe de souris traitées pour lesquelles nous observons un effet positif du traitement sur la croissance de la tumeur. Les résultats seront analysés par des approches statistiques.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (poids, aspect et comportement). En effet, conformément aux guides de la Commission Européenne et aux recommandations internationales en cancérologie expérimentale, le raffinement de ces modèles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché pour déterminer des points d’arrêt les plus précoces possibles. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de mettre en place des points-limite adaptés. L’atteinte d’un point-limite conduira à la mise en place de soins de support voire à la mise à mort de l’animal si la souffrance ne peut être soulagée. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation. Un apport de fluide injectable sera également assuré pour en cas de déshydratation. Les gestes nécessitant une immobilisation de l’animal seront effectués sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de par la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.

Rasées sur le dos puis exposées à un allergène, par patch répété six fois ou par solution appliquée cinq jours d'affilée sur trois cycles, 1 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur décrit une peau qui desquame, rougit, s'épaissit et sèche, des souris qui se grattent, se lèchent et peinent à se toiletter, avec une perte de poids de 5 à 10 % la première semaine. 180 d'entre elles reçoivent en plus un traitement par gavage, et 150 une injection dans le péritoine. Il écrit néanmoins que les applications cutanées "n'engendreront pas de nuisances particulières" puisque les animaux sont anesthésiés au moment de la pose.

Objectifs

Augmenter le portefeuille des approches thérapeutiques est crucial pour répondre aux besoins cliniques et proposer des traitements personnalisés aux patients allergiques tels que les patients atteints de dermatite atopique. La dermatite atopique est l’affection cutanée inflammatoire chronique la plus courante avec une prévalence en forte croissance. Elle se caractérise par un prurit, de l’inflammation et un eczéma et une hypersensibilité à des substances environnementales inoffensives. L'étiologie de la dermatite atopique n’est pas complètement comprise, mais de nombreux facteurs (génétiques, environnementaux, immunitaires ou structurels) contribuent au développement des lésions cutanées. La dermatite atopique est caractérisée par l'infiltration de cellules immunitaires, notamment des lymphocytes T qui par leur présence contribuent à la rupture de la barrière épidermique et à l'épaississement de la peau. Il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu qui induisent le recrutement de ces lymphocytes T au niveau de la peau pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients. Pour ce faire, nous utilisons des modèles expérimentaux de dermatite atopique chez la souris qui miment des situations physiopathologiques des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet propose de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de la maladie de dermatite atopique, notamment liés aux lymphocytes T. La dermatite atopique est traitée par des médicaments anti-inflammatoires topiques et systémiques sans réel effet curatif sur la maladie de type modérée à sévère. Il apparait donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et de nouveaux médicaments plus spécifiques et plus efficaces. Ainsi, ce projet permettra d’identifier et de caractériser de nouvelles pistes utilisables pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. L’enjeu socio-économique des pathologies allergiques et notamment la dermatite atopique nécessite le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ce type de pathologies. Nous anticipons que la réalisation de ce projet pourrait donc avoir des répercussions en santé humaine sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de dermatite atopique.

Procédures

Pour les souris où la dermatite atopique est induite sur le dos des souris (1080 souris), les animaux seront rasés et l’application de patch (pour 660 souris sur les 1080) ou une solution (pour 420 souris sur les 1080) contenant l’allergène inducteur de la dermatite sera déposé sous anesthésie générale volatile (durée intervention : 5min/animal). L’application de patch sera répétée 6 fois au total (pour 450 sur 660 souris recevant des patchs). Pour les 420 souris recevant une solution d’allergène sur le dos et les 420 souris recevant une solution d’allergène sur les oreilles, il y aura au total 3 cycles de 5 jours consécutifs d’application sous anesthésie volatile (durée intervention : 5min/animal). Pour les modèles de dermatite atopique induite après transfert adoptif de cellules (150 souris), il y aura une seule injection au niveau du péritoine (durée intervention :

Impact sur les animaux

Les protocoles de développements d’inflammations cutanées de dermatite atopique pourraient conduire à une perte de poids de 5 à 10% transitoires des animaux sur la première semaine ainsi qu’une baisse légère d’activité des animaux. Le développement de l’inflammation cutanée attendue au cours du protocole seront responsables de desquamation, de rougeurs, de sécheresse et d’épaississement de la peau. Les souris peuvent également présenter des phénomènes de grattements/léchages sur les zones traitées et être gênées pour leur toilettage. Les applications cutanées n’engendreront pas de nuisances particulières car les animaux seront anesthésiés et surveillés jusqu’à leur réveil.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans les procédures expérimentales seront euthanasiés en fin d'étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

L'étude des mécanismes physiologiques reliés à l'immunité nécessite des modèles in vivo capables d’intégrer différents processus cellulaires telles que l’activation des cellules immunitaires suite à des stimulation de l’environnement, la migration cellulaire et l'infiltration dans différents tissus, notamment la peau. Il n'existe pas actuellement de méthodes alternatives à cette étude in vivo pour l'obtention de résultats scientifiques exploitables, pertinents pour la pathologie humaine. Le remplacement par substitution n’est actuellement pas envisageable, aucun modèle cellulaire in vitro ne permet de mener les études proposées, puisque ces mécanismes impliquent des micro- et macro-environnements cellulaires, incluant de nombreux types cellulaires ainsi que le système vasculaire de la peau. Cependant, ce projet est basé sur une étude de preuve de concept réalisée in vitro qui justifie cette étude in vivo. D’autre part, ce projet utilise des modèles d’invalidation de gène chez la souris. C’est pourquoi ce projet de recherche ne peut se faire qu’en utilisant la souris comme modèle d’étude afin de comprendre les mécanismes d’activation des cellules immunitaires en condition d’inflammation cutanée. Les résultats de ces travaux devraient contribuer à optimiser les traitements chez les patients.

Réduction

Dans les différentes expérimentations et pour réduire la variabilité expérimentale, la détermination sexuelle étant importante, les souris des 2 sexes seront utilisés, mais indépendamment. Nous privilégierons des lots de souris issues de mêmes portées avec le fond génétique le plus proche possible en vu de diminuer également la variabilité expérimentale. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux. D’autre part, nous optimiserons l’utilisation de chaque animal et maximiserons le nombre de données à partir d’un seul animal. Nous mettrons également en banque des données utilisables a posteriori par d’autres utilisateurs notamment des blocs de tissus, des analyses de large base de données. Les niveaux de significativités permettant la comparaison entre les échantillons seront déterminés par un modèle statistique. Nous utiliserons pour chaque procédure le nombre minimal d’individus permettant la réalisation de ce test statistique, tout en assurant la fiabilité des résultats (reproductibilité et significativité). Nous mettons en place une stratégie longitudinale de mesures répétées de l’épaississement de l’oreille permettant d’appliquer un modèle statistique au cours du temps plus puissant.

Raffinement

Les points limites ont été anticipés mais toute souris ayant atteint un point limite sera euthanasiée. Tout traitement anti-inflammatoire n’est pas compatible avec les études menées (perturbation de la réponse immunitaire et inflammatoire) cependant un traitement visant à réduire ou supprimer la douleur (par exemple, par traitement avec des analgésiques) sera proposé. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités d'amélioration des procédures. Le design expérimental a été établi en vue de limiter au maximum toute gêne ou souffrance de l’animal, comme le nombre d’application cutanée. D’autre part, les conditions d’hébergement permettent l’utilisation de méthodes d’enrichissement adaptées et les animaux seront suivis visuellement quotidiennement en particulier au niveau des zones cutanées traitées et des oreilles.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est un modèle adapté à la complexité de la physiologie humaine, elle a de grandes similitudes génétiques avec l’homme en particulier concernant le système immunitaire et la peau. La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines comme la dermatite atopique. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. La souris est aussi le modèle de choix pour réaliser l’invalidation de gènes spécifiques afin d’en étudier la fonction. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux comme les anticorps qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Enfin, il est important de mentionner que les modèles expérimentaux proposés miment des situations physiologiques et pathologiques de l’Homme. L’ensemble de ces critères font que la souris est le modèle le mieux adapté à notre activité d’expérimentation animale. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées pour réaliser les différents traitements proposés dans ces procédures expérimentales correspondant au stade optimal de développement pour étudier les réponses immunitaires en particulier dans la dermatite atopique à l’âge adulte.

Jusqu'à huit poses de ligature autour des dents, renouvelées tous les trois jours sous anesthésie générale profonde, plus trois radiographies 3D des mâchoires sous anesthésie gazeuse et une dernière anesthésie avant la mise à mort. 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à 1, 4, 14 ou 28 jours pour prélever leurs tissus. La moitié des ligatures est imbibée de bactéries agressives pour le parodonte, et le porteur signale des douleurs gingivales postopératoires, des abcès possibles et une baisse de la mastication et de la prise de poids. Il estime, "par nos expériences passées", que huit animaux par groupe suffisent à obtenir une différence statistique, alors que les 128 souris se répartissent en huit groupes de seize.

Objectifs

La parodontite est une maladie fortement prévalente qui entraine une destruction des tissus de soutien des dents, et des édentements précoces. Elle est déclenchée par un déséquilibre de la flore bactérienne. La concentration de certains globules blancs, comme les neutrophiles, dans le tissu conjonctif est en corrélation avec la gravité de la parodontite. Cependant, leur fonction et leur distribution spatio-temporelle dans les tissus de la parodontite restent inconnues. Notre projet vise à étudier le rôle des neutrophiles à plusieurs étapes du développement de la maladie, dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris. La parodontite sera induite sous anesthésie générale profonde pendant 1, 5, 14 ou 28 jours, selon un protocole validé dans la littérature. Nous caractériserons radiographiquement l’évolution de la destruction du parodonte chez des souris au cours du temps, puis analyserons les fonctions des neutrophiles. Le projet se déroulera sur un an et nécessitera 128 souris.

Bénéfices attendus

Les neutrophiles sont les globules blancs les plus abondants et les premiers à intervenir lors d’une inflammation gingivale. L’analyse de l’évolution des fonctions de ces cellules au cours de la parodontite est cruciale pour mieux comprendre la pathologie. Grâce à ce projet, nous espérons découvrir de nouvelles cibles de diagnostic et de traitement de la parodontite.

Procédures

Les souris seront soumises au modèle de parodontite : pose d’une ligature (5 minutes) par souris sous anesthésie générale profonde (maximum 8 anésthésies + 1 anésthésie avant la mise à mort, par animal), renouvelés tous les 3 jours pendant 1, 4, 14 ou 28 jours (maximum 8 poses de ligature). Avant et à la fin de la mise en œuvre de ce modèle, une radiographie 3D (maximum 3 radiographies) des machoires sera réalisée pour toutes les souris sous anesthésie légère gazeuse (maximum 3 anésthésies par animal, durée 5 minutes/souris). Nous aurons alors 8 groupes de souris : (4 groupes avec une ligature simple, 4 goupes avec une ligature imbibée de bactéries agressives pour le parodonte). Les animaux seront mis à mort à 1, 4, 14 ou 28 jours pour évaluer l’évolution des fonctions des neutrophiles dans la parodontite avec ou sans bactérie agressive.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour l’animal pourraient être : - exceptionnellement pour les souris recevant la pose de ligature : des douleurs gingivales post-opératoires, voir des abcès gingivaux, diminuant la mastication et la prise de poids des animaux. - pour tous les animaux : une hypothermie au cours de l’anesthésie. - pour tous les animaux : une résistance à l’anesthésie.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux sont mis à mort, permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.

Remplacement

Nous développons une recherche sur modèle expérimental chez le petit animal, car il n’existe pas d’autres méthodes alternatives (in vitro, in silico) pour l’étude de la parodontite dans son ensemble, et la souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de cette maladie. Le modèle étudié permet de reproduire certaines caractéristiques de la pathologie humaine telles que l'inflammation et la perte osseuse.

Réduction

Nous utiliserons une lignée consanguine dont le fond génétique est contrôlé et homogène pour minimiser la variabilité des phénotypes et donc le nombre d’animaux à utiliser. Afin de minimiser le nombre d’animaux, une étude de puissance statistique a été réalisée pour le modèle de parodontite. Par nos expériences passées, il est estimé qu’une réponse sur un nombre de 8 animaux est suffisante pour obtenir une différence statistique.

Raffinement

Afin d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur les éléments suivants sont mis en place : (1) Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, en milieu enrichi pour minimiser leur stress (2) Avant chaque examen radiologique, sans intervention chirurgicale, une anesthésie légère mais dont l’efficacité est validée, sera effectuée (3) Avant chaque pose de ligature les souris seront anesthésiées profondément (4) Après chaque anesthésie, les souris seront placées dans un environnement chauffé et surveillées jusqu’à leur réveil (5) Les animaux seront surveillés le lendemain de chaque intervention ainsi que tous les 2 à 3 jours par le personnel dédié de l'animalerie ou/et les responsables de projet (6) Des points limites ont été établis. (7) La mise à mort anticipée sera effectuée selon les méthodes réglementaires, en cas d’atteinte de points limites. (8) Une analgésie est administrée avant la mise à mort

Choix des espèces

Le modèle de parodontite induite par ligature chez la souris est un modèle d’étude pertinent permettant de reproduire plusieurs caractéristiques de la pathologie humaine (inflammation et resorption osseuse). Ce modèle est validé par la littérature scientifique. 3 mois – âge adulte avec croissance des maxillaires achevée

3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune manipulée moins d'une minute tous les deux à trois jours pendant trois à trente jours de traitement. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et comprennent une injection de cellules tumorales sous la peau, entre les côtes ou dans une veine, un suivi de la croissance tumorale au pied à coulisse ou par bioluminescence sous vingt minutes d'anesthésie, des injections intrapéritonéales trois fois par semaine et des gavages de solutions médicamenteuses ou bactériennes. Le porteur indique que la croissance tumorale et les traitements peuvent faire perdre du poids aux souris, et que les sites d'injection peuvent s'infecter. L'objet du projet est de relier la composition du microbiote intestinal à la réponse aux immunothérapies, et le porteur conclut à la "nécessité d'utiliser un organisme entier" dans lequel les cellules immunitaires circulent.

Objectifs

La dysbiose du microbiote intestinal a été reconnue comme une des caractéristiques du cancer impliquée dans le dialogue cancer-immunité au niveau clinique. Pour cette raison, nous souhaitons identifier les produits microbiens (tels que les métabolites) présents dans l’intestin afin d’étudier leur impact sur le cancer. L’objectif de ce projet est d’évaluer si la dysbiose du microbiote intestinal induit des changements métaboliques et immunitaires, à la fois dans l'intestin et au niveau systémique, qui peuvent être pertinents pour améliorer la prise en charge du cancer. Il s’agit d’un nouveau concept qui mérite une recherche approfondie.

Bénéfices attendus

Le cancer du poumon est le deuxième cancer le plus fréquent chez l’homme, le troisième chez la femme, ce qui en fait un problème majeur de santé public. Ainsi il est important d’étudier les mécanismes de réponse aux traitements dans ce type de cancer. Dans cette étude, nous espérons que la dysbiose intestinale identifiée pourra être utilisée en tant que biomarqueur prédictif de la réponse au traitement dans le cancer L’ensemble de ce projet de recherche a pour finalité essentielle d’améliorer la prise en charge des patients et les effets des immunothérapies.

Procédures

Tous les animaux seront manipulés brièvement (moins d’une 1 minute) tous les 2 à 3 jours pour mesurer les tumeurs ou les co-traitements. Deux tiers des souris recevront des traitements dans l’eau de boisson qui seront changés tous les 2 à 3 jours. La durée des traitements variera entre 3 à 30 jours. Certaines souris seront soumises à une expérience de croissance tumorale : 1 injection en sous-cutanée ou en intercostale sous anesthésie (3 à 5 minutes pour chaque souris) ou 1 injection en intraveineuse sur animal vigile (environ 3 minutes par souris). Une heure avant et huit heures après l’injection des cellules en intercostale, les souris recevront un analgésique. La croissance tumorale sera suivie par mesure manuelle (pied à coulisse) ou par bioluminescence. Cette dernière méthode nécessitera d’endormir pendant 20 minutes la souris qui sera placée sur un tapis chauffant. D’autres souris seront soumises à une administration de molécules thérapeutiques par voie intra-péritonéale sur animal vigile. Un tiers des souris recevront 3 injections par semaine et le reste des souris recevront 4 injections au total pendant l’expérience. Certaines souris seront soumises à l’administration d’une solution médicamenteuse ou bactérienne, par gavage sur animal vigile (3 administrations par semaine). Du sang sera prélevé une fois sur l’animal vigile (3 à 5 minutes) pour certaines expériences afin d’évaluer les changements métaboliques face aux traitements.

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent engendrer un stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. L’anesthésie peut induire un stress thermique. Les gavages répétés peuvent entrainer une certaine contrainte. Un prélèvement sanguin sur animal vigile effectué pourrait engendrer une légère douleur et la formation d’un hématome. Par ailleurs, la croissance tumorale et l’administration de traitements peuvent entrainer une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux.

Devenir

Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. Chaque procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus, sang et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude peut exclusivement être conduite in vivo, car il n’y a pas de modèles alternatifs permettant d’étudier l’efficacité des traitements anticancéreux et de confirmer leur action via l’activation du système immunitaire. Il est donc essentiel d’utiliser un modèle reproduisant au mieux l’environnement tumoral et le fonctionnement du système immunitaire. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les molécules du système immunitaire peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, des groupes de 10, 20 ou 40 souris (selon les procédures) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés, soit au total 3360 souris. Nous appliquerons des tests statistiques appropriées à notre modèle d’étude pour comparer les effets étudiés entre les groupes. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Les échantillons seront partagés avec des collaborateurs.

Raffinement

Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress. Pour minimiser leur stress, plusieurs souris seront logées dans la même cage, offrant un environnement social au calme et un espace vital suffisant. Les conditions d’hébergement respecteront les normes conventionnelles, comprenant un régime alimentaire normal disponible en permanence et un accès libre à l’eau. Un milieu enrichi adapté est prévu: dans les cages il y aura des nids et des tunnels en carton. Le comportement général des animaux sera surveillé régulièrement et leur poids sera mesuré avant le début des traitements, ainsi qu’une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. L’anesthésie sera effectuée lors des injections des cellules tumorales. Une heure avant et huit heures après l’injection des cellules en intercostale, les souris recevront un analgésique. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte des points limites préétablis.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. Tout d’abord, la souris est un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à celui de l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent. De plus, sa génétique est bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. L’utilisation de la souris présente plusieurs avantages: nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Nous utiliserons des animaux témoins et transgéniques avec un phénotype normal. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire actif.

Pour entretenir un élevage de tiques au laboratoire, 20 lapines adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à raison d'une lapine par repas sanguin, trois à quatre fois par an pendant cinq ans. Chacune est tondue sur un quart de la surface du dos, porte deux capsules collées à la peau et un gilet vétérinaire, puis reste douze jours seule en cage pendant que les tiques la piquent par intermittence. Le porteur décrit un stress thermique le temps que les poils repoussent, une gêne de trois jours due aux capsules, un prurit de cinq à sept jours et un stress d'isolement sur toute la durée. 15 lapines seront proposées à l'adoption et 5 tuées pour prélèvement d'organes, le porteur indiquant qu'un gorgeur artificiel existe mais n'obtient que 25 % de repas réussis, ce qui rend selon lui le recours au lapin "encore nécessaire".

Objectifs

L’objectif de ce projet est l’utilisation de lapins pour entretenir et maintenir un élevage de tiques en laboratoire. Les tiques serviront par la suite à réaliser diverses expériences nécessitant l’utilisation de cet acarien hématophage (qui se nourrit exclusivement de sang). Nous utiliserons les tiques pour réaliser des infections expérimentales avec divers agents pathogènes afin d’analyser leur transmission et comprendre la relation entre l’hôte vecteur et le pathogène, pour développer de nouveaux protocoles d’identification de tiques par biologie moléculaire ou encore pour tester des molécules acaricides ou répulsives. Nous collecterons également du sang sur 5 lapins pour étudier le système immunitaire de ces animaux après un cycle de gorgement des tiques.

Bénéfices attendus

Les lapins qui serviront dans la procédure de ce projet, permettront d’entretenir un élevage de tiques dans le laboratoire. Les tiques sont de très importants vecteurs de micro-organismes pathogènes à la fois pour les animaux et pour l’être humain. Pour lutter contre les tiques il est indispensable de connaitre leur biologie et leur physiologie, ce qui ne peut se faire que grâce à un élevage maintenu en laboratoire. Outre l’acquisition de connaissances, cet élevage permettra aussi de tester de nouvelles molécules acaricides dites « naturelles » pour en évaluer l’efficacité. Enfin, nous utiliserons ces tiques pour mettre en place de nouveaux protocoles d’identification moléculaire des différentes espèces. Du sang sera collecté sur des lapins ayant eu une procédure de gorgement pour étudier l’immunité « anti-tique » développée chez ces lapins.

Procédures

Tonte de 5 minutes pratiquée avec une tondeuse électrique vétérinaire. Pose de deux capsules et d’un gilet (quelques minutes) sur la peau des lapins. Dépôt des tiques sur la peau du lapin, piqures par les tiques (12 jours de contact, piqure par intermittence). Prise de sang (quelques minutes).

Impact sur les animaux

Lors de la procédure expérimentale le lapin pourrait ressentir un stress physique de 5 minutes environ pendant la tonte qui doit être pratiquée avec une tondeuse électrique vétérinaire. Le lapin rasé au niveau du dos (25% de sa surface) pourrait ressentir un stress thermique le temps que les poils repoussent soit environ une douzaine de jours. Les deux capsules, où sont placées les tiques pendant la procédure, collées avec une colle latex non toxique, pourront gêner le lapin pendant environ 3 jours, le temps que l’animal s’habitue. Pour limiter l’accès du lapin aux capsules, il porte pendant la durée de la procédure un gilet vétérinaire qui peut occasionner un stress physique pendant 24 à 48h. Lors du dépôt des tiques sur la peau du lapin, un stress physique de quelques minutes pourra être ressentie. Un prurit pourrait apparaitre lors du repas sanguin des tiques soit environ 5 à 7 jours maximum. Les lapins seront hébergés individuellement le temps de la procédure de repas sanguin qui dure 12 jours, cela pourrait induire un stress d’isolement pendant la durée de cette période. Un stress physique d’environ 5 minutes sera ressenti pendant la prise de sang ainsi qu’une douleur de piqure de sévérité légère de courte durée (3 secondes).

Devenir

15 des 20 lapins seront proposés à l’adoption. 5 lapins seront mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer des organes.

Remplacement

Les tiques sont des animaux hématophages stricts : le repas sanguin sur un animal vertébré est donc obligatoire pour leur métamorphose et donc les maintenir en élevage. Un système de repas sanguin artificiel sera utilisé dès que possible afin de ne pas utiliser de lapin. A l’heure actuelle, ce n’est pas un système totalement optimal (on obtient une efficacité de repas sanguin de 25% en moyenne pour les tiques déposées sur le gorgeur artificiel) ce qui ne permet pas d’obtenir suffisamment de tiques pour maintenir une colonie ou lors d’un besoin ponctuel de nombreux individus. Le recours à un lapin est donc encore nécessaire. En revanche le repas sanguin sur ce système artificiel sera utilisé pour les larves (disponible en très grand nombre) et pour les infections expérimentales.

Réduction

Les tiques sont des acariens hématophages pour qui le repas sanguin est obligatoire pour leur métamorphose et donc pour entretenir un élevage Ces repas sanguins sont réalisés au laboratoire tous les 3 - 4 mois sur des lapins. Nous réaliserons donc entre trois et quatre procédures de repas sanguin par an pendant toute la durée de ce projet. Chaque procédure sera réalisée avec 1 lapin. Nous utiliserons donc au maximum pendant les 5 années du projet 20 lapins. Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur notre expérience de la conception d’études de ce type. Un système de repas sanguin artificiel permet de réduire le nombre de lapin dans ce projet. Pour ce dispositif les tiques sont placées dans un flacon de culture cellulaire percé sur sa face supérieure pour y adapter un gorgeur en verre. Ce gorgeur est fermé à sa base avec une peau de lapin pour que les tiques puissent se fixer et il est rempli de sang de mouton défibriné maintenu à 37°C qui sera changé deux fois par jour, pour que les tiques puissent se nourrir. Nous l’utiliserons pour le nourrissage des larves de tiques et lors des expériences d’infection expérimentales des tiques.

Raffinement

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. L’absence d’effets indésirables sera contrôlée au cours de l’expérience et des points limites spécifiques sont mis en place, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure. La présence d’un prurit important, une déshydratation, un comportement anormal des lapins seront surveillés comme des indicateurs d’effets indésirables. Si l’un de ces indicateurs est atteint, le lapin sortira de la procédure et le protocole de repas sanguin sera arrêté. La consultation du vétérinaire référent permettra de mettre en place un traitement correctif pour cet animal. Les lapins seront maintenus dans des portoirs conventionnels (le milieu est enrichi avec des jouets et des balles autoclavables, hébergement en cage collective pour éviter les stress d'isolement) permettant ainsi l’interaction entre les individus. Lorsque les lapins arrivent de chez le fournisseur, ils resteront 7 jours minimum dans la pièce d’hébergement avant d’entrer dans la phase d’habituation à la procédure. Le lapin en expérimentation sera séparé du groupe, afin d’éviter que les individus non appareillés viennent défaire le gilet et abîmer les capsules du lapin en expérimentation. Même individualisé, les lapins auront un contact auditif et olfactif avec les autres lapins. Les lapins seront habitués à la manipulation une semaine en amont du repas sanguin pour l’habituer à l’opérateur et à la procédure. Nous ferons fonctionner la tondeuse quelques minutes à proximité du lapin la semaine avant le repas sanguin pour l’habituer au bruit. Nous enfilerons le gilet au lapin 3 ou 4 fois la semaine précédant l’expérimentation. Le lapin le gardera quelques minutes à chaque fois. Nous placerons les animaux qui subiront une prise de sang dans un sac de contention plusieurs fois et pendant 5 minutes la semaine précédant l’expérimentation. Pendant le repas sanguin, nous surveillerons l’apparition d’une réaction allergique ou un des effets indésirables cité au début de ce paragraphe. Une crème anti-démangeaison pourra être appliquée sur recommandation du vétérinaire référent si on constate la présence d’un prurit ou d’une allergie à la piqure des tiques. On limitera le nombre de tiques par lapin au strict minimum pour éviter toute spoliation sanguine des lapins.

Choix des espèces

Nous utiliserons des lapins car les tiques présentent des spécificités d'hôtes relativement strictes et ne peuvent se gorger que sur certains animaux vertébrés. Afin de maintenir un élevage de tiques au laboratoire, il est nécessaire d’obtenir un grand nombre de tiques gorgées pour chaque stade et le lapin permet de nourrir simultanément plusieurs tiques sans lui nuire. L’utilisation de lapins permet d’éviter l’apparition d’anémie compte tenu de la sa taille lors de la procédure expérimentale. Les lapins que nous utiliserons seront des femelles adultes d’environ 6 mois. Ce stade permet de gorger un nombre suffisant de tiques pour maintenir la pérennité de l’élevage de tiques. D’autre part, ce stade relativement jeune, permettra un replacement des animaux après l’expérimentation.