Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Evaluation in vivo de l’impact d’une bithérapie anticancéreuse innovante sur le système immunitaire et recherche d’applications en immunologie clinique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau une pompe implantée en dix minutes de chirurgie, puis des injections dans le ventre ou sous la peau, avec une douleur pouvant durer quarante-huit heures après l'opération. L'effectif se déduit d'un montage, cinq groupes, six moments de mise à mort, cinq souris par point d'analyse, plus 10 % pour les décès imprévus. Les souris sont tuées à chacun de ces moments parce que les analyses réclament un volume de sang qu'on ne peut pas prélever sur un animal vivant, le porteur présentant cette mise à mort comme un moyen de limiter le nombre total de souris.
Objectifs
Objectif principal : Evaluation de la tolérance d’un traitement anticancéreux sur le système immunitaire chez des animaux. Objectifs secondaires : Evaluation de l’efficacité d’un traitement innovant pour inhiber l’activation de certaines cellules du système immunitaire en vue d’une application dans des situations où ces cellules sont sur-activées (maladies auto-immunes et auto-inflammatoires), évaluation des mécanismes permettant cet effet.
Bénéfices attendus
Ce projet présente 2 bénéfices attendus principaux. Le premier est la poursuite du développement d’un traitement qui pourrait être utilisé chez l’Homme pour le traitement de cancers. La preuve d’efficacité sur des souris a été réalisée en amont, mais l’évaluation de l’effet du traitement sur les défenses immunitaires est indispensable (rôle important de celui-ci dans le cancer) et n’a pas pu être réalisée précedemment (absence de système immunitaire chez les souris étudiées précedemment). Le deuxième objectif est le développement potentiel d’un traitement luttant contre les maladies du système immunitaire, par exemple les maladies auto-immunes.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions : - Mise en place d’une pompe sous cutanée : Le geste sera réalisé sous anesthésie générale et sous traitement contre la douleur, et dure environ 10 minutes par souris. Ce geste sera réalisé sur l’ensemble des animaux (220 animaux), à une seule reprise. Cette pompe sous-cutanée est nécessaire à l’administration continue d’un des traitements à l’étude. - Injections intrapéritonéales et sous-cutanées : Une injection d’un faible volume par seringue sera réalisée au niveau du ventre des souris (injection intrapéritonéale) ou sous leur peau (injection sous-cutanée) afin de leur administrer un autre traitement. Il s'agit d'une procédure vigile durant moins d'une minute par souris. Cette intervention sera appliquée à 220 animaux. - Les souris seront euthanasiées à la fin de l’experimentation (durant 0 à 21 jours), sous anesthésie générale. Cela est nécessaire pour permettre un recueil de sang suffisant pour les analyses qui répondront aux objectifs de l’étude. Immédiatement après la mise à mort, les souris seront autopsiées et leurs organes conservés.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient subir les nuisances et effets indésirables suivants : - Douleur légère à modérée pouvant durer 48h suivant la chirurgie de pose de la pompe sous-cutanée. Chirurgie réalisée sous anesthésie générale puis administration systématique d’antalgiques suivant la chirurgie. - Douleur légère de quelques secondes lors des administrations médicamenteuses par injections sous-cutanées ou intrapéritonéales. - Des effets indésirables des traitements étudiés sont possibles, mais une étude préliminaire a permis de s’assurer de l’absence d’effet indésirable dans les 24 premières heures de traitement, et un ajustement de dose est prévu si un effet indésirable est constaté à forte dose. - Stress léger lors des manipulations quotidiennes (pesées et contentions). - Aucun inconfort n’est prévu au moment de la mise à mort, celle-ci étant réalisée sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d’un volume de sang suffisant pour la réalisation des analyses. Cela permet de limiter le nombre de souris nécessaires en optimisant le volume prélevé à chaque souris lors de la mise à mort. Par ailleurs, un prélèvement sanguin si important ne serait pas possible du vivant de la souris. Le stress de l’animal est réduit au minimum par le biais d’une anesthésie générale profonde.
Remplacement
Une étude chez l’animal est nécessaire pour plusieurs raisons : - Aucun modèle experimental en laboratoire ne reproduit avec fiabilité la complexité du système immunitaire, qui est très complexe et interagit avec de nombreux facteurs. L’animal est pour l’instant irremplaçable dans ce champ de la recherche. - La tolérance de l’association thérapeutique à l’épreuve sur le système immunitaire n’est pas connue, et l’objectif final est un transfert à l’Homme de cette bithérapie.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre minimal d’animaux pour ce projet en tenant compte de plusieurs exigences : - Le traitement étudié comporte deux composantes, qui doivent être associées pour que le traitement fonctionne, avec une notion de synergie. L’évaluation scientifique d’un traitement synergique nécessite d’évaluer individuellement les deux composantes en plus de les étudier associées, afin de démontrer l’effet synergique entre les deux. - Nous avons choisi d’administrer un agent connu et utilisé couramment, comme contrôle positif en ce qui concerne l’action du traitement à l’étude sur un phénomène biologique appelé la « methylation de l’ADN». Cela impose un groupe supplémentaire. - Plusieurs points de suivi sont nécessaires afin d’évaluer une efficacité et une toxicité temps dépendantes. Chacun de ces points de suivi impose une mise à mort de l’animal, car les analyses permettant de répondre aux objectifs principal et secondaires nécessitent un volume de sang supérieur à ce qu’il serait possible de prélever de manière répétée sans compromettre le bien-être de l’animal. Chacun de ces points nécessite un minimum de 5 souris pour réaliser les calculs nécessaires. Enfin, il est également important d’observer les effets d’un traitement lorsque le système immunitaire est activé. Ainsi 15 souris par groupes recevront une injection contenant un composé connu pour activer celui-ci. Au total, en considérant les 5 groupes à l’étude, les 6 points de mise à mort (dont 1 commun à l’ensemble des groupes), avec 5 souris par point statistique, et en considérant un risque de décès non lié aux traitements de 10% des animaux, un total de 225 souris sont nécessaires à l’étude.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour limiter les nuisances attendues ou non liées aux manipulations des animaux et aux procédures. Le bien-être animal fera l’objet d’une évaluation bi-quotidienne tous les jours week end compris. Pour limiter le stress, une période d’acclimatation standardisée de 7 jours sera respectée avant la première procédure sur l’animal. Pendant cette période, les animaux seront habitués au contact humain et aux manipulations par le biais de jeux. Les manipulations auront lieu dans un environnement calme et par un manipulateur qualifié pour l’experimentation l’animale, pour le confort de l’animal et pour limiter la durée des manipulations. En cas de douleur ou d’inconfort modéré, un antidouleur simple sera administré. Si la douleur persistait ou semble plus que modérée, un antidouleur plus puissant sera administré. En cas de signe indiquant une douleur sévère définissant un point limite, la souris sera mise à mort pour éviter toute prolongation inutile de sa souffrance.
