Système immunitaire

5 652 souris et 1 296 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mères subissent des injections et des gavages à l'état vigile, une césarienne sous anesthésie, une perfusion de deux heures et une traite de quinze à trente minutes, tandis qu'une partie de la descendance reçoit un produit chimique déclenchant une colite pendant deux cycles de six jours. Les régimes imposés aux mères simulent un retard de croissance intra-utérin ou un diabète gestationnel, pour observer les conséquences sur l'immunité intestinale des petits, tués à trois ou cinq semaines. Aucun modèle cellulaire in vitro ne pourrait reproduire l'intégralité de ces interactions, affirme le porteur, qui annonce par ailleurs recourir à des organoïdes intestinaux pour l'analyse fine des mécanismes.

Objectifs

La période périnatale (gestation et allaitement) est une période déterminante pour le développement de l'immunité chez le bébé. Certaines complications pendant la grossesse, comme un retard de croissance du bébé dans l'utérus ou le diabète gestationnel, augmentent le risque que l'enfant développe plus tard des maladies inflammatoires chroniques. Et nous manquons encore de données scientifiques pour comprendre précisément comment ces problèmes perturbent l’immunité du bébé et comment cela perdure dans le temps. Nous utilisons différents régimes alimentaires sur des modèles de rongeurs pour simuler ces complications de la grossesse et étudier leur impact sur le développement de l’immunité du bébé et si cela augmente le risque de maladies chroniques intestinales à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer ou d’infirmer notre hypothèse quant au problème de transfert de l’immunité de la mère à son bébé lors de complications de la grossesse. Notre projet permettra d’identifier les acteurs et les mécanismes mis en jeu, responsables du problème initial et à l’âge adulte. Il permettra de trouver le ou les nutriments manquants pour restaurer les défauts. Le projet devrait ainsi fournir des bases scientifiques pour de futurs essais cliniques afin d’améliorer la santé de la maman et de son bébé, réduisant l'impact des maladies inflammatoires chroniques chez le futur adulte en vue de l'amélioration de la santé de toute la population.

Procédures

Nos deux premiers groupes d'animaux recevront 2 à 3 injections à l'état vigile, et notre troisième groupe, à l'état vigile, recevra 4 administrations par voie orale. Chacun de ces actes sera d’une durée réduite de quelques secondes à 1 minute. Le prélèvement de lait réalisé sous anesthésie durera entre 15 et 30minutes. L'étude des flux de nutriments nécessite de réaliser une perfusion sur animal anesthésié d'une durée de 2h. Les animaux subiront un seul acte chirurgical, une césarienne, effectué sous anesthésie et analgésie, la durée de cet acte est de 10 à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Pour nos trois procédures expérimentales, les préhensions, injections ou administrations par voie orale sur les animaux vigiles devraient constituer un stress et une douleur de faible intensité et d’une durée réduite de quelques secondes à 1 minute, il s'agit d'actes expérimentaux de sévérité légère. Néanmoins, la réalisation consécutive de plusieurs actes expérimentaux incluant nos manipulations à l'état vigil, cités précédemment, avec des actes sur animaux anesthésiés et sous anti-douleur, requalifie nos procédures 1 et 2 en procédures de sévérité modérée. Notre procédure 3 constitue une procédure de sévérité modérée. En effet, l’administration du produit induisant la colite, a un impact modéré au dosage administré au vu des tests déjà effectués au sein de notre animalerie. Cet acte expérimental devrait occasionner une inflammation de grade modéré au niveau du côlon distal durant les deux cycles de 6 jours de traitement. Celle-ci peut être associée à des selles molles ou des diarrhées et une perte modérée de poids. L’arrêt de l’administration du produit (remplacé par de l’eau de boisson seule) entraîne l’arrêt progressif de ces symptômes et une récupération de l’état physiologique normal au bout de 4 jours. Pour toutes nos procédures, l’habituation à la préhension et l’administration par voie orale par des techniciens expérimentés, et l’utilisation de sondes souples, réduira les nuisances à leur niveau minimum. Les animaux auront une inflammation modérée du côlon, ou colite, qui durera 6 jours sur deux périodes espacées d'une période de 14 jours. Cette inflammation peut être associée à des selles molles ou des diarrhées et une perte modérée de poids. L’arrêt du traitement inflammatoire au bout des 6 jours entraine l’arrêt progressif de ces symptômes et un retour à la normale dès 4 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe.

Remplacement

Notre étude implique de suivre l’évolution physiopathologique de la transmission de l’immunité de la mère à sa descendance en situation de complications de la gestation tels que le retard de croissance intra-utérin ou le diabète gestationnel, et d’analyser les conséquences sur la santé intestinale de l’adulte en devenir. L’utilisation d’animaux est indispensable dans les études évaluant l’impact au long cours des complications de la gestation qui sont initiées in utero et qui nécessitent d’étudier l’interface mère-enfant. Par ailleurs, notre projet de recherche implique des interactions multi-systèmes complexes, tels que le microbiote intestinal, l’écosystème microbien le plus riche sur terre, et la muqueuse intestinale, qui met en jeu un système immunitaire très dense. Il n’existe pas de modèle cellulaire in vitro pouvant reproduire l’intégralité de ces interactions. Néanmoins, nous envisageons d’utiliser, pour les analyses plus précises des mécanismes en jeu, des systèmes in vitro de culture cellulaire et des cultures d’organoïdes intestinaux.

Réduction

Ce projet de recherche sur cinq ans implique l'utilisation d'un total de 5652 souris et 1296 rats pour trois procédures distinctes. Le nombre d'animaux par procédure a été déterminé en tenant compte de la variabilité intra- et intergroupe inhérente à l'expérimentation in vivo, avec un minimum de trois répétitions indépendantes pour assurer la reproductibilité des résultats. Cette stratégie permettra une évaluation statistique robuste des effets des régimes alimentaires sur les réponses immunitaires placentaires et intestinales, ainsi que sur l'inflammation intestinale, en incluant des analyses statistiques guidées par des logiciels et des références bibliographiques d’aide à la décision statistique. Ces différents outils nous ont permis de déterminer le nombre optimal d’animaux par groupe pour obtenir des résultats significatifs permettant de répondre à nos hypothèses. Enfin, les schémas expérimentaux et le nombre d'animaux associés à chaque procédure ont été validés par les statisticiens de l'équipe pour garantir leur robustesse et leur efficacité dans la génération de données scientifiques fiables.

Raffinement

L’environnement des souris sera enrichi (tunnel, bâton à ronger, frisottis, dôme). Après deux semaines d'acclimitation à leur environnement les femelles seront mises en reproduction. Une observation hebdomadaire avec suivi du poids des animaux sera réalisée dès leur arrivée dans l’animalerie de façon à identifier un éventuel problème. Les quatre gavages de la procédure 3 seront effectués par un personnel animalier expérimenté et ils seront réalisés en utilisant des sondes fines et souples. Lors de l’induction de l’inflammation intestinale (colite par traitement chimique), les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel animalier compétent pour détecter d’éventuels signes de souffrance. L’évaluation de l’état des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique -pelage, posture-, activité, comportement, fréquence respiratoire). Si une douleur était constatée chez un animal durant le traitement induisant la colite, un analgésique de type central sera administré. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée en nutrition, est idéale pour les études sur les régimes obésogènes, les colites expérimentales et l'âge maternel avancé. Elle offre l'avantage d'être immunologiquement bien caractérisée et d'accéder à de nombreux modèles génétiquement modifiés dans ce fond génétique. La ratte est un modèle maîtrisé au laboratoire, est adaptée à l’étude du retard de croissance intra-utérin induit par un régime pauvre en protéines. Son système immunitaire, proche de celui de l’humain, renforce le potentiel translationnel des résultats. Ce modèle permet également d’évaluer, lors de transferts de microbiote, d’éventuels obstacles interespèces liés à des spécificités microbiennes d’hôte. Ces analyses anticipent la faisabilité du transfert de microbiote humain à murin et ajustent le choix du modèle axénique. De façon à étudier l’effet de l’âge maternel sur le transfert immunitaire de la mère à la descendance, les animaux (rattes et souris) commandés auprès de l’établissement éleveur, pour la première partie du protocole, seront âgés soit de 7 semaines soit de 24 semaines. Après une phase d’acclimatation de deux semaines, les animaux seront mis en reproduction. De façon à étudier l’effet de nos différents régimes sur le transfert d’immunité de la mère à la descendance, une partie des mères gestantes et des fœtus sera mise à mort au dernier tiers de la gestation. L’autre partie des animaux sera maintenue sous leurs régimes respectifs jusqu’au sevrage. Au sevrage, les mères seront traites pour récupération du lait puis mises à mort pour l’analyse de populations immunitaires intestinales. Les petits âgés de 3 semaines seront alors mis à mort pour l’analyse des marqueurs de maturation immunitaire intestinale ou seront placés sous régime contrôle. L’évolution de leur maturation immunitaire sera étudiée et les derniers groupes de descendants seront mis à mort à 5 semaines de vie. Pour la troisième partie du projet, les souris axéniques, sans germe, âgées de 3-4 semaines seront commandées auprès de l’établissement éleveur de façon à réaliser immédiatement à leur arrivée un transfert microbien en période de sevrage. Une partie des animaux sera mise à mort à l’âge de 8 semaines avant l’induction de la colite pour regarder l’état de maturation immunitaire puis à 4 temps différents au cours de la colite pour suivre l'évolution inflammatoire et mimer la pathologie humaine.

Pendant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, la glycémie est suivie en cinétique et du glucose est administré si le seuil défini est franchi. 644 souris génétiquement modifiées pour développer de l'athérosclérose vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Elles subissent des contentions et des injections intrapéritonéales jusqu'à trois fois par semaine, un gavage, deux mises à jeun de cinq heures, des prélèvements de sang à la queue par microcoupure et un prélèvement rétro-orbitaire sous anesthésie. Le porteur annonce un effectif calculé par analyse de puissance sans donner ni le nombre de groupes ni le nombre d'individus par groupe.

Objectifs

L’obésité est associée à une augmentation du risque de développer des maladies cardiovasculaires, en particulier des pathologies des artères du cœur (maladie coronarienne) ou des artères carotides, pouvant entraîner l’infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Ces maladies des artères sont causées par la formation de plaques d’athérome (ou athérosclérose). L’athérosclérose est caractérisée par une réaction inflammatoire chronique dans la paroi des artères, impliquant divers types de cellules immunitaires, dont les macrophages. Cependant, l’impact de l’obésité sur la fonction des macrophages dans l’athérosclérose reste méconnu. Ce projet a pour objectif de (i) caractériser avec précision les macrophages vasculaires dans un modèle combinant l’obésité et l’athérosclérose chez la souris et (ii) évaluer le ciblage thérapeutique des macrophages dans le traitement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité chez la souris, et utilisera pour ce faire un modèle d'athérosclérose associé à l'obésité induite par des régimes particuliers riches en gras et/ou cholesterol. Ce projet nous permettra d’approfondir les connaissances concernant l’impact de l’obésité sur les mécanismes inflammatoires de l’athérosclérose et de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra également d’évaluer l’efficacité thérapeutique du ciblage des macrophages dans le développement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’approfondir les connaissances concernant l’impact de l’obésité sur les mécanismes inflammatoires de l’athérosclérose et de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra également d’évaluer l’efficacité thérapeutique du ciblage des macrophages dans le développement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité.

Procédures

-Contention (maximum 3 fois par semaine; quelques secondes) -Injections intrapéritonéales (maximum 3 fois par semaine; quelques secondes) -Injections intraveineuses sous anesthésie (1 fois, quelques secondes) -Gavage par sonde gastrique (1 fois, quelques secondes) -Prélèvement de sang à la queue sur souris vigiles (2 fois prélèvements répétés sur une période de 2 heures) -Mise à jeun (2 fois 5 heures) -Individualisation pendant les tests de tolérance au glucose ou à l'insuline (2 fois; environ 2h)-Anesthésie (1 fois; quelques minutes) -Prélèvement sanguin rétroorbital sous anesthésie (1 fois; quelques secondes)

Impact sur les animaux

Inconfort lié à la préhension et contention des animaux (nuisance légère de courte durée); injections intrapéritonéales : douleur de courte durée au point d'injection (nuisance légère de courte durée); inconfort lié au gavage du glucose lors du test de tolérance au glucose (nuisance légère de courte durée); prélèvement de sang lors des tests d’intolérance au glucose et à l’insuline: douleur de courte durée au site de prélèvement par microcoupure de la pointe de la queue (nuisance légère de courte durée); mise à jeun des souris avant tests d’intolérance au glucose et à l’insuline: stress liée au retrait temporaire de la nourriture (nuisance légère de courte durée); stress lié à l'individualisation des animaux durant la durée des tests de tolérance à l'insuline et au glucose (nuisance légère de courte durée)

Devenir

Tous les animaux sont mis à morts à la fin de la procédure. La mise à mort est nécessaire pour prélèvement d'organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Les questions scientifiques adréssées dans ce projet ne peuvent l'être que grâce à l'utilisation d'un modèle animal in vivo. En effet, l’athérosclérose et l’obésité sont des maladies impliquant divers organes et types cellulaires interagissant de manière complexe. Les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'athérosclérose et de l’obésité doivent être étudiés dans un modèle qui imite le plus fidèlement possible la pathologie humaine. Actuellement il n'existe pas de système in vitro qui reproduise, imite ou permette la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’obésité et de l’athérosclérose. L’expérimentation in vivo est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie. Les modèles in vivo sont donc une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l’obésité et l’athérosclérose, ou pour évaluer le potentiel effet de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Nous avons déterminé un nombre minimum de souris par groupes expérimentaux pour garantir une analyse statistique fiable, à partir de calculs statistiques (analyse de puissance) et à partir de notre expérience préalable sur les méthodes utilisées dans ce projet. Les données obtenues seront analysés à l'aide de tests statistiques prédéfinis et appropriés. Des mesures spécifiques sont mises en oeuvre pour éviter les biais expérimentaux: randomisation, analyse des données "en aveugle". Nous visons toujours à maximiser l'information qui peut être récupérée à partir d'un seul animal.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Un enrichissement complémentaire spécifique à la procédure sera implémenté : bâtonnets de bois pour éviter la pousse ou abrasion dentaire anormale des animaux sous régime riche en gras (aliment mou). Lors des procédures expérimentales, les nuisances seront réduites au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie adaptés et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Pour la procédure des tests métaboliques de tolérance à l'insuline et au glucose, la glycémie sera suivie en cinétique et l'apport de glucose sera réalisé si nécessaire en fonction des points limites définis. Les animaux feront l’objet d’une surveillance par les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’athérosclérose dans un organisme biologique complexe, développant une pathologie présentant des similitudes à l'athérosclérose humaine. Les souris génétiquement modifiées présentant une prédisposition à l'athérosclérose utilisées dans ce projet représentent un modèle communément utilisé dans ce domaine de recherche, ce qui permettra une intégration et comparaison des résultats obtenus à la littérature scientifique existante. Les complications cardiovasculaires de l'obésité se manifestent à l'âge adulte. Nous utiliserons donc des souris âgées de 8 à 12 semaines au début des expériences, ce qui constitute un âge adulte. De plus, cet âge est communément utilisé dans les modèles souris d'athérosclérose et d'obésité, facilitant ainsi l'intégration et la comparaison de nos données à la litérature existante.

Toutes tuées à l'issue pour que leurs tissus soient prélevés, 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui les fait cesser de prendre du poids vers dix semaines, développer une pathologie musculaire vers un an, puis une atteinte cardiaque qui les tue autour de quatorze mois, avec une survie médiane de 10,8 mois. À 5 et 10 mois, elles passent une semaine de tests comportementaux que le porteur qualifie d'inoffensifs sans les nommer, avant une chirurgie sans réveil. Sur le remplacement, il indique que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier des profils de comportement et affirme devoir passer par la souris, y compris pour accéder à des tissus inaccessibles chez l'humain.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative. Elle se déclare à l'âge adulte (40-80 ans) et évolue, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient. Elle est causée par la mort de certains neurones, entraînant un affaiblissement progressif et une atrophie des muscles. A ce jour, il n'existe pas de traitement contre la SLA car les mécanismes sont méconnus. La SLA touche les deux sexes et son incidence augmente avec l'âge à partir de 40 ans. De manière intéressante, elle peut dans certains cas être associée à des troubles de type démence. Des travaux précèdent sur une cohorte de patients souffrant de cette forme de démense, avait permis d’identifier une mutation sur un gène . Un modèle murin a été créé et caractérisé. Parmi tous les facteurs impliqués dans la pathogenèse, certains défauts dans la cellule s’avèrent essentiels et pourrait contribuer à la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Nous émettons l'hypothèse qu’un type de désorganisation cellulaire déclenche des cascades dans le système nerveux central, contribuant à la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Nous voulons ainsi tester l’inhibition de cette cascade sur la neurodégénération.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément les mécanismes moléculaires conduisant à la neurodégénérescence. Ils pourraient également permettre le développement de modèle pouvant être utilisés pour développer de nouveaux médicaments ciblant les mécanismes imlpliqués, pour permettre de prévenir ou freiner le développement des maladies neurologiques chez les patients. Dans cette optique, notre partenaire va tester sur des modèles cellulaires l'efficacité de l'Elamipretide (un médicament déjà utilisé dans des essais cliniques en phase précoce). A plus long terme, un essai préclinique dans notre modèle murin pourrait être développé. Ce projet présente également potentiellement des bénéfices clinique et sociétal : Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un projet financer par l'Agence Nationale de la Recherche et il se fait en collaboration avec des cliniciens. Ainsi les résultats obtenus ont le potentiel d'améliorer la prise en charge de plusieurs maladies rares en termes de diagnostic moléculaire et d'engagement des patients/public. En mettant l'accent sur les processus pathogènes dans les maladies mitochondriales reconnues et les maladies neurodégénératives, ce projet contribuera à la définition de cibles thérapeutiques. Actuellement, les traitements pour les maladies mitochondriales et les maladies neurodégénératives sont inefficaces et la prise en charge des patients a un coût important en termes de santé publique en raison de la gravité de l'invalidité présentée par ces patients. Les avantages économiques de cette recherche sont difficiles à évaluer à ce stade. Néanmoins, les bénéfices pour les patients en termes d'optimisation du diagnostic sont inestimables et les possibilités thérapeutiques potentielles permettront de réduire le coût des soins.

Procédures

Des tests comportementaux seront effectués sur les animaux de 5 et 10 mois pendant 1 semaine. Aucune nuisance d’ordre général n’est attendue durant ses tests compte-tenu de leurs innocuités. Une étape d’habituation sera effectuée en amont pour limiter les perturbations dues à la manipulation. Une chirurgie sans réveil sera effectuée avant analyse de certains tissus.

Impact sur les animaux

L'étude de la lignée murine réalisée par nos collaborateurs indique qu’elles sont normales à la naissance mais à partir de 10 semaines commencent à moins prendre de poids. Vers l'âge d'un an, elles présentent une pathologie des muscles . Leur état s'aggrave rapidement avec une perte de poids importante et des tremblements, et elles développent une pathologie du coeur sévère, conduisant à la mort des animaux vers 14 mois. Cette étude indique également que le modèle présente une altération des capacités d'apprentissage et de mémoire dès 10 mois. L’atteinte neurologique est mesurable mais reste limitée et n’est pas responsable de la mortalité, qui est principalement liée à la pathologie cardiaque. Les signes cliniques apparaissent au stade terminal, débutant par une perte de poids importante. De même, l’apparition de symptômes tels qu’un affaiblissement partiel de l’extension des pattes ou des tremblements, combinée à l’incapacité de la souris à se retourner sur le flanc en moins de 15 secondes, indiquera une réduction significative de la mobilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car leurs tissus seront récoltés pour analyse.

Remplacement

La caractérisation du modèle a d’abord été réalisée avec des modèles cellulaires. Les expériences réalisées sur des fibroblastes issus de patients porteurs de la mutation d'intérêt ont permis d'identifier de potentiels mécanismes impliqués dans les atteintes mitochondriale et neurodégénérative. Cependant, pour l’étude de maladies neurodégénératives avec des composantes motrices et cognitives, les modelés cellulaires ne peuvent pas être utilisés pour disséquer les effets des variations moléculaires sur des profils de comportements. C’est pourquoi nous devons utiliser le modèle murin pour mieux comprendre la pathologie au cours du temps et pour tester si l’inactivation d’un processus moléculaire peut ralentir ou inverser les processus pathologiques permettant d’envisager des voies d’intérêt thérapeutiques dans l’avenir. L'utilisation de modèles murins, permet aussi d'accéder à des tissus auxquels on n'a pas accès chez l'homme.

Réduction

Avec l’aide des statisticiens de notre institut de recherche, les protocoles permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement ont été établis, réduisant au maximum le nombre d’animaux. Ainsi dans un but de réduction du nombre d’animaux à utiliser pour cette étude, des statistiques prédictives ont été réalisées dans le but d’utiliser le minimum d’animaux nécessaires et les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique, vérifiée par les statisticiens.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux inclus dans le projet, axé sur leur état général de santé, est prévu. Il sera associé à l’utilisation d’une fiche d'observation détaillée permettant un suivi optimal des animaux. Ce suivi quotidien permettra d’identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Le phénotype de notre modèle murin étant associé à une perte de poids. En effet à partir de l'âge de 10 semaines, les souris malgré un apport calorique normal ne prennent plus de poids normalement. Les courbes de poids au cours des 5 dernières semaines de vie montrent qu’une perte rapide de poids peut être observée avant le stade final. De plus l'analyse de survie a révélé que les souris avaient une survie significativement réduite par rapport à leurs compagnons de cages non génétiquement modifiés, avec une survie médiane de 10.8 mois. Ainsi, dès 8 mois, en plus d’être pesés une fois par semaine, une surveillance accrue sera mise en place : la fréquence du suivi augmentera, de l'eau et de la nourriture gélifiées seront placées au sol dans la cage pour éviter des complications si les animaux éprouvent de l'inconfort ou des difficultés à atteindre la trémie alimentaire et la source d'eau. De plus si des signes de stress sont observés, l’enrichissement de la cage sera amplifié (avec litière en cellulose, tunnels en carton, rouleaux de coton, etc.). Enfin, lors de cette surveillance quotidienne, si la perte de poids dépasse un seuil par rapport à la pesée précédente, cela conduira à la mise à mort.

Choix des espèces

La caractérisation du modèle murin a permis de mieux comprendre comment la mutation étudiée (chez l'Homme) d'un gène codant pour une protéine mitochondriale est impliqué dans le dysfonctionnement mitochondrial. Cette caractérisation a en particulier permis de montrer que le modèle murin présente des déficits moteurs ou cognitifs qui sont liés à un déficit de traitement des signaux de communication chez la souris mesurée par des méthodes d’électrophysiologie L'analyse du phénotype neurodégénératif des souris pourra permettre d’étudier si l’invalidation de certains gènes permet une protection contre la neurodégénérescence. L'évolution du phénotype pourra également être étudiée au cours de la vie relativement courte de l'animal et seul le modèle murin permet cette étude comportementale. Nous avons identifié les stades de développement intéressant à étudier sur la base de résultats publiés précédemment. - stade précoce, apparition des premiers signes moléculaires = 5 mois de vie : dans ce modèle l’atteinte neurologique est mesurable mais reste limitée et n’est pas responsable de la mortalité, qui est principalement liée à la cardiomyopathie. Ce modèle ne présente aucun phénotype avant l’âge de 6 mois et le stade 5 mois correspond à l’apparition d’une atteinte mitochondriale au niveau moléculaire. - stade final précédant l'atteinte finale de la maladie = 10 mois de vie : à partir de l’âge de 6 mois les animaux commencent à perdre du poids et développent une cardiomyopathie mitochondriale fatale avant l’âge de 14 mois (survie médiane de 10.8 mois).

1 250 souris vont être utilisées, dont cinquante pour entraîner le geste chirurgical et quinze par donneur humain, avec des mises à mort échelonnées sur trois dates. Une partie est immunodéficiente, donc exposée aux infections et aux tumeurs, ce que le porteur nomme un phénotype dommageable. Chacune subit deux chirurgies de la moelle épinière à quarante-huit heures d'intervalle, l'une pour détruire la myéline, l'autre pour y greffer des cellules immunitaires humaines, puis des tests de traversée d'une barre crantée et de force des pattes avant. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour fabriquer le modèle animal de sclérose en plaques qui manque aujourd'hui.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire et démyélinisante du système nerveux central. Dans cette pathologie les macrophages et lymphocytes du sang pénètrent le cerveau et la moelle épinière et viennent détruire une composante essentielle du système nerveux : la myéline. On distingue différent type de lésions décrites chez les patients atteints de sclérose en plaques. Un type de lésion en particulier est associé à une maladie plus agressive. Mais, à l’heure actuelle, aucun modèle animal ne permet l’étude de ce genre de lésion. L’objectif de ce projet sera de développer un nouveau modèle animal de lésions chroniques actives afin d’étudier la formation et l’évolution de ces lésions que l’on observe chez les patients atteints de forme agressive de la maladie.

Bénéfices attendus

En France, plus de 130 000 personnes vivent avec la sclérose en plaques (SEP), une maladie qui touche 2,8 millions de personnes dans le monde. Elle est souvent diagnostiquée entre 25 et 35 ans, mais peut aussi apparaître plus tôt ou plus tard. Chaque année, 5 000 nouveaux cas sont recensés en France. La SEP concerne principalement les femmes (trois malades sur quatre), mais leur progression vers le handicap est plus lente que chez les hommes, qui présentent un risque plus élevé de complications neurologiques. Il existe deux formes principales de la maladie : La forme rémittente (RR) : elle évolue par poussées, avec des symptômes qui apparaissent puis disparaissent. C'est la forme la plus fréquente et elle débute souvent entre 25 et 35 ans. Avec le temps, elle peut évoluer vers une forme plus sévère. La forme progressive (PP) : plus rare, elle se développe généralement après 40 ans et entraîne un handicap progressif, sans poussées distinctes. Les traitements actuels sont efficaces pour la forme rémittente, mais restent très limités pour la forme progressive, qui est la plus sévère. Certains types de lésions sont associés à cette forme aggressive de de la maladie, mais il manque aujourd’hui un modèle animal permettant de étudier en détail la formation et le développement de ce type de lésion. Notre recherche vise à mieux comprendre ces lésions et, à terme, à tester de nouveaux traitements pour améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Une partie des animaux auront une seule procédure chirurgicale pour optimiser le geste chirurgical menant à une lésion de démyélinisation de la moelle épinière. Les animaux participeront à deux tests comportementaux afin d’évaluer leurs capacités motrices. Dans le premier test, l'animal est placé sur une barre crantée et on mesure la durée de la traversée de la barre et le nombre d'erreurs, l'animal étant libre de ces mouvements durant le test. Dans le deuxième test l'animal est placé sur une grille sur laquelle l'animal s'accroche ce qui nous permet de mesurer la force de ses pattes avant. Ces deux tests comportementaux durent respectivement 90 secondes et 60 secondes. Les animaux réaliseront 2 procédures chirurgicales sous anesthésie générale et analgésie adaptée, à 48 heures d’intervalle, l’une pour la mise en place de la lésion de démyélinisation et la deuxième pour l’injection de cellules immunitaires humaines sur le site lésionnel. Chaque chirurgie durera 15 minutes. Une dernière procédure sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera réalisée pour évaluer les voies sensorielles de l’animal entre une zone stimulée et le cerveau (1 fois, 30 minutes maximum par animal). Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Une partie des animaux utilisés dans le projet sont immunodéficients (phénotype dommageable) et seront donc susceptibles de contracter des infections et des tumeurs. Les tests comportementaux pourront générer un stress aux animaux dû au changement d’environnement et aux manipulations. Les procédures chirurgicales (lésion de démyélinisation, greffe de cellules humaines) génèreront une douleur et un inconfort post-opératoire, et pourront être associées à des complications inattendues telles qu’un saignement ou une infection. L’anesthésie générale nécessaire pour leur réalisation impliquera une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements post-mortem nécessaires pour répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Le seul moyen à notre disposition pour décortiquer le processus de remyélinisation endogène et de démyélinisation chronique est d’utiliser un modèle animal bien établi du processus de démyélinisation/ remyélinisation développé il y a 20 ans que nous avons réadapté pour le rendre plus proche des conditions pathologiques des patients. En ce qui concerne la souche de souris immunodéficiente utilisées, la greffe de cellules humaines nous contraint à utiliser les souris les plus adaptée pour éviter le rejet de greffe. Pour étudier le processus de développement d’une lésion chronique l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. En effet des alternatives pour étudier la remyélinisation existe (comme l’utilisation de culture ex vivo de cervelet) mais celles-ci ne peuvent pas être utilisé dans notre cas car nous étudions l’évolution d’une lésion à long terme (3mois). De plus l’étude de tissus humain ne nous permet l’étude qu’à un temps donné des lésion chronique et non l’évolution. Il nous est donc impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas ces animaux

Réduction

Pour l'optimisation du geste chirurgical, des souris seront utilisées. Nous avons défini qu’un maximum de 50 souris pourrons être utilisées sur les 5 années du projet afin de perfectionner la technique d’injection dans le cordon dorsal de la moelle épinière. De plus, nous allons étudier la mise en place d’une lésion chronique en greffant les lymphocytes de deux types de patients atteints de sclérose en plaque, nous aurons 2 groupes de patients avec 20 patients par groupe et 40 donneurs sains, soit 80 sujets au total. Pour chaque patient, nous injecterons 15 souris puis nous échelonnerons les euthanasies sur 3 temps différents nous permettant ainsi d’avoir au final 5 souris par temps d’euthanasie et par patient. Par expérience nous savons que cet effectif sera suffisant pour des tests statistiques fiables. Pour les analyses statistiques nous aurons donc pour chaque temps 400 souris au total, 100 pour le premier groupe de patient avec une forme modérée de la maladie , 100 pour le deuxième groupe de patient avec une forme aggressive de la maladie et enfin 200 pour le groupe de donneurs sains. Nous aurons donc besoin au total de 1250 souris au total.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie définies par les normes européennes (directive européenne 2010/63/UE) soit 22Cplus ou moins 2C pour la température et entre 45 et 65 pourcent d’hygrométrie avec un cycle jour,nuit progressif de 12h. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe avec carré de coton et bâton à ronger) et observés quotidiennement. Ils bénéficieront d’une semaine d’acclimatation à leur arrivée. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désignée si nécessaire. Les animaux sont hébergés dans des cages à ventilation individuelles, des précautions lors de la manipulation sont prises comme manipulation sous hotte, changement de gant et nettoyage de l’endroit de manipulation entre chaque cage. Ils seront ensuite habitués à l’expérimentateur pendant 1 semaine avant le début des procédures pour réduire leur stress. Les animaux auront une période d’acclimatation aux pièces à raison de 30min à 1h avant chaque début des expériences comportementales, acclimatation également aux tests comportementaux à raison de 3 essais/tests/jours avant d’établir la performance basale de l’animal, pour diminuer le stress de l’animal. Entre chaque essais l’animal aura un temps de repos au minimum égal à son temps passé à faire le test. De plus les animaux seront manipulés de façon à diminuer le stress Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésiques adaptée. Une surveillance renforcée sera mise en place en période post-chirurgie pendant 2 jours et puis 2 fois par semaine après la première semaine afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux et afin d’adapter la prise en charge analgésique en fonction de l’observation de signes de douleurs une grille de score (mise au point avec la structure du bien être animal est utilisée pour définir la prise en charge de l’animal. En cas de signe de mauvaise santé (stress, blessure, comportements anormaux) un avis vétérinaire sera demandé, Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

Notre projet nécessitant un acte chirugical d’injection dans la moelle épinière, nous prévoyons d’optimiser le geste chirurgical des personnes (étudiants ou ingénieurs) associés à ce projet sur des souris immunocompétentes avant de réaliser ce geste ainsi que les injections de cellules humaines aux souris immunodéficiences. Notre projet nécessitant des greffes de cellules immunitaires humaines, nous utiliserons des souris immunodéprimées. En effet, ces souris présentent un système immunitaire déficient, elles sont donc de bonnes candidates pour la greffe de cellules humaines car il n’y aura pas de rejet de greffe. Les souris sont utilisées car le modèle de démyélinisation a été bien décrite chez la souris et nous avons une grande expérience de ce modèle dans notre équipe. Les animaux utilisés sont âgés d’au moins 8 semaines afin d’avoir une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes).

Dès l'âge de 4 ou 6 semaines et jusqu'à 60 semaines, des souris, des rats et des hamsters dorés reçoivent une alimentation hypercalorique, avec ou sans boissons enrichies en fructose, en éthanol ou en composé pro-inflammatoire, pour provoquer obésité, diabète ou stéatose du foie. 4 750 rongeurs, soit 2 750 souris, 500 rats et 1 500 hamsters dorés, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés testés une à deux fois par jour, par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen ou dans une veine sous anesthésie, subissent trois prises de sang et passent à trois reprises 40 heures seuls en cage sans enrichissement, et 24 heures sur grille en cage métabolique en fin de projet. Le porteur retient le hamster parce qu'il "consomme spontanément" l'éthanol, et invoque la hausse de la consommation d'alcool depuis la pandémie de COVID-19. En fin de projet, tous sont tués pour prélever leurs tissus et leur sang.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, le rat et le hamster, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

2 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et chacune peut être bloquée jusqu'à quatre fois, sans anesthésie, en position fœtale au bout d'un tube en plastique percé, pour mesurer sa masse grasse. Pour celles nourries d'un régime riche en graisses avant l'âge adulte, le porteur estime que la prise de poids "ne devrait pas dépasser 200% du poids initial". 1 472 souris subissent une neurochirurgie de 90 minutes et autant un gavage quotidien de cinq jours. 1 312 passent dix jours seules en cage hermétique, et autant subissent un jeûne de 7 heures puis des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avec des glycémies prises par entaille de la queue, une zone que le porteur dit "non innervée". Toutes sont tuées à l'issue, 2 560 d'entre elles par une injection dans l'abdomen sous sédation et sans anesthésie, pour prélever cerveau et tissu gras. Les thérapies contre l'obésité restent au conditionnel : ce projet "pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques", écrit le porteur.

Objectifs

Le poids de notre corps reste assez stable tout au long de la vie adulte grâce à un mécanisme que l'on appelle le "set-point", qui correspond à un poids de référence que notre organisme cherchera à conserver Ce mécanisme est contrôlé par le cerveau, en particulier par une région appelée l'hypothalamus, qui communique avec les graisses du corps pour gérer l'énergie disponible en modifiant le comportement alimentaire, le stockage et l’utilisation des calories ingérées. Cependant, des facteurs biologiques et environnementaux peuvent modifier le set-point du poids corporel comme c’est le cas dans la maladie de l'obésité. Lorsqu'une personne prend du poids, le corps met en place des mécanismes pour le maintenir, ce qui rend difficile de perdre du poids de manière durable. Cela explique pourquoi 80 % des personnes qui ont suivi un régime ou ont recours à une thérapie de l’obésité reprennent du poids rapidement après l'avoir perdu. De récentes recherches scientifiques suggèrent que les altérations du système nerveux et des cellules du système immunitaire du cerveau, appelées microglie, puissent jouer un rôle dans le set-point du poids. Elles pourraient expliquer pourquoi le corps "se souvient" de l'obésité, ce qui facilite la reprise de poids. Ici nous proposons d’étudier leur rôle dans le maintien et dans la reprise du poids.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’1 milliard le nombre de personnes souffrant d’obésité à travers le monde, ce qui représente un problème de santé publique de la plus haute importance. Malgré l’existence de thérapies pour la réduction du poids, la plupart des patients reprennent du poids. Cette reprise de poids et l’incapacité de maintenir dans le temps le poids perdu sont de vraies urgences clinques pour la gestion de l’obésité. Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes biologiques participant au changement du set-point du poids corporel, dans l’espoir de fournir à l’avenir de meilleurs traitements aux personnes affectées. À court terme, notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes biologiques concernant l’altération du set-point du poids corporel, qui contribue au maintien de l’obésité et des comorbidités associées. À plus long terme, ce projet pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’obésité

Procédures

Voici la liste des gestes techniques réalisés sur les animaux. 1) Analyse de la composition corporelle (2624 souris) : l’analyse de la composition corporelle (mesure de la masse grasse et de la masse maigre) nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique présentant des trous afin de permettre le passage de l’air, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris feront au maximum quatre analyses de ce type au cours du projet. 2) Neurochirurgie : (1472 souris) cette technique d’injection intra-cérébrale est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 90 minutes. Une injection sous-cutanée sera réalisée sur souris vigiles 30 minutes avant la neurochirurgie, puis 1 par jour dans les 2 jours suivants, afin d’administrer les médicaments anti-douleurs. Cinq autres injections sous-cutanées seront réalisées lorsque les souris seront anesthésiées (2 d’anesthésiques locaux, 1 d’anti-douleur et 2 de réhydratation). Les souris concernées n’auront qu’une seule neurochirurgie au cours de l’étude. 3) Injections abdominales (2624 souris) : 1152 souris recevront des molécules par injection abdominales ponctuelle sans anesthésie durant deux semaines maximums. Toutes les souris (2560) recevront également un euthanasiant par voie abdominale (injection unique), sans anesthésie préalable mais sous sédation, après une injection sous-cutanée d’un sédatif. 4) Gavage oral (1472 souris) : un gavage oral sera réalisé 1 fois par jour durant 5 jours, sans anesthésie. 5) Cages pour l’étude de la dépense énergétique (1312 souris) : les souris seront transférées dans des cages hermétiquement fermées pour étudier leur dépense énergétique, ce qui augmente leur état d’isolation social. Elles vivront dans ces cages pour une durée de 10 jours. Cela n’aura lieu qu’une seule fois au cours de l’étude. 6) Test de tolérance au glucose (GTT) et d’insuline (ITT) (1312 souris): ces tests nécessitent de réaliser, après un jeûne d’une durée maximale de 7 heures, une injection dans l’abdomen des souris, puis de mesurer leur glycémie à différents temps post-injection. Entre 4 et 6 mesures de glycémie se font grâce à une goutte de sang obtenue après entaille de l’extrémité de la queue, une région non innervée qui ne cause pas de douleur. Ces tests se réalisent sans anesthésique ou analgésique qui biaisent les résultats de glycémie. Ces tests durent au maximum 120 minutes et ne seront réalisés qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet permettent un hébergement en cage collective tout le long de l’expérience. Cependant, pour les tests de dépense énergétique au sein de cages hermétiquement fermées, les souris adultes devront être hébergées de manière individuelle pendant 10 jours maximum, empêchant ainsi les interactions sociales. Pour l’ensemble des procédures, les souris subiront un stress d’immobilisation d’une durée de 5 minutes au maximum lors de l’analyse de composition corporelle, qui nécessite l’insertion de la souris dans un tube en plastique afin de pouvoir faire l’analyse, avec des trous pour le passage d’air. Les souris sous régime alimentaire gras vont prendre du poids de manière significative. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. Les souris qui passeront les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent perdre du poids après le jeûne, d’une durée totale de 7 h. La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. Enfin, des douleurs post-opératoires sont possibles pour les souris ayant une neurochirurgie. Il est possible d’observer une perte de poids/appétit lors de la période post-opératoire. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés et certains de leurs organes seront récupérés (cerveaux, tissu gras, autres) pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle du système nerveux et des cellules immunitaires du cerveau dans la reprise de poids et l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et communique avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu gras…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de ce dialogue entre le cerveau et différents organes. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire, le changement du poids, la dépense énergétique, nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu nos expériences de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximum dont nous estimons avoir besoin durant les 5 ans que durera ce projet. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera (par exemple en regroupant les mâles et les femelles dans nos analyses, si nous constatons que le sexe n’influence pas les résultats de nos tests).

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 4 semaines et y seront habitués pendant 1 semaine minimum. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux possiblement dû au nouvel espace d’hébergement. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages inclut l’utilisation de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons les tunnels pour manipuler les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite une neurochirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès le début de l’anesthésie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu par injection sous-cutanée d’une solution de réhydratation. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropries ont été́ définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie/suture (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera immédiatement retiré de l’étude et euthanasié, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire est depuis longtemps étudiée chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à̀ ce type d’études. En effet, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel fait de cette espèce un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de notre étude, la réaction inflammatoire induite par un régime alimentaire riche en graisses est retrouvée à la fois chez la souris et chez l’Homme, ce qui rend d’autant plus pertinent l’étude de ce phénomène chez cette espèce. Enfin, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Toutes les souris de cette étude arriveront à 4 semaines d’âge dans notre animalerie. Cet âge a été choisi car il est important que le début du régime riche en graisses commence avant l'âge adulte. En effet, des scientifiques ont montré que les effets de l'obésité sont plus marqués lorsqu'ils sont induits avant l'âge adulte.

1 214 souris vont être utilisées dans un modèle de sclérodermie, chacune pouvant recevoir 24 injections intrapéritonéales, 40 gavages, deux injections intraveineuses caudales et deux instillations oro-pharyngées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À cela s'ajoutent une imagerie, un acte chirurgical et des transports entre trois établissements, dont le porteur reconnaît qu'ils stressent les animaux. Les atteintes cutanées apparaissent vers la quatorzième semaine, la perte de poids et la mobilité réduite vers la dix-septième. Toutes les souris sont tuées, une partie faute de porter le génotype recherché, tandis que les bénéfices annoncés se limitent à identifier "à terme" de nouveaux candidats médicaments.

Objectifs

La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.

Devenir

Une partie des animaux seront mis à mort car sans génotype d'interêt. L'autre partie seront mis à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques.

Remplacement

Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.

Les souris subissent cinq injections sous-cutanées par semaine pendant dix, vingt-huit ou quarante-deux jours, ou une incision dorsale sous anesthésie pour implanter une mini-pompe diffusant un inducteur de fibrose pendant sept à vingt-huit jours. 126 souris âgées de six à huit semaines sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le produit injecté enflamme et épaissit la peau, les poumons et les reins, ce qui reproduit une partie de la sclérodermie systémique pour y repérer des pièges extracellulaires de neutrophiles. Le porteur annonce une surveillance rapprochée destinée à détecter des points limites "préalablement établis", sans indiquer lesquels.

Objectifs

La sclérodermie systémique est une maladie qui modifie et épaissit la peau et d’autres organes les empêchant de fonctionner correctement. Il n’existe pas encore de traitement efficace. Certains globules blancs de notre organisme (les neutrophiles) sont capables d’éjecter autour d’eux un ensemble de molécules que l’on appelle NETs et qui dans des conditions normales forment des pièges à bactéries. Cependant, ces molécules peuvent être libérées de façon incontrôlée et être impliquées dans la progression de certaines maladies. Le rôle des NETs dans la sclérodermie est encore mal compris. Nous avons montré que des neutrophiles de patients libérent plus de NETs que ceux de sujets sains lorsqu’ils sont stimulés in vitro. Dans ce projet, nous visons à mettre en évidence l’existence de NETs dans des souris chez lesquelles nous aurons reproduit en partie la sclérodermie afin de pouvoir tester dans le futur des médicaments qui empêcheraient la formation des NETs et qui potentiellement freineraient l’avancement de la maladie.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’acquérir des connaissances supplémentaires sur les phénomènes mettant en jeu les NETs dans les tissus et dans la circulation sanguine lors de la progression de la maladie et ainsi démontrer la pertinence de chacun des modèles pour l’utilisation ultérieur d’un inhibiteur de NETs. A plus long terme, cela nous permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les NETs dans un contexte de sclérodermie systémique.

Procédures

Dans une première procédure, les souris subiront une injection sous-cutanée d'une solution induisant la fibrose ou d'une solution saline, 5 fois par semaine pendant 10, 28 ou 42 jours. Dans une seconde procédure, les souris subiront 1) une injection sous-cutanée d'une solution d'anesthésiant, 2) une incision au niveau dorsal pour créer une poche sous-cutanée dans laquelle sera implantée la mini-pompe osmotique contenant une solution induisant la fibrose ou une solution saline et 3) une suture. La durée de l'intervention sera de 10 à 15 minutes et la diffusion sous-cutanée de la solution fibrosante durera 7, 18 ou 28 jours.

Impact sur les animaux

L’injection sous-cutanée peut causer une douleur légère de courte durée. La manipulation, l’anesthésie et l’intervention chirurgicale peuvent être des sources importantes de stress physiologique et psychologique chez la souris. Lors de la pose de la mini-pompe, les souris peuvent ressentir de la douleur ou de l’inconfort à l’endroit de l’implantation. Les injections répétées ainsi que la diffusion sous-cutanée des inducteurs de fibrose induisent une inflammation et un épaississement des tissus cutané, pulmonaire et rénal.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire et des NETs en particulier nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Les résultats précédemment publiés par la communauté scientifique nous ont confirmé qu’il n’existe pas d'autre possibilité que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes mettant en jeu plusieurs types cellulaires au cours de la sclérodermie systémique. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécéssaire au plus juste grâce à un logiciel de statistique afin de limiter le nombre de souris utilisées. Pour l’analyse des résultats a posteriori, des tests statistiques adaptés seront utilisés. Une répartition aléatoire des animaux sera réalisée dès leur arrivée. Une banque de tissus sera récupérée pour éviter de refaire des expériences dans l’avenir.

Raffinement

Nous utiliserons une mini-pompe pour faire diffuser l'inducteur de fibrose dans la peau, évitant les injections répétées. Le deuxième inducteur de fibrose que nous utiliserons est très instable dans le temps et nécessite d’être préparé extemporanément. Dans le cas des injections répétées de ce second inducteur, les injections seront réalisées par deux expérimentateurs au niveau du dos de l’animal. Une rotation systématique dans le sens des aiguilles d’une montre sera faite afin de ne pas injecter quotidiennement au niveau du même site. Par ailleurs, ces expériences (injections multiples ou implantation pompe) ne se feront pas en un seul essai (126 animaux) mais seront fractionnées de façon à travailler sur des groupes plus petits améliorant la prise en charge de chacune des souris. Dans le cas de l’implantation de la mini-pompe, une analgésie pré-opératoire sera effectuée par injection sous-cutanée de buprénorphine. Une surveillance post-opératoire rigoureuse sera mise en place après l’intervention pour détecter tout signe de douleur, d’infection ou autres complications. Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter les points limites préalablement établis et d’éviter ainsi tout stress et souffrance. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle cellulaire capable de reproduire la complexité des interactions entre le système immunitaire, le système vasculaire et les tissus. La souris est considérée comme le modèle le plus approprié à l’étude de ces interactions complexes et plus particulièrement à l’étude du système immunitaire. En effet, la maturation ainsi que la réponse à un stimulus du système immunitaire murin sont très proches de celles de l’Homme. Les souris utilisées dans ce projet seront des souris « jeune adulte » âgées de 6 à 8 semaines. Les souris à cet âge ont un système immunitaire mature, essentiel pour modéliser la réponse inflammatoire et fibrotique propre à la sclérodermie. En termes de poids et de taille, les souris de 6 à 8 semaines sont assez robustes pour tolérer les injections répétées sans causer de stress excessif pouvant conduire à une mort prématurée. Les souris de cet âge peuvent par ailleurs subir l’intervention chirurgicale associée à l’implantation de la mini-pompe sans complication post-opératoire. Enfin, ce stade de développement permet une tolérance à la mini-pompe sous-cutanée et favorise une diffusion homogène de l'inducteur de fibrose.