Système immunitaire

Injectées dans la peau avec des cellules cancéreuses, puis anesthésiées pour recevoir des anticorps radiomarqués par voie intraveineuse, 1 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La prise de sang finale se fait dans le thorax, sur animal anesthésié et sans réveil, et les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et des troubles fonctionnels qui figurent parmi les points limites. Il s'agit de mesurer où se fixent des anticorps radioactifs dans l'organisme, pour développer un outil de diagnostic du mélanome par imagerie TEP. Le porteur annonce que tous les animaux seront tués à l'issue de chaque procédure, puis écrit quelques lignes plus loin que les souris saines seront conservées, si possible, pour d'autres manipulations.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’intérêt de l’utilisation des anticorps radiomarqués dans le diagnostic et le suivi de pathologies tumorales, telles que le mélanome. L’arrivée des nouveaux anticorps thérapeutiques sur le marché, tels que les inhibiteurs de checkpoint immunitaire (ICI), notamment les anti-PD-1 et anti-CTLA_4, nécessite de développer de nouveaux outils diagnostiques qui permettront d’identifier les biomarqueurs et ainsi, déterminer le meilleur traitement à employer. En effet, les anticorps, de par leur spécificité, peuvent être utilisés en thérapie et en diagnostic ce qui en fait des candidats prometteurs pour la théragnostic. La variabilité de la réponse des patients à l’immunothérapie, malgré une analyse préalable de leur marqueur sanguin ou de leur biopsie, démontre la nécessité de développer ces outils théragnostiques. Nous proposons de développer et valider des radiotraceurs permettant un diagnostic précoce et un suivi de la réponse thérapeutique par imagerie nucléaire.Des études de biodistribution après administration intraveineuse seront réalisées sur les radiotraceurs d’intérêt afin d'observer la distribution du traceur au sein de l'organisme et dans les sites antigéniques d’intérêt. Les études précliniques se dérouleront en 2 phases : études par imagerie de Tomographie par Emission de Positons (TEP) et études post-mortem sur les organes d’intérêt. Ces études seront réalisées avec l'aide des modèles de cancers pertinents. Face à l’hétérogénéité des cancers et des mécanismes immunitaires, il est nécessaire de travailler sur plusieurs modèles murins pour ce projet. Les procédures décrites dans ce projet seront réalisées dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les études précliniques par imagerie TEP et par études post-mortem permettront d’étudier la biodistribution des anticorps thérapeutiques radiomarqués d’intérêt afin d'observer la distribution du traceur au sein de l'organisme et dans les sites antigéniques. Ainsi nous pourrons évaluer l’intérêt de l’utilisation des anticorps radiomarqués dans le diagnostic de pathologies tumorales, telles que le mélanome. Cette étude préclinique permettra de pouvoir évaluer par la suite nos anticorps radiomarqués chez l’homme afin de développer de nouveaux outils diagnostiques qui permettront d’identifier les biomarqueurs et ainsi, déterminer le meilleur traitement à employer.

Procédures

Les animaux seront soumis à une induction des tumeurs par injection intradermique de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales de traitement, basé sur des anticorps. Quel que soit le modèle, l’administration du radiotraceur, sous anesthésie à l’isoflurane, par voie intraveineuse. Prélèvement sanguin transthoracique terminal réalisé sur l’animal anesthésié sans réveil. L’établissement des tumeurs avant immunoTEP sera réalisé dans l’EU1. Toutes les sessions d’ImmunoTEP seront réalisés dans l'EU2.

Impact sur les animaux

L’injection d’anticorps radiomarqués n’influera pas sur l’état de l’animal. Les quantités injectées d’anticorps sont à doses traceuses, c’est-à-dire inférieure à la dose nécessaire à un possible effet thérapeutique. Quant au radioélément, il n’influera pas sur l’état de santé de l’animal car les activités administrées restent faibles et il s’agit de radioéléments émetteurs béta+ à usage diagnostic. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Les conditions d’hébergement seront optimisées par ajout d’enrichissement adapté pour assurer le bien-être des animaux. L’induction de modèles tumoraux peut entrainer une perte de poids de l’animal qui sera surveillée et qui fait partie des points limites. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal (points limites). Une observation visuelle quotidienne des animaux pour l’apparition des signes de douleurs sera faite par l’expérimentateur et le personnel animalier. Tout animal présentant des signes de souffrance ou de léthargie, décrit dans les points limites des procédures, sera exclu de l’étude et mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu de chaque procédure. La procédure d’étude de biodistribution des anticorps radiomarqués permettra de sélectionner les temps pertinents pour l’étude post mortem. Le protocole sera optimisé afin coïncider l’euthanasie des animaux avec l’étude post mortem. Les animaux malades ne peuvent pas être gardés et l’euthanasie est nécessaire au vu des modèles de maladie induits. Pour les animaux sains, si cela est possible, ils seront conservés pour d’autres manipulations afin de réduire au maximum le nombre d’individus nécessaires.

Remplacement

Une étude préalable in vitro des anticorps radiomarqués a été préalablement effectué pour vérifier l’intérêt des anticorps avant l’injection chez l’animal. Il a été testé la stabilité in vitro, l’affinité et l’immunoréactivité des anticorps radiomarqués sur un modèle cellulaire adapté. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.

Réduction

Une étude complète de la littérature a été effectuée pour ne pas reproduire des expériences. Nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats et limiter le nombre d’expériences. Par ailleurs, le suivi longitudinal des animaux sur 24 à 170h permis par l’imagerie non invasive TEP permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux impliqués dans l’études par comparaison avec la méthode plus classique de biodistribution ex vivo qui nécessiterait la mise à mort de lots d’animaux à chaque temps d’observation.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière à la souffrance et au stress des animaux ainsi qu’à anticiper l’atteinte des points limites. Le suivi de l’état général des souris sera effectué quotidiennement par le porteur de projet et le personnel. Pour diminuer la souffrance liée au procédures expérimentales et au développement du cancer, un traitement analgésique en locale (lidocaïne). L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations comportementales. Si un changement chez l’animal traduit un point limite, l’animal sera mis à mort, en accord avec le vétérinaire désigné. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool).

Choix des espèces

L’utilisation de modèles animaux de cancer est incontournable si nous voulons préciser les mécanismes sous- jacents à son développement. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décris pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine. Les expériences seront réalisées sur des jeunes adultes (6-16 semaines). Avant le système immunitaire est immature et après il est affaibli, de plus la croissance tumorale n'est pas la même sur des souris jeunes adultes que sur des souris âgées.

Une sonde de température est implantée sous la peau de chaque souris, qui reçoit ensuite dans la veine de la queue une injection de bactéries pathogènes. 176 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les quatorze jours d'infection sont résumés à une "variation de température", alors que le raffinement prévoit d'administrer des analgésiques en cas de baisse trop forte de la température corporelle. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur donnant pour seule raison qu'elles auront été infectées par des bactéries pathogènes.

Objectifs

La pyrine est un composant de l'immunité. La pyrine est activée lors de certaines infections bactériennes et déclenche une réaction inflammatoire (variation de température) qui permet de lutter contre ces infections. A ce jour, les mécanismes d'activation et de régulation de la pyrine lors d'infections est peu compris. Le but de ce projet est de mieux décrire les mécanismes d'activation et de régulation de pyrine lors d'infections bactériennes dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Nous attendons des bénéfices scientifiques de ce projet : progrès des connaissances sur l’activation et la régulation de pyrine et sur l’utilisation d’un modèle murin pour modéliser l’activation de pyrine lors d’une infection. L'inflammasome pyrine étant associé à des maladies génétiques chez l'homme (la fièvre méditerranéenne familiale entre autres), l'utilisation d'un modèle murin humanisé pourra nous permettre de développer de nouveaux traitements pour ces maladies génétiques.

Procédures

Tous les animaux du projet subiront une injection intraveineuse qui durera 30secondes dans la veine de la queue et une injection sous-cutanée qui durera 30 secondes d'une sonde de température, certains animaux pourront recevoir une injection sous cutanée de qui durera 30secondes d'analgésique.

Impact sur les animaux

Les gestes techniques prévus dans les procédures (injections intraveineuses ponctuelles, mesure de poids, pose de sonde de température) sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. Pendant les 14 jours d’infection, les souris pourront ressentir les effets de l’infection (variation de température).

Devenir

Les animaux auront été infectés par des bactéries pathogènes, ils seront donc euthanasiés

Remplacement

L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests préliminaire déjà réalisés in vitro) et pour s’assurer d’une potentielle relevance clinique. Les modèles in vitro étudient la réplication de bactéries dans un seul type cellulaire dans un contexte non-inflammatoire et ne peuvent pas mimer la complexité des interactions hôtes-pathogènes rencontrées lors d’une infection.

Réduction

De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Nous prévoyons 5 animaux par lot de génotype et de souche d’infection, 3 animaux par lot contrôle pour les analyses post-mortem. Les nombres d’animaux sont calculés au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.

Raffinement

Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation à la contention (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser angoisse et biais secondaire. 2) Utilisation d’implants pour prendre la température (la pose de l’implant est plus invasive mais cela permettra de rendre les prises de température moins intrusive) 3) Anesthésie gazeuse lors de la pose de l'implant de température 4) Minimisation de la fréquence de manipulation (observation et privilège aux mesures les moins intrusives). 5) L'utilisation d'analgésiques en cas de trop forte baisse de température corporelle des animaux suite à l'infection. Les points limites sont définis spécifiquement pour le projet afin de limiter au maximum la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo, vertébré Mammifère), avec un fonctionnement immunitaire reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain. La souris en est un modèle idéal, permettant aussi un accès aux lignées humanisées, KO (délétion de gènes) et phénotypes issus de mutations, indispensables pour l’analyse de maladies génétiques comme ici. Par ailleurs, les animaux portant un gène humanisé nous permettront de savoir si les réponses observées in vitro sont transposable à l’échelle de l’organisme. Les expériences débuteront à l’âge de 6 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature.

Une colite est provoquée chimiquement chez 1 962 souris, qui peuvent alors perdre du poids, saigner dans les selles et par le rectum, et développer un prolapsus anal. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue. Le porteur qualifie pourtant les produits administrés de "non toxiques et non irritants" et annonce comme seule nuisance attendue une gêne de courte durée au point d'injection, avant de décrire une inflammation de l'ensemble du tractus intestinal. Les souris sont mises à mort après un prélèvement sanguin terminal, pour des analyses portant sur le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes du côlon.

Objectifs

Le côlon est un organe formé d’une monocouche de cellules dites épithéliales qui s’invaginent de façon à former des cryptes. Ces cryptes participent à l’absorption et à la digestion. Cette barrière physique (les cellules épithéliales) est constamment en contact avec des agents extérieurs : microorganismes provenant du microbiote ou du bol alimentaire par exemple. Ainsi, le côlon est protégé par de nombreuses structures lymphoïdes : ce sont des agrégats de cellules immunitaires situés entre les cryptes du côlon. Ces cellules immunitaires, principalement des lymphocytes (d’où le terme de structure lymphoïde), sont présentes pour à la fois tolérer le microbiote mais également déclencher la défense immunitaire en cas d’infection par un agent pathogène par exemple. Au niveau architectural, les structures lymphoïdes sont formées d’un réseau de cellules hautement contractiles appelées fibroblastes, entre lesquelles naviguent les cellules immunitaires. Lors d’une réaction immunitaire, les structures lymphoïdes augmentent leur volume afin de recruter plus de cellules immunitaires et augmenter la puissance et la vitesse de réponse à l’inflammation. Ce phénomène est régulé par le réseau de fibroblastes de la structure lymphoïde, qui se contracte ou se relaxe pour modifier le volume de la structure. Les fibroblastes jouent donc un rôle important dans le fonctionnement de la réponse immunitaire locale via les structures lymphoïdes. Cependant, aucune étude n’a été réalisée au niveau des structures lymphoïdes du côlon, alors que cet organe est constamment mis à l’épreuve par l’environnement extérieur (via le microbiote notamment). Dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (ou MICI), le côlon est dans un état inflammatoire important. Cette inflammation chronique du tissu peut être due à une dérégulation du système immunitaire dans le côlon. Chez les patients atteints de MICI, il existe un risque plus élevé de développer un cancer colorectal. Notre projet vise à caractériser le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes dans l’homéostasie (c'est-à-dire en conditions physiologiques, en l'absence d'inflammation), l’inflammation du côlon, et le cancer colorectal

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre à court terme d’étudier le rôle de la contractilité des fibroblastes dans la régulation des structures lymphoïdes décrites ici dans l’inflammation du côlon. Il va ainsi permettre d’améliorer les connaissances sur les interactions entre les cellules immunitaires et les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale en contexte inflammatoire chronique. A long terme, il pourrait permettre de mieux comprendre le rôle des SLT dans l’inflammation colique pré-cancéreuse et de mettre en évidence un nouveau mécanisme de cancérogenèse dans le côlon. Ceci pourrait participer à l’élaboration de nouveaux traitements des MICI ainsi que du cancer colorectal.

Procédures

Dans un premier lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Au moins 24h après, un second produit sera administré aux animaux vigiles (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Enfin, les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min). Dans un deuxième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Ces animaux seront ensuite répartis en 3 groupes, un premier groupe reçevra un second traitement sur 8 jours en continu puis auront une période convalescence de 0 à 60 jours. Le deuxième groupe recevra le même second traitement mais sur 3 cycles de 5 à 8 jours avec 7 jours de repos entre chaque cycle puis une convalescence de 7 à 60 jours. Enfin le troisième groupe recevra un autre traitement à raison d’une fois par semaine sur 4 semaines (durée du geste inf à 10 sec). 2h avant la mise à mort, une partie de chacun des groupes, recevra un dernier traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Enfin, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min). Dans un troisième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Les animaux auront un second traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). De plus, un autre traitement sur 4 jours à 3 cycles (repos de 4 à 17 jours entre chaque cycle) sera réalisé. Les animaux seront suivis par coloscopie sous aneshtésie (durée du geste 5 min). Enfin, 2h avant la mise à mort, tous les animaux recevront un autre traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Finalement, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues suite à l’administration de produits non toxiques et non irritants seront celles liées aux administrations elles-mêmes : gêne de courte durée au point d’injection. L’administration de nos traitements peut engendrer une déshydratation et une inflammation de l’ensemble du tractus intestinal. Les animaux utilisés lors des procédures peuvent présenter une perte de poids, des saignements dans les selles et rectaux. Ces effets pourront être observés en cours de traitement et jusqu’à 1 semaine après l’arrêt du traitement. La coloscopie peut engendrer une irritation transitoire du côlon.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Il est nécessaire de réaliser les expériences sur des animaux afin de modéliser (i) le développement des structures lymphoïdes tertiaires dans l’inflammation colique et (ii) le cancer colorectal ainsi que (iii) les interactions entre les différentes populations immunitaires, les fibroblastes et les cellules épithéliales adjacentes. Dans l’état actuel de notre projet, les expériences in vitro ne sont pas adaptées pour étudier les comportements immunitaires dans l’inflammation du côlon et le cancer colorectal (interactions cellulaires multiples et complexes). Il est difficile de reproduire la complexité du système immunitaire et de son interaction avec les cellules épithéliales à l’aide des organoïdes. Cependant, nous envisageons, dans une étape ultérieure, d’utiliser des organoïdes de côlon en co-culture avec des cellules immunitaires afin de répondre à des questionnements plus spécifiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts Plusieurs types d'analyses seront effectués sur la même souris. Les tissus extraits seront utilisés pour des expériences multiples afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. De plus, les croisements de souris seront optimisés pour produire le nombre d'animaux souhaité de génotype d’intérêt. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique. Tous les animaux seront utilisés pour des analyses post-mortem.

Raffinement

Les animaux seront suivis attentivement : mesure du poids cinq fois par semaine voire quotidienne (week-end inclus) à partir de 20% de perte de poids, surveillance du rectum (présence de prolapsus anal) et des selles (présence de diarrhées), aspect et comportement (signes de détresse), afin de détecter tout signe de souffrance. De plus, de précédentes études ont permis de déterminer les doses optimales de nos traitements afin d’optimiser les résultats obtenus tout en minimisant l’impact sur les animaux. Les gestes douloureux ou invasifs seront réalisés sous anesthésie avec recours aux analgésiques si nécessaire. Une grille de score adaptée aux procédures réalisées est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas de perte de poids, du gel nutritif sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire qui peuvent être causés par la colite spontanée ou chimio-induite. En cas de déshydratation, une injection de soluté réhydratant chaud sera administrée. Le gel nutritif peut être proposé en complément de l’injection. Enfin, l’inflammation du côlon peut être suivie par une méthode non invasive grâce à la recherche de marqueur de l’inflammation dans les selles.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage qui permet l’obtention rapide de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. De plus, les bases de données d'expression de la souris, les lignées de souris et les protocoles déjà établis permettraient d'étendre facilement ce projet à l'avenir en utilisant des modèles déjà existants, ou de comparer les résultats du projet à différents ensembles de données provenant d'autres projets. Par ailleurs, la souris est très proche de l'Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c'est donc un excellent modèle d'étude des maladies chroniques du tractus intestinal et du cancer colorectal. De plus, cela nous permet d’étudier le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes dans l’inflammation colique et le cancer colorectal. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire mature.

8 694 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection d'antigènes puis une prise de sang tous les sept jours, et une partie d'entre elles est irradiée pour que son système immunitaire soit reconstitué à partir de moelle osseuse prélevée sur des souris donneuses. Le porteur situe la douleur du côté de cette irradiation, des injections de cellules et des biopsies de génotypage, et décrit l'épisode d'auto-immunité observé dans certains cas comme sans effet sur le bien-être de l'animal. Il indique par ailleurs que sept souris par groupe suffisent à obtenir des résultats concluants et que chaque expérience sera répétée trois fois, sans expliquer comment on parvient de là à 8 694 animaux.

Objectifs

L'aide entre lymphocytes B et T est une partie indispensable dans notre système immunitaire pour la génération d'anticorps de haute affinité qui nous protègent contre les infections. Nos travaux précédents montrent que la régulation des ARNs dans les lymphocytes B et T est essentielle pour développer cette protection immunitaire. Donc, avec l'utilisation de modèles de souris, notre projet vise à découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires qui contrôlent l'amplitude et l'extension des réponses immunitaires pour le développement de futures thérapies vaccinales. Plus précisément, les objectifs spécifiques de notre projet sont : 1 - Comprendre les interactions des lymphocytes T et B dans un contexte physiologique après immunisation, et 2 - Étudier l’importance de la régulation des ARNs par les protéines de liaison à l'ARN dans les mécanismes d’activation du système immune.

Bénéfices attendus

Nous avons sélectionné des modèles de souris pour évaluer l'importance des mécanismes qui régulent des ARNs tels que l'épissage, la traduction et la dégradation de l'ARNm. Le rôle de ces mécanismes dans le bon fonctionnement des lymphocytes B et T est peu exploré mais essentiel comme nous l'avons récemment rapporté. Nos études apportent des connaissances importantes sur la biologie des ARNm et le fonctionnement des lymphocytes B et T pour une meilleure optimisation des stratégies de vaccination basées sur l'ARN.

Procédures

Toutes les souris (contrôle et déficient en une protéine régulatrice de l'ARN) seront vaccinées avec des antigènes modèles par injection intrapéritonéale ou sous-cutanée. Une prise de sang sera réalisée tous les 7 jours pour surveiller la réponse immunitaire. Les organes seront collectés après l'euthanasie. Certaines souris seront irradiées pour reconstituer leur système immunitaire avec des cellules de moelle osseuse provenant de souris donneuses. Dans d’autres cas, des lymphocytes B et/ou T avec des récepteurs de cellules T ou de cellules B spécifiques seront transférés à des souris hôtes avant la vaccination et évaluation du système immunitaire. Avant d'effectuer une procédure, le génotypage de tous les animaux sera déterminé par PCR après prélèvement d'une biopsie tissulaire.

Impact sur les animaux

La vaccination avec des antigènes émulsionnés dans un adjuvant n'a aucune conséquence dans nos modèles des souris. La souffrance et la douleur dans nos procédures sont principalement associées à l'irradiation de souris pour la reconstitution de cellules immunitaires, à l'injection de cellules ou d'antigènes et à des prélèvements de sang ou d’une biopsie tissulaire. Nous avons observé le développement d'un épisode d'auto-immunité léger dans certains cas mais il n'affecte pas la vie ou le bien-être de l'animal. Cet épisode disparaîtra au bout de 3 semaines, après la génération de nouvelles cellules T régulatrices fonctionnelles.

Devenir

Dans ce projet, tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Aucune alternative à l'utilisation de souris n'est disponible. Les réponses immunitaires contre les agents pathogènes sont des mécanismes complexes qui ne peuvent être modélisés in vitro. Les souris ont un système immunitaire similaire à celui des humains. Dans la mesure du possible, nous remplacerons les souris avec des cultures cellulaires in vitro, mais ces cultures ne retranscrivent pas la physiologie du système immunitaire.

Réduction

Les directrices ARRIVE et du Comité d'éthique sont suivies pour garantir le bien-être animal et la collecte de données de haute qualité avec un nombre minimum d'animaux. La stratégie d'élevage produit des souris tests et contrôles. Les souris seront sevrées en fonction du sexe, mais pas du génotype. Le nombre minimal d'animaux dans chaque expérience est déterminé en utilisant des calculs de puissance statistiques. En général, nous aurons besoin de 7 souris par groupe pour l’obtention de résultats statistique concluants. Nous répéterons chaque expérience 3 fois pour tester la reproductibilité.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine dès l’initiation du modèle. Les utilisateurs ont reçu une formation spécialisée officiel que leur permettant le raffinement des procédures. Un animal sera euthanasié s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure que nous aurons définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces points limites sont associés à une reconstitution défectueuse du système immunitaire mais pas à la vaccination avec des antigènes modèles (qui sont asymptomatiques). Des zootechniciens compétents assureront également le suivi du bien-être des animaux et des signes cliniques, et nous signaleront tout incident tel que l’amaigrissement, la déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés et/ou une absence de toilettage.

Choix des espèces

La dynamique des réponses immunitaires observées chez la souris est similaire à celle observée chez l'homme. En outre, il est connu que les mécanismes moléculaires régulés par de telles protéines de liaison à l'ARN sont les mêmes chez la souris et chez l'homme. Ainsi, ces modèles de souris nous permettront d’identifier les mécanismes responsables d’une réponse immunitaire efficace dans un contexte physiologique de maladies immunitaires et de pathologies inflammatoires. Pour ces raisons, nous avons généré de nouvelles souris transgéniques knock-out pour étudier le rôle des protéines de liaison à l'ARN impliquées dans l'épissage, la maturation et la traduction de l'ARN dans la réponse immunitaire. Les procédures 1, 2 et 4 seront effectuées sur des souris âgées de 6 à 20 semaines présentant un système immunitaire mature mais non vieillissant. Le transfert de cellules B et T afin de reconstituer ces compartiments immunitaires (procédure 3) peut être réalisé chez les jeunes souris et après sevrage (3 semaines) pour favoriser l'expansion des lymphocytes innés.

4 770 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, et une partie d'entre elles est anesthésiée jusqu'à dix fois en deux semaines pour recevoir une injection par jour, cinq jours par semaine, avant parfois un second traitement. D'autres reçoivent six injections en quatre jours sans anesthésie, ou une seule application de produit sur la peau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'injection d'un agent inflammatoire, que le résumé ne nomme pas, provoque une inflammation et une zone de fibrose de moins d'un centimètre sur le bas du dos, avec douleur, gonflement et rougeur, puis une desquamation entre le 12e et le 16e jour, et les souris sont suivies six semaines. Le porteur présente ces travaux comme un apport de "connaissances fondamentales" sur la migration des cellules immunitaires, et comme un préalable pour établir ensuite des "modèles in vitro conformes aux propriétés des tissus observées in vivo".

Objectifs

La peau est le plus grand organe du corps humain, indispensable à notre survie. Elle agit comme une barrière protectrice, maintient la température corporelle stable et joue un rôle crucial dans notre système immunitaire. La peau est composée de trois couches. 1)L’épiderme, la couche externe, est principalement constitué de kératinocytes qui synthétisent la kératine, une protéine qui protège la peau contre les dommages et la déshydratation. 2)Le derme, la couche intermédiaire, contient des fibres de collagène et d’élastine qui lui donnent élasticité et fermeté. Il abrite également des vaisseaux sanguins, des nerfs, ainsi que des follicules pileux. Enfin, 3) l’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau et est essentiellement composée de tissus adipeux et conjonctif. Elle fournit une isolation thermique et agit comme un coussin pour les organes internes. Dans le derme et l’épiderme, les cellules immunitaires patrouillent à la recherche de pathogènes ou de signaux de danger pour la mise en place d’une réponse immunitaire efficace, qu’elle soit spontanée suite à une infection ou à l’apparition d’une tumeur, ou induite par un vaccin par exemple. Ce processus est aussi essentiel pour le maintien de la tolérance immunitaire, et ainsi éviter les maladies auto-immunes. Pour cela, certaines cellules immunitaires (les cellules dendritiques) se déplacent dans les tissus en prélevant des échantillons de leur environnement. Elles migrent ensuite vers les ganglions lymphatiques drainant leur tissu d’origine. Ces 2 étapes (échantillonnage en périphérie et migration vers les ganglions) sont clefs dans la mise en place de la réponse immunitaire et le maintien de la tolérance. Dans les tissus, la migration des cellules dendritiques est guidée par des signaux chimiques et physiques, qui sont profondément modifiés en cas d’inflammation et de fibrose. Notre projet vise à comprendre comment la modification des propriétés mécaniques de la peau modifie la migration et l’efficacité des cellules immunitaires dans la peau et dans les ganglions. La compréhension de ces mécanismes mis en jeu pourra s’appliquer à d’autres pathologies dans lesquelles la modification de la structure du tissu est majeure. La modification de la structure tissulaire et de ses propriétés physiques est maintenant connue dans de nombreuses pathologies notamment au sein divers cancers, où le remodelage semble favoriser la survenue de métastases en inhibant la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Comprendre comment l’installation d’une fibrose modifie les propriétés mécaniques des tissus et la migration des cellules immunitaires permettra d’obtenir des connaissances fondamentales sur la migration des cellules dans les tissus. Nous focalisons nos recherches sur les cellules dendritiques, cellules sentinelles du système immunitaire indispensable pour le déclenchement d’une réponse immunitaire spécifique. Nous étudierons ici de manière détaillée des voies de signalisations mises en jeu dans leur sensibilité aux signaux physiques et mécaniques. Ces mécanismes pourront être utilisés dans de nombreuses autres pathologies où la modification de la matrice extracellulaire joue un rôle majeur dans la progression de la maladie et la réponse immunitaire.

Procédures

Un premier lot d’animaux recevra des injections de traitements, pendant 4 jours consécutifs. Aux jours 1 et 3 du traitement, les animaux vigiles recevront 2 injections tandis qu’aux jours 2 et 4 du traitement, ils recevront une injection unique (durée du geste inf à 10 sec) Dans un second lot, les animaux vigiles recevront une application cutanée unique de produit (durée du geste inférieure à 1 minute). Dans un troisième lot, les animaux anesthésiés recevront des traitements par injection à raison de maximum 1 injection par jour, 5 jours par semaine pendant 2 semaines (durée de chaque anesthésie de 10 minutes maximale). Certains de ces animaux recevront ensuite un second traitement soit par injection à raison d’1 injection par jour pendant 4 jours consécutifs (durée du geste inf à 10sec) soit par application cutanée (application unique – durée du geste de 1 minute).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors des injections de produits seront celles liées à la piqûre elle-même (douleur de courte durée). L’injection d’un agent inflammatoire induira une inflammation chez les animaux. L’inflammation se caractérise par la douleur, le gonflement, la rougeur et la chaleur qui peuvent entraîner une gêne chez l’animal. Néanmoins, il s’agit ici d’une inflammation locale et non générale, et modérée. La gêne est caractérisée par l’apparition d’une desquamation principalement entre les 12e et 16e jours après injection, et la présence d’un érythème dont l’intensité est maximale du 9e au 14e jour. Les animaux seront suivis pendant 6 semaines afin d’étudier la résolution de l’inflammation, mais nous ne nous attendons pas à des effets rémanents après la fin des injections. La surface attendue de la zone fibrotique de la peau du bas du dos de la souris est inférieure à 1cm. Nous porterons notre attention spécifique sur cette zone. Nous ne nous attendons pas à des conséquences sur la mobilité des souris , la zone fibrotique étant à distance des articulations des membres supérieurs et inférieurs. Un éventuel effet sur la mobilité n’a d’ailleurs pas été décrit dans la littérature. L’application cutanée d’un marqueur fluorescent sans addition de molécule pro-inflammatoire induira une réaction locale éventuelle (mais non décrite dans la littérature). L’application cutanée d’un marqueur fluorescent associé à une molécule proinflammatoire pourra induire un aspect inflammatoire local (rougeur, chaleur).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

L’influence du microenvironnement tissulaire sur la migration des cellules immunitaires a été démontré par de nombreuses équipes au cours de la dernière décennie. Ces cellules répondent à des signaux de dangers, largement étudiés in vitro , comme par exemple la présence de composants bactériens. Néanmoins, il s’agit d’un effet direct d’un agent inflammatoire sur les cellules, qui ne prend pas en compte le contexte complexe et la réponse du tissu, qui répond également à la présence de signaux de dangers. Il n’est donc pas possible d’extrapoler ces données sans avoir une description précise et quantitative des propriétés du microenvironnement in vivo. L’utilisation de différents modèles in vitro (matrice en fibres 3D) ou ex vivo (explants de peau humaine) ne permettent pas de reconstituer la complexité du tissu cutané : - Sa structure en 3 couches (épiderme, derme, hypoderme) et la structure des fibres de collagène formant le tissu de soutien aux cellules. - Nombreux types cellulaires présents : kératinocytes dans l’épiderme, fibroblastes dans le derme, adipocytes (manquant dans les modèles in vitro), extrémités neuronales (non présents dans les modèles in vitro) et l’infiltrat immunitaire comportant de multiples types cellulaires différents. L’objectif de ce projet est de fournir cette description, afin ensuite de pouvoir établir des modèles in vitro conformes aux propriétés des tissus observées in vivo. Cela permettra alors d’isoler les propriétés du tissu une par une et de tester leur effet individuel sur les cellules immunitaires, afin d’identifier les paramètres les plus importants. Par ailleurs, Le modèle in vivo est indispensable pour déchiffrer le dialogue entre différentes cellules immunitaires et la migration d’un organe à l’autre, dans un organisme vivant intégré dont le système immunitaire est proche de celui de l’homme, comme la souris. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet, afin d’avoir un tissu et un système immunitaire complets et fonctionnels.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les expériences de mise au point seront réalisées sur des échantillons prélevés sur des animaux utilisés pour d’autres expériences (mise à mort pour prélèvement d’autres organes que la peau). Une procédure pilote sera réalisée afin de déterminer les meilleurs temps expérimentaux à utiliser. Les échantillons issus des études pilotes seront également utilisés pour les analyses des procédures suivantes. Le maximum d’échantillons d’intérêt sera prélevé lors de la mise à mort des souris (peau, ganglions, sérum) et conservés pour des analyses ultérieures. Cela permettra de concentrer ensuite la caractérisation sur ces conditions expérimentales et donc de limiter le nombre total d’animaux utilisés. A partir de données publiées et accessibles, nous avons ici déterminé le nombre d’animaux nécessaire comme étant le plus petit nombre d’animaux permettant de mettre en évidence une différence significative dans notre modèle expérimental (induction de fibrose cutanée).

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales, les animaux sont suivis attentivement afin d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Pour cela : -Les souris sont habitués à l’animalerie (accoutumance après transfert) et habituées à être manipulées par le même expérimentateur avant le début de la procédure, afin de limiter le stress après le début de la procédure. -Un suivi clinique renforcé sera réalisé pendant les 30 min suivant l’injection sous-cutanée, puis 6h après, puis une fois par jour pendant 10 jours, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. -Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point limite, les animaux seront sortis de la procédure (traitement antalgique, mise à mort). -Le suivi des animaux pour les procédures suivantes sera adapté en fonction de ce qui a été observé dans les procédures antérieures (au fur et à mesure de l’avancée du projet). Pour éviter l’inconfort et la douleur lors des procédures, des anesthésiques et analgésiques adaptés seront utilisés.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet.

Pour tester sur la peau des molécules dont l'établissement dit ignorer la composition, celles de ses clients, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus. Une inflammation de l'oreille leur est provoquée par injections répétées d'interleukine 23, puis les produits sont appliqués une ou deux fois par jour pendant seize jours. Huit mesures d'épaisseur de peau au pied à coulisse ou par imagerie, et une prise de sang hebdomadaire sous anesthésie gazeuse, complètent le protocole. Les points limites retenus donnent la mesure des atteintes possibles, perte de plus de 20 % du poids sur 72 heures, hypothermie persistante, plaie nécrosée ou purulente, arrêt de l'alimentation pendant 24 à 48 heures.

Objectifs

La dermatite atopique, encore appelée eczéma atopique, est une des maladies les plus fréquentes de l'enfant qui peut apparaître dès les premiers mois de la vie. L’origine de cette pathologie est principalement allergique. Il n’existe pas de traitement curatif efficace à ce jour. Les traitements utilisés sont symptomatiques et permettent de réduire les signes cliniques. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique pertinent permettant de tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). De ce fait, il est important d’avoir un modèle préclinique prédictif de la dermatite atopique afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques) qui permettront dans un futur proche d'apporter au patient plus de confort au quotidien.

Bénéfices attendus

Ces études permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traiements contre la dermatite atopique. Si une molécule se révélait efficace, elle permettrait d'améliorer la prise en charge des patients atteints de cette pathologie.

Procédures

Les interventions réalisées au cours de l'étude sont les suivantes: manipulation quotidienne (1 minute), contention pour administrations (une ou deux fois par jour pendant seize jours, durée d'environ trente secondes), anesthésie gazeuse pour l'induction et mesures au pied à coulisse ou par imagerie non invasive par tomographie de cohérence optique ou OCT (à huit occasions, tous les deux jours, environ 5 minutes), prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum, durée d'environ trois minutes).

Impact sur les animaux

L'injection répétée d'IL23 (interleukine 23) induit une inflammation locale au niveau de l'oreille. Il est possible également que des effets indésirables liés aux molécules testées apparaissent, mais ceux-ci sont difficiles à anticiper car il s'agit des molécules de nos clients dont nous n'avons pas connaissance. Le suivi clinique et la mise en place d'un scoring permettra de les détecter le plus précocément possible et d'adapter les traitements (dose, fréquence...) en conséquence.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés pour analyses.

Remplacement

L'utilisation du modèle animal de dermatite atopique ne sera utilisé qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme)

Réduction

La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (seuil de significativité alpha de 5% dont le critère principal sera l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d’initier les phases de traitement. Le nombre d’animaux sera de 8 répartis en 5 groupes (un groupe induit mais non traité, un groupe induit et traité avec une molécule de référence, un groupe induit traité avec l'escipient de la molécule à tester, 2 groupes d’animaux devant recevoir la molécule à tester à deux différentes doses ou recevant 2 molécules à tester). Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation d'imagerie OCT permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés de 50% du fait du suivi longitudinal de chaque animal. Une procédure d’évaluation de la dermatite atopique en imagerie est prévue et cette approche permettra de réduire le nombre d’animaux de 50 %. Dans le cadre d’une approche classique (approche en groupes parallèles, sans utilisation d’imagerie et sans application d’un plan en mesures répétées), le nombre d’animaux par groupe de traitement serait supérieur dans le cas où l'on voudrait suivre l'évolution de la pathologie au cours du temps (au moins 16 animaux par groupe, par exemple 8 animaux mis à mort à un temps intermédiaire et 8 animaux mis à mort à la fin de l'expérimentation dans le cas où une approche histologique classique serait envisagée).

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites au niveau des oreilles et de la peau du dos...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation - Perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris immunocompétentes) sont d’excellents modèles de dermatite atopique. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de la dermatite atopique induite dans ces espèces. De plus, ces animaux développent des symptômes de dermatite atopique très semblables à ceux observés chez l’humain. Ils présentent aussi certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants (maturité). Tous les animaux auront le même âge.

Infectées par instillation directe dans la trachée sous anesthésie, 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent ensuite neuf à dix-sept fois en tube de contention pour une mesure de composition corporelle, et quatre à neuf tests de tolérance au glucose, chacun précédé de cinq heures sans nourriture et suivi de sept prélèvements de sang à la queue. L'objectif est de mesurer ce qu'une infection bronchique chronique de trente à quatre-vingt-dix jours fait aux os, aux muscles et au métabolisme du glucose. Le porteur écrit que la perte de poids n'excède jamais 5 % et que les souris reprennent une activité normale en deux jours, tout en indiquant que l'infection peut se compliquer du décès de l'animal dans moins de 5 % des cas.

Objectifs

Notre projet a pour but d’étudier les effets de l’infection bronchique chronique au niveau extra-pulmonaire. Les infections pulmonaires chroniques sont une complication fréquente des maladies bronchiques chroniques et ont un lourd impact pronostic. Elles sont responsables d’un déclin plus rapide et plus marqué de la fonction respiratoire et d’une augmentation du nombre d’exacerbations respiratoires (aggravation aigue de la maladie chronique). De plus, les maladies respiratoires chroniques s'accompagnent souvent de comorbidités ou de manifestations extra-respiratoires telles que l'ostéoporose, la perte de muscles, la dénutrition, le diabète, et les maladies cardiovasculaires. Le rôle de l’infection pulmonaire chronique dans la survenue de ces manifestations extra-respiratoires n’est à ce jour pas connu et n’a jamais fait l’objet d’études spécifiques dans le cadre de modèles animaux. Le modèle murin d’infection bronchopulmonaire chronique développé dans notre laboratoire est particulièrement adapté à la réalisation d'études longitudinales. L’objectif de ce projet est donc d’étudier les effets de l'infection bronchique chronique sur la composition corporelle et musculaire, l'architecture osseuse, l'inflammation sanguine, et le métabolisme du glucose.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à faire progresser les connaissances scientifiques afin de générer des bénéfices substantiels en santé humaine. Les infections pulmonaires chroniques, complications fréquentes des maladies bronchiques chroniques, ont un lourd impact sur la santé des patients et sont souvent associées à des comorbidités graves comme l'ostéoporose, la sarcopénie, la dénutrition, le diabète et les maladies cardiovasculaires. Cependant, le lien entre ces manifestations extra-respiratoires et les infections pulmonaires chroniques demeure largement inexploité scientifiquement, notamment dans les modèles animaux. Les bénéfices attendus de cette recherche sont multiples. Premièrement, elle permettra d'élucider les mécanismes reliant les infections bronchiques chroniques aux anomalies musculo-squelettiques et métaboliques, ainsi qu'à l'inflammation systémique. Ces connaissances pourraient conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter ou prévenir ces complications chez les patients atteints de maladies bronchiques chroniques. Une meilleure compréhension de l'interaction entre l'infection chronique et le métabolisme du glucose pourrait offrir des pistes pour des interventions visant à réduire le risque de diabète chez ces patients. Deuxièmement, cette étude pourrait modifier les pratiques cliniques en améliorant le suivi et la prise en charge des patients. L'identification de biomarqueurs spécifiques d'inflammation systémique et d'infection chronique permettrait une meilleure surveillance de la progression de la maladie et d'ajuster les traitements en conséquence, ralentissant ainsi la progression des comorbidités et améliorant la qualité de vie des patients. Enfin, ce projet a le potentiel d'enrichir la littérature scientifique en fournissant des données précises et inédites sur les effets systémiques des infections pulmonaires chroniques. En résumé, ce projet permettra d'approfondir notre compréhension des infections pulmonaires chroniques et de leurs effets systémiques, tout en fournissant des bases solides pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes, avec des bénéfices à long terme pour les patients et le système de santé.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions. Tout d'abord, ils seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) puis infectés par vvoie intra-trachéale directe. Cette intervention sera réalisée une fois pour chaque animal et devrait durer quelques minutes (anesthésie + infection). Des mesures de la composition corporelle des souris seront réalisées de manière répétée tout au long de l'étude (9, 13 ou 17 mesures selon le temps d’infection qui sera de 30, 60 ou 90 jours). Cette procédure implique la pesée des souris suivie d'une analyse par scanner à résonance magnétique nucléaire pour évaluer la masse grasse et la masse maigre de chaque animal. Le scan se fait en contention dans un tube adapté pour les rongeurs pendant 3 minutes (animal vigile). Enfin, seront effectués des tests métaboliques tels que l'IPGTT (test de tolérance au glucose intrapéritonéal). Pour évaluer les profils glycémique et insulinémique après une charge en glucose (IPGTT), les souris subiront une restriction alimentaire de 5 heures (de 9h à 14h), puis recevront du glucose en fonction de leur poids. Les mesures de glycémie seront prises à t=0’, 5’, 10’, 15’, 30’, 60’ et 120’ (prélèvement sanguin de 5 microlitres). Des prélèvements sanguins (environ 40 microlitres) seront effectués à t=0’, 15’, 30’ et 60’ pour doser l’insuline. La glycémie est mesurée en premier pour éviter tout impact de stress sur la valeur initiale. Durant tout le test, les animaux ont accès uniquement à l’eau, et la nourriture leur est remise à la fin du test. Les animaux sont laissés au repos pendant au moins une semaine entre chaque test. Ce test sera réalisé 4, 6 ou 9 fois sur chaque animal selon le temps d’infection (30, 60 ou 90 jours). Enfin, au terme de l'infection, les animaux seront mis à mort selon un protocole établi, impliquant une injection intrapéritonéale de d'anesthésiques et d'analgésiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux dans le cadre de ce projet sont : 1° Stress et inconfort liés aux manipulations : Les animaux seront soumis à des mesures régulières de poids et de composition corporelle, ainsi qu'à des prélèvements sanguins, ce qui peut causer du stress et de l'inconfort. 2° L'infection bronchique peut causer un stress initial (manipulation, anesthésie) et des difficultés respiratoires temporaires (résolutives en moins de 30 minutes suivant l'instillation généralement). Dans de rares cas (

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort au terme des différents temps expérimentaux.

Remplacement

Dans le domaine de la recherche en santé respiratoire, les alternatives non animales les plus fréquemment utilisées sont les modèles in vitro (cultures cellulaires) et les organoïdes. Ces méthodes présentent cependant des limitations significatives lorsqu’il s’agit d’étudier des systèmes complexes comme par exemple les réponses physiopathologiques mises en jeu au niveau systémique en réponse à une infection pulmonaire chronique. En effet, les modèles in vitro et les organoïdes ne permettent pas de reproduire de manière fidèle les interactions entre différents systèmes corporels ni de simuler l'inflammation systémique et les réponses immunitaires globales de l'organisme. Par conséquent, l'utilisation d'animaux vivants, en l'occurrence des modèles murins d'infection bronchopulmonaire chronique, est essentielle pour atteindre les objectifs de ce projet. Les souris offrent un modèle biologique pertinent en raison de leurs similarités physiologiques et immunologiques avec les humains, ce qui permet une évaluation détaillée et intégrée des effets systémiques des infections chroniques. Cela inclut l'étude des interactions entre l'infection pulmonaire et les réponses musculo-squelettiques, métaboliques et inflammatoires à l'échelle de l'organisme entier. En utilisant des modèles murins, nous pourrons obtenir des données précises et transposables, cruciales pour comprendre les mécanismes physiopathologiques et développer des stratégies thérapeutiques efficaces pour les patients. Enfin, les règles de l’éthique médicale ne nous permettent pas de réaliser ces études sur l’homme.

Réduction

Grâce à nos expériences passées sur des modèles animaux similaires, nous avons déterminé qu'un groupe de 8 animaux est généralement suffisant pour obtenir des résultats statistiques robustes. Toutefois, en raison de la variabilité inhérente à la qualité des instillations et du risque de décès par insuffisance respiratoire aiguë lors de ces procédures, nous avons décidé d'augmenter la taille des groupes à 10 souris. Cette approche a été validée par des études antérieures. Les autres mesures prises pour appliquer le principe de réduction ont été les suivantes : 1. Optimisation des techniques d’instillation : Nous avons raffiné et standardisé nos techniques d’instillation endotrachéale pour maximiser la consistance et minimiser les pertes animales. Une formation rigoureuse et continue des opérateurs est mise en place pour garantir la qualité des procédures. 2. Optimisation et maximisation du nombre et des types de prélèvement afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires aux différentes analyses du projet. 3. Analyse en temps réel : L’utilisation d’analyses statistiques en temps réel permettra d'arrêter l’expérience dès que les données suffisantes auront été recueillies, évitant l’utilisation de plus d'animaux que nécessaire. Analyses statistiques : • Études de survie : Les courbes de Kaplan-Meier seront utilisées pour analyser la survie des animaux, permettant une visualisation claire des différences potentielles entre les groupes. • Données quantitatives : Les données seront initialement analysées à l’aide du test de Kruskal-Wallis, qui est adapté aux échantillons non paramétriques et permet de détecter les différences globales entre les groupes. • Comparaisons multiples : Si le test de Kruskal-Wallis révèle une différence significative, des comparaisons multiples seront effectuées à l’aide du test de Dunns, pour identifier spécifiquement quelles paires de groupes diffèrent.

Raffinement

Toutes les procédures invasives seront effectuées par un expérimentateur entraîné. L’instillation des billes se fera sous anesthésie générale. Nous prévoyons une surveillance clinique quotidienne des animaux dans les 5 jours suivant l'instillation. Un score de douleur et de confort respiratoire sera établi en observant quotidiennement le comportement des animaux. Si nécessaire une analgésie sera mise en place ou si ce score est considéré comme trop important, l’animal sera mis à mort. Les souris seront hébergées à 5 par cages au maximum et du matériel d’enrichissement (nidification, jeux…) sera mis à disposition dans les cages. Elles bénéficieront d’une période d’adaptation minimale de 7 jours entre leur arrivée dans l’animalerie et le début des expérimentations. Tout animal présentant des signes de détresse respiratoire ou moribond sera mis à mort.

Choix des espèces

L'utilisation des souris dans ce projet présente plusieurs avantages significatifs. Leur petite taille facilite leur hébergement en animalerie, permettant de maintenir un grand nombre d'animaux dans un espace réduit tout en assurant leur bien-être. Les manipulations, y compris l'anesthésie, sont relativement simples à mettre en œuvre, ce qui minimise la souffrance et l'inconfort des animaux tout au long des procédures expérimentales. La physiopathologie de l'infection broncho-pulmonaire chronique chez la souris est remarquablement similaire à celle observée chez l'homme. Cette similitude permet une transposition pertinente des résultats aux conditions humaines, ce qui est crucial pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus, notre modèle d’infection broncho-pulmonaire chronique chez la souris a été validé par la communauté scientifique, en particulier dans le cadre de la recherche sur la mucoviscidose (Martin et al., European Respiratory Journal, 2011). L'utilisation continue de ce modèle nous permettra de fournir des données novatrices sur les infections respiratoires chroniques et leurs effets systémiques. En résumé, les souris représentent un modèle idéal pour notre étude en raison de leur gestion pratique, de la simplicité des procédures expérimentales, et de leur pertinence biologique pour comprendre les mécanismes des infections broncho-pulmonaires chroniques et leurs comorbidités associées.

Clampage de l'artère rénale sous anesthésie, irradiation du corps entier, reconstitution de moelle osseuse, injections rétro-orbitaires : 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six prélèvements sanguins et six prélèvements d'urine, et jusqu'à quatre mesures du débit de filtration glomérulaire de quarante-cinq minutes chacune, réparties sur un mois. Une partie d'entre elles voyage entre deux établissements utilisateurs installés sur des sites différents. Sur le remplacement, le porteur se contente d'une phrase, l'insuffisance rénale aiguë serait "impossible à reproduire in vitro".

Objectifs

Récemment, nous avons identifié un peptide CD99 prédictif du développement d'une insuffisance rénale aigue (IRA) dans les urines obtenues 4h après un pontage cardiaque provenant d’une cohorte humaine. Ce peptide est également différentiellement représenté dans les urines pré-opératoires des patients développant une IRA post-opératoire. CD99 est une protéine transmembranaire principalement identifiée sur la membrane des cellules endothéliales et immunitaires. Dans la cohorte de patients utilisée pour identifier le ratio CD99 (peptide/protéine entière) comme nouveau biomarqueur de l'insuffisance rénale aiguë, l'expression du CD99 sur les cellules immunitaires circulantes (monocytes, neutrophiles, cellules B, cellules T) était similaire chez les patients ayant développé ou non une insuffisance rénale aiguë. Il est donc nécessaire de caractériser la façon dont les CD99 « rénal » (c’est à dire à la surface des cellules endothéliales et immunitaires résidentes) modulent le risque de développer une insuffisance rénale aiguë avant de mettre en œuvre une approche thérapeutique ciblant les CD99. Ce projet est un projet multisite qui se déroule deux EU (EU1 et EU2)

Bénéfices attendus

Mieux caractériser le rôle respectif de CD99 endothélial et immunitaire dans le développement d’une insuffisance rénale aiguë et chronique afin de développer ensuite une approche thérapeutique ciblant CD99.

Procédures

1/prélèvements sanguins à la queue (sous anesthésie) avant chirurgie et avant mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque rélèvement dure environ 2min par animal (anesthésie et prélèvement compris) 2/prélèvement d'urine lors de la contention de l'animal avant chirurgie et avant la mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque prélèvement dure environ 2min par animal. 3/Mesure du Débit de Filtration Glomérulaire avant chirurgie et avant sacrifice (placement du capteur et injection en retro-orbitaire sous anesthésie) (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 4 mesures seront réalisées (J0, J7 ou J14 J21 et M1). Chaque mesure dure environ 45min par animal (placement du capteur, injection en retro-orbitaire sous anesthésie et mesure) 4/irradiation (EU2). Une seule irradiation par animal est réalisée, la totalité de la procédure ne dépasse pas 2h (mise en cage, irradiation et retour en cage animalerie) 5/Induction d’une agression rénale (chirurgie, régime spécifique, injection de drogues) (EU1). Une seule chirurgie est effectuée par animal, la procédure dure entre 30 et 45min (anesthésie, chirurgie, clampage d'aorte rénale (le temps varie en fonction du sexe et de la souche) et souture).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront : 1/Une irradiation sans geste invasif suivi d’une reconstitution de leur moelle osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. Les animaux peuvent avoir un léger stress du fait de l'enfermement et du bruit, mais ce stress est de courte duréee. L'irradiation ne procure aucune douleur. 2/Une agression rénale (chirurgie, régime spécifique, injection de drogues) résultant en une détérioration de leur fonction rénale. Les effets indésirables possibles sont une baisse de l'alimentation liée à l’agression rénale et dans peu de cas, des complications suite à l'acte chirurgical. C'est pour cela que les souris sont surveillées attentivement pendant les heures qui suivent l'intervention. Les animaux ne doivent pas resentir de stress mais pourraient ressentir une douleur lors de l'acte chirurgical et après réveil, c'est pour cela que nous injectons en sous cutanée un analgésique avant chirurgie et après. 3/ Une mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG) n'est normalement pas suceptible d'induire de douleur. L'anesthésie permet de faciliter la procédure pour l’expérimentateur et en particulier d’être sûr que l’animal est complètement immobile pour l’injection rétro-orbitaire afin d’éviter toute blessure. Notre expérience de ce système montre que la plupart des animaux tolèrent très bien le dispositif et se comportent normalement pendant la période de mesure. Cependant, certains animaux peuvent être gênés, si des signes de stress importants sont observés (agitation), le dispositif est retiré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure ou si l'un des points limites était atteint. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever de l’urine, du sang et différents organes (dont le rein) en vue de leur analyse.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car l’insuffisance rénale aiguë est impossible à reproduire in vitro.

Réduction

Les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 960 Souris.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 25% du poids initial ; 2) Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après l’agression rénale ; 3) Signes de souffrances (comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront mis à mort. Concernant le transport des animaux entre l'EU1 et l'EU2, il sera effectué sur des animaux aptes à supporter le voyage qui sera effectué dans des conditions telles qu'ils ne puissent être blessés ou subir des souffrances inutiles. Le transport sera effectué par une société agrée qui effectue de manière régulière la navette entre l'EU2 et l'EU1.

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience, à cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.

Des cellules tumorales leur sont injectées, puis la tumeur est mesurée au pied à coulisse une à deux fois par semaine. Jusqu'à 14 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent deux injections de traitement par semaine pendant neuf semaines, une injection de produit d'imagerie dix minutes avant chaque séance, et un prélèvement sanguin sous anesthésie toutes les deux semaines, l'objet du projet étant de tester des vésicules extracellulaires modifiées comme piste d'immunothérapie. Le porteur décrit pourtant des modèles qui "nécessitent un minimum d'intervention" et ne demandent "pas l'administration d'anti-douleurs", chez des souris porteuses de tumeurs pendant neuf semaines.

Objectifs

Le cancer est actuellement la deuxième cause principale de décès à l'échelle mondiale. L'immunothérapie a révolutionné le traitement de certains patients mais dans environ 70% des cas, cette approche s’avère inefficace. Pour améliorer les traitements, il est essentiel de comprendre comment le cancer communique avec notre système immunitaire. Une partie de cette communication se fait via de petites vésicules lipidiques appelées "vésicules extracellulaires", porteuses d’informations génétiques et protéiques, sécrétées par les cellules tumorales mais aussi les cellules du microenvironnement tumoral. Elles peuvent moduler la croissance des tumeurs, notamment en interagissant avec la surface des cellules immunitaires ou après capture par ces mêmes cellules. Il existe une grande variété de vésicules, certaines semblent aider le cancer à se développer en empêchant le système immunitaire de reconnaître le cancer, alors que d’autres semblent aider l’organisme et son système immunitaire à se débarrasser du cancer. Il est nécessaire de comprendre quelles vésicules renferment l’activité anti-tumorale et quelles vésicules contiennent l’activité pro-tumorale, afin de pouvoir créer de nouveaux traitements anti-cancéreux efficaces. De récentes études ont montré qu’on peut changer la composition des vésicules extracellulaires en modifiant les cellules qui les sécrètent. Nous avons identifié quelques molécules cibles ou produits pharmacologiques, qui changent les propriétés des vésicules extracellulaires in vitro, en particulier quand elles interagissent avec des cellules du système immunitaire. Nous devons donc évaluer l’effet in vivo de ces vésicules modifiées ou de leur sécrétion in situ sur la croissance des tumeurs et leur reconnaissance, voire leur destruction par le système immunitaire. L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau mode de communication entre les cellules cancéreuses et le système immunitaire pour identifier des vésicules extracellulaires capables de diminuer la croissance et la progression des tumeurs. Il pourrait ouvrir la voie au développement de futures thérapies anticancéreuses utilisant ces vésicules modifiées ou leur sécrétion locale.

Bénéfices attendus

Le cancer est la seconde cause de décès dans le monde, malgré les récentes innovations thérapeutiques. Les immunothérapies visant à reprogrammer le système immunitaire contre le cancer présentent une efficacité spectaculaire chez certains patients, mais très variable et le bénéfice n’est observé que sur un nombre limité de patients. Il est donc essentiel de développer de nouvelles approches ou combinaisons d’approches pour bénéficier à un plus grand nombre de patients. Les vésicules extracellulaires permettent une communication entre les cellules tumorales et le système immunitaire, et peuvent aussi interférer avec les traitements d’immunothérapies. Ce projet étudie l’utilisation de vésicules extracellulaires modifiées par les chercheurs, comme nouveaux outils de thérapie anti-tumorale, permettant d’augmenter l’activité du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Il découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Avant d'envisager toute application clinique ou thérapeutique chez l'Homme, l’étude de ce processus dans un modèle de tumeur in situ chez la souris est une étape cruciale. Nous prévoyons d'atteindre ces objectifs dans les cinq prochaines années. Les résultats que nous recueillerons grâce à ce projet peuvent ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques utilisant la modification de la sécrétion des vésicules extracellulaires par les chercheurs, seule ou en combinaison avec d’autres traitements.

Procédures

Des cellules tumorales seront injectées aux souris vigiles (1 fois par expérience – durée du geste inf à 10 sec). Les animaux seront suivis, à raison de 1 à 2 fois par semaine soit sur animaux vigiles pour mesurer la tumeur au pied à coulisse soit par imagerie sur animaux anesthésiés (durée de l’anesthésie 10 min). Dix minutes avant chaque séance d’imagerie, les animaux seront injectés avec un produit spécifique pour l’imagerie (durée du geste inf à 10sec) Certains animaux recevront également des traitements par injection à raison de 2 fois par semaine pendant 9 semaines maximum (durée du geste inf à 10 sec) ou à raison de 2 injections au cours de l’expérience (9 semaines max) (durée du geste inf à 10 sec) Un prélèvement sanguin est effectué une fois toutes les 2 semaines sur les animaux anesthésiés(durée de l’anesthésie inf à 5 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales seront celles liées à injection elle-même (gêne de courte durée et de faible intensité due à l’introduction d’une aiguille). Suite à ces injections les animaux développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée). Ces types de traitement n’induisent pas d’effets secondaires négatifs connus. Pour le suivi des réponses immunitaires, des prélèvements sanguins pourront être effectués. Ces prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés pour réduire le stress lié à la contention et la douleur liée à la piqûre elle-même.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture, ayant permis la caractérisation des vésicules extracellulaires modifiées et de leur mode d’interaction avec les cellules cibles, tumorales et immunitaires. Le projet, ayant pour objectif final d’identifier des traitements ciblant les vésicules extracellulaires permettant l’activation des réponses immunes anti-tumorales, nécessite l’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires, et de l’organisme entier. A notre connaissance, aucun modèle in vitro (co-culture, organoïde) ou in silico ne peut se substituer à un modèle animal. Le modèle murin est le plus adapté compte tenu de l’organisation de son système immunitaire, proche de celle de l’Homme.

Réduction

1. Nous utiliserons de façon générale 10 souris par groupe expérimental. Ce nombre prend en compte la variabilité intrinsèque à nos modèles, notamment le taux d’obtention de tumeur suite à l’injection de cellules tumorales. Il se base aussi sur nos connaissances de ces modèles tumoraux et de leur cinétique et variabilité de développement. Les lignées tumorales modifiées pour sécréter des vésicules extracellulaires différentes, et l’absence de conséquence directe sur la multiplication des cellules ont toutes été validées in vitro. 2. le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe sera défini à l’aide d’outils statistiques. 3. Pour chaque procédure et chaque molécule, 2 expériences montrant une absence d’effet sur la croissance tumorale seront utilisées comme point d’arrêt de l’expérience, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. 4. Si les 2 premières modifications testées s’avèrent avoir l’effet recherché, nous ne continuerons pas avec les autres molécules. Le nombre total d’animaux utilisés sera réduit de 14160 (nombre maximum) pour 5 molécules testées à 7446 pour 2 molécules.

Raffinement

Les modèles développés pour ce projet nécessitent un minimum d’intervention sur les souris, réduisant le stress et la douleur potentielle, et ne nécessitent pas l’administration d’anti-douleurs. Les animaux greffés seront contrôlés deux à trois fois par semaine afin de vérifier que le développement de la tumeur n’ait pas d’effet notable sur le bien-être général, ni sur leur poids (en prenant en compte le poids additionnel de la tumeur). Une grille de score sera utilisée pour évaluer leur état de manière objective. Si un état général compromis est observé, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Comparé à d’autre modèles animaux, la souris est le modèle de choix pour les recherches en immunologie et cancérologie pour sa proximité avec l’homme, et nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris. Les modèles de tumeurs transplantées sont de plus couramment utilisés chez cette espèce Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 16 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.