Choix des espèces
Les souris utilisées (souche C57Bl6) constituent un modèle animal très bien connu, fréquemment utilisé pour les études portant sur de nouveaux médicaments. Les souris seront accueillies au laboratoire à un âge compris entre 6 et 10 semaine.
Comment certains gènes des cellules immunitaires présentes dans le cerveau influencent son fonctionnement et le développement de pathologies comme la maladie d’Alzheimer ?
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Des souris reçoivent jusqu'à cinq chocs électriques par séance, à raison d'une séance de 30 minutes par jour pendant neuf jours, dans un test fondé sur l'évitement du choc. 2 250 souris, dont des lignées génétiquement modifiées qui développent une forme de maladie d'Alzheimer, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau. Selon les protocoles, elles subissent aussi cinq injections dans l'abdomen, des séries de quatre tests de 3 minutes chaque jour, cinq jours par semaine pendant deux semaines, que le résumé ne nomme pas, et un isolement temporaire en cage individuelle. Le porteur qualifie le choc de "désagréable mais non douloureux", et écrit que les analgésiques centraux sont "à proscrire pour des raisons scientifiques".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de cinq gènes d’intérêts dans le fonctionnement normal et pathologique des cellules immunitaires du cerveau. Les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière et jouent des rôles critiques à la fois dans son fonctionnement en conditions physiologiques et pathologiques. Les études récentes ont permis d’établir que la population de cellules immunitaires du cerveau est hétérogène et existe sous une grande diversité d’états microgliaux. Comment ces différents états sont contrôlés et quels sont leurs rôles dans le fonctionnement physiologique et pathologique du cerveau reste encore à déterminer. Notre équipe s’intéresse à plusieurs gènes qui de par leur localisation et/ou leur fonction dans d’autres cellules immunitaires sont susceptibles de jouer un rôle clé dans le contrôle de ces différents états microgliaux. L’objectif final du projet est donc de comprendre, dans différents contextes physiologiques et pathologiques (en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer), le rôle de ces cibles dans le fonctionnement des cellules microgliales. Pour ce faire, nous utiliserons une combinaison de lignées murines permettant de modifier l’expression de ces gènes spécifiquement dans les cellules immunitaires du cerveau. In fine, ce projet permettra de valider l’intérêt thérapeutique des gènes cibles dans les différents contextes envisagés.
Bénéfices attendus
1. Déchiffrer le rôle de gènes d’intérêt exprimés dans des cellules immunitaires dans le fonctionnement physiologique et physiopathologique des cellules immunitaires du cerveau (en particulier dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer) 2. Valider l’intérêt thérapeutique de ces cibles pour le développement de stratégies thérapeutiques, notamment dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer
Procédures
Les interventions prévues dans le cadre de ce projet sont : des injections dans l’abdomen (5 injections, à raison d’une injection par jour, sur 5 jours, durée d’une injection environ 10 sec) ; l’enchainement de tests pour évaluer le comportement cognitif des animaux (au maximum 1 série de 4 tests de 3 min (soit 12 min/animal/jour) chacun par jour, 5j par semaine sur 2 semaines ; chacun des tests étant non-invasif et reposant sur la propension des rongeurs à explorer leur environnement) ; un test basé sur l’évitement d’un choc électrique désagréable mais non douloureux (au maximum les animaux peuvent recevoir 5 petits chocs électriques par session, 1 session de 30 min par jour sur 9 jours). L’étude de l’effet de l’impact de la pathologie et/ou des gènes d’intérêt sur l’activité circadienne requiert l’emploi de tests impliquant des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement isolé temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l'étude.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables découlant des interventions sont les suivants : Douleurs et stress léger de piqure d’aiguille dans le péritoine ; Stress léger et inconfort de certains tests de comportement. Isolement temporaire pour l’évaluation de l’activité circadienne.
Devenir
L'ensemble des animaux contribuant à ce projet sera mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires et/ou moléculaires.
Remplacement
Les cellules immunitaires du cerveau sont, par nature, des cellules ultra-sensibles à leur environnement. Pour comprendre leur rôle dans le fonctionnement physiologique ou physiopathologique du système nerveux central, il est nécessaire de les étudier dans un environnement aussi proche que possible des conditions natives. Dans ce contexte, les données récentes de la littérature indiquent que les morphologies, les fonctions ou encore le répertoire de gènes exprimés par les lignées cellulaires microgliales ou même les cultures primaires de microglies diffèrent substantiellement de ceux exprimés par les microglies fraichement isolées à partir de cerveaux adultes. L’utilisation d’animaux vivants est donc requise. Par ailleurs, certains des rôles des cibles que nous cherchons à évaluer (i.e. effets sur comportement cognitif, en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer) ne peuvent être réalisées que sur animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 2250) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent. Par ailleurs, nous avons défini des stratégies de croisement de manière à limiter au maximum la production d’animaux qui ne seraient pas utiles pour l’expérimentation. Il est bien établi qu’il existe un important dymorphisme sexuel dans la biologie des cellules immunitaires du cerveau, les études seront donc réalisées à la fois chez le mâle et la femelle. Par ailleurs, la maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative. Nos données antérieures et celles de la littérature indiquent que les cellules immunitaires du cerveau pourraient jouer des rôles fonctionnels différents en début et en fin de pathologie, les effets des cibles d’intérêts seront donc évalués à deux stades différents, au stade précoce et à un stade plus tardif. Dans la mesure du possible, nous réaliserons l'expérimentation comportementale, et les analyses post-mortem sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel permettant de déterminer le nombre d’animaux statistiquement requis en fonction des effets escomptés.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera effectué régulièrement. Des points limites spécifiques ont été définis (perte de poids continue et excessive (évaluée de manière visuelle); prostration ; poils ébouriffés, arrêt d’alimentation, etc.) et le raffinement s’appliquera pour une prise en charge adaptée des animaux. Pour les scores les plus importants, cette prise en charge pourra conduire à l’euthanasie de l’animal. En cas de blessures (notamment à la suite de bagarres entre animaux), des analgésiques d’application locale pourront être utilisés. Cependant, notre projet se référant à l’étude de processus neuroinflammatoires, l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques centraux (hors procédure d’euthanasie) est à proscrire pour des raisons scientifiques. . La présence d'une roue d'activité pour mesurer la rythmicité circadienne constitue un enrichissement très apprécié des souris. Ce test nécessite de travailler avec un seul animal par cage, mais les contacts visuels et olfactifs sont maintenus entre animaux de cages voisines.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le mieux adapté pour étudier les effets des modifications génétiques sur le comportement, les tissus, les cellules et les molécules des cellules immuitaires du cerveau. L'utilisation de la recombinase Cre pour contrôler ces modifications génétiques est particulièrement intéressante. C'est pourquoi les modèles murins, en particulier dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, sont privilégiés. Ces avancées permettent de respecter au mieux les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Refinement). Nous utiliserons des animaux adultes à différents âges en fonction des sous-objectifs du projet : 2-3 mois pour les études en conditions physiologiques ; 4 et 8 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début précoce; 9 et 12 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début tardif.
Évaluation de nouveaux traitements contre la maladie du greffon contre l’hôte
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 600
Greffés de cellules immunitaires humaines qui attaquent leurs propres tissus, 2 500 souris et 600 rats développent une maladie du greffon contre l'hôte, avec perte de poids, perte de poils, diarrhées, mobilité réduite et défaillance d'organes pouvant les tuer. S'y ajoutent des gavages, des injections rétro-orbitaires sous anesthésie, des prises de sang répétées et des mesures de température par sonde rectale. Le porteur ouvre le paragraphe des effets en parlant de nuisances "modérées", avant d'y ranger, quelques lignes plus loin, la mortalité par défaillance d'organes qu'il qualifie de sévère. Tous les animaux sont tués à l'issue, l'évaluation des candidats médicaments réclamant l'analyse des tissus et du système immunitaire en fin d'étude.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements sur des modèles de la maladie du greffon contre l’hôte. La maladie du greffon contre l’hôte (GvHD : Graft versus Host Disease) peut survenir après une greffe de moelle osseuse réalisée dans le cadre du traitement d’une leucémie. Les lymphocytes T contenus dans le greffon vont attaquer les cellules du patient greffé, conduisant à des lésions des tissus sains. La maladie du greffon contre l’hôte est une complication grave, parfois mortelle. Elle survient lorsque les cellules du donneur présentent une incompatibilité immunologique avec celles du receveur, et perçoivent ces dernières comme étrangères. Dans ce cas, les lymphocytes T du donneur, dits « alloréactifs », vont alors détruire les cellules et tissus sains de l’hôte. Ce phénomène survient chez environ 20 à 50 % des patients greffés, rapidement après l’intervention ou plus tardivement. Il peut être très difficile à traiter. Les informations qui seront générées par le biais de ces études seront utilisées pour préparer les phases précliniques et cliniques du développement pharmaceutique. Ces informations comprennent entre autres : • Dose minimale produisant un effet thérapeutique • Dose minimale pour lequel l’effet thérapeutique est le plus élevé. • Déterminant pharmacocinétique qui conduit à l’efficacité thérapeutique • Régime de doses pour les études toxicologiques exploratoires et règlementaires. • Régime de doses pour les essais cliniques chez le volontaire sain, puis chez le patient.
Bénéfices attendus
La maladie du greffon est contrôlée à l’aide de médicaments immunosuppresseurs qui atténuent le conflit immunitaire entre les cellules du donneur et celles du receveur. Ces traitements peuvent durer plusieurs mois, voire plusieurs années. Cependant beaucoup de patients sont réfractaires aux corticoïdes et de nouveaux traitements sont nécessaires puisque la maladie du greffon contre l’hôte est une cause de mortalité et de morbidité majeure. Les traitements biologiques récents sont très couteux et peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d’efficacité due à la production d’anticorps neutralisants par le patient. Les études qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes (y compris des thérapie cellulaires et fécalothérapie). A court terme, elles permettront de confirmer l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les pathologies de la GvHD. A plus long terme, ces études constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux. • Pesées d'un animal vigile, pendant 30s jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Mesure de la température corporelle d'un animal vigile ou sous anesthésie générale via une sonde rectale pour rongeur pendant 30s. • Les prélèvements de sang via la veine caudale seront réalisés soit sur animal vigile, soit sur animaux anesthésié à l’isoflurane pendant 30 à 60s. Les prélèvements de sang terminaux par ponction cardiaque seront effectués sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine) pendant 30 à 60s. Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 20 à 50 µl chez la souris et de 20 à 200 µl chez le rat. Le volume total prélevé n’excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l’animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place pouvant aller jusqu’à une semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques par voir orale (gavage à l’aide d’une sonde gastrique), intrapéritonéale, sous-cutanée ou via la veine caudale) pendant une durée de 15 à 30s : Sur animaux vigiles. • Administrations intraveineuses par voie retro orbitale : Sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine) pendant 15 à 30s.
Impact sur les animaux
Cette procédure induira chez l’animal un certain nombre de nuisances modérées : injection de cellules, , administration de traitement par gavage ou injection (ip, iv, sc) pendant plusieurs jours ainsi qu’une préhension accompagnant ces administrations. De plus, les animaux seront également soumis à une anesthésie, des administrations de composés (voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous cutanée) et des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent générer également des nuisances. Les effets indésirables attendus (suite à une xénogreffe) sont une perte de poids, une perte de poils, une piloérection, une réduction de la mobilité, des diarrhées, des douleurs qui selon la gravité justifierait une mise à mort immédiate (modéré). Une GvHD peut entrainer une mortalité selon le type de greffe, notamment lors de xenogreffe qui peut entrainer une défaillance des organes de l’hôte . ‘sévère
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. L’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différents tissus et du système immunitaire en fin d'étude.
Remplacement
Il existe des modèles de peau humaine isolée qui permettent de détecter avec une grande précision la possibilité pour un patient de développer une GvHD (compatibilité donneur/receveur). Cette méthode a aussi été utilisée avec des peaux de rats pour des études de transcriptomiques et recherche de biomarqueurs. Cependant, ce système dépourvu d’autres organes et de structures immunologiques clés (rate, système lymphatique, hépatique, rénale et circulatoire) ne peuvent pas à ce jour constituer un environnement fiable pour des études de pharmacologie in vivo. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.
Réduction
Les entités thérapeutiques auront préalablement été évaluées de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent par exemple de prédire le profil pharmacocinétique d’un composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. Chaque étude comprendra en moyenne 60 animaux (10 animaux par groupe : Ctrl-Naif, Vehicle et 4 groupes traités avec des composés). Chaque projet de développement nécessite en moyenne l’évaluation de 5 entités thérapeutique expérimentale. Nous estimons réaliser 2 projets par an dans le domaine de la GvHD. Le nombre d’animaux est donc 60 (animaux par étude) x 5 (composé par projet) x 2 (projet par an) x 5 ans. Ainsi, les tests sur animaux sont réduits au minimum nécessaire (3100 animaux estimés).
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux exigences règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront hébergés en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement afin de satisfaire la manifestation de leur comportement naturelle (nidification, instinct grégaire, recherche de nourriture,..). Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique à minima journalière sur la durée des procédures. Les locaux d'hébergement et les systèmes d’hébergement suivront un programme d’hygiène et sanitaires (programme sanitaires) afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adaptés sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définis dans la consigne en vigueur. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car Le stress lié à la manipulation peut être une nuisance pour l’animal, et aussi avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris qui sont communément utilisées en pharmacologie. De nombreuses données sur les modèles de GvHD chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets. Adulte : Les données de la littérature indiquent clairement que les rats (4-5 semaines) et les souris adultes (7-8 semaines) représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine de la GvHD car ils doivent disposer d'une système immunitaire mature
Santé du juvénile de bar exposé à un scénario de réchauffement climatique d’acidification et de désoxygénation – Etablissement n°2
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
3 400 juvéniles de bar vont être utilisés pendant dix-huit mois, chacun pesé tous les mois après implantation d'une puce électronique dans le muscle, dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à sévère. Le sévère correspond aux épreuves infectieuses de la fin du protocole, deux à six semaines d'exposition à une bactérie et à un virus, avec déformation de l'œil, lésions cutanées, nage anormale, léthargie et une mortalité pouvant atteindre 90 % des poissons d'un bassin. Trois semaines d'hypoxie à 60 % d'oxygénation précèdent cette phase, après quinze mois d'eau réchauffée et acidifiée. Les survivants sont tués pour analyse immunologique, au service de connaissances que le porteur relie, au conditionnel et à moyen terme, à l'élaboration de politiques de gestion des pêches et de l'aquaculture.
Objectifs
Plus de la moitié des espèces connues de poissons vivent en zone côtière ou estuarienne. Les nourriceries en milieu côtier dont dépendent l’accomplissement du cycle de vie et le renouvellement des populations sont, de ce fait, considérées comme des habitats essentiels. De plus, l'élevage des poissons s'effectue également principalement en zone côtière. Or, il est bien établi que les zones côtières et estuariennes sont les plus vulnérables face aux pressions combinées du changement climatique et notamment au réchauffement, à l'acidification et aux épisodes de désoxygénation des océans. Ainsi, la santé des poissons (sauvages ou d'élevage) présents dans ces zones, et notamment leurs capacités à croitre et à se défendre contre les pathologies dépendront de leur capacité à faire face à la combinaison de ces contraintes environnementales en milieu côtier. Les questions abordées dans le projet sont : 1) L’exposition à long terme de juvéniles de bar à des conditions environnementales (température, acidification, oxygénation) prédites à l’horizon 2100 va-t-elle modifier des paramètres physiologiques associés à la santé du poisson ? et 2) ces effets vont-ils modifier leurs performances de croissance, de survie, leur maturation sexuelle et leur résistance à une exposition à des pathogènes ? Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs (EU) qui coupleront leurs expertises.
Bénéfices attendus
A court terme, les différentes analyses de performances et les caractérisations physiologiques réalisées au cours des différentes phases d’exposition donneront une vision globale de la capacité des poissons à faire face à une combinaison de facteurs environnementaux. A moyen terme, les données générées contribueront à déterminer des marqueurs d’exposition à ces différents facteurs environnementaux. Plus globalement, ce projet s’inscrit dans la volonté de mieux comprendre et prédire les interactions des poissons pêchés ou élevés avec leur environnement dans l’écosystème côtier et ainsi élaborer des politiques solides en matière de gestion des pêches et de l’aquaculture dans un contexte de changement global.
Procédures
De 3 à 5 mois, 50 poissons par bassin et par mois, aléatoirement pêchés, seront pesés (sous anesthésie, durée de la pesée par poisson: 1 minute). A partir du cinquième mois, tous les poissons (n=3400) seront pesés mensuellement après avoir été marqués individuellement par injection d'une puce électronique intramusculaire (sous anesthésie). Ces interventions nécessiteront la pêche des poissons. Afin de limiter le stress lié à la manipulation, les poissons pêchés seront sédatés dans leur bac puis anesthésiés. L'intervention de micro-injection n'excèdera pas 5 minutes (pêche, anesthésie, et injection comprises). La durée par poisson d'une intervention de pesée n'excèdera pas non plus 5 minutes. Des transferts entre bassins seront également effectués au cours du projet. Ces transferts se feront sous anesthésie en utilisant des bacs de transferts transitoires opaques et oxygénés. Les étapes de transfert n'excèderont pas 15 minutes. Les conditions de température et d'acidification, prises indépendamment les unes des autres ou en interaction représentent une nuisance légère durant les 15 premiers mois. A 16 mois, la moitié des poissons survivants (non mis à mort pour analyse post mortem) seront placés en niveau d'oxygénation de l'eau à 60% pendant 3 semaines. Nous supposons, sur la base d'études précédentes, que cette exposition représente une nuisance légère dans le contexte de l'élevage (absence de prédation; autres facteurs environnementaux contrôlés). Tous les éléments décrits précédemment seront réalisés dans l’EU n°1. Au début du 18ème mois, l'exposition expérimentale à des pathogènes, nécessaire pour évaluer le statut immunitaire des poissons, constitue une nuisance sévère. L'exposition durera entre 2 et 6 semaines. L’EU n°1 aura en charge un pathogène bactérien et l’EU n°2, vers qui sera transférée une partie des animaux, une bactérie et un virus. Les animaux seront alimentés pendant toute la durée du projet avec un aliment commercial d'élevage et seront rationnés au niveau alimentaire à 60% de ce qui est distribué en aquaculture afin de mieux calquer les réalités écologiques. Ce rationnement ne représente pas une nuisance car il permet aux poissons de croitre à un rythme moindre comparé aux conditions aquacoles standards où l'on vise à diminuer les durées d'élevage.
Impact sur les animaux
Un stress léger pourra intervenir lors de la manipulation des poissons pour estimer la prise de poids mensuelle. A raison d'1mn de stress par poisson pour chaque pesée, la durée de ce stress léger est estimée à 16 mn sur l'ensemble du projet ( x 16 mesures biométriques). Un stress léger pourra aussi intervenir lors du transfert des poissons dans les différents bassins ; au début de l’expérimentation et au cours des étapes d’hypoxie et des épreuves infectieuses avec les différents pathogènes. Pour les transferts intra-structure, la durée du transfert sous anesthésie n'excédera pas 5 minutes. Les lots de poissons qui seront exposés aux prétests et challenges avec les pathogènes viraux et de type vibrio seront transférés au sein du site, dans une structure située à 200 mètres. Le transfert durera 15 minutes et se fera sous anesthésie. Du fait de l' anesthésie, le stress associé aux transferts est léger; de plus, les caractéristiques physicochimiques (températures, pH, salinité) de l'eau des bacs avant et après transferts seront identiques. Les poissons seront alimentés 24h après transfert, délai nécessaire pour leur acclimatation à leur nouveau bassin. Les changements des caractéristiques physicochimiques de l'eau des bassins ne pourront s'effectuer que 48h après transfert. Les conditions abiotiques (température, pH, niveau d’oxygénation) prises indépendamment les unes des autres constituent des stress légers (18 mois) pour les facteurs température et pH ou modérés (3 semaines) pour l'hypoxie modérée. La contrainte hypoxique peut se traduire par une diminution de l’activité de nage des poissons traduisant une dépression métabolique. La durée de l’hypoxie (3 semaines) limite toutefois le risque de forte sévérité ; la mortalité devant être évitée lors de cette étape d’hypoxie, dans le cas contraire, le niveau d’hypoxie pourra être adapté. Un stress léger interviendra au moment des prises de sang (1mn par poisson). Les épreuves infectieuses virale et bactérienne constituent des stress très sévères puisqu’ils induisent l’apparition de signes cliniques (déformation de l'oeil, changement de couleur de robe, lésions cutanées, nage anormale, léthargie, déséquilibre, anorexie) et une mortalité sur les poissons (% de mortalité variable dans les bassins en fonction de la résistance des poissons mais pouvant aller jusqu’à 90%).
Devenir
A l'issue des challenges aux pathogènes, tous les poissons survivants seront mis à mort pour prélèvement et analyse de paramètres immunologiques
Remplacement
Cette étude vise à étudier l'effet de facteurs environnementaux (température, pH, oxygénation) sur l’état de santé du poisson. La caractérisation de ces effets se fait à l'échelle de l'organisme entier. Les méthodes de substitution telles que la culture cellulaire par exemple ne permettent pas de répondre à un questionnement physiologique dépendant de réponses complexes de différents tissus. Le maximum d’analyses sera réalisé au niveau de prélèvements sanguins, ce qui permettra dans le futur de trouver des marqueurs de l’état de santé du poisson. Les épreuves infectieuses sont à ce jour la seule possibilité d’évaluer et de prédire les capacités de résistance des poissons face à des agents pathogènes prévalents dans le milieu environnant (contexte écologique et aquacole); cette capacité de résistance dépend de nombreux facteurs, en particulier de différentes composantes du système immunitaire dans divers organes mais également (par exemple) du statut énergétique du poisson ou encore de son microbiote. Les données obtenues au cours du projet pourront permettre de développer dans le futur des marqueurs (au niveau sanguin et tissulaire) prédictifs des capacités de résistance des poissons face aux pathogènes.
Réduction
Le bar européen juvénile est un animal vivant en groupe et le nombre d'animaux par bac répond tout d'abord à cette contrainte. Le nombre de poissons tient donc compte de la densité minimale d’animaux requise pour permettre aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles, et permet donc de répondre à leur bien-être. De plus, le nombre de poissons a été réduit à son minimum et défini en fonction du nombre nécessaire pour réaliser la cinétique de prélèvements (à 6, 9 et 18 mois post-éclosion) ainsi que les épreuves infectieuses expérimentales. Ce nombre tient également compte des taux de mortalités communément observés au cours des 18 premiers mois de vie juvénile. Le nombre de prélèvements prévus a été déterminé en fonction du seuil de la pertinence scientifique et statistique. De même, le nombre de poissons prévus pour les épreuves infectieuses permet de réaliser une analyse statistique de résistance.
Raffinement
Pour la phase 2, les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement, à savoir, un volume d'eau adapté en circuit ouvert avec une oxygénation suffisante en fonction de la biomasse, un rythme jour/nuit naturel, la présence de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche, une distribution d’aliment adaptée. Une importance particulière sera donnée à l’observation des animaux, 1 fois/jour minimum (plus pour suivre l'évolution de poissons présentant des signes de stress). Les infections expérimentales bactériennes ou virales peuvent provoquer une mort rapide sans qu'il soit possible d'observer des symptômes cliniques. Toutefois, pour éviter toute souffrance, les animaux présentant un comportement de nage anormal marqué avec des périodes sur le flanc / sur le ventre et/ou des signes de détresse respiratoire avancée et/ou des hémorragies faciales / au niveau des flancs et/ou des signes nerveux seront mis à mort de manière compassionnelle avec une surdose d’anesthésique.
Choix des espèces
Le bar est une espèce de poisson marin d'intérêts halieutique, aquacole et écologique. La communauté scientifique s'intéresse à mieux prédire l'impact du changement global sur cette espèce. Les poissons sont des juvéniles (non matures sexuellement). Agés d’environ 3 mois, ils pèseront en moyenne 3 grammes au début de l’expérimentation. Ce stade de développement est particulièrement pertinent pour notre étude puisque c'est à ce stade de vie que les poissons regagnent les nourriceries côtières dans la nature et qu’ils sont donc plus exposés aux contraintes environnementales associées au changement global.
Elevage de souris immuno-déficientes
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées à huit mois pour être remplacées par des femelles plus jeunes et plus fécondes, 104 souris reproductrices ouvrent un élevage qui en compte 805 au total, dans des conditions classées au niveau de souffrance léger. Les 701 souriceaux nés de ces accouplements rejoindront d'autres protocoles expérimentaux entre quatre et vingt-quatre semaines d'âge. Aucune intervention n'est pratiquée dans le projet lui-même, le phénotype suffisant à le rendre dommageable : privées de lymphocytes T et B, ces souris vivent sous hotte stérile, avec litière et aliment irradiés, sous le risque permanent d'une infection. Le porteur écrit qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour étudier des sous-populations de lymphocytes.
Objectifs
Ce projet consiste à élever une lignée murine immuno-déficiente, c'est à dire sans défense immunitaire, afin de générer les animaux nécessaires à la réalisation de plusieurs projets scientifiques. Ces souris possèdent une mutation génétique qui conduit à l’absence d’une partie du système immunitaire dans l’organisme : les lymphocytes T et les lymphocytes B. L'intérêt d'utiliser de tels animaux immuno-déficients dans des études scientifiques en immunologie est majeur. En effet, dans diverses études, un sous type cellulaire d'intérêt va être injecté et son devenir sera étudié (activation, prolifération, interaction avec les organes, etc) sans interactions avec d'autres cellules du système immunitaire. Ainsi seule le sous type cellulaire injecté sera étudié et analysé.
Bénéfices attendus
L’utilisation de ce modèle de souris immuno-déficientes va permettre de mieux comprendre le rôle de sous populations du système immunitaire étudiées, et en particulier des sous populations de lymphocytes T. Ces rôles seront étudiés dans un contexte non pathologique dans un premier temps afin d’étudier leur fonctionnement élémentaire. Dans un second temps, elles seront étudiées dans un contexte pathologique comme certaines maladies auto-immunes afin de comprendre leur rôle dans le contrôle de la pathologie. Les cellules étudiées dans ce modèle sont très semblables à celles présentes chez l’homme. Une meilleure compréhension de ces cellules immunitaires pourrait donc servir à mieux comprendre les maladies auto-immunes chez l’homme et donc à pouvoir proposer des thérapies en clinique.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à une intervention mais il s'agit d'un projet d'élevage dont le phénotype des animaux est considéré comme dommageable. Des interventions seront réalisées dans le cadre d'autres projets expérimentaux autorisés.
Impact sur les animaux
Les animaux ici en élevage présentent une immunodéficience acquise ce qui implique un risque accru aux infections.
Devenir
104 animaux seront mis en accouplement dans ce projet d'élevage. Après 6 mois en accouplement soit à 8 mois d'âge, les animaux seront euthanasiés afin de renouveler les accouplements avec des animaux plus jeunes et féconds. Les animaux issus de ces accouplements, soit 701 animaux, seront inclus dans d'autres protocoles expérimentaux dans le cadre d'une utilisation continue. L'inclusion des animaux dans un projet expérimental interviendra entre 4 et 24 semaines d'âge.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable pour étudier le rôle d’une population cellulaire au sein du système immunitaire, dans différents contextes pathologiques auto-immuns. Les organes et les réponses immunitaires étudiés sont complexes et il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu.
Réduction
805 animaux seront nécessaire pour obtenir des animaux pour la reproduction et les animaux qui seront inclus dans les projets expérimentaux pour aboutir à des résultats statistiquement fiables. Le nombre d'accouplement sera suffisant et nécessaire pour la production des animaux et toujours maintenu au strict nécessaire pour éviter un surplus d'animaux qui ne serait pas utilisés. La lignée étant cryo-préservée dans notre établissement, l’élevage pourrait être suspendu si pendant une période les animaux ne sont plus utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, avec un environnement dépourvu de pathogènes et d'opportunistes spécifiques, avec des conditions environnementales (température, hygrométrie, etc.) conformes à la règlementation en vigueur pour l'espèce utilisée. Le milieu est enrichi avec 2 types d’enrichissement pour toute la durée de l’élevage: bâton en bois à ronger pour la mastication et lambeaux de papier kraft pour la nidification changé toutes les semaines. Pour protéger les animaux avec un système immunitaire déficient, le change des animaux s'effectue sous hotte de change en conditions stériles et la litière et l'aliment sont irradiés. Les contrôles sanitaires sont réalisés tous les trimestres. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie. Une mise en place d’étiquettes au niveau des cages permet d'assurer un meilleur suivi (note d’observation au cas de blessure, présence de souris gestante ou naissance).
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé pour les études dans le domaine de l’immunologie car son système immunitaire est proche de celui de l’homme. Par ailleurs il existe de nombreux outils (anticorps, dosages de cytokines, modèles pathologiques, etc) qui nous seront nécessaires pour ces études et sont développés quasiment seulement chez la souris. Les animaux utilisés pour les accouplements pourront être mis en duo à partir de 2 mois (8 semaines d’âge), âge de bonne maturité sexuelle. Les accouplements seront renouvelés au maximum tous les 6 mois, soit à 8 mois d'âge. Les animaux utilisés pour l’élevage seront donc euthanasiés au maximum à 32 semaines (8 mois X 4 semaines). Au-delà, les animaux sont vieillissants et voient leur reproduction décroitre. Les animaux issus des accouplements seront quant à eux inclus dans d’autres projets préalablement autorisés (utilisation continue) entre 4 et 24 semaines d’âge.
Développement de vaccins optimisés contre les infections respiratoires aéroportées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
3 052 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 456 d'entre elles et modéré pour 1 596. Elles subissent un génotypage par phalangectomie, de trois à douze prises de sang sur animal vigile, jusqu'à trois administrations intranasales et trois injections intramusculaires sous anesthésie, puis de sept à quatorze séances d'imagerie réparties sur cinq à sept semaines. Une partie est infectée par la grippe ou le SARS-CoV-2, à doses non létales ou létales, avec abattement, poils hérissés, dos voûté et perte de poids attendus chez les souris non traitées. Le porteur écrit qu'il privilégiera la culture cellulaire ou les organoïdes dès que ce sera possible, tout en concluant que les méthodes actuelles ne permettent pas d'étudier la mise en place d'une réponse immunitaire locale.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de développer un vecteur vaccinal optimisé pour une délivrance intranasale contre les infections respiratoires (virus Influenza A (IAV) et SARS-Cov-2) avec une efficacité accrue par rapport aux vaccins actuels administrés en intramusculaire. Une administration intranasale améliora grandement la mise en place d’une mémoire immunitaire forte, durable, et localisée, nécessaire à l’élimination rapide et efficace du virus, et évitant sa dissémination à d’autres individus. Dans notre stratégie, le vaccin sera administré à des souris de laboratoire sous forme de microgouttes dans le nez de souris de laboratoire. L’objectif sera, d’une part, d’analyser la capacité de notre vaccin à activer le système immunitaire et à induire une mémoire immunologique locale forte dans le nez des souris vaccinées. D’autre part, nous allons étudier la capacité du vaccin à protéger durablement et efficacement ces souris contre une infection par diverses souches de IAV et du SARS-Cov-2. La mise en place d’une mémoire immunologique lors d’une vaccination est un processus complexe qui nécessite l’utilisation d’un modèle souris pour son étude. La souris est un animal qui permet de modéliser de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection respiratoire chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les maladies respiratoires ont des impacts sociaux et économiques majeurs, tant au niveau individuel que sociétal, et ciblent particulièrement les populations à risque du monde (i.e., nourrissons, personnes âgées et patients immunodéprimés). De nombreux experts prédisent que de nouvelles pandémies de grippe seront très probables l’année prochaine, alors que le SARS-CoV-2 circule toujours avec de nouveaux variants. Même si des vaccins existent, aucun vaccin administré par voie nasale n'est disponible utilisant la technologie de l’ARN messager. Or, une forte réponse immunitaire dès l’arrivée du virus au lieu d’infection, i.e., le nez, favorise significativement l’élimination plus rapide du virus, évitant ainsi la propagation de la maladie d’un individu à l’autre. L’augmentation de l'efficacité des vaccins actuels aura un impact sur les questions économiques ainsi que sur les domaines sociaux et culturels, avec un impact majeur sur la santé et des conséquences sociales. De plus, dans ce projet, nous sélectionnons des antigènes très conservés par des souches de virus différentes et ainsi développerons des vaccins « universels » qui protégera chaque individu contre différentes souches d’un même virus et évitera le besoin d’une vaccination répétée pour des variants différents. D’un point de vue scientifique et technologique, ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le fonctionnement des réponses immunitaires associées à la muqueuse nasale. D’autre part, les équipes de recherche impliquées dans ce projet ont à cœur de sensibiliser le public et participent activement à accroître l'exposition de la recherche immunologique sur les vaccins à un large public. Un meilleur accès à la recherche sur les vaccins sans aiguille, mais en spray nasal, pourrait aussi accroître l’acceptation du vaccin au sein de la population. Par ce projet, nous espérons ouvrir de nouvelles perspectives dans le développement de vaccins, qui pourrait également être utilisée pour la conception de nouveaux vaccins contre d’autres virus aéroportés et/ ou dans la lutte contre les cancers du système respiratoire et du cerveau par exemple.
Procédures
Le génotypage est réalisé sur les fragments tissulaires issus de l’identification par phalangectomie (une seule fois). De trois à douze prises de sang seront effectuées (quelques secondes par animal par prise de sang) sur animaux vigiles. Jusqu’à trois administrations intranasales (quelques secondes par animal) sur animal anesthésié. Jusqu’à trois injections intramusculaires (quelques secondes par animal) sur animal anesthésié. L’imagerie non-invasive in vivo sera réalisée sur animaux anesthésiés à l’isoflurane (quelques minutes) avec le système IVIS de 7 à 14 fois sur 5 à 7 semaines via une injection intrapéritonéale de D-luciférine.
Impact sur les animaux
Des souris de laboratoire seront utilisées pour ce modèle d’infection pour imiter les infections chez l’Homme. L’instillation intranasale du virus de la grippe ou du SARS-CoV-2 permet le développement d’une infection chez la souris. La période critique chez la souris avec les souches virales et les doses infectieuses utilisées sera à partir de J6 post-infection pour des doses non-létales et à partir de l’infection pour des doses létales. Les signes cliniques attendus sur les souris non traitées sont les suivants : abattement, poils hérissés, dos voûté, perte de poids et manque d’appétit, selon les doses virales. L’imagerie non-invasive in vivo sera réalisée sur animaux anesthésiés à l’isoflurane via une injection intrapéritonéale de D-luciférine, pas de nuisance attendue sauf une sensation de piqure lors de l'intrapéritonélae.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront infectés. De plus les animaux “contrôles” non-infectés devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentes dans les organes et nous devons absolument mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.
Remplacement
Nous reconnaissons que les avancées dans les techniques de recherche et les technologies alternatives permettent un remplacement et/ou une réduction de l’utilisation d’animaux. Dès qu’il sera possible de remplacer un modèle murin par une modélisation in vitro, via de la culture cellulaire ou la conception d’organoïdes 3D nous privilégierons cette solution, comme nous l’avons déjà fait par le passé. Il est important de noter que nos diverses formulations vaccinales seront systématiquement soumises à une caractérisation in vitro et à une validation sur des modèles de cultures cellulaires avant toute autre étape. Cependant, les méthodes alternatives actuelles, comme la modélisation mathématique ou les systèmes in vitro, ne permettent pas d’étudier la mise en place d’une réponse immunitaire lors d’une vaccination, notamment au niveau systémique, en préservant l'intégrité scientifique. De plus, l’infection par voie respiratoire fait intervenir de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection humaine que nous ne pouvons pas reproduire par le biais de techniques in vitro. Par conséquent, nous utiliserons un modèle murin, le seul à permettre l'étude approfondie du mécanisme de transport du vaccin et des réponses immunitaires qu'il engendre. L'utilisation de modèle murin est essentielle pour tester nos vaccins réactivant localement et de manière systémique le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des avancées significatives dans la lutte contre les infections respiratoires.
Réduction
Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animaux. La taille d'effet est calculée pour un certain niveau de risque et de puissance . Les animaux seront répartis en lots de 7 individus maximum par cage. Nous estimons qu’un effet cage peut représenter une part de la variabilité totale des données, ce qui nous amène à augmenter le nombre d’individus d’un certain facteur par rapport à un cas où aucun effet cage n’est observé. Les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, des résultats significatifs . Le plan expérimental mis en œuvre est emboîté. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques ou l’analyse de la variance.
Raffinement
Pour l’administration par voie intranasale, les souris seront soumises à une anesthésie légère et de courte durée à l’isoflurane pour assurer une respiration calme et ample. Le raffinement sera aussi assuré par l’expérimentateur par un suivi clinique des animaux (observation et pesée). Les expériences pratiquées dans ce protocole seront réalisées en accord avec les points limites acceptables définis dans la littérature. Les signes cliniques permettant d’évaluer l’état de douleur ou détresse seront évalués afin de mettre à mort les animaux dépassant un certain niveau de souffrance défini par un point limite intégrant plusieurs critères. Pratiquement, 2 types de critères (a et b) sont mesurés systématiquement. Le point limite est défini par l’occurrence d’un critère (b) minimum ou de 4 critères (a). Si le score limite est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
La souris est le modèle privilégié pour les expérimentations dans le domaine du développement de vaccins et de la réponse immunitaire. Ceci est principalement dû à la connaissance approfondie du génome murin, ce qui permet de tirer parti de nombreux outils soigneusement caractérisés. Parmi ceux-ci figurent les souris génétiquement modifiées pour exprimer des protéines spécifiques d'intérêt. De plus, la souris présente des avantages pratiques significatifs. Elle est aisément manipulable, dispose d'une courte période de gestation et peut donner naissance à plusieurs individus par portée, ce qui crée des conditions d'élevage optimales pour les expériences. Grâce à sa grande similitude génétique avec l'Homme, il est envisageable de transférer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Cette corrélation renforce la pertinence des découvertes réalisées avec les souris, ouvrant la voie à des avancées cliniques prometteuses dans la lutte contre les maladies infectieuses. Les animaux seront accueillis à 6-7 semaines d’âge (âge constituant un compromis adéquat entre maturité suffisante du système immunitaire et mis en expérimentation à partir de 7-8 semaines d’âge).
Rôle des cellules tuft dans la réponse antivirale précoce – étude pilote
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
240 souris vont être utilisées dans une étude pilote, réparties en cohortes de quinze par génotype et par condition de traitement, toutes tuées dans un délai allant de quelques heures à cinq jours après le traitement. Chacune reçoit une substance parmi huit, par injection intrapéritonéale ou par gavage gastrique, avant autopsie des organes digestifs. Le niveau de souffrance déclaré est léger, les lignées utilisées ne présentant pas, selon le porteur, de phénotype dommageable à l'état de base. Les bénéfices annoncés, comprendre pourquoi certains individus répondent mieux que d'autres à une infection virale, sont formulés au conditionnel, alors que le porteur reconnaît n'avoir aucune donnée préliminaire permettant de préjuger des effets attendus.
Objectifs
L’objectif de ce projet est simple, et consiste à réévaluer les séquences des évènements de la réponse immune précoce à la suite d’une infection virale. Nos données, obtenues dans un modèle cellulaire, indiquent que l’absence de certaines cellules épithéliales impactent de manière drastique la synthèse de molécules antivirales de type interférons, molécules sans lesquelles la réponse d’un hôte infecté est compromise. Ces données, inédites et encourageantes, méritent d’être approfondies le plus rapidement possible dans un modèle intégré, afin de mesurer le réel impact de ce défaut d’initiation de réponse antivirale. Notre stratégie expérimentale consiste à utiliser des analogues chimiques, disponibles commercialement, validés dans la littérature, capables d’activer et de mimer chaque étape de la réponse antivirale. De manière synthétique, les souris seront traitées avec les molécules ad hoc, avant d’être analysés dans un laps de temps n’excédant pas 5 jours, pour analyses histologiques et moléculaires. Nous comparerons ainsi la mise en place de la réponse immune précoce (d’où les temps de cinétique court) entre des individus contrôles et des individus dans lesquels certaines cellules intestinales sont absentes. Cette stratégie nous permettra de répondre à des questions simples : (1) quels sont les types cellulaires impliqués dans la mise en place de la réponse immune suite à une infection virale et (2), l’absence de certains type cellulaire compromet-elle l’efficacité de la réponse de l’hôte suite à une infection ?
Bénéfices attendus
La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Nos données préliminaires indiquent en effet que les expériences associées à cette étude peuvent aboutir à la découverte de nouveaux mécanismes associés à l’immunité antivirale précoce. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, dans le contexte de pandémie que nous connaissons. A titre d’exemple, comprendre selon quelles modalités une réponse antivirale efficace doit se mettre en place est une question d’actualité, permettant virtuellement d’expliquer les raisons pour lesquelles certains individus réagissent favorablement à une infection virale (réponse interféron adéquate), alors que d’autres développent des formes graves (réponse inflammatoire prédominante). Notre stratégie expérimentale simple, nos données obtenues ex-vivo, le tout conjugué à la rapidité avec lesquelles nous devrions obtenir des réponses, font de ce projet une question importance majeure.
Procédures
Les souris se verront administrer 1 substance parmi les 8 testées au total, par voie intrapéritonéale ou gavage gastrique, à l'aide de seringue et de canules adaptées, via le personnel habilité de notre équipe zootechnique. Suite aux traitements, les animaux seront progressivement euthanasiés dans un laps de temps allant de quelques heures à 5 jours tout au plus, se focalisant sur les conséquences précoces de traitements initiés.
Impact sur les animaux
Les lignées utilisées dans ce projet ne présentent, à l’état de base, pas de phénotype dommageable. Les nuisances seront celles liées à l'administration des substances aux individus: injection intrapéritonéale et gavage gastrique.
Devenir
Les animaux devront être euthanasiés, puisqu’autopsiés afin de récupérer les organes digestifs
Remplacement
Ce projet doit être abordé de façon intégrée et ne peut être intégralement mené in vitro puisqu’il a comme objet principal l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains virus. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions. Nous avons, jusqu’à présent, pu valider notre hypothèse avec le modèle de culture d’organoïdes, légitimant cette demande d’expérimentation in vivo, et réduisant la probabilité d’échec de ce projet. Le système de culture d’organoides sera réutilisé en complément des données obtenues in vivo, dès que possible.
Réduction
A ce jour, nous n’avons aucune expérience préliminaire ni donnée nous permettant de pouvoir préjuger des effets attendus entre nos deux groupes d’animaux, faisant de cette étude une étude pilote. Cependant, étant donné l’absence de synthèse d’interféron dans les individus mutés, nous anticipons des différences drastiques entre nos groupes d’individus. Cette saisine intégrera donc des cohortes de 15 animaux par génotypes et par conditions de traitements, incluant tous les controles. Les conclusions seront obtenues via des analyses de comparaison de moyenne des paramètres mesurés. Lorsque possible, les analyses seront complétées en modèle ex-vivo (organoïdes intestinaux). La réduction de nombre d’animaux se fera aussi via l’utilisation de la majorité des animaux produits pour chaque lignée (études menées sur les mâles et femelles, la plupart des génotypes produits seront utilisés).
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou l’apparition de signe de prostration seront considérés comme des points limites. En cas de signes de détresse ou de douleur, d’atteinte d’un point limite, en accord avec le personnel qualifié, le protocole sera immédiatement stoppé pour ces animaux qui seront euthanasiés et autopsiés.
Choix des espèces
Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. De plus, nous disposons du modèle idéal (souris mutées pour un gène essentiel pour la différenciation de certaines cellules intestinales impliquées dans l'immunité). La comparaison de la mise en place d'une réponse entre des souris contrôles et les souris mutées pour ce gène nous permettra donc de définir les types cellulaires impliqués dans la réponse antivirale. Les individus seront utilisés à partir de 8 semaines d’âge, lorsque le système digestif est mature
Projet pilote : Evaluation de régimes optimums pour le développement des comorbidités associées à un syndrome métabolique dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune maintenue sept, huit, seize ou vingt-quatre semaines sous un régime enrichi en graisse, en cholestérol ou en fructose destiné à lui faire développer une obésité, une résistance à l'insuline, une stéatose du foie et une athérosclérose. Les femelles gestantes sont isolées cinq jours avant la mise bas et soumises au même régime, ce qui expose aussi les fœtus. Après une mise à jeun et deux tests métaboliques, les souris sont anesthésiées puis tuées pour le prélèvement de sang et d'organes. Ce projet pