Système immunitaire
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- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
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- Système urogénital
Efficacité et toxicité de candidats médicaments impliqués dans le traitement du cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
30 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dans environ 600 études de 50 souris destinées à tester des candidats médicaments contre le cancer. Selon les études, elles reçoivent des tumeurs humaines ou murines par chirurgie ou par injection, et peuvent subir d'autres chirurgies jusqu'à 30 minutes, castration ou interventions sur le fémur, le foie ou le poumon, ainsi que des traitements par toutes les voies, des séances d'imagerie jusqu'à 45 minutes et des prises de sang. Certaines sont immunodéficientes, d'autres dotées d'un système immunitaire humain à partir de cellules de cordon ombilical ou de sang humain. Le porteur justifie leur mise à mort par l'implantation de tumeurs, sans rien dire du sort des souris sans tumeur prévues pour des études pilotes, de biodistribution et de toxicité. Il indique avoir fixé l'effectif d'après les études des années antérieures, en anticipant une croissance annuelle "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines implantés sur des souris immunodéficientes (diminution de l’état d’immunité de l’organisme), immunocompétentes (≠immunodéficience, capacité normale de l’organisme à se défendre contre une infection) ou humanisées à l’aide de cellules souches issues de cordons ombilicaux humains ou de cellules sanguines provenant du sang périphérique (PBMC). Différentes stratégies d’implantations des tumeurs pourront être réalisées en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir la fonctionnalité d’un candidat médicament dans un modèle se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'Homme.
Procédures
Injection par voie intraveineuse : 2 fois maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Chirurgie avec implantation de fragments de tumeurs : moins de 5 minutes. Injection de cellules tumorales : moins de 5 minutes. Autres chirurgies (castration, fémur, foie, poumon, …) : entre 5 à 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, tumorale, dermique, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie d’une durée comprise entre 10 et 45 minutes. Le suivi de l’état de santé des animaux se fera par score clinique (aspect des poils, mobilité, état corporel, …) ou bien par palpation (ou autre geste technique). Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire d’établissement et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par les injections, les chirurgies, le développement de tumeurs et des éventuelles métastases, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques injectés et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront été implantés avec des cellules tumorales ou des fragments de tumeurs dérivées de patients ou auront développé une tumeur. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 30128 souris seront utilisées, couvrant une période de 4 ans et permettant de réaliser environ 600 études précliniques de 50 souris et 2 études précliniques de 64 souris chacune pour la castration des souris R26-p53PC. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction du type d’étude. Des études pilotes pourront être réalisées afin de déterminer le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir un résultat interprétable.
Raffinement
En début d’étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En plus de ces conditions minimums légales, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées régulièrement à la présence humaine. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, de la perte de poids, et le cas échéant du volume tumoral ou de l’apparition d’une ulcération tumorale.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang. La castration pourra être réalisée à partir de 10 semaines d’âge.
Evaluation préclinique de composés visant à prévenir et traiter la lymphopénie radio-induite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 018 souris vont être utilisées, chacune recevant une greffe de cellules tumorales sous la peau puis jusqu'à dix injections de composés, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus et des organes. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. L'abdomen est irradié sous anesthésie gazeuse pendant un quart d'heure, ce qui provoque selon le porteur une toxicité et une perte de poids modérée dans les jours suivants, les tumeurs entraînant une gêne et un inconfort qualifiés de modérés. Le projet vise d'abord à installer chez la souris un modèle de chute des lymphocytes après radiothérapie, l'espoir d'un traitement pour les patients étant placé "à plus long terme" et suspendu à d'éventuels essais cliniques.
Objectifs
La radiothérapie fait partie du traitement de près de 60% des patients atteints de cancer, que ce soit dans le cadre d’un traitement ou à des fins palliatives. Un des mécanismes d’action de la radiothérapie est l’induction de dommages létaux au niveau de l’ADN des cellules, et notamment des cellules tumorales. La radiothérapie est délivrée principalement par des accélérateurs externes et les rayons, pour atteindre la tumeur, traversent également des tissus sains et touchent des vaisseaux sanguins. Les lymphocytes sont des cellules très radiosensibles. Un des effets secondaires majeurs de la radiothérapie réside dans la survenue d’une lymphopénie. Il s’agit d’une baisse drastique du taux de lymphocytes après le début du traitement par radiothérapie. La lymphopénie radio-induite (RIL) est un phénomène transitoire qui dure généralement jusqu’entre 3 et 9 mois après la fin du traitement par radiothérapie. Elle peut persister parfois pendant des années après le traitement. La sévérité comme la durée de la lymphopénie radio-induite ont été corrélées à une plus mauvaise survie globale chez les patients traités par radiothérapie. Ce phénomène est encore mal compris. Nous savons aujourd’hui que les lymphocytes sont des acteurs majeurs de la réponse anti-tumorale et cette chute du taux de lymphocytes pourrait concourir à une mauvaise réponse anti-tumorale. Notre projet vise à établir un modèle de lymphopénie radio-induite chez la souris pour avoir un modèle sur lequel tester de nouveaux composés pouvant éventuellement réduire ou abroger cette lymphopénie.
Bénéfices attendus
La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. 50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de minimiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. La lymphopénie radio-induite est un effet secondaire majeur de la radiothérapie. Il est actuellement reconnu que les lymphocytes sont essentiels dans la réponse anti-tumorale. De plus, il a été montré que les patients qui subissent cet effet secondaire ont une plus faible chance de survie. Réduire la durée ou la sévérité de la lymphopénie pourrait éventuellement permettre d’améliorer l’efficacité antitumorale du traitement par radiothérapie et d’augmenter les chances de survie des patients traités par radiothérapie. La mise en place d’un modèle préclinique de lymphopénie radio-induite permettra d’obtenir des connaissances sur ce phénomène encore assez peu exploré et permettra de tester si certains composés peuvent réduire ou atténuer cette lymphopénie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender le phénomène de lymphopénie radio-induite mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de nouvelles combinaisons thérapeutiques lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.
Procédures
Une injection de cellules tumorales en sous-cutané sera réalisée chez tous les animaux, durée 10 secondes, sous anesthésie locale. L’injection des composés se fera par injection intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineux (une à 10 injections selon les composés), durée 10 secondes, sous anesthésie locale. Les souris seront anesthésiées pendant l’irradiation (maximum 15 minutes), une fois. Les prélèvements de sang sur les souris seront réalisés sous anesthésie générale, n=3, durée 3 minutes..
Impact sur les animaux
Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée de l’abdomen. Elle a lieu sous anesthésie gazeuse (maximum 15 minutes). Cela peut générer du stress et de l’anxiété. Par contre, l’irradiation en elle-même est indolore. Elle peut induire de la toxicité qui va se traduire par une perte de poids modérée dans les jours suivants l’irradiation.L’administration des composés par voie intrapéritonéale ou sous-cutané ou intravein eux peut engendrer de la douleur et un stress léger et transitoire (mais les injections seront faites sous anesthésie locale). L’administration des composés per os peut engendrer du stress léger et de courte durée. Les tumeurs peuvent entraîner une gêne et un inconfort modérés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales aux fins d'analyses sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Il a clairement été mis en évidence ces dernières décennies que le système immunitaire et le microenvironnement tumoral jouent un rôle fondamental dans la progression tumorale ainsi que dans la réponse à la radiothérapie et aux traitements anticancéreux en général. Il n’existe actuellement pas d’alternative permettant de récapituler aussi bien qu’un organisme vivant l’ensemble de ces interactions dans leur nombre et leur complexité. De même, il n'existe pas de sytème permettant de reproduire les interactions entre les éléments du sang, les cytokines, la tumeur et le sytème immunitaire dans sa globalité. La phénomène de la lymphopénie n'a pour l'instant pas pû être modélisé in vitro ou in silico.is
Réduction
Une analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives au niveau du taux de lymphocytes dans le sang au cours du temps. L’analyse des différences de taux de lymphocytes se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité des différences obtenues pour les différents groupes.
Raffinement
Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections un anesthésique local sera appliqué sur la peau avant chaque injection. L’irradiation sera réalisée sous anesthésie générale pour réduire le stress induit. Les prélèvements de sang seront réalisés par une personne entraînée qui effectue déjà ce geste depuis longtemps au sein du laboratoire pour réduire le temps et le stress induit, sous anesthésie locale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids. Du Diet Gel Hi Energy pourra être introduit en cas de perte de poids). De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines, jeunes adultes, ce qui correspond au meilleur âge pour les greffes et à la population de patients visées.
Etude de la réponse immunitaire induite après administration nasale d’un candidat vaccin anti-paludique en modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Vigiles et maintenues en contention, 350 souris reçoivent trois instillations nasales et subissent quatre prises de sang en six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le candidat vaccin nasal testé cible le paludisme, l'enjeu étant de mesurer la réponse immunitaire déclenchée dans la rate et le foie. Le porteur affirme qu'aucune vaccination ni aucune prise de sang n'a jamais produit d'effets indésirables au laboratoire, avant d'admettre dans la même rubrique que la contention peut stresser les souris et les prélèvements provoquer un hématome et une douleur. Toutes sont tuées au bout de six semaines pour prélever les organes où se joue cette réponse.
Objectifs
Le paludisme est une maladie parasitaire responsable de 241 millions de cas et de 627 000 décès estimés dans le monde en 2020. Les deux vaccins candidats recommandés par l'OMS, affichent une efficacité modérée et un calendrier de vaccination contraignant nécessitant le développement de nouveaux candidats vaccins affichants une efficacité protectrice d'au moins 75 % d'ici 2030 (OMS). Le paludisme a un cycle de vie complexe impliquant l'invasion et le développement à l'intérieur des hépatocytes et des érythrocytes de l'hôte mammifère. A chaque étape de son cycle de vie, le parasite à travers ses différentes formes exprime de nombreuses protéines qui peuvent être la cible de candidats vaccins contre le paludisme. Ces dernières années, l'équipe a développé un candidat vaccin sous-unitaire administré par voie nasale en utilisant des nanoparticules. Celui-ci induit des réponses immunitaires humorales et cellulaires aux niveaux systémique et muqueux assurant une protection. L’équipe souhaite sur la base de cette expertise développer un vaccin contre le paludisme qui induit des réponses humorales et cellulaires au niveau systémique, et hépatique. Des travaux récents, en modèle d’hépatite B, ont montré que seule la vaccination nasale avait la capacité d’induire une réponse cellulaire hépatique en comparaison d’une immunisation systémique renforçant l’intérêt de la voie nasale comme une solution pertinente. Pour ces raisons, nous proposons de développer un vaccin nasal contre le paludisme, et valider l’induction d’une réponse immunitaire protectrice systémique au niveau splénique et hépatique.
Bénéfices attendus
Les vaccins contre le paludisme actuellement les plus avancés et recommandés par l'OMS montrent une efficacité d'environ 45 % et 66% respectivement qui reste insuffisante notamment pour protéger les enfants âgés de 5 à 17 mois au cours de la première année après la vaccination. Il est donc urgent de développer un vaccin plus efficace, éventuellement pour compléter ces deux vaccins. Dans ce but, nous proposons d'utiliser une nouvelle plateforme vaccinale qui a montré des résultats prometteurs. La capacité du candidat vaccin à induire une forte réponse immunitaire humorale et cellulaire systémique et hépatique forte spécifique de Plasmodium pourrait être d'un grand avantage pour un vaccin antipaludique. De plus, si notre calendrier vaccinal à trois immunisations par voie intranasale montre des réponses immunitaires robustes, ce sera une grande avancée dans la recherche sur le vaccin antipaludique. En effet, les vaccins dénommés RTS,S et R21/Matrix-M™ sont proposés sous la forme d'un schéma à quatre doses chez l'enfant à partir de 5 mois ce qui est une organisation difficile dans les pays endémiques (aiguille stérile, personnel médical). De plus, cibler différentes étapes du cycle de vie du parasite pourrait aider à compléter des candidats vaccins plus avancés et permettre d'augmenter la protection si peu de parasites parviennent à échapper à l'immunité hépatique.
Procédures
Les animaux subiront tous 4 prises de sang à J0, J14, J28 et J42. 3 instillations par voie nasale à J0, J14 et J28. Les prises de sang et les instillations/injections ne durent que quelques secondes sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
A ce jour dans le laboratoire, aucune des expériences de vaccinations utilisant des antigènes, ni aucune prise de sang n'a produit d'effets indésirables sur les animaux d'autant plus que les gestes sont très bien maitrisés. Cependant, il est possible que les contentions engendrent du stress, les prises de sang peuvent entrainer un hématome ainsi qu’une douleur légère au niveau du site de prélèvement.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation à J42 de façon à pouvoir étudier les réponses immunitaires induites par les différents types de vaccination notamment les réponses immunitaires hépatiques.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucun modèle de remplacement capable de reproduire la complexité du système immunitaire et d'étudier l'ensemble des réponses immunitaires suite à une vaccination.
Réduction
Les résultats obtenus précédemment avec un extrait total du parasite supporte la preuve de concept qu'une immunisation par voie nasale est capable d'établir une réponse immunitaire hépatique. Afin de poursuivre cette étude, dans une stratégie de vaccin sous-unitaire nous allons dans un premier temps tester plusieurs protéines du parasite pour savoir lesquelles sont les plus immunogènes. Pour chaque protéine utilisée nous constitueront un groupe de 10 souris (5 mâles + 5 femelles). Cette première expérimentation permettra de récolter assez de données, notamment sur le choix des protéines à conserver et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la suite de nos expérimentations. Cette première expérimentation permettra de récolter assez de données notamment sur le choix des protéines à conserver et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la suite de nos expérimentations. Des tests statistiques ainsi qu'une analyse de normalité seront effectués.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Une surveillance accrue sera effectuée à la suite de chaque procédure afin de détecter au plus tôt les points limites définis pour chaque procédure. Un enrichissement positif sera mis en place en introduisant un enrichissement permanent de type igloo dès la semaine d’adaptation des animaux. Un enrichissement positif ponctuel, à leur entrée dans la structure puis après chaque procédure, de type carré en kraft pendant 48h pouvant être dépouillé et permettant la confection d’un nid.
Choix des espèces
Le modèle d'étude d'un candidat vaccin administré par voie nasale est déjà établi chez la souris dans le laboratoire. De plus, l'espèce de souris retenue est décrite dans la littérature comme le modèle de référence permettant l'étude des réponses immunitaires hépatiques. Tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Des souris adultes sont utilisées car leur système immunitaire est complètement développé. Ce modèle murin permettra la preuve de concept de l’induction d’une réponse immunitaire systémique splénique et hépatique suite à une vaccination par notre candidat vaccin sous-unitaire par voie nasale avant de passer sur un modèle d’infection adapté.
Validation d’un candidat médicament dans un modèle murin exprimant le récepteur TREM-1 humain
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Chaque souris subit un unique prélèvement de sang par ponction intracardiaque, dix minutes sous anesthésie, sans jamais se réveiller. 15 souris génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur humain vont être utilisées ainsi, tuées avant tout réveil, la mise à mort servant à obtenir le volume de sang voulu. Deux expériences en laboratoire doivent vérifier que le gène humain fonctionne chez elles, l'objet réel étant de préparer des études réglementaires et une demande d'essai clinique. Le candidat médicament a déjà montré un effet sur du sang humain et du sang de singe, et le bénéfice avancé est de "limiter drastiquement" le recours aux primates non humains dans les tests de toxicité à venir.
Objectifs
Dans le contexte du développement d’un futur médicament pour le traitement de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (Maladie de Crohn et Rectocolite hémorragique), nous souhaiterions utiliser des souris génétiquement modifiées (souris exprimant un gène humain) afin d’évaluer la possibilité d’utiliser cette lignée de souris pour des futures études réglementaires. En effet, le futur médicament cible spécifiquement un gène humain et ne fonctionne pas avec ce même gène chez la souris, c'est pourquoi ces souris génétiquement modifiées ont été dévellopées. Le but de notre projet est de vérifier si le gène humain fonctionne correctement dans ces souris modifiées. Pour cela, nous avons besoin de récupérer le sang de ces souris pour isoler les cellules sanguines et réaliser des expériences au laboratoire. Les souris seront anesthésiées pour effectuer un prélèvement sanguin, un anti-douleur sera administré avant le prélèvement sanguin et le sang obtenu sera traité pour isoler les cellules sanguines (neutrophiles). Deux expériences seront realisées au laboratoire sur ces cellules sanguines pour démontrer que le gène humain fonctionne bien dans ces souris. L'objectif final de ce projet est de préparer la mise en place d'un essai clinique en Europe et aux Etats Unis pour montrer l'efficacité de notre futur médicament pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin .
Bénéfices attendus
En cas de résultats positifs avec ces souris génétiquement modifiées, nous pourrions les utiliser lors d’études réglementaires pour tester la tolérance et la toxicité de notre médicament dans le but de limiter drastiquement le recours à des singes (primates non humains).
Procédures
Injection en intrapéritonéale d'un analgésique, puis prélèvement sanguin sur animal anesthésié. Fréquence : 1 seul prélèvement sanguin par animal. Durée : 10min
Impact sur les animaux
Ces souris ne présenteront pas d'effets indésirables visibles à l'oeil. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous antalgie et anesthésie pour éviter les douleurs/souffrances aux animaux. Cependant, un analgésique sera administré en intra péritonéal aux souris 1h avant la ponction intra-cardiaque pouvant engendrer une nuisance aux souris mais la douleur sera légère et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin d'obtenir le volume sanguin nécessaire au projet.
Remplacement
L'efficacité du candidat médicament a été validé au préalable dans un modèle cellulaire humain ainsi que dans un modèle cellulaire chez le singe. En effet, des tests préliminaires ont été réalisés en utilisant du sang humain et du sang de singe montrant un effet thérapeutique. Dans le cadre de notre demande d'autorisation d'essai clinique, ces tests doivent être réitérés chez la souris.
Réduction
Le nombre de souris utilisé pour le projet principal (10 souris: 5 males et 5 femelles) a été défini en fonction du nombre de cellules pouvant être isolées par millilitre de sang et du nombre de conditions expérimentales nécessaires pour répondre aux objectifs du projet. De plus, en mélangeant le sang des souris males et femelles, nous limitons les croisements et donc reduisons le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'une période d'acclimatation de 1 semaine dans l'établissement utilisateur avant le début du projet afin de réduire le stress dû au transport et au changement d'animalerie. Les souris seront réparties en deux groupes de 5 souris par cage en fonction de leur sexe. Les cages seront enrichies avec des buchettes, du coton et de la frisure de papier craft. Afin d’appliquer le principe de raffinement, un anti douleur sera administré aux souris 1h avant le prélèvement sanguin. De plus, un anesthésique local sera également appliqué au niveau de la cage thoracique pour limiter la douleur induite par le prélèvement sanguin qui sera effectué sur un animal vivant anesthésié.
Choix des espèces
Notre molécule thérapeutique est spécifique d'une protéine humaine et n’interagit pas avec la souris. Pour palier à cela, nous avons développé un modèle de souris qui exprime cette protéine humaine afin de réaliser des études nécessaires au développement pré-clinique de notre candidat médicament. Pour ce projet, des souris adultes de 8 semaines seront utilisées car cela représente l'âge adulte. De plus, cet âge est optimum car il permet d'obtenir le volume sanguin nécessaire à la réalisation du projet avec seulement 10 souris.
Validation en modèle murin de l’effet thérapeutique d’un vaccin muqueux anti-SARS-CoV2 contre les symptômes du covid-long
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Les souris qui perdent 15 % de leur poids ou présentent des difficultés respiratoires après l'infection par le SARS-CoV-2 sont mises à mort sans délai, l'infection pouvant les tuer en huit jours. 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs poumons, de leur cerveau et de leur tête. Chacune reçoit une puce sous la peau du dos, subit huit prises de sang à raison d'une par semaine, trois ou quatre vaccinations par le nez sous anesthésie générale et une inoculation du virus par la même voie. Toute médication susceptible d'interférer avec la réponse immunitaire est exclue. Les résultats doivent alimenter une publication et une éventuelle demande d'essai clinique pour le candidat vaccin LVT-001, contre les symptômes du covid long.
Objectifs
Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.
Bénéfices attendus
Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.
Procédures
Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sous anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 3 et 4 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).
Impact sur les animaux
Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire.
Choix des espèces
Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.
Etude de l’induction des réponses immunitaires mémoires mucosales après vaccination intra-nasale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Vaccinées par le nez sous anesthésie générale, une ou deux fois à deux semaines d'intervalle, 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur réponse immunitaire. Elles peuvent aussi recevoir entre 13 et 30 injections quotidiennes dans l'abdomen sans anesthésie, trois prises de sang et une injection dans la veine, et subir sous anesthésie un lavage des poumons et une perfusion par le cœur avant le prélèvement du poumon. L'équipe cherche les mécanismes qui font apparaître, après une vaccination par le nez, des cellules immunitaires cytotoxiques résidant dans le poumon, en vue de vaccins contre le cancer du poumon. Une chirurgie de 20 minutes figure parmi les actes, sans que sa nature soit précisée, et ni le traitement injecté chaque jour ni le produit injecté dans la veine ne sont nommés.
Objectifs
Le but des vaccins anti-tumoraux est d’induire des cellules immunitaires capables d’éliminer les cellules tumorales. Des travaux ont montré que dans le cancer du poumon, il est important d’induire localement des cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans cet organe, car ces cellules résidentes sont connues pour avoir une protection plus rapide et plus efficace du fait de leur localisation. Ces cellules ne peuvent être générées que par une voie de vaccination intranasale et non systémique ( sous-cutanée ou intramusculaire). L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes qui favorisent la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes, après vaccination intra-nasale.
Bénéfices attendus
Une meilleure connaissance dans la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans les poumons, permettra de développer et d’optimiser des vaccins anti-tumoraux pour traiter les cancers du poumons.
Procédures
Injection par voie intra-nasale : 1 ou 2 fois à 2 semaines d'intervalles, sur animaux sous anesthésie générale, durée: 30min. Injection par voie intra-péritonéale d’anesthésique sur souris vigiles: 1 ou 2 injections à 2 semaines d'intervalles,durée: 10secondes/injection. Injection par voie intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : entre 13 et 30 injections ( 1 injection/ jour sur une période de 13 à 30 jours),durée 10 secondes/ injection. Prélèvement de sang: x3 sur souris anesthésiées,durée 1-2 min. Injection intraveineuse de produit : 1 fois sur animaux sous anesthésie générale,durée: 30 secondes. Injection d'analgésique par voie sous-cutanée sur souris vigiles : x1 fois, durée 10 secondes/injection. Prélèvement du lavage broncho alvéolaire (x1fois), perfusion intracardiaque et prélévement du poumon (x1fois) sur animaux sous anesthésie générale,durée totale environ 30 min. Chirurgie sur animaux sous anesthésie,durée 20 min.
Impact sur les animaux
La vaccination par voie intranasale peut induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoire (traitée par un analgésique) et risque d’infection et problème de cicatrisation ( traitée avec un antiseptique locale).
Devenir
mise à mort pour récupérer les organes en vue d’analyse de la réponse immunitaires
Remplacement
L’analyse des réponses immunitaires après vaccination, dans différents organes au cours du temps, ne peut être évaluée que dans des organismes entiers. Les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement muqueux pulmonaire. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme. Aucune méthode alternative n'existe.
Réduction
Les paramètres expérimentaux (doses, cinétiques) ont été déterminés selon des données déjà publiées. Basé sur des études déjà publiées et avec l’aide d’un logiciel de calcul d’effectifs, nous avons déterminé un nombre d’animaux minimum pour avoir assez de matériel et garantir une analyse statistique fiable. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les injections intranasales, les prélèvements de sang, les injections intraveineuses, et la chirurgie sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des analgésies pre et post-opératoires sont prévues ainsi que des solutions antiseptiques pour la cicatrisation. Tous les vaccins et traitements sont préparés dans des formulations validées pour des administrations chez l’animal et ne sont pas décrits comme toxiques aux doses utilisées. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteint d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.
Choix des espèces
Cette étude sera réalisée avec des souris, car nous avons des vaccins déjà utilisés et validés dans cette espèce pour induire une bonne réponse immunitaire dans les poumons ainsi que tous les outils et techniques d’analyse adéquats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car le système immunitaire est développé et mature.
Impact du déficit en p53 sur le phénotype des souris STING gain de fonction
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 407 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour créer et entretenir deux lignées mutantes. Chacune subit un prélèvement de tissu à l'oreille sur animal vigile, et celles qui entrent en expérimentation une prise de sang à la joue immédiatement suivie de la mise à mort et du prélèvement d'organes, les reproducteurs restant en vie pour les croisements. Les souris porteuses de la première mutation développent un déficit immunitaire avec retard de croissance et mortalité accrue à partir de six mois, celles porteuses de la seconde des tumeurs dès trois à six mois. Le porteur annonce un suivi hebdomadaire par grille de score pour soustraire ces animaux à la souffrance, et écrit aussi que la douleur ne pourra pas être traitée par des antalgiques, en raison de l'interférence avec les expériences.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de créer et de maintenir les lignées pour mieux comprendre les mécanismes d’une mutation génétique (mutation 1) impactant les fonctions lymphocytaires et qui conduit à induire un déficit immunitaire chez les souris.
Bénéfices attendus
Les souris porteuses de la mutation étudiée dans ce projet (mutation 1, lignée 1) présentent une baisse du taux de lymphocytes. Nous émettons l’hypothèse que cette baisse de lymphocytes est du à l’action d’une protéine impliquée dans la mort cellulaire. Ainsi nous proposons de croiser les souris porteuses de la mutation causant la baisse de lymphocytes avec une seconde lignée (mutation 2, lignée 2) déficitaire pour la protéine impliquée dans la mort cellulaire. Ces données pourraient permettre de mieux comprendre certains traits de la maladie chez les patients porteurs de la mutation 1 étudiée dans ce projet, et ainsi bénéficier aux patients.
Procédures
Un prélèvement tissulaire sera réalisé sur chaque animal vigile, pour une durée de 2 minutes environ. Les souris porteuses de la mutation étudiée dans ce projet (mutation 1) développent un déficit immunitaire à phénotype dommageable avec une croissance moins importante, une modification de l’aspect général et du comportement de l’animal, et une mortalité accrue à partir de l’âge de 6 mois. Les souris déficitaires pour la protéine impliquée dans la mort cellulaire (mutation 2) développent des tumeurs à partir de 3-6 mois en moyenne lorsque la mutation est homozygote, et 10 mois lorsque la mutation est hétérozygote.
Impact sur les animaux
Les souris seront prélevées à l'oreille pour le génotypage. Une douleur transitoire peut être générée lors de ce prélèvement de tissu et un stress léger lors de la contention. Un prélèvement sanguin sera réalisé en submandilaire sur animal vigile, immédiatement suivi de la mise à mort de l'animal pour le prélèvement d'organes pour l'expérimentation.
Devenir
Les lignée de souris seront utilisées de manière continue pour le projet de recherche. Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.
Remplacement
La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier les réponses immunes qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la moelle osseuse, le thymus et la rate. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire, car les connaissances chez la souris sont très développées dans le domaine de l'immunité.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. le nombre total d'animaux comprend les animaux pour les accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages à couvercle filtrant (6 maximum par cage) comportant des enrichissements (nids, frisures de kraft...) sur des portoirs ventilés. Un suivi hebdomadaire des animaux à phénotype dommageable sera réalisé selon une grille de score permettant d'évaluer des points limites permettant de soustraire les animaux à la souffrance. La douleur ne pourra pas être traitée par des antalgiques en raison d'interférence avec vos expériences.
Choix des espèces
En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l’immunité, pour lequel de nombreux modèles d’analyses et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos analyses. Adulte, en âge de procréer pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour l'expérimentation auront un âge minimum de 2 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et maximum de 6 mois.
Régulation des interactions Hôte-Microbiote et impact en santé inflammatoire et métabolique.
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, 9 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier les liens entre microbiote intestinal et maladies inflammatoires chroniques. Les actes décrits se limitent à des prises de sang sans anesthésie, uniques ou répétées sur deux heures, et à quatre gavages au plus. Le porteur annonce pourtant que certaines approches provoqueront une inflammation intestinale chronique ou un cancer colorectal, et une prise de masse grasse chez certaines souris, puis écrit : "Aucun stress ni comportement anormal n'est anticipé." Il affirme que le recours à la souris est "indispensable", sans préciser comment ces maladies sont déclenchées, quels facteurs alimentaires sont testés, ni combien de souris subissent chaque approche.
Objectifs
Ces expérimentations ont pour objectif d’évaluer les facteurs environnementaux régulant le microbiote intestinal, ainsi que de caractériser les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal peut conduire au développement de maladies inflammatoires chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal est régulé, et l’importance de ce dernier dans les maladies inflammatoires
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvement de sangs de 5 à 10µL par prélèvement sur animaux vigiles. Les animaux subiront 4 prélèvements uniques de sang pour une durée inférieure à 1 minute Les animaux subiront 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements multiples seront séparés d’au moins une semaine Les animaux subiront un maximum de 4 gavage oral d’un volume maximal de 200microL ? Ces gavages seront séparés d’au moins une semaine entre eux. Les animaux subiront un prélèvement unique de sang en fin de protocole
Impact sur les animaux
Certaines approches induiront une inflammation intestinale chronique et/ou un cancer colorectal chez les animaux. De plus, certains animaux développeront des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse. Les facteurs alimentaires étudiés, via leurs effets sur le microbiote intestinal, pourront favoriser la dysbiose intestinale de manière à promouvoir une inflammation intestinale chronique et/ou certaines dérégulations métaboliques légères. Aucun stress ni comportement anormal n’est anticipé. Ces nuisances attendues sont de sévérité modérée. Un stress et une potentielle douleur peuvent être liés aux prélèvements sanguins.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures proposées, les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes nécessaires à des analyses approfondies dans le but de répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment intestin/microbiote en lien avec le développement de pathologies inflammatoires chroniques.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 15 souris par condition et par sexe était nécessaire être utilisé afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès des biostatisticiens.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.
Choix des espèces
L’exploration de l’interaction du système immunitaire avec le microbiote nécessite un modèle flexible qui permette de manipuler chacun de ces domaines, de tester les causalités et de mesurer les paramètres moléculaires et cellulaires. En ce sens, le modèle souris est le plus adapté, car les outils permettant de manipuler et d’analyser le système immunitaire chez la souris sont les mieux développés parmi les mammifères. De plus, les connaissances acquises chez la souris permettent un transfert chez l’homme, du moins conceptuellement, et bien souvent en l’état. Les souris utilisées seront âgées de 3-8 semaines d’âge lors du démarrage des différentes procédures. Le microbiote intestinal se met en place dès les périodes précoces de la vie, et il est nécessaire pour nous d’utiliser de jeunes animaux afin d’étudier les facteurs environnementaux impactant la mise en place du microbiote.
Impact d’une infection secondaire bactérienne ou fongique chez la souris immunodéprimée suite à un sepsis.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Deux injections de Busulfan pour détruire la moelle osseuse, une injection de bactéries dans l'abdomen, cinq jours d'antibiotique, sept jours de gavage, puis une instillation de staphylocoque ou d'aspergillus directement dans la trachée : 714 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une perte de poids et un score de grimace augmenté après l'induction du sepsis, puis un nouvel affaiblissement après l'infection pulmonaire. L'objectif est d'observer la réponse immunitaire d'animaux déjà immunodéprimés face à une seconde infection, et d'évaluer un complément alimentaire. Il affirme que l'accès aux organes est "indispensable", ce qui exclut de garder les souris en vie, et retient un modèle murin d'immunodépression chimique qu'il décrit comme "connu et bien caractérisé".
Objectifs
Les infections abdominales sont fréquentes et appelées en fonction de la gravité sepsis ou choc septique. Ces infections sont responsables de nombreuses hospitalisations en soins intensifs. Cet état de sepsis entraîne une dysfonction du système immunitaire propice à l’acquisition d’infections nosocomiales. Ces dernières sont responsables de la majorité des décès observés en réanimation pouvant survenir plusieurs jours voire semaines après l’admission des patients. Une grande majorité des patients hospitalisés en réanimation présente une altération du système immunitaire pouvant être provoqué par des traitements pré-greffe de type chimiothérapie, les exposant ainsi aux infections d’origine digestive. Ces infections sont généralement liées à une diminution du nombre de lymphocytes à l’origine d’une translocation bactérienne dans le sang. Une connaissance plus approfondie des modifications immunologiques induites par le sepsis au long cours chez des souris préalablement immunodéprimées permettrait de reproduire au mieux ce qui se produit chez l’Homme et ainsi de mettre en place des stratégies thérapeutiques chez les patients immunodéprimés hospitalisés en soins intensifs pour sepsis ou choc septique afin d’améliorer leur pronostic. Ainsi ce projet de recherche a pour but d’évaluer, chez des souris préalablement immunodéprimées, la réponse du système immunitaire lors d’une infection secondaire plusieurs semaines après la résolution du sepsis ainsi que d’évaluer le rôle d’un complément alimentaire sur la restauration du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient déboucher sur une meilleure compréhension des liens entre immunodépression induite et infection secondaire plusieurs semaines après traitement d’un sepsis abdominal.
Procédures
L’induction de l’immunodépression induite chimiquement par injection de Busulfan nécessitera une injection une fois par jour pendant deux jours en intrapéritonéal (i.p.) sur animal vigile après contention, ce geste sera réalisé en moins d’une minute. L’induction du sepsis sera réalisée sur animal vigile après contention par une seule injection en i.p. d’une quantité de bactéries commensales bien définie, ce geste sera réalisé en moins d’une minute. Les animaux vigiles après contention recevront un traitement antibiotique en i.p. une fois par jour pendant 5 jours, l'injection durera moins d'une minute. L’immunonutrition sera réalisée sur animal vigile après contention à l’aide d’une canule de gavage une fois par jour pendant 7 jours, ce geste est réalisé en moins d’une minute. Les animaux vigiles recevront en s.c. une fois par jour une injection permettant leur réhydratation seulement quand cela est nécessaire, cette injection durera également moins d'une minute et sera réalisée en même temps que l’injection d’antibiotique évitant ainsi une double contention de l’animal le même jour. L’induction de la pneumopathie par Staphylococcus aureus ou Aspergillus fumigatus, nécessitera l’anesthésie des animaux par anesthésie gazeuse d’environ 5 minutes durant lesquelles les animaux recevront une suspension bactérienne par instillation intratrachéale.
Impact sur les animaux
L’injection de Busulfan et le sepsis seront réalisés par injection intrapéritonéale sur animal vigil après contention. Ces gestes peuvent induire du stress chez l’animal. L’injection de Busulfan va induire un affaiblissement de l’animal dû à la myéloablation provoquée par ce traitement qui se traduit par une perte de poids de l’animal durant 2 jours avant reprise progressive de la masse perdue. Aucun autre signe clinique n’est visualisé après ce traitement. Le sepsis va induire un affaiblissement de l’animal se traduisant par une perte de poids et un score de grimace augmenté. L’immunonutrition sera réalisée par gavage sur animal vigil après contention. Ce geste peut induire du stress chez l’animal. L’instillation de la suspension bactérienne ou fongique va engendrer un affaiblissement et une perte de poids de l’animal.
Devenir
Afin d'évaluer les conséquences de l'infection induite sur les animaux immunodéprimés, l'accès aux organes d'intérêts ainsi qu'aux fluides biologiques est indispensable, nous ne pouvons donc pas garder les animaux en vie.
Remplacement
L'évaluation de l'impact du sepsis chez la souris immunodéprimée nécessite l’accès aux organes d’intérêt pour évaluer les conséquences de cette infection. Ceci n’est absolument pas reproductible in vitro et c’est pourquoi le recours à des animaux est indispensable pour le développement de ce type de modèle.
Réduction
Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nos précédents projets ayant eu pour objectifs de caractériser les dysfonctions immunitaires suite à un sepsis nous ont permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaire afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs. De plus, le laboratoire possède déjà une expertise à la fois sur le développement d'infections abdominales et sur le développement de modèle murin d’immunodépression, ce qui nous permettra d'utiliser moins d'animaux pour la mise en place de cette étude. Les tests statistiques utilisés seront des tests non pairés non paramétrique (Mann-Whitney) pour les comparaisons de groupes deux à deux et de la réalisation d’un test ANOVA (Dunn’s test) lorsque plus de deux groupes seront comparés.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées : locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum, maximum 5 animaux/cage et aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. L'utilisation d’analgésiques permettra d’éviter toute souffrance aux animaux. De plus, l’évaluation régulière du score de grimace des animaux et le suivi de leur poids et de leur comportement permettra d’avoir un contrôle continu sur leur état de santé.
Choix des espèces
Ce modèle de souris permettra de caractériser l’affaiblissement du système immunitaire induit par une infection abdominale chez des souris immunodéprimées au long cours et ainsi d’étudier la réponse du système immunitaire face à une seconde infection. Ce modèle nous permettra ainsi de caractériser la paralysie du système immunitaire survenant sur plusieurs semaines. Le développement d'une immunodépression suivi d’une infection abdominale puis d’une infection pulmonaire n'est pas reproductible in vitro car il touche le système immunitaire dans son ensemble. De plus, le modèle murin d’immunodépression induite par traitement chimique est un modèle animal connu et bien caractérisé et le développement d'infections abdominales et pulmonaires ont récemment été développées et caractérisées au sein de notre laboratoire. La très grande majorité des travaux scientifiques réalisés utilise des souris de 9 à 10 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature.
Santé du juvénile de bar exposé à un scénario de réchauffement climatique d’acidification et de désoxygénation- etablissement n°1
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Jusqu'à 90 % de mortalité dans les bassins lors des épreuves infectieuses : 3 400 bars juvéniles vont être utilisés, dont 1 606 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les survivants étant tous tués pour analyses immunologiques. Pendant dix-huit mois, ils vivent dans une eau réchauffée puis acidifiée, appauvrie en oxygène à 60 % pendant trois semaines, avec une ration limitée à 60 % de ce qui est distribué en aquaculture. Chacun est pêché, sédaté, anesthésié, marqué par une puce implantée dans le muscle, pesé chaque mois et transféré entre bassins. L'infection expérimentale, bactérienne puis virale, provoque déformations de l'œil, lésions cutanées, nage anormale et léthargie, sur des poissons pesant trois grammes au départ, choisis à l'âge où les bars sauvages rejoignent les nourriceries côtières.
Objectifs
Plus de la moitié des espèces connues de poissons vivent en zone côtière ou estuarienne. Les nourriceries en milieu côtier dont dépendent l’accomplissement du cycle de vie et le renouvellement des populations sont, de ce fait, considérées comme des habitats essentiels. De plus, l'élevage des poissons s'effectue également principalement en zone côtière. Or, il est bien établi que les zones côtières et estuariennes sont les plus vulnérables face aux pressions combinées du changement climatique et notamment au réchauffement, à l'acidification et aux épisodes de désoxygénation des océans. Ainsi, la santé des poissons (sauvages ou d'élevage) présents dans ces zones, et notamment leurs capacités à croitre et à se défendre contre les pathologies dépendront de leur capacité à faire face à la combinaison de ces contraintes environnementales en milieu côtier. Les questions abordées dans le projet sont : 1) L’exposition à long terme de juvéniles de bar à des conditions environnementales (température, acidification, oxygénation) prédites à l’horizon 2100 va-t-elle modifier des paramètres physiologiques associés à la santé du poisson ? et 2) ces effets vont-ils modifier leurs performances de croissance, de survie, leur maturation sexuelle et leur résistance à une exposition à des pathogènes ? Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs (EU) qui coupleront leurs expertises.
Bénéfices attendus
A court terme, les différentes analyses de performances et les caractérisations physiologiques réalisées au cours des différentes phases d’exposition donneront une vision globale de la capacité des poissons à faire face à une combinaison de facteurs environnementaux. A moyen terme, les données générées contribueront à déterminer des marqueurs d’exposition à ces différents facteurs environnementaux. Plus globalement, ce projet s’inscrit dans la volonté de mieux comprendre et prédire les interactions des poissons pêchés ou élevés avec leur environnement dans l’écosystème côtier et ainsi élaborer des politiques solides en matière de gestion des pêches et de l’aquaculture dans un contexte de changement global.
Procédures
De 3 à 5 mois, 50 poissons par bassin et par mois, aléatoirement pêchés, seront pesés (sous anesthésie, durée de la pesée par poisson: 1 minute). A partir du cinquième mois, tous les poissons (n=3400) seront pesés mensuellement après avoir été marqués individuellement par injection d'une puce électronique intramusculaire (sous anesthésie). Ces interventions nécessiteront la pêche des poissons. Afin de limiter le stress lié à la manipulation, les poissons pêchés seront sédatés dans leur bac puis anesthésiés. L'intervention de micro-injection n'excèdera pas 5 minutes (pêche, anesthésie, et injection comprises). La durée par poisson d'une intervention de pesée n'excèdera pas non plus 5 minutes. Des transferts entre bassins seront également effectués au cours du projet. Ces transferts se feront sous anesthésie en utilisant des bacs de transferts transitoires opaques et oxygénés. Les étapes de transfert n'excèderont pas 15 minutes. Les conditions de température et d'acidification, prises indépendamment les unes des autres ou en interaction représentent une nuisance légère durant les 15 premiers mois. A 16 mois, la moitié des poissons survivants (non mis à mort pour analyse post mortem) seront placés en niveau d'oxygénation de l'eau à 60% pendant 3 semaines. Nous supposons, sur la base d'études précédentes, que cette exposition représente une nuisance légère dans le contexte de l'élevage (absence de prédation; autres facteurs environnementaux contrôlés). Tous les éléments décrits précédemment seront réalisés dans l’EU n°1. Au début du 18ème mois, l'exposition expérimentale à des pathogènes, nécessaire pour évaluer le statut immunitaire des poissons, constitue une nuisance sévère. L'exposition durera entre 2 et 6 semaines. L’EU n°1 aura en charge un pathogène bactérien et l’EU n°2, vers qui sera transférée une partie des animaux, une bactérie et un virus. Les animaux seront alimentés pendant toute la durée du projet avec un aliment commercial d'élevage et seront rationnés au niveau alimentaire à 60% de ce qui est distribué en aquaculture afin de mieux calquer les réalités écologiques. Ce rationnement ne représente pas une nuisance car il permet aux poissons de croitre à un rythme moindre comparé aux conditions aquacoles standards où l'on vise à diminuer les durées d'élevage.
Impact sur les animaux
Un stress léger pourra intervenir lors de la manipulation des poissons pour estimer la prise de poids mensuelle. A raison d'1mn de stress par poisson pour chaque pesée, la durée de ce stress léger est estimée à 16 mn sur l'ensemble du projet ( x 16 mesures biométriques). Un stress léger pourra aussi intervenir lors du transfert des poissons dans les différents bassins ; au début de l’expérimentation et au cours des étapes d’hypoxie et des épreuves infectieuses avec les différents pathogènes. Pour les transferts intra-structure, la durée du transfert sous anesthésie n'excédera pas 5 minutes. Les lots de poissons qui seront exposés aux prétests et challenges avec les pathogènes viraux et de type vibrio seront transférés au sein du site, dans une structure située à 200 mètres. Le transfert durera 15 minutes et se fera sous anesthésie. Du fait de l' anesthésie, le stress associé aux transferts est léger; de plus, les caractéristiques physicochimiques (températures, pH, salinité) de l'eau des bacs avant et après transferts seront identiques. Les poissons seront alimentés 24h après transfert, délai nécessaire pour leur acclimatation à leur nouveau bassin. Les changements des caractéristiques physicochimiques de l'eau des bassins ne pourront s'effectuer que 48h après transfert. Les conditions abiotiques (température, pH, niveau d’oxygénation) prises indépendamment les unes des autres constituent des stress légers (18 mois) pour les facteurs température et pH ou modérés (3 semaines) pour l'hypoxie modérée. La contrainte hypoxique peut se traduire par une diminution de l’activité de nage des poissons traduisant une dépression métabolique. La durée de l’hypoxie (3 semaines) limite toutefois le risque de forte sévérité ; la mortalité devant être évitée lors de cette étape d’hypoxie, dans le cas contraire, le niveau d’hypoxie pourra être adapté. Un stress léger interviendra au moment des prises de sang (1mn par poisson). Les épreuves infectieuses virale et bactérienne constituent des stress très sévères puisqu’ils induisent l’apparition de signes cliniques (déformation de l'oeil, changement de couleur de robe, lésions cutanées, nage anormale, léthargie, déséquilibre, anorexie) et une mortalité sur les poissons (% de mortalité variable dans les bassins en fonction de la résistance des poissons mais pouvant aller jusqu’à 90%).
Devenir
A l'issue des challenges aux pathogènes, tous les poissons survivants seront mis à mort pour prélèvement et analyse de paramètres immunologiques
Remplacement
Cette étude vise à étudier l'effet de facteurs environnementaux (température, pH, oxygénation) sur l’état de santé du poisson. La caractérisation de ces effets se fait à l'échelle de l'organisme entier. Les méthodes de substitution telles que la culture cellulaire par exemple ne permettent pas de répondre à un questionnement physiologique dépendant de réponses complexes de différents tissus. Le maximum d’analyses sera réalisé au niveau de prélèvements sanguins, ce qui permettra dans le futur de trouver des marqueurs de l’état de santé du poisson. Les épreuves infectieuses sont à ce jour la seule possibilité d’évaluer et de prédire les capacités de résistance des poissons face à des agents pathogènes prévalents dans le milieu environnant (contexte écologique et aquacole); cette capacité de résistance dépend de nombreux facteurs, en particulier de différentes composantes du système immunitaire dans divers organes mais également (par exemple) du statut énergétique du poisson ou encore de son microbiote. Les données obtenues au cours du projet pourront permettre de développer dans le futur des marqueurs (au niveau sanguin et tissulaire) prédictifs des capacités de résistance des poissons face aux pathogènes.
Réduction
Le bar européen juvénile est un animal vivant en groupe et le nombre d'animaux par bac répond tout d'abord à cette contrainte. Le nombre de poissons tient donc compte de la densité minimale d’animaux requise pour permettre aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles, et permet donc de répondre à leur bien-être. De plus, le nombre de poissons a été réduit à son minimum et défini en fonction du nombre nécessaire pour réaliser la cinétique de prélèvements (à 6, 9 et 18 mois post-éclosion) ainsi que les épreuves infectieuses expérimentales. Ce nombre tient également compte des taux de mortalités communément observés au cours des 18 premiers mois de vie juvénile. Le nombre de prélèvements prévus a été déterminé en fonction du seuil de la pertinence scientifique et statistique. De même, le nombre de poissons prévus pour les épreuves infectieuses permet de réaliser une analyse statistique de résistance.
Raffinement
Pour la phase 2, les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement, à savoir, un volume d'eau adapté en circuit ouvert avec une oxygénation suffisante en fonction de la biomasse, un rythme jour/nuit naturel, la présence de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche, une distribution d’aliment adaptée. Une importance particulière sera donnée à l’observation des animaux, 1 fois/jour minimum (plus pour suivre l'évolution de poissons présentant des signes de stress). Les infections expérimentales bactériennes ou virales peuvent provoquer une mort rapide sans qu'il soit possible d'observer des symptômes cliniques. Toutefois, pour éviter toute souffrance, les animaux présentant un comportement de nage anormal marqué avec des périodes sur le flanc / sur le ventre et/ou des signes de détresse respiratoire avancée et/ou des hémorragies faciales / au niveau des flancs et/ou des signes nerveux seront mis à mort de manière compassionnelle avec une surdose d’anesthésique.
Choix des espèces
Le bar est une espèce de poisson marin d'intérêts halieutique, aquacole et écologique. La communauté scientifique s'intéresse à mieux prédire l'impact du changement global sur cette espèce. Les poissons sont des juvéniles (non matures sexuellement). Agés d’environ 3 mois, ils pèseront en moyenne 3 grammes au début de l’expérimentation. Ce stade de développement est particulièrement pertinent pour notre étude puisque c'est à ce stade de vie que les poissons regagnent les nourriceries côtières dans la nature et qu’ils sont donc plus exposés aux contraintes environnementales associées au changement global.
Impact du rythme circadien et des régimes alimentaires sur la susceptibilité à l’infection bactérienne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une perte de poids de plus de 20 % ou un score de souffrance cumulé de 5 déclenche la mise à mort immédiate. 2 880 souris vont être utilisées, 1 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 440 un niveau sévère, toutes tuées pour prélèvements. Elles reçoivent des régimes riches en gras ou en sucre pendant huit semaines, subissent des gavages, des prélèvements fécaux hebdomadaires, des prises de sang répétées jusqu'à huit fois en deux heures, puis une infection par Salmonella Typhimurium. Le porteur précise qu'aucun analgésique ni antalgique ne pourra leur être administré, les anti-inflammatoires et les opiacés modifiant la réponse infectieuse qu'il cherche à mesurer.
Objectifs
Le rythme circadien, influencé par la photosensibilité et le comportement alimentaire, joue un rôle régulateur dans divers processus physiologiques, notamment au niveau intestinal. La barrière intestinale peut être fortement perturbée les régimes riches en graisses ou en sucres qui sont connus pour perturber l'horloge biologique. Il s'en suit une réaction en chaine qui conditionne la susceptibilité post-prandiale aux maladies infectieuses comme cela est observée chez les patients atteints d'obésité. En particulier, des études viennent de mettre en évidence que ces alimentations (dé)favorisent la colonisation par certaines bactéries commensales ayant la capacité de moduler la surveillance immunitaire et la résistance à la colonisation par des pathogènes. Dans ce contexte, un intérêt tout particulier de notre étude réside résolument dans notre capacité à documenter dans le détail la réponse anti-infectieuse post-prandiale en réponse à ces alimentations riches en graisses ou en sucres qui favorisent l'obésité. Nos résultats pourraient ainsi ouvrir aujourd'hui des pistes d'intérêt pour la recherche sur les graves complications du surpoids et de l'obésité.
Bénéfices attendus
L’utilisation d'agent infectieux permettra d’élucider les mécanismes favorisant ou limitant le pronostique de l’infection à Salmonella Typhimurium, en réponse à un régime hypercalorique. Cela permettra à plus long terme de proposer de meilleures approches thérapeutiques aux patients atteints de plusieurs comorbidité comme l’obésité.
Procédures
Prélèvements fécaux : sur animaux vigiles, ramassage dans la cage d’une durée 1 à 2 min par souris, de manière hebdomadaire. Prélèvements sanguins pour test glycémies et insulinémies : sur animal vigile, prise de sang d’une durée de 10 à 30 secondes, 8 mesures par test étalé sur 2h, 2 fois au cours de la vie de l’animal (1 de chaque). Prélèvements sanguins pour suivi métabolique : sur animal anesthésié, prise de sang unique d’une durée de 30 secondes, de manière hebdomadaire, pendant 8 semaines. Procédure de gavage pour colonisation microbienne et test de perméabilité intestinale : sur animaux vigiles maintenu par contention afin de ne pas les blesser et ajuster le geste de gavage à leur déglutition/respiration et à tout signe potentiel de douleur. Le gavage dure 4-5 secondes environ. 1 fois durant la vie de l'animal, 2 fois si greffe fécale en plus.
Impact sur les animaux
A) Les régimes riches en gras et/ou sucres sont susceptibles d’entraîner une prise de poids, affectant la mobilité. Mesures envisagées : Un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage), une pesée des animaux hebdomadaires et avec un suivi de la consommation de nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée) seront effectués. En cas d’accès réduit à l’eau et à la nourriture, des biberons d’eau et des croquettes seront mis à dispositions à hauteur de souris. Il est à noter qu’aucune obésité morbide n’est attendu dans ce protocole. B) Les injections et prélèvements sanguins peuvent être douloureux. Mesures envisagées : Des seringues d’injection avec des gauges les plus élevés seront utilisées pour limiter la douleur. Les prélèvements seront espacés d’une semaine pour cicatrisation. Les cicatrices seront désinfectées. C) Les manipulations répétées peuvent induire du stress. Mesures envisagées : Les animaux seront manipulés par les mêmes expérimentateurs (formés et 2 max) quelques jours avant l’expérimentation pour adaptation et à heure régulière tout au long de l’expérience. Un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage) et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée) seront également effectués. D) Les effets de l’infection à Salmonella Typhimurium, comme la perte de poids et les modifications des selles et un risque de mortalité, peuvent être observés. Mesures envisagées : Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs. Afin de limiter la souffrance des animaux, une grille de notation avec un score a été établie. Un score cumulé de 5 ou plus ou une perte de poids de plus de 20% entraînera l’euthanasie immédiate des animaux.
Devenir
Euthanasie des animaux nécessaires aux prélèvements et aux analyses
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour étudier le rythme circadien et son impact sur l’homéostasie des tissus et la flore intestinale. En effet, les relations entre l’apport alimentaire, le microbiote, la réponse immunitaire anti-infectieuse sont autant de facteurs s’adaptant aux différents moments de la journée, ne peuvent pas être reproduites dans d’autres systèmes tels que la culture in vitro ou ex vivo de cellules ou même d’organoïdes.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux avec une puissance statistique suffisante, des lots de 8 souris seront utilisés avec une charge infectieuse préalablement établie. Ce nombre est justifié sur la base d’expériences préliminaires montrant la variabilité inter-individuelle qui influence notamment la puissance des tests statistiques de comparaisons inter-groupes. Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront surveillés quotidiennement par des personnes formées avec un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe), de la nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration...) sera réalisé. En parallèle, l’apparence physique externe de l’animal sera observée afin de déceler des signes de diarrhée, ainsi qu'un éventuel changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe.
Raffinement
Les souris seront manipulées par des personnes formées (au maximum deux), notamment quelques jours précédant l’expérimentation, afin qu’elles s’habituent à l’expérimentateur et ainsi de réduire le stress. Les manipulations se feront à la même heure chaque jour, ceci afin d’établir une habitude pour les animaux. La manipulation des animaux se fera dans une salle de manipulation séparée de la salle d’hébergement. Les animaux seront hébergés au sein de la plateforme d’expérimentation et de haute technologie animale ou par défaut dans un des isolateurs de l’Institut Pasteur de Lille (eau et aliment standard ad libitum (ou restreint le jour ou la nuit selon les protocoles), cycle jour/nuit 12h/12h, 23 °C). Les animaux sont individualisés avec une boucle d’oreille par le fournisseur, et maintenus dans des cages de 4 à 5 individus, en portoirs ventilés (Etiquetage informatisé des cages individuelles). Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront observés quotidiennement à la recherche de signes classiques de souffrance par des personnes formées, avec un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage seront surveillés), d’un changement de comportement (perte de réponse comportementale au stimulus externe), une pesée des animaux et avec un suivi (en début et fin de journée) de la consommation de nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée, automutilation). Si une détérioration de l’état d’un animal est observée, une grille de notation sera réalisée. Si une perte de poids supérieure à 20 % survenait, les souris en souffrance seraient immédiatement mises à mort. Il est à noter qu’il ne pourra pas être utilisé d’analgésique ou d'antalgique, car ces traitements interfèrent avec la réponse inflammatoire intestinale et anti-infectieuse. En effet, les molécules anti-inflammatoires non stéroïdiens et les opiacés modifient la susceptibilité aux infections.
Choix des espèces
L'infection par les pathogènes murins que nous utilisons est permise en ayant recours au modèle animal ‘souris’ sous fond C57BL6/J. Nous utilisons cette espèce ainsi que ce fond génétique car les modèles KO que nous possédons sont sous fond C57BL6J. Les procédures commenceront entre 6 et 12 semaines d'âge des souris pour permettre à la composition du microbiote intestinal de se stabiliser et au système immunitaire d’être à maturité.. Les protocoles d'infection peuvent durer jusqu'à 3 semaines. L’induction de l’obésité par le régime durent jusqu’à 8 semaines.
Etude du role de sous types spécifiques de neurones sensoriels dans l’inflammation cutanée
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Applications répétées de molécules irritantes sur la peau, blessures cutanées, inoculations virales, gavages, injections intrapéritonéales et chirurgies de trente minutes : 3 579 souris vont être utilisées, dont 3 425 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Neuf protocoles s'étalent sur huit semaines, certains animaux étant anesthésiés à l'isoflurane jusqu'à cinq fois par semaine. Le porteur écrit que les souris génétiquement modifiées utilisées ici le sont "sans nuisances", leur principale modification étant une sensibilité à la douleur diminuée, et attribue les seules nuisances aux modèles d'inflammation. Toutes sont tuées à la fin, peau, ganglions nerveux, cerveau, moelle épinière, rate et ganglions lymphatiques étant prélevés.
Objectifs
En réponse à une coupure, une dermatite ou une infection virale, le système immunitaire déclenche une réponse inflammatoire locale impliquant le recrutement de cellules immunitaires. Cette action du système immunitaire protège des infections, mais peut aussi promouvoir la réparation et la cicatrisation. La peau, barrière de protection et tissu de contact avec l’environnement externe, est aussi innervée de capteurs sensoriels. Ces neurones sensoriels sont localisés dans les ganglions nerveux spinaux (DRG), près de la colonne vertébrale. Ils disposent de longs axones qui s’étendent jusqu’à la peau ce qui leur permet de détecter des stimulations telles que la chaleur, le froid, le toucher. Ils envoient ensuite cette information par signal électrique jusqu’au cerveau, pour déclencher des sensations variées, du plaisir à la douleur. Les neurones sensoriels sont très hétérogènes, et c’est leur diversité qui permet de détecter différentes stimulations pour déclencher des sensations distinctes. En cas d’inflammation ou de blessure de la peau, ces neurones sont activés et peuvent déclencher douleurs, inconfort ou démangeaisons, et ils participent à la défense et à la réparation de l’organisme. En revanche, on ne sait pas encore quel est le rôle précis des différents types de neurones dans ces interactions complexes. De plus, les parties du cerveau activées par ces neurones dans ces situations ne sont pas connues. Le but de ce projet est de déterminer le rôle des différents sous types de neurones sensoriels dans le cadre d’une inflammation de la peau.
Bénéfices attendus
L’inflammation en général, et les douleurs chroniques associées à l’inflammation (hypersensibilité, démangeaisons), sont encore imparfaitement comprises, et les traitements sont à la fois peu nombreux et comportent des risques de dépendance (ex : opioïdes). Ce projet vise à identifier les neurones sensoriels impliqués dans les douleurs associées à l’inflammation. Un des avantages majeurs de la neuro-immunologie est d’identifier des possibilités de traitements qui pourraient simultanément soigner la pathologie, et limiter les douleurs qui y sont associées. Par ailleurs, notre approche permet de cibler les neurones sensoriels de manière plus précise que ce qui a été fait par le passé, pour mieux comprendre comment sont générées les sensations, mais également dans l’optique de développer des thérapies plus précises en cas de dysfonctionnements. Enfin, les parties du cerveau qui traduisent les diverses stimulations en sensations sont encore mal connues, et notre approche apportera des éléments nouveaux dans ce domaine.
Procédures
Les animaux seront soumis à des modèles d’inflammation cutanée, avec réponse immunitaires localisées, qui seront suivis pendant une à trois semaines sur ces souris. Plusieurs injections seront réalisées sur les souris, selon les règles éthiques en vigueur. Des injections intrapéritonéales et sous cutanées se feront sur souris immobilisées en vigiles et prennent une dizaine de seconde par animal. Des gavages oraux sont aussi réalisés sur certaines souris immobilisées et prennent jusquà 20 secondes par animal. Les injections intrapéritonéales et les gavages sont espacés d'au moins deux jours. L'application cutanée de molécule irritantes, ou la création d'une blessure cutanée, se feront sous anesthésie et prennent jusqu'à une minute par souris. Un prélèvement sanguin pourra être réalisé sur certains animaux immobilisés en vigiles, et prennent jusqu'à une minute par animal. Certaines procédures nécessiteront une chirurgie sous anesthésie, après laquelle la plaie sera suturée, et la souris traitée avec un antalgique immédiatement après et surveillée quotidiennement pour s’assurer de son rétablissement. Le temps estimé pour ces procédures chirugicales est estimé à 30 minute par animal, à la suite de quoi l'animal est maintenu sous surveillance jusqu'à son réveil. La procédure 2 requiert 1 injection intrapéritonéale, trois gavages, un prélèvement sanguin, et 7 applications cutanée d'une molécule inflammatoire, sur une durée de 8 semaines. La procédure 3 requiert 1 injection intrapéritonéale, trois gavages, un prélèvement sanguin, et 7 applications cutanée d'une molécule inflammatoire, sur une durée de 8 semaines. La procédure 4 requiert 6 injections intrapéritonéales, trois gavages, un prélèvement sanguin, et une blessure cutanée, sur une durée de 8 semaines. La procédure 5 requiert 5 injections intrapéritonéales, trois gavages, un prélèvement sanguin, et une inoculation virale cutanée, sur une durée de 8 semaines. La procédure 6 requiert une inoculation virale cutanée, 5 injections intrapéritonéales, et trois gavages, sur une durée de 8 semaines. La procédure 7 requiert une procédure chirugicale, et 4 injections sour-cutanée, sur une semaine. La procédure 8 requiert 2 injections péritonéales, 3 gavages, une injection sous cutanée, et une intervention chirurgicale, sur une période de 8 semaines. La procédure 9 requiert une injection sous cutanée, une injection intrapéritonéale, et une intervention chirurgicale, sur une période de 3 semaines.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées sans nuisances pour les animaux. L’effet principal des modifications génétiques que nous réalisons est une diminution de la sensibilité à la douleur chez ces animaux (sensibilité à la chaleur, ou aux stimulations mécaniques). On utilise également un modèle génétique pour activer les neurones sensoriels impliqués dans les sensations de plaisir. En revanche, ce sont les modèles d’inflammation utilisés qui peuvent causer des nuisances chez les animaux, avec le développement de réactions immunitaires sur une zone définie de la peau. Par ailleurs, le suivi de certaines souris impliquera une anesthésie légère à l’isoflurane jusqu’à 5 fois par semaine, ce qui pourra induire du stress à l’animal. Enfin, certaines méthodes d’étude du cerveau nécessiteront des chirurgies sous anesthésie, pour lesquelles un traitement post-opératoire et un suivi rigoureux sont nécessaires pour s’assurer du bon rétablissement de l’animal et limiter les conséquences post-opératoires.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés sera euthanasié à l'issue de la procédure. Les organes d'intérêts (peau, DRG, cerveau, moelle épinière, rate, ganglion lymphatique) pourront alors être prélevés pour des études d'histologie, d'ARN, ou de cytométrie en flux.
Remplacement
Les interactions entre neurones et cellules immunitaires sont complexes et impliquent de nombreuses interactions, pour laquelle l’étude d’organismes entiers est requise. Les neurones sensoriels ne peuvent pas être étudiés sur des biopsies de patients humains (sauf post-mortem), et il n’y a pas encore les connaissances disponibles pour produire in vitro des cultures de neurones proches de ceux qui existent dans l’organisme. Seuls les modèles animaux permettent d'étudier ces neurones de manière rigoureuse et fiable. Nous utilisons également plusieurs approches ex vivo dans ce projet, qui ne sont pas décrites dans cette demande pour prélever et étudier les neurones et cellules immunitaires dans des cultures en boite de pétri (ex : culture des neurones sensoriels). Cette méthode est notamment utile pour observer des mécanismes moléculaires spécifiques .
Réduction
Le plan de nos expériences est construit de sorte à limiter le nombre de souris. Nous avons mené une étude statistique pour pouvoir déterminer les nombres d’animaux minimum pour répondre à chaque question scientifique posée. Après la mise à mort, un maximum d’organes seront prélevés afin d’obtenir le plus d’information possible pour chaque souris, et afin d’éviter d’avoir à répéter inutilement des expériences. Enfin, nous utiliserons des souris particulières, dites « congéniques », permettant de limiter la variabilité d’un individu à l’autre , et ce qui permet d’utiliser un nombre réduit de souris pour chaque expérience.
Raffinement
Pour réduire le stress des animaux, un temps d'acclimatation d'au minimum une semaine sera respecté après un transfert d'une animalerie à l'autre ainsi qu'avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 souris par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons en dôme. Les souris sont nourries et sont libres de leurs déplacements. Les souris génétiquement modifiées utilisées ne présentent pas de phénotype dommageable. Certaines procédures nécessitant une chirurgie sur les souris, suivront un protocole strict visant à réduire la souffrance de l’animal pendant et après la chirurgie (traitements pré et post-opératoires). Les souris seront maintenues profondément anesthésiées lors de l’opération puis traitées avec des analgésiques (et anti-inflammatoires si nécessaire). Si les animaux montrent des signes de souffrance, des doses supplémentaires d’analgésiques seront fournies. Dans le cas où ces signes perdurent, les animaux seront mis à mort. Une surveillance quotidienne est réalisée lorsque la souris a subi une intervention, pour surveiller notamment son poids, son comportement, et la zone d’inflammation. Si l’animal a un état général qui se dégrade à cause de la procédure, il sera mis à mort et l’expérience arrêtée. De la nourriture humide sera déposée systématiquement dans la cage des animaux pendant 2 jours suivant l'infection pour faciliter au maximum l'alimentation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme (dans notre cas, les schémas des systèmes immunitaires et neuronaux sont très similaires entre l’homme et la souris), l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaire et nerveux. De plus, le modèle murin est un modèle de choix par l'existence de souris génétiquement modifiées.