Système immunitaire

Pour savoir si la microglie participe à l'ouverture de la période critique du cerveau, 547 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La microglie est appauvrie pendant la vie intra-utérine par un traitement mêlé à la nourriture des mères, ou une inflammation prénatale est provoquée par une injection intrapéritonéale sur femelle gestante vigile. Après transfert vers un second établissement, la moitié des souriceaux de chaque groupe subit la suture d'une paupière sous anesthésie, puis une imagerie du cortex visuel d'environ deux heures, avant d'être mise à mort sans avoir été réveillée. L'effectif compte 67 mères, dont 40 ne sont utilisées que pour accompagner leurs petits pendant le transport.

Objectifs

La plasticité cérébrale décrit la capacité du cerveau à remodeler ses connexions en fonction de l'environnement et des expériences vécues par l'individu. Cette plasticité est élevée peu après la naissance et diminue chez l’adulte. Elle est maximale au cours d’une période limitée dans le temps, appelée « période critique », pendant laquelle les circuits neuronaux sont particulièrement susceptibles d’être remodelés en réponse à un changement de l’environnement. Ainsi, une pathologie touchant par exemple la vision pendant la période critique aura des impacts irréversibles sur la perception visuelle par le cerveau. Comprendre les mécanismes permettant la mise en place des périodes critiques est donc essentiel pour espérer un jour rouvrir chez l’adulte une forte plasticité et recouvrer, après un handicap ou un environnement inadéquat pendant leur mise en place, des réseaux neuronaux optimaux. Cependant, nos connaissances sur ces mécanismes restent profondément incomplètes, et le présent projet a pour objectif d’étudier si la microglie participe à l’établissement de la période critique. La microglie est en effet une population de cellules du cerveau dont le rôle est d’assurer la défense immunitaire grâce à ses capacités phagocytaires. Des données préliminaires ont montré qu’une altération du niveau de microglie chez l’embryon de souris induisait une modification profonde des circuits neuronaux après la naissance. En particulier, certains de ces circuits neuronaux sont connus pour être des régulateurs importants de l'ouverture de la période critique. Cela suggère donc un rôle majeur de la microglie dans l’établissement de la période critique. Le but de ce projet est maintenant de tester si des changements de plasticité ont lieu in vivo dans le but de confirmer ces résultats préliminaires et de caractériser ainsi les conséquences de modifications prénatales des microglies sur la période critique. Ce projet, qui est multisite, a déjà fait l’object d’une demande similaire, qui a été validée, avec le même nombre d’animaux. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé.

Bénéfices attendus

D’un point de vue fondamental, nos connaissances concernant le rôle de la microglie dans l’établissement des périodes critique est profondément incomplet. De plus, la compréhension des mécanismes qui sont impliqués ouvre donc des perspectives thérapeutiques de pouvoir réinstaller une plasticité neuronale chez l’adulte et rétablir des connexions corticales normales suite à une pathologie pendant l’enfance.

Procédures

Les animaux seront produits par accouplements contrôlés dans le premier établissement utilisateur (EU2/2), pour produire les 3 groupes d’animaux : 1) ceux dont lesquels la microglie aura été déplétée pendant le développement in utero (par traitement pharamacologique non dommageable présenté dans la nourriture), 2) ceux qui auront été exposé à une procédure mimant une inflammation prénatale (injection à un stade précis de la gestation- geste réalisé par des expérimentateurs entrainés (injection de quelques secondes réalisée sur animal vigile) et suivi intensifiés dans les 3 jours suivants (voir ci -dessous)), et 3) un groupe non manipulé d’animaux contrôle. Les animaux seront ensuite transférés dans un deuxième établissement utilisateur situé à proximité (EU1/2), dans des cages de transport scellés, avec des congénères de chaque portée, et ont une période d’acclimatation d’au moins une semaine après ce transport. Certains animaux devront être transporté avant sevrage pour leur laisser une semaine d’adaptation, et dans ce cas particulier, les mères seront également transportées. Dans le deuxième établissement utilisateur (EU1/2), nous procéderons à 3 actes sur les animaux. Pour la moitié des animaux de chaque groupe, nous réaliserons une fermeture transitoire de la paupière par suture chirurgicale, réalisée sous analgésie et anesthésie contrôlée (20 minutes environ pour l’entièreté de l’acte) et avec suivi post-opératoire pendant 3 jours. Après 3 jours, la plasticité induite par cette fermeture, ou l’absence de fermeture (autre moitié de chaque groupe), sera évaluée dans le cortex visuel par imagerie (environ 2h), réalisée sous analgésie et anesthésie contrôlée, et qui seront euthanasiés par méthodes règlementaires avant réveil.

Impact sur les animaux

L’induction des modèles d’étude se fera sur les mères et leurs embryons soit par l’alimentation sans contrainte autre que le changement de l’aliment, soit par une injection intrapéritonéale qui peut induire un stress lors de la contention une douleur de courte durée lors de l’injection au point de piqûre. Les animaux seront ensuite transportés dans un autre établissement ce qui pourra induire un léger stress. Dans le second établissement, la procédure chirurgicale mise en œuvre est rapide mais entraîne néanmoins un stress thermique et des risques liés à l’anesthésie générale. De plus, cela peut mener à un inconfort dans les jours suivants tels que grattages et petites plaies autour de l’œil. En fin de période de maintien, les animaux subiront une imagerie sous anesthésie (stress thermique/risques anesthésiques) puis seront euthanasiés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par méthodes règlementaires, ce qui permet de réaliser les analyses et prélèvements nécessaires.

Remplacement

Des données préliminaires obtenues in vitro par notre équipe indiquent que les circuits neuronaux impliqués dans la période critique sont modifiés suite à une altération de la microglie in utero. La prochaine étape consiste à tester directement cette hypothèse in vivo au sein d'un organisme complexe. Il n’est pas alors possible de remplacer les enregistrements du cerveau intact par des simulations ou par des cultures de cellules du cerveau.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, la taille de chaque lot a été optimisé pour pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé, mais pouvoir établir des conclusions scientifiquement et statistiquement fiables. Nous estimons à 10 animaux la taille optimale par lot, ce qui porte à 547 le nombre total d'animaux (480 animaux seront enregistrés, auxquels s'ajoutent 40 mères qui devront accompagner les animaux en plus bas âge au moment du transport et 27 mères ayant subies des traitements). Nous avons également choisi de réaliser un groupe contrôle unique pour les deux conditions expérimentales, afin de réduire le nombre total d’animaux.

Raffinement

Sur l’ensemble de la trajectoire de vie des animaux, et donc sur les deux établissments utilisateurs, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Suite à la manipulation des souris gestantes, nous aurons un suivi particulier de ces animaux et de leur descendance (grâce à des points limites définis, et protocoles analgésiques dédiés). Pour les mères un suivi sera effectué en même temps que leur progéniture pour déceler des changements dans leur comportement et leur apparence. Pour le transport, nous veillerons à maintenir les congénères de chaque portées et une semaine d’adaptation. Suite à la chirurgie de fermeture d’un oeil, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant 3 jours et une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte et présente une plaie autour de l’oeil. Dans ce cas, nous procéderons à une désinfection de la zone opérée et, à l’application d’un anesthésique local. Nous examinerons en parallèle le comportement et l'apparence des souris opérées pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté si besoin. Pour l'expérience d'imagerie, la procédure sera réalisée sous anesthésie et préparée par une injection analgisante. De plus, la technique d'imagerie utilisée pour l’enregistrement de l’activité cérébrale est minimalement invasive et ne nécessite pas de chirurgie lourde. Tous les animaux seront logés à plusieurs dans des cages enrichies à l'aide de coton pour faire leur nid et boisson et nourriture à volonté, dans les deux établisssments utilisateurs.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin qui est un modèle idéal puisque son développement est proche de celui de l’homme. La souris est l’espèce animale la plus répandue dans les laboratoires de Neurosciences aujourd’hui. Elle permettra une meilleure reproductibilité des résultats et une meilleure comparaison avec ceux publiés dans la littérature. De plus, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de parents. Ces animaux seront testés soit aux jours post-nataux 21, 28, 50 et 100. Ces âges constituent des âges remarquables pour la plasticité visuelle chez la souris car : - La période critique pour la dominance oculaire chez la souris est maximale vers le jour post-natal 28. - Au jour post-natal 21, la période critique commence à s’ouvrir. - Au jour post-natal 50, la plasticité est largement réduite - Au jour post-natal 100 la période critique est totalement fermée.

Prélèvement du cœur ou du rein sur les souris donneuses, puis greffe sur les receveuses au cours d'une opération de vingt à quatre-vingt-dix minutes selon l'organe, suivie de quatre injections de morphine et d'un suivi qui peut atteindre cent soixante-huit jours. 4 240 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les lignées d'élevage au phénotype dommageable subissent trois prélèvements sanguins par an au sinus rétro-orbitaire pendant cinq ans, et les receveuses de greffe d'îlots pancréatiques reçoivent d'abord une injection provoquant un diabète, puis deux contrôles de glycémie par semaine. Chaque chirurgie entraîne une gêne au réveil et une douleur malgré les analgésiques, et toutes les souris sont tuées en fin de procédure pour que soient prélevés leur sang, leurs organes lymphoïdes et les greffons.

Objectifs

La transplantation est souvent le traitement le plus efficace, voire le seul, pour les patients en insuffisance terminale d'organe. Ce processus permet de remplacer l’organe malade par celui d’un donneur génétiquement différent. Cependant, son efficacité à long terme est limitée par le rejet, principal facteur de perte de greffon. Ce rejet survient car le système immunitaire du receveur reconnaît le greffon comme un tissu étranger. Actuellement, le rejet est attribué à la reconnaissance du greffon par la réponse immunitaire adaptative. Nos recherches récentes explorent le rôle d’un autre bras du système immunitaire, l’immunité innée, révélant un potentiel thérapeutique inédit pour éviter et traiter le rejet du greffon. L’identification et la compréhension des mécanismes du rejet inné permettraient de mieux évaluer et suivre les patients, tout en ouvrant la voie à de nouveaux traitements innovants. Les objectifs du projet sont : i) analyser les réponses de l’immunité innée du receveur contre le greffon; ii) tester des molécules susceptibles de freiner les lésions de rejet et d’augmenter la durée de vie des greffons ; iii) étudier comment l’interaction entre les cellules innées et les lymphocytes. Cette approche optimiserait la sélection des donneurs et prolongerait la survie des greffons, tout en améliorant la qualité de vie des receveurs. Des études récentes montrent que le type de rejet varie selon les cellules immunitaires impliquées et le type de greffe. Nous utiliserons diffèrents modèles de greffes pour explorer la contribution des cellules de l’immunité innée dans le rejet de greffe chronique et aiguë. Le projet est structuré en 8 procédures, chaque modèle de greffe (moelle osseuse, greffe cardiaque, rénale, îlots) étant étudié avec deux objectifs : 1) caractériser les mécanismes impliqués dans le rejet de greffe médié par les monocytes et tester des molécules visant à réduire le risque de rejet ; 2) analyser les mécanismes impliqués dans le rejet de greffe médié par les cellules innés NK avec les lymphocytes. D’une durée de 5 ans, le projet pourrait impliquer jusqu’à 4240 souris, avec des expériences réalisées en séquence et arrêtées en cas d’hypothèse invalidée.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'améliorer la compréhension du rôle du système immunitaire inné dans le rejet de greffe, ainsi que de ses interactions avec le système adaptatif. Cette meilleure connaissance pourra nous guider dans l'identification de traitements potentiels pour atténuer le rejet. L’effet thérapeutique de molécules candidates sera étudié, ce qui permettra de sélectionner et valider des candidats capables de moduler ces interactions, avec des études plus approfondies sur les mécanismes moléculaires in vitro.

Procédures

Elévages des souris du phénotype dommageable : prélèvement sanguin au sinus retro-orbital trois fois par an, maximum 5 secondes par prélèvement – durée 5 ans Souris receveuses des cellules moelle osseuse : Greffe des cellules moelle osseuse sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre 20 sec) – au niveau du rein - Incision au niveau du flanc latéral. (opération 20 minutes) Souris donneuses de greffon cardiaque : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 15 minutes Souris receveuses de greffon cardiaque : greffe cardiaque sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections 20 sec) – opération au niveau du cou (opération 60 minutes) Expérience de maximum 56 jours Souris donneuses de greffon rénale : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 20 minutes Souris receveuses de greffon rénale : greffe rénale sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections soucutanée 20 sec) – opération au niveau du ventre (opération 90 minutes) + + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre 20 sec) – opération au niveau du ventre (total opération 20 minutes) Expérience de maximum 168 jours Souris receveuses de greffon d’îlots pancréatiques : Injection dans le ventre pour une induction chimique de diabète (maximum 5 secondes). Greffe des cellules de pancréas sous anesthésie (injection dans le ventre de 5 secondes) + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre de 20 secondes) – réalisée au niveau du rein via une incision sur le flanc latéral. (opération 20 minutes). Suivi de la glycémie par glucomètre (prélèvement sanguin de la queue deux fois par semaine, maximum 5 secondes par prélèvement). Expérience de maximum 56 jours

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales et les prélèvements de sang sont susceptibles d’entrainer un stress (contention) et une légère douleur. La greffe de cellules de moelle osseuse, cœur, rein et îlots pancréatiques sont des procédures bien documentées, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. Chacun des 4 types de chirurgie entrainera une gêne lors du réveil et douleur (malgré les analgésiques) et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux.

Devenir

Les souris seront mises à mort en fin de procédure avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Les mécanismes de rejet d’organe ne peuvent pas être reproduits in vitro.

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour garantir des résultats pertinents, fixé à 8 animaux par groupe. Afin d’atteindre cet effectif malgré les taux de réussite variables des greffes rénales, des greffes d’îlots et de l’induction du diabète (80-90% et 70% respectivement), chaque groupe comprendra entre 10 et 14 individus au départ. Cette marge permet de s’assurer qu’au moins 8 animaux pourront être analysés par groupe. Au total, 4240 souris (Mus musculus) seront nécessaires pour ce projet. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique afin d’assurer la robustesse des analyses. Les expériences seront réalisées de manière séquentielle, chaque étape étant conduite uniquement après l’obtention et l’analyse complète des résultats de la procédure précédente. Si les résultats obtenus ne permettent pas de valider l’hypothèse testée, les étapes suivantes ne seront pas engagées. Cette approche garantit que la poursuite des expériences repose sur des résultats concluants, limitant ainsi la réalisation d’expériences non nécessaires.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué et pris en compte tout au long du protocole grâce à un suivi rigoureux, incluant l’observation de leur poids, de leur comportement et de leur état général. Des points limites spécifiques à chaque chirurgie seront définis pour assurer une prise en charge adaptée. Des traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés afin de garantir le confort des animaux lors des interventions chirurgicales et des prélèvements sanguins. Un suivi rapproché sera effectué après chaque chirurgie, avec une surveillance accrue en fonction des signes cliniques observés. Pour limiter le stress, les animaux seront maintenus en groupes sociaux. Les interventions chirurgicales seront réalisées par un professionnel formé à la chirurgie sur rongeurs, avec du matériel stérile et sous conditions optimales. Après la chirurgie, les animaux seront placés en armoire chauffante pour favoriser leur réveil.

Choix des espèces

La souris, grâce à sa similarité génétique et physiologique avec l’homme, est un modèle idéal pour étudier la réponse immunitaire allogénique. Notre projet utilise diverses lignées de souris génétiquement modifiées et de fonds génétiques variés pour simuler différents types de rejets, qu’ils soient allogéniques ou innés : 1. Souris receveuses et donneuses sans système adaptatif (immunité innée seule) pour étudier les monocytes : BRG (receveuses et donneuses contrôles), NSG (donneuses uniquement, SIRPA mismatch). 2. Souris receveuses sans système adaptatif pour l’étude des NK : Rag. 3. Souris donneuses de greffons pour l’études des NK: C57BL/6 (contrôle), B2MKO (absence de MHC-I, « missing-self »). 4. Pour les greffons exprimant l’antigène OVA : B6-OVA, B2MKO-OVA. 5. Pour les donneuses de cellules T spécifiques d’OVA : Rag OTII. Ces souches permettent une analyse précise des mécanismes de rejet de greffe. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées (age de la maturité sexuelle) Age maximum 12 mois en fin de procédure.

Les souris qui atteignent les critères d'arrêt de la grille de score sont tuées immédiatement. 505 souris vont être utilisées dans ce projet, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un cocktail d'antibiotiques pendant quatorze jours, subissent une irradiation du bas du corps sous anesthésie, avalent sept jours durant un produit chimique dans leur eau de boisson qui provoque lésions intestinales, diarrhée, perte de poids et saignements anaux, ou sont infectées par gavage avec une bactérie intestinale. Le porteur indique que les doses ont été calibrées pour rester tolérables chez les souris témoins, admet que des signes cliniques plus importants ou plus précoces peuvent apparaître chez les souris mutantes privées des cellules étudiées, et range les retombées thérapeutiques au rang de perspectives.

Objectifs

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules clefs du système immunitaire. Lors d’infections virales elles produisent en grandes quantités les interférons, des molécules essentielles pour bloquer la propagation du virus chez l’hôte infecté. Les pDC interviennent aussi dans d’autres fonctions physiologiques. Lorsque la peau est lésée, les pDC se localisent dans la lésion et promeuvent la réparation du tissu grâce à leur production d’interférons. Les pDC sont très nombreuses dans l’intestin. Chez l’individu sain les pDC de l’intestin seraient impliquées dans la tolérance aux aliments. La flore intestinale est essentielle pour le bon fonctionnement du système immunitaire, mais son impact sur les pDC de l’intestin a été peu étudié. Notre premier objectif est de déterminer si et comment les pDC intestinales sont affectées si on traite temporairement les souris avec une combinaison d’antibiotiques qui élimine la flore intestinale. Le rôle des pDC au cours des maladies inflammatoires de l’intestin est très controversé. Dans certains modèles de ces maladies elles seraient délétères en promouvant l’inflammation, alors que dans d’autres elles seraient bénéfiques en promouvant la réparation des tissus enflammés ou en limitant les infections intestinales. Notre hypothèse est que cette controverse ne dépend pas uniquement du modèle de maladie étudié, mais aussi de la spécificité du modèle murin utilisé pour étudier les pDC. Nous avons généré et validé un nouveau modèle murin permettant la perte sélective des pDC depuis la naissance sans affecter aucun autre type de cellule. Grâce à ces souris notre deuxième objectif est d’étudier le rôle des pDC intestinales dans trois modèles distincts de maladies inflammatoires de l’intestin. Dans ces modèles l’inflammation intestinale est obtenue suite à l’exposition de l’intestin 1) aux rayons X ou 2) à un produit chimique ou 3) à l’infection par un pathogène intestinal, le Citrobacter rodentium. Ces trois modèles induisent des lésions intestinales par des mécanismes différents. Il est donc possible que selon le modèle étudié la perte des pDC ait un impact différent et, par conséquent, soit associé à des fonctions bénéfiques ou délétères. Connaitre le rôle des pDC dans ces différents modèles de pathologie intestinale va ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients souffrant de maladies inflammatoires de l’intestin, pour lesquelles peu de traitements sont efficaces à ce jour.

Bénéfices attendus

Le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin vise principalement à bloquer les molécules promouvant l’inflammation. Ces molécules sont surtout produites par les cellules du système immunitaire. Cependant, ces mêmes traitements affectent aussi l’efficacité des réponses du système immunitaire face à des pathogènes, rendant les patients plus susceptibles aux infections microbiennes. De plus, certaines cohortes de patients souffrant de MICI sont résistantes à ces traitements, soulignant ainsi la nécessité de trouver d’autres stratégies thérapeutiques plus adaptées. Nos études peuvent ouvrir de nouvelles perspectives de traitements pour promouvoir la guérison et/ou atténuer les symptomes associés au MICI en stimulant ou en inhibant les fonctions des pDC.

Procédures

Traitement antibiotique dans l’eau de boisson modifiant la flore intestinale pendant 14 jours. Irradiation pendant 10 minutes de la partie inférieure du corps sur animaux sous anesthesie générale. L'injection de l'anesthésie est effectuée une fois par voie intrapéritonéale et dure 20 secondes. Une partie des animaux (30) recevront vigiles une seule fois par injection intrapéritonéale un composé, ceci 4 heures avant la mise à mort 4 jours après irradiation. L'injection intrapéritonéale dure 20 secondes. Administration d’un composé dans l’eau de boisson sur animaux vigiles pendant 7 jours. Administration d’une souche bacterienne par gavage unique sur animaux vigiles. Le gavage dure 20 secondes. Gavage unique sur animaux vigiles avec un composé permettant d’étudier la permeabilité intestinale. Le gavage dure 20 secondes. Prélevement de sang sur souris sous anesthesie générale 2 heures après gavage. Le prélèvement de sang est effectué une seule fois et dure 30 secondes.

Impact sur les animaux

Le traitement d’une durée maximale de 2 semaines par cocktail d’antibiotique est généralement bien toléré. Le traitement antibiotique peut impacter la motilité intestinale et provoquer constipation ou diarrhée. Les trois modèles de maladies inflammatoires de l’intestin présentés dans ce projet ont déjà été mis au point dans une équipe de notre institut, ce qui nous permettra de bien maitriser le suivi des souris traitées et limiter le nombre de souris requis pour les mises au point des protocoles. L’exposition aux radiations ionisantes sera restreinte à la partie inférieure du corps avec un dosage qui n'induit pas de perte de poids, de colite ou de diarrhée dans les souris contrôle C57BL/6. Cependant, il est possible que des signes cliniques puissent apparaître dans les souris mutantes. Le traitement avec le DSS induit des lésions et une inflammation de l’intestin, accompagnée d'une perte de poids et de diarrhée pendant une durée de 7 jours. Cela peut induire aussi des saignements et des lésions au niveau anal. La dose de DSS utilisée sera calibrée pour induire une colite modérée chez les souris C57BL/6. Cependant, il est possible que des signes cliniques plus importants ou plus précoces puissent apparaître dans les souris mutantes. En ce qui concerne l’infection par Citrobacter Rodentium, les souris C57BL/6 sont naturellement résistantes à l'infection, donc elles tolèrent l'infection et récuperent en 2-3 semaines sans signes cliniques évidents. La souche de C. rodentium et la dose d’inoculum ont été choisies sur la base de la literature comme étant bien tolerées chez les souris C57BL/6. Cependant, des signes cliniques peuvent apparaître dans les souris mutantes.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement organe et/ou analyse.

Remplacement

Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire et de la réparation tissulaire au cours d’une inflammation produite in vivo. La complexité des nombreuses interactions cellulaires impliquées dans le processus inflammatoire et dans la réparation tissulaire associées aux MICI justifie l’utilisation de modèles d’études in vivo. De plus, la flore intestinale a été montrée comme capable de réguler les fonctions de nombreux organes de l’hôte et leur intercommunication. L’intégration d’un système vivant et complet est donc indispensable pour reproduire l’ensemble de ces processus dans leur complexité.

Réduction

Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits au minimum. Nous utiliserons des souris de fond génétique pur, C57BL/6, ce qui nous permet de limiter la taille des groupes expérimentaux à 5 souris par souche et par condition, en raison d’une variabilité inter-individuelle moindre par rapport aux animaux de fond génétique mixte. Ces nombres ont déjà été validés dans d’une autre équipe de notre institut, qui maitrise les procédures incluses dans ce projet, comme suffisantes pour effectuer des analyses statistiques fiables dans les procédures utilisées.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques et exemptes d’organismes pathogènes spécifiques. La température, l’hygrométrie et la photopériode sont contrôlées et régulées. Chaque animal bénéficiera d’au moins 100 cm2 de surface. Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Le poids, l’apparence (en particulier du pelage), l’activité, la mobilité des animaux, la consistance des selles avec éventuel saignement et éventuellement la température corporelle seront suivis quotidiennement au début de chaque traitement. Dans le cas d’affaiblissement des souris de la nourriture sous forme de gélée sera mise à l’intérieur de la cage afin d’en faciliter l’accès et la surveillance sera renforcée à deux fois par jour. Les points limites et des grilles de score ont été définis dans chaque procédure. Sur la base de ces points limites un système de scoring de la douleur sera scrupuleusement appliqué pour évaluer les signes de souffrance relatifs à l’expérimentation en cours, et mettre en place le plus précocément les mesures pour les réduire les nuisances et la souffrance des animaux. Les animaux atteignant les critères d’arrêt seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Des souris âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées car elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires. Un écart type de maximum 2 semaines au sein d’un même groupe expérimental est défini afin de limiter les variabilités qui pourraient exister entre des souris d’un écart d’âge plus important.

Une partie des souris utilisées appartient à une lignée transgénique retenue pour son nombre plus élevé de cellules mémoires dites MAIT, censé rendre l'effet recherché plus facile à observer. 1 946 souris vont être utilisées, 1 574 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 372 un niveau modéré. Elles reçoivent une injection de cellules sous anesthésie, puis une administration de produits sous une anesthésie pouvant atteindre quarante minutes, puis six injections espacées de vingt minutes le jour de leur mise à mort. Le porteur affirme que les activations du système immunitaire ainsi provoquées ne sont pas douloureuses et que le passage par un organisme vivant intégré est "indispensable" pour tester les mécanismes de régulation. Toutes sont tuées pour le prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Objectifs

Le système immunitaire a pour rôle de détecter un potentiel danger et d’y répondre par le biais des globules blancs afin d’éliminer cette source de danger. On compte parmi ces globules blancs des cellules appelées « lymphocytes T », dont le sous-type dit « CD4 » est absolument essentiel pour l’organisation et l’action du système immunitaire. Par exemple, les patients qui ont un déficit en lymphocyte T CD4 développent de graves maladies infectieuses. Chaque lymphocyte T généré dans l’organisme est capable de reconnaître une cible qui lui est unique. Quand un lymphocyte T n’a pas encore rencontré sa cible au long de la vie de l’individu, on dit qu’il est « naïf » et lorsqu’il a rencontré sa cible, on dit que cette cellule est « mémoire ». Les cellules mémoires sont capables de répondre plus rapidement en cas de reconnaissance d’un danger et c’est sur ce principe qu’est basée la vaccination.

Bénéfices attendus

Ce projet tente de répondre à une question fondamentale en immunologie : comprendre les différents signaux qui sont intégrés par les cellules T CD4 naïves et qui peuvent influencer leur activité. Ce projet pourrait permettre à court terme d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent l’activation des cellules T CD4 naïves qui, pour rappel, sont des cellules clés de la fonction du système immunitaire. A plus long terme, nos résultats pourraient avoir des applications très intéressantes notamment dans le domaine de la vaccination car nous pourrions développer de nouveaux adjuvants capables d’activer des cellules mémoires et ainsi orienter la réponse T CD4 naïve de la façon la plus optimale par rapport à l’effet recherché.

Procédures

Dans la procédure expérimentale, les souris anesthésiées recevront d’abord une injection de cellules mémoires et/ou naïves (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 5 min). Puis les animaux recevront 6h plus tard une administration de produits non douloureux. Ce geste sera réalisé sur animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 40 min). Le jour de la mise à mort, les animaux recevront six injections, chacune séparée de 20 min, d’un produit non inflammatoire sous anesthésie (durée de chaque anesthésie < 5 min).

Impact sur les animaux

Suite à l'injection d’anesthésique dans l'abdomen une douleur légère immédiate de courte durée liée à la piqûre est attendue. Au réveil de l’anesthésie, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie par les animaux après l’administration des traitements ou l’injection de cellules. Il est important à souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées

Remplacement

Le type d’activité que peut adopter une cellule CD4 naïve a déjà été étudiée in vitro et nous sommes capables aujourd’hui de modifier le comportement d’un lymphocyte T CD4 in vitro. Cependant, le comportement que va adopter un lymphocyte T CD4 in vivo peut être très différent de celui obtenu in vitro. Malheureusement, nous n’avons pas aujourd’hui les technologies nous permettant de reproduire in vitro les différents signaux complexes que peuvent recevoir les cellules naïves au sein de leur environnement proche. En effet, les mécanismes qui peuvent moduler l’activité des cellules naïves CD4 sont très nombreux et font notamment intervenir les cellules présentatrices de l’antigène (c’est-à-dire la source de danger), les cellules naïves et les cellules mémoires. Ainsi, une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris est nécessaire. Cette étape est notamment indispensable pour tester les mécanismes de régulation. Stratégie de remplacement : Des expériences in vitro ont déjà été réalisées au laboratoire et ont démontré que l’environnement immédiat des lymphocytes est déterminant pour leurs fonctions. Il est maintenant nécessaire de valider ces résultats dans un environnement intégré qu’est la souris.

Réduction

Nous utiliserons de façon générale 12 souris par groupe expérimental. Il s’agit d’un nombre suffisant nous permettant de surmonter les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à notre modèle. Ce nombre se base sur des expériences préliminaires déjà réalisées au laboratoire en utilisant ce modèle.

Raffinement

Tous les gestes douloureux ou nécessitant une immobilisation parfaite de l’animal seront réalisés sous anesthésie avec recours aux analgésiques si nécessaire. Lors des anesthésies, la température corporelle des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de tapis chauffant. Par ailleurs, pour éviter l’assèchement des yeux pendant les anesthésies, les yeux des animaux seront recouverts de vaseline officinale. Une solution de Ringer lactate préchauffée à 37°C sera administrée en fin d’anesthésie pour améliorer le réveil de l’animal. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux sera évalué de manière objective grâce à une grille de score permettant de définir des points-limite. L’atteinte de ces points-limite conduira à la mise en place de soins de support/analgésiques voire à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie pour plusieurs raisons : a) nous avons une bonne connaissance de son génome, ce qui nous permet notamment d'utiliser des souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt. b) la souris est aussi un modèle de choix du fait de la disponibilité de souches congéniques (« génétiquement proches ») et transgéniques (« génétiquement modifiées »). c) enfin, nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris Nous utiliserons des souris de « phénotype sauvage » (non génétiquement modifiées) mais également une lignée transgénique car cette lignée possède un plus grand nombre de cellules mémoires particulières dites « MAIT » ce qui permettrait d’observer plus facilement l’effet biologique attendu (influence des cellules mémoires sur le devenir des cellules naïves). Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 12 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.

820 poissons zèbres juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certains passant deux à trois heures dans un test de mémoire dont une heure entière de stimulations électriques. Ils subissent aussi la coupe d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie brève, des séances d'imagerie, et pour d'autres une exposition à des agents pharmacologiques par bain ou par injection. Le porteur qualifie ces chocs de faible intensité et affirme qu'ils n'induisent pas de douleur, tout en retenant le nombre de stimulations reçues par un même individu comme l'un des deux points limites de la procédure. Les poissons expérimentaux sont tués à l'issue, les reproducteurs porteurs de la mutation liée au syndrome Kabuki étant gardés en vie pour maintenir la lignée.

Objectifs

Le syndrome Kabuki, principalement causé par un exemplaire non fonctionnel d'un gène identifié chez l’homme, est caractérisé par une déficience intellectuelle et des troubles immunologiques pour lesquels il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement. Les mécanismes à l'origine de ce syndrome ne sont pas élucidés. Les 3 principaux objectifs du projet sont : (1) de modéliser les anomalies au niveau du système immunologique et du système nerveux du syndrome Kabuki grâce à une lignée de poissons dont l'un des 2 exemplaires du gène correspondant n’est pas fonctionnel; (2) de caractériser chez ces poissons les problèmes induits par le défaut génétique au niveau des cellules nerveuses et immunitaires, et enfin (3) de tester l’effet thérapeutique de plusieurs agents pharmacologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait d’abord valider l'utilisation du modèle pour étudier les troubles immunologiques et du système nerveux du syndrome Kabuki. Une fois ce modèle validé, il nous aidera à déterminer quels sont les gènes et les types cellulaires plus spécifiquement impliqués dans la survenue des problèmes immunologiques et nerveux associés à ce syndrome. Enfin, les tests avec des agents à visée thérapeutique réalisés à la fin de ce projet pourraient aboutir à de nouvelles pistes pour le développement de traitements pour les patients.

Procédures

L’utilisation d’une lignée de poissons-zèbre déficiente pour un gène particulier portant une mutation nécessite de vérifier la présence de cette mutation. Pour cela, une unique procédure d'identification à partir du prélèvement d’un fragment de tissu de la nageoire caudale est réalisée sous anesthésie générale brève (

Impact sur les animaux

La nageoire régénérant rapidement et spontanément chez cette espèce, le prélèvement d'un fragment de tissu de la nageoire caudale ne crée pas de gêne ou d’incapacité durable chez les animaux maintenus en hébergement. Réalisée par un personnel qualifié, elle n’induit généralement aucune douleur. Au cours des tests comportementaux, la stimulation électrique sera calibrée de façon à ne pas interrompre l'exploration spontanée des animaux selon des protocoles bien documentés qui n’induisent pas de douleur. Une attention particulière sera toutefois portée : 1) aux signes de stress, notamment lors de l’introduction dans la zone de test, et 2) au nombre de stimulations subi par un même individu lors de la phase de conditionnement. Ces deux paramètres constituent les points limites majeurs pour cette procédure. Lors des tests pharmacologiques, qui peuvent générer du stress et/ou de l’inconfort sur les animaux, le comportement de nage et la prise alimentaire des animaux expérimentaux seront donc surveillés avec attention durant et après le traitement selon des grilles de scoring adaptées.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à l’issue des procédures décrites dans cette demande d'autorisation de projet, exceptés les animaux portant un exemplaire non fonctionnel du gène d'intérêt, et identifiés après une procédure de vérification de la présence de cette mutation. Ces derniers seront gardés en vie afin de maintenir la lignée à l'état hétérozygote pour assurer la reproduction lors du projet.

Remplacement

Le comportement des poissons et le fonctionnement des cellules immunitaires ne peuvent être étudiés qu’in vivo au niveau d’un organisme entier, il n’est donc pas possible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants pour ce projet de recherche. Le comportement examiné et les cellules immunitaires d'intérêt n’étant matures qu’aux stades juvéniles, il n’est pas possible de mener cette étude à des stades précoces du développement.

Réduction

Nous réaliserons une expérience pilote chez des larves de moins de 5 jours de développement afin de déterminer quel agent thérapeutique de notre panel compense le mieux les effets de la mutation de notre gène d'intérêt chez l’espèce étudiée et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’individus à utiliser a été calculé afin d’obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Enfin nous avons établi des procédures en étapes successives, ce qui permet de stopper l'expérimentation dès que les objectifs scientifiques sont atteints.

Raffinement

Les poissons utilisés sont maintenus avec un seul exemplaire du gène d'intérêt non fonctionnel, ce qui permet d'éviter l'apparition de défauts dommageables pour le bien être des animaux au cours de l'expérimentation. Des grilles d'évaluation seront utilisées pour effectuer un suivi complet du bien-être des animaux selon leur aspect, leur activité, leur prise alimentaire et leur comportementet afin de définir des points limite adaptés en fonction de leur âge. Cette surveillance fine permet, à chaque étape du projet, de prendre des mesures adaptées pour réduire les nuisances sur le bien-être des animaux voire d'interrompre l'expérimentation. Une grande attention sera portée aux conditions d’hébergement et le comportement de nage ainsi que la prise alimentaire des animaux reproducteurs seront l’objet d’une surveillance régulière, trois fois par jour.

Choix des espèces

Le poisson-zèbre a été choisi pour ce projet car les processus biologiques étudiés (mémoire, immunité) ont été bien décrits chez cette espèce. De plus, une lignée de poissons mutante pour le gène d’intérêt a déjà été générée et son étude à des stades précoces a montré l’existence d'atteintes chez ces poissons semblables à celles du syndrome Kabuki. Ces résultats indiquent donc que le poisson-zèbre est un modèle de choix pour permettre à la fois d’étudier les mécanismes de la maladie humaine et de procéder à des tests pour de nouveaux agents thérapeutiques. Les poissons seront utilisés à des stades juvéniles (1 à 2 mois de vie) pour toutes les procédures décrites et sont justifiés scientifiquement par des études préalables qui ont démontré que : 1) le comportement que nous allons tester chez les poissons mutants se développe seulement à partir de 3 semaines de vie, et que 2) concernant l’étude immunologique, les cellules d’intérêt sont impliquées dans la régénération de la nageoire entre 3 et 8 semaines de vie. Une étude pilote utilisant des jeunes larves sera également menée afin de sélectionner de façon rapide et fiable le(s) meilleur(s) candidat(s) parmi les agents pharmacologiques à tester ensuite à des stades plus tardifs.