Système immunitaire

Soumises à des contentions répétées destinées à produire un état de stress, puis à l'injection d'une substance inflammatoire, 2 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent une perte d'appétit, une chute de température et un retrait social, que le porteur nomme "comportement de maladie" et présente comme contribuant à leur rétablissement. Il écrit par ailleurs que la contention laisse l'état général des souris stable, sans perte de poids ni changement d'activité, tout en s'en servant comme modèle de stress. Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus, et la rubrique consacrée au remplacement décrit un travail sur les oméga-3 et les régimes alimentaires, quand l'objectif annoncé porte sur un récepteur de la neuroinflammation.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de dépression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, unique cellule immunitaire du cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents composés biologiques d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces molécules bioactives a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels ces composés influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes neuroinflammatoires impliqués dans les troubles psychiatriques, notamment via le rôle du récepteur HCAR2 dans les cellules immunitaires du cerveau et de la périphérie.

Procédures

Pour désactiver le gène spécifique HCAR2 dans certaines cellules immunitaires du cerveau (positives pour le gène CX3CR1), les souris recevront une injection par jour pendant cinq jours. Trois semaines plus tard, un groupe de souris modifiées et un groupe témoin recevront une substance inflammatoire pour observer leur réaction. Leur état sera suivi pendant les 48 heures suivantes. À la fin de l’expérience, les souris seront endormies sans douleur grâce à un anesthésiant, suivi d’une injection pour mettre fin à leur vie. Chaque injection ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dans ce projet sont limitées et soigneusement contrôlées grâce à des protocoles rigoureux et des mesures adaptées. La contention répétée est une méthode utilisée pour modéliser un état de stress. Bien qu’elle puisse entraîner un inconfort temporaire, l’état général des souris reste stable, sans perte de poids ni altération de leur activité habituelle, selon notre expérience et les données disponibles. L’injection d’une substance inflammatoire entraîne une activation temporaire du système immunitaire, provoquant un malaise passager caractérisé par des modifications de la température corporelle, du métabolisme énergétique, une perte d’appétit et un comportement de retrait social. Ce phénomène, appelé « comportement de maladie », contribue au rétablissement des animaux et disparaît en 48 heures. Les évaluations comportementales sont conçues pour minimiser l’impact sur le bien-être des souris, avec des durées d’exposition réduites et des manipulations adaptées. De plus, les lignées utilisées sont bien caractérisées, et un suivi rigoureux permet de détecter rapidement tout effet inattendu. Pour garantir le bien-être des animaux, des mesures spécifiques sont mises en place : une surveillance quotidienne par l’expérimentateur et bihebdomadaire par les animaliers, ainsi qu’une évaluation systématique de la douleur après chaque manipulation, avec administration d’analgésiques si nécessaire. L’enrichissement de l’environnement, des manipulations douces et une attention constante visent à réduire au maximum les effets indésirables tout en assurant des conditions optimales pour les expériences.

Devenir

A la fin de chaque procédure expérimentale ou si les points limites sont atteints au cours de l'une d'entre elle, les souris seront euthanasiés afin de préléver les tissus nécéssaires aux analyses.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les mécanismes neurobiologiques et rôle des acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la prévention des altérations cognitives et émotionnelles suite à un stress chronique. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Les expériences ne peuvent pas être effectuées sur des cultures cellulaires ou dans des modèles computationnels ou encore chez l’homme, car aucune de ces approches ne permet de réaliser toutes ces expériences chez un même sujet. Le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des troubles de l’humeur reste une nécessité expérimentale majeure.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. De plus grâce à des études menées précédemment dans notre laboratoire montrent que pour avoir une puissance statistique suffisante, nous avons montré que 15 souris sont nécessaire par groupe afin de permettre une robustesse des données.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement ainsi que des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientique.En fin d'expérimentation, les animaux seront mis a mort par une anesthésie sans reveil avec au préalable une analgésie pour limiter la douleur pendant la procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris en raison de leur petite taille, qui permet de les héberger facilement dans des conditions d’élevage optimales en animalerie. Nous privilégions la souris plutôt que le rat, car de nombreuses lignées transgéniques sont déjà disponibles dans notre laboratoire, contrairement aux rats. Ce choix s’inscrit également dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, les cellules immunitaires de la souris et de l’homme partagent de nombreux gènes en commun, ce qui facilite la transposition des résultats obtenus chez l’animal à l’humain. Les différentes lignées transgéniques générées arriveront dans notre animalerie à l’âge de 6 semaines et bénéficieront d’une période d’acclimatation de 2 semaines avant de commencer les protocoles de stress. Les tests comportementaux débuteront sur des animaux âgés de 12 semaines au maximum.

Infectées par le virus de la grippe, gavées, anesthésiées à plusieurs reprises et saignées jusqu'à quatre fois, 3 322 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyses. Le projet vise à mettre au point des films à dissoudre sous la langue, présentés comme une voie de vaccination moins effrayante que la piqûre pour les futurs patients humains. Le porteur annonce une inflammation locale des muqueuses de faible intensité et un inconfort au réveil. Il indique que des seuils d'intervention ont été définis pour limiter la douleur, sans préciser lesquels ni ce qu'ils déclenchent.

Objectifs

Ce projet a pour but de créer un nouveau type de vaccin qui permettrait une meilleure protection contre certaines maladies. Les vaccins classiques sont souvent injectés, mais ils ne fonctionnent pas toujours aussi bien que prévu, ce qui peut poser des problèmes, surtout pour les maladies pour lesquelles il n'existe pas de bon vaccin. Nous voulons développer des films buccaux, un peu comme des pastilles à dissoudre sous la langue. Ces films permettraient au corps de réagir plus efficacement aux infections, car ils agiraient directement dans la bouche, là où certains virus et bactéries pénètrent souvent. Cette méthode est moins effrayante qu'une piqûre et pourrait faciliter la vaccination pour beaucoup de gens. Pour fabriquer ces films, nous utilisons des matériaux sûrs pour le corps et respectueux de l'environnement. Nous avons aussi l’intention d’intégrer des nanoparticules, de toutes petites structures qui permettent de protéger les ingrédients du vaccin et de les libérer lentement dans le corps. Cela aide le système immunitaire à mieux reconnaître et combattre les maladies. Un autre aspect important de notre projet est de comprendre comment notre corps se souvient des infections passées. Pour cela, nous allons étudier des souris génétiquement modifiées qui nous permettront de comprendre comment leur système immunitaire se prépare à se défendre contre les maladies après avoir été vacciné. Nous commencerons par administrer des films au niveau de la bouche contenant un ingrédient modèle aux souris afin de tester notre méthode. Nous observerons ensuite comment les souris réagissent et si elles produisent des anticorps, qui sont comme des soldats prêts à défendre le corps contre les infections. En résumé, notre projet vise à rendre la vaccination plus efficace et plus accessible à tous, en utilisant une méthode simple qui pourrait mieux fonctionner contre certaines maladies.

Bénéfices attendus

La plus part les vaccins utilisés chez l'homme à l'heure actuelle reposent sur une ou plusieurs injections dans le muscle ou sous la peau même lorsqu’il s’agit de protéger contre des maladies infectieuses transmises par les muqueuses (buccale par exemple). Or l’administration par ces voies d'injection n’est pas la voie efficace pour induire une réponse immunitaire au niveau des muqueuses. Ainis, une formulation vaccinale administrée au niveau de la bouche est un enjeu majeur dans le domaine. Notre projet propose de tester la voie buccale comme voie d’administration en recherchant une formulation permettant de garantir une réponse du corps efficace à long terme, sécuritaire, et contrôlée

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1- anesthésies (à 1 mois d'intervalle) ; 2- une injection de cellules immunitaires (une fois) ; 3- une injection de virus de la grippe (une fois) ; 4- un gavage intragastrique de molécule (2 fois à une semaine d'intervalle) ; 5- une anesthésie de moins d'une heure ; 6- des prélèvements sanguins après une anesthésie qui durera moins de 10 minutes 3 fois (procédure 2) ou 4 fois (procédure 3) à au moins 28 jours d’intervalle.

Impact sur les animaux

Les principaux risques identifiés dans le cadre de ce projet sont les suivants : • L’administration du vaccin sous la langue de nanoparticules pourrait provoquer une légère inflammation locale des muqueuses, mais cette réaction est généralement de faible intensité et temporaire (moins de 48 heures) ; • Un stress peut être causé par l'anesthésie qui est répétée 2 fois à 28 jours d’intervalle ; • L’animal peut ressentir un léger inconfort au réveil après un prélèvement sanguin ou l’administration du virus de la grippe sous anesthésie. • Une douleur peut survenir après l'injection des substances anesthésiques ou suite au gavage des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales pour des analyses biologiques.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucune méthode en laboratoire capable de remplacer l'expérimentation animale pour répondre aux questions de ce projet. La réponse vaccinale est un phénomène complexe qui ne peut pas être étudié de manière complète en dehors d'un organisme vivant. C'est pourquoi l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire avant de passer aux essais cliniques sur l'humain.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous réalisons d’abord des études préliminaires minutieuses qui nous aident à affiner les formulations dès le départ. Ainsi, nous minimisons les tests sur différentes formes de vaccins en utilisant un nombre limité de souris. Nous utilisons aussi des techniques d’imagerie non invasives, qui permettent de visualiser en temps réel la localisation et la durée d’expression des composants du vaccin dans le même animal. Ces méthodes fournissent des informations précieuses sans prélèvements supplémentaires et sans sacrifier davantage d'animaux. En parallèle, les souris modifiées génétiquement nous permettent de suivre l’activation des cellules immunitaires, notamment des cellules immunitaires mémoires, chez le même animal. Cela nous offre des données détaillées sur la réponse immunitaire tout en réduisant le nombre de souris nécessaires. Enfin, nous employons des outils mathématiques pour calculer précisément le nombre minimal d'animaux requis, optimisant ainsi chaque étape expérimentale tout en respectant des normes éthiques strictes. Grâce à cette approche, nous obtenons des résultats de haute qualité scientifique tout en limitant au maximum l'usage d'animaux.

Raffinement

Tout au long de l'étude, les souris sont surveillées de près pour repérer rapidement tout signe anormal. Après l'immunisation, une surveillance rapprochée est mise en place pendant 24 à 48 heures pour détecter d’éventuels effets secondaires, comme des réactions inflammatoires dues à l'injection. Des seuils d’intervention ont été définis pour limiter la douleur au maximum, assurant ainsi le bien-être des animaux pendant toute la durée de l'étude.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris pour notre projet de vaccination orale en raison de leur proximité biologique avec les humains, ce qui permet de mieux interpréter les résultats pour d’éventuelles applications humaines. De plus, de nombreuses études sur la vaccination des souris contre le virus de la grippe existent déjà, ce qui nous permet de comparer nos résultats à ceux d’autres laboratoires. Nous avons également accès à des modèles de souris génétiquement modifiées qui nous permettent d’analyser en détail les cellules immunitaires B mémoire, essentielles pour évaluer la réponse vaccinale. Les souris seront principalement utilisées à l’âge adulte car leur système immunitaire est alors pleinement développé. Cela garantit des observations précises et pertinentes pour évaluer la réponse immunitaire au vaccin.

Produire des anticorps à la commande, pour des clients de la recherche académique : 108 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir jusqu'à trois injections intradermiques et huit injections sous-cutanées, subir jusqu'à dix prélèvements sanguins sous anesthésie, avant d'être exsanguiné par ponction intracardiaque sans réveil. Le porteur décrit des inflammations d'environ quatre millimètres au point d'injection, visibles pendant un mois, et affirme n'avoir constaté aucune autre nuisance importante en plusieurs dizaines d'années. Le nombre d'animaux suit le volume de sérum attendu, dix à quinze millilitres par cobaye quand la plupart des commandes en réclament plus de vingt, ce qui conduit à en utiliser deux par immunogène.

Objectifs

Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Les anticorps seront utilisés principalement dans la recherche académique.

Bénéfices attendus

Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Nous développons depuis plusieurs dizaines d’années des anticorps pour la recherche. Les résultats obtenu grâces aux anticorps générés par notre entreprise ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires. Ce projet s’inscrit dans cette continuité pour poursuivre la génération d’outils biologiques pour la recherche et le développement.

Procédures

- Prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés, environ 5 min, maximum 10 prélèvements. - Injection en intradermique sur animaux anesthésiés, environ 3 minutes, maximum 3 injections. - Injection en sous cutané sur animaux anesthésiés, environ 1 minute, maximum 8 injections. - Exsanguination en intracardiaque sous anesthésie, sans réveil.

Impact sur les animaux

La préhension lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une inflammation au niveau des sites d’injections en intradermique peut être observée ( environ diamètre 4mm qui peut former une petite croute), dans la majorité des cas un point rouge est observé. Les réactions sont visibles environ 1 mois. Pour les injections sous-cutanées, dans la plupart des cas il n’y a pas de réaction observée, dans de très rares cas une petite (3mm de diamètre environ) boule inflammatoire peut être observé au site d’injection, Il peut y avoir une légère douleur à l’injection . Avec notre expérience depuis plusieurs dizaines d’années, nous n’avons pas constaté d’autres nuisances importantes. Nous resterons néanmoins vigilants à tous effets imprévus.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant la coopération entre de multiples types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent ces approches n’apportent pas la même qualité d’anticorps. Les chances de succès sont limitées comme le démontre le nombre d’anticorps en clinque issus de ces techniques qui restent marginales. Enfin l’obtention d’anticorps polyclonaux ne peux pas être remplacée par un mélange d’anticorps monoclonaux. Cette approche des anticorps multi clonaux ne permet pas non plus d’obtenir la même efficacité.

Réduction

Le nombre de cobayes utilisé pour chaque expérimentation est réduit au minimum, mais est déterminé par la quantité d’anticorps attendue par le client. Nous obtenons environ 10 à 15ml de sérum au minimum par cobaye, la majorité des projets nécessite plus de 20ml. En effet les méthodes de purification de ces sérums requierent un volume suffisamment pour obtenir quelques milligrammes d’anticorps c’est pourquoi nous utiliserons généralement 2 cobayes par immunogènes.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de palet de bois Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus les animaux sont manipulés et caressés régulièrement ( 2 fois par semaines).

Choix des espèces

Le cobaye est l’animal de laboratoire bien adapté au développement d’anticorps pour la recherche. Il montre en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs il permet de récolter une quantité de sérum conséquente suffisante pour les applications en recherche. Nous utilisons des jeunes adultes car c’est chez les jeunes adultes que la réponse immunitaire est la meilleure et par là même la génération d’anticorps.

Toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés et l'effet des traitements caractérisé, 836 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales, puis jusqu'à neuf injections de vaccin, de traitement associé et d'immunothérapie étalées sur trois semaines. Les tumeurs implantées dans le poumon peuvent provoquer des difficultés respiratoires, des douleurs modérées et une perte d'appétit. Le porteur écrit ne pas pouvoir envisager le remplacement des animaux, tout en indiquant que l'intelligence artificielle permettrait d'étudier l'interaction entre cellules immunitaires et cellules tumorales et qu'elle n'est "pas actuellement utilisée".

Objectifs

Le pronostic global des patients atteints de cancer du poumon est mauvais, et dans ce contexte l’immunothérapie suscite un grand intérêt, néanmoins, bien que ces traitements aient permis d’améliorer la survie de certains patients, les taux de réponse restent limités. Nous avons identifié des lymphocytes infiltrant les tumeurs et appelées lymphocytes T résidents capables d’éliminer les cellules tumorales et associés à une meilleure survie des patients dans plusieurs pathologies cancéreuses. Ce projet permettra : 1) d’élucider le rôle des lymphocytes T résidant dans les tumeurs dans la réponse aux immunothérapies in vivo dans un modèle de souris, 2) de mieux comprendre le fonctionnement des immunothérapies pour les améliorer et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous utiliserons deux modèles de souris portant une pathologie cancéreuse, et des traitements anti-cancéreux in vivo. Jusqu’à ce jour, aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité du système immunitaire dans un environnement tumoral.

Bénéfices attendus

Afin de comprendre pourquoi les taux de réponse à l’immunothérapie restent limités chez la majorité des patients atteints de cancer, notre objectif est de mieux comprendre le rôle d’une nouvelle classe de globules blancs, les lymphocytes T résidents, présents dans la tumeur. Grâce à des modèles in vivo, nous chercherons à comprendre quels sont les mécanismes permettant l’obtention de ces lymphocytes dans la tumeur. Notre but est de faire avancer les connaissances sur les causes de l’efficacité limitée du système immunitaire dans les tumeurs et ainsi contribuer à l’amélioration de la réponse aux immunothérapies et au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris seront greffées avec une lignée cellulaire tumorale avec une seule injection (durée 1 minute, anesthésie locale). L'injection du vaccin sera répétée 2 fois tous les 7 jours pendant 20 jours (durée 1 minute, sous anesthésie locale). Le vaccin sera combiné à un autre traitement appliqué par injection répétée 3 fois tous les 4 jours pendant 20 jours (durée 1 minte, anesthésie locale). L’immunothérapie est une solution injectée 4 fois tous les 4 ou 5 jours pendant 16 à 22 jours (durée 1 minute, anesthésie locale).

Impact sur les animaux

Les injections causent un stress et douleur légère de courte durée. Les tumeurs greffées en sous-cutanée peuvent entraîner une gêne mécanique légère, une douleur modérée. Les tumeurs induisant un ou plusieurs foyers tumoraux dans le poumon, peuvent causer des problèmes respiratoires et des douleurs modérées. Parmi les nuisances possibles de ces tumeurs il y a aussi la perte d'appétit et de poids.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever certains organes pour caractériser l’effet des traitements, les effets anti-tumoraux et les cellules immunitaires.

Remplacement

L’étude de l’effet thérapeutique d’un vaccin peptidique ou des anticorps thérapeutiques dans un contexte cancéreux relève d’une grande complexité où les modèles in vitro seuls n’apporteraient pas tous les éléments et ne permettraient pas de vérifier nos hypothèses. Un des effets majeurs attendus est le recrutement et l’activation prolongée des cellules immunitaires au sein des tumeurs. Nous ne pouvons pas envisager le remplacement des animaux pour nos études. Cependant nos hypothèses de travail se basent sur nos expériences in vitro avec des cellules humaines et sur la littérature. Certaines approches expérimentales in vitro pourront aussi être réalisés afin de confirmer une partie des résultats obtenus grâce aux expérimentations in vivo. Le nombre de souris pour cette étude a été calculé mathématiquement afin d'utiliser le plus petit nombre de souris tout en restant statistiquement significatif. L'intelligence artificielle pourrait permettre d'étudier l'interaction potentielle entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales mais n'est pas actuellement utilisée.

Réduction

Les expérimentations seront réalisées toutes les 6 semaines pour nous permettre d’analyser les résultats et de modifier le protocole suivant les résultats précédents obtenus in vivo. Un maximum de conditions sera réalisé au sein d’une même expérience pour réduire le nombre d’expériences et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés en tant que lot contrôle. Nous utiliserons le plus petit nombre de souris tout en respectant la validité statistique de l'étude. Afin de calculer à priori le nombre d’animaux pour répondre à nos hypothèses, un logiciel de statistique a été utilisé. Pour chaque procédure, le test statistique sera adapté et tiendra compte des résultats de nos expérimentations antérieures et de nos connaissances sur les modèles murins en cancérologie, ce qui nous permettra de réaliser des conditions de traitement cohérentes et ainsi réduire le nombre de groupes/animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les deux jours puis tous les jours à partir de J8 pour les souris avec tumeurs pulmonaires et une grille de score sera réalisée. Le comportement social des souris sera suivi, en observant des comportements tels que le toilettage = grooming, leurs mouvements dans la cage ou encore le temps de toilettage des souris. En cas de changement de comportement, de l’enrichissement sera ajouté dans la cage ou les souris seront séparées. Un examen clinique sera réalisé avec l'utilisation d'une grille de score et en cas de gênes ou douleur dues à la progression des tumeurs, en particulier les tumeurs pulmonaires, un anti-inflammatoire sera administré pour minimiser les douleurs et un aliment adapté sera donné. Un anti-inflammatoire sera administré pour les douleurs légères. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle in-vivo le plus adéquat pour l’étude des interactions entre le système immunitaire et le microenvironnement tumoral complexe. De plus, le système immunitaire de la souris est proche de celui de l’Homme, et les modèles tumoraux sont les plus appropriés pour notre étude et comparables aux cancers humains. L’invalidation génétique de la molécule d'intérêt spécifiquement dans les lymphocytes T a été généré seulement dans cette espèce. Cependant, une étude sera réalisée en parallèle sur des échantillons tumoraux humains afin de renforcer les résultats obtenus dans le modèle murin. Les animaux, âgées de 5 à 8 semaines seront réceptionnées par l’animalerie et utilisés après une période d’acclimatation de 7 jours minimum. Les greffes de tumeurs seront réalisées sur des animaux âgés de 6 à 9 semaines afin d’obtenir une meilleure prise de greffe et avoir une grande quantité d’infiltrat lymphocytaires.

Un patch d'ovalbumine posé chaque jour pendant quatorze jours sous anesthésie, ou du calcipotriol appliqué chaque jour pendant onze jours, avec démangeaisons, rougeurs, œdème et excoriations à la clé. 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que les modèles animaux "ne reproduisent pas fidèlement la complexité" de la dermatite atopique humaine et qu'ils en représentent seulement des sous-phénotypes, puis installe deux de ces modèles dans son laboratoire. Les bénéfices annoncés se limitent à cette installation, pour des projets de recherche à venir.

Objectifs

L’objectif du projet est la mise en place dans notre laboratoire de deux modèles murins de DA déjà établis pour nos futurs projets de recherche sur la DA. La dermatite atopique (DA) est la première et la plus fréquente maladie allergique, touchant 10 à 15 % des enfants en Europe. Cliniquement, elle se manifeste par une peau sèche, une inflammation cutanée et des démangeaisons intenses, qui peuvent être exacerbées par divers déclencheurs tels que les allergènes, les infections ou le stress. Chez les patients atteints de DA, les cellules de l’épiderme produisent de grandes quantités de molécules pro inflammatoire. Alors que 70 % des patients voient leurs symptômes disparaître naturellement pendant l’enfance, 30 % souffrent de symptômes persistants et présentent un risque accru de comorbidités atopiques associées telles que l’asthme, la rhinite ou les allergies alimentaires. Actuellement, il n’existe pas de stratégies préventives efficaces pour la DA. Il existe des phénotypes cliniques distincts de la DA ce qui conforte la nécessité d'une approche médicale personnalisée. La recherche préclinique sur la DA visant à développer de nouveaux traitements, à caractériser les mécanismes fondamentaux de la pathologie et à identifier les sous-types distincts de la DA a depuis longtemps rendu indispensables les modèles animaux appropriés. Malheureusement les modèles animaux ne reproduisent pas fidèlement la complexité de la DA humaine, mais représentent plutôt des sous-phénotypes de la maladie. Une publication récente résume très bien les différents modèles murins de DA existants, leurs caractéristiques et les avantages/inconvénients de chaque modèle. C’est la raison pour laquelle nous avons choisi de mettre en place au laboratoire, deux modèles de DA différents – ovalbumine et calcipotriol – qui répondent à des questions biologiques différentes.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont la mise en place dans notre laboratoire de deux modèles murins de DA pour nos futurs projets de recherche sur la DA.

Procédures

Procédure 1 = anesthésie et application journalière d’un patch ovalbumine pendant 14 jours. Procédure 2 = anesthésie et application journalière de calcipotriol pendant 11 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la présence d’un patch sur le dos, les symptômes liés à la mise en place de la DA (prurit, érythème, œdème et excoriations), les anesthésies gazeuses répétées.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de la DA et ainsi valider nos modèles.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude de la dermatite atopique (DA), il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum et calculé pour être statistiquement pertinent pour la mesure du score clinique mais aussi avoir assez de matériel biologique pour effectuer non seulement des coupes histologiques mais aussi les mesures des biomarqueurs immuns de la DA dans la peau et dans le sérum.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique.

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur la dermatite atopique (DA) en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la barrière cutanée, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de la DA, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris sensibilisées avec des allergènes spécifiques permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Les souris seront âgées de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à la DA chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie.

Injection de cellules tumorales en moins d'une minute, mesure du volume de la tumeur tous les deux jours sur animal vigile, trois vaccinations sous anesthésie espacées d'une semaine, deux prises de sang, puis radiothérapie. 2 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans un modèle de cancer du sein pour les femelles et de mélanome pour les mâles. Le porteur affirme que le développement de la tumeur ne créera pas de contrainte mécanique et que la radiothérapie, administrée au quart ou à la moitié de la dose maximale tolérée, n'induit aucune nuisance. Toutes sont tuées, soit après avoir atteint les points limites, soit pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Le cancer est la principale cause de mortalité en Europe et 14.1 millions d’individus dans le monde sont affectés par cette maladie. Malgré les avancées technologiques dans le diagnostic et le traitement des cancers, de nombreux patients succombent à la maladie. Il est donc urgent de développer de nouvelles études afin d’améliorer la prise en charge des patients, ainsi que d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de développer des traitements efficaces. Le système immunitaire est au centre de nouvelles approches thérapeutiques et permet d’induire une immunité antitumorale et donc la destruction des tumeurs. L’efficacité de ces immunothérapies requiert au préalable une inflammation dans le site tumoral. Celle-ci n’est présente que dans un nombre limité de tumeurs et peut être induite par le matériel génétique tumoral hors des cellules. De plus, de nombreuses thérapies, incluant la chimiothérapie et la radiothérapie ont été montrées comme induisant une mort des cellules tumorales conduisant à la libération du matériel génétique tumoral qui stimule les réponses inflammatoires et potentialise l’immunité antitumorale. Ces observations posent la question fondamentale de savoir comment et par quels mécanismes est régulée la capacité du matériel génétique dérivé des tumeurs à stimuler l’immunité antitumorale. Nous avons caractérisé récemment une composante dont la fonction principale est de couper/digérer le matériel génétique libéré par les cellules mourantes contrôlant ainsi sa capacité à induire une réponse inflammatoire par le système immunitaire. Nos résultats préliminaires suggèrent que la déficience de cette enzyme limite l’impact thérapeutique des chimiothérapies et leur capacité à induire une réponse immunitaire antitumorale. Nous proposons donc dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet d’étudier les mécanismes d’action de protéine, ciblant le matériel génétique tumoral, dans la régulation de l’immunité antitumorale en réponse aux thérapies conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies). Cela nous permettra de caractériser la fonction de cette composante dans la régulation de l’immunité antitumorale et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques afin de renforcer l’efficacité thérapeutiques des traitements communément utilisés chez les patients atteints de cancers du sein et du mélanome.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser le rôle d'une composante ciblant le matériel génétique libéré dans les tumeurs dans la régulation de l’immunité antitumorale induite par différentes radiothérapies en oncologie. C’est une question fondamentale car le matériel génétique libéré par les cellules tumorales joue un rôle clef dans l’activation de l’immunité tumorale en réponse à diverses thérapies. Des résultats préliminaires de nos collaborateurs semblent indiquer que cette composante soit requise pour l’induction de l’immunité antitumorale induite par certaines chimiothérapies, notre but est d’étudier les rôles de cette composante dans les mêmes modèles tumoraux mais traités par radiothérapies. Ainsi, une meilleure compréhension du rôle de ces enzymes pourrait déboucher sur de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de cancers du sein et du mélanome.

Procédures

1. L’injection des cellules tumorales ou des anticorps est réalisée en moins d’une minute. 2. Certains animaux de l’étude auront deux prélèvements de sang. 3. La mesure du volume tumoral est effectuée tous les deux jours sur des animaux vigiles. et dure moins d’une minute par souris. 4. La vaccination par des cellules s’effectue sur souris endormies à 3 reprises espacées d’une semaine ; l’injection dure au maximum une minute par souris.

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. La douleur associée à l'injection de cellules par voie sous-cutanée ou dans le coussinet de la glande mammaire est équivalente à celle d’une piqûre d’aiguille. Le développement des tumeurs sera suivi par des mesures régulières et leur développement ne créera pas de contraintes mécaniques chez les souris. Concernant les nuisances associées aux traitements par les vésicules, des études préliminaires ont montré qu’elles ne seraient pas supérieures à celles induites par une piqûre d’aiguille ; aucune autre douleur n’est prévisible. Dans ce projet, la thérapie radioactive n’induit pas de nuisance puisqu’elle est utilisée à la moitié ou au quart de la dose maximale tolérée.

Devenir

Tous les animaux inclus dans l’expérimentation seront euthanasiés à la fin de ce projet, soit après avoir atteint les points limites soit afin de procéder à des prélèvements tissulaires pour des analyses supplémentaires.

Remplacement

Afin d’étudier la fonction d’une enzyme coupant/digérant le matériel génétique relargué par les cellules cancéreuses impliquée dans la mise en place de la réponse antitumorale suite aux traitements anti-cancéreux, nous utilisons des animaux génétiquement modifiés avec une déficience de cette enzyme. Ainsi, cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudierons l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales ont été déterminés pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Concernant la gestion de la colonie de souris, nous utilisons les souris femelles pour le modèle de cancer du sein, tandis que les souris mâles seront utilisées pour le modèle de mélanome. Ainsi, les mâles et les femelles issues de notre colonie seront utilisés pour l’un de nos modèles, afin d’optimiser au maximum la gestion de notre colonie.

Raffinement

Nous avons établi des point limites gradés, précis et adaptés pour toutes les procédures (décrits dans la section procédure) mises en œuvre au cours de ce projet. Si les animaux atteignent ces points limites, cela constitue un critère d’arrêt de l’expérimentation et les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. L’approche des points limites entrainera une surveillance accrue des animaux (suivi journalier du poids, du volume tumoral et du comportement) afin réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux. Concernant l’enrichissement du milieu, les souris disposent de carrés en cellulose pour la formation d’un nid commun confortable, de baguettes en bois qu’elles peuvent ronger. En cas d’isolement forcé d’une souris dans une cage, un abri supplémentaire sera également fourni.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour répondre à nos objectifs de recherche. Les souris sont les animaux de choix pour notre projet car nous avons une souche de souris génétiquement déficiente pour la composante que nous étudions afin répondre au mieux à nos objectifs. Nous utiliserons les souris adultes à partir de 8 semaines. En effet, nous nous intéressons au rôle d’une composante l’induction de l’immunité antitumorale en réponses aux thérapies conventionnelles dans le cancer du sein et du mélanome, des pathologies qui affectent exclusivement l’adulte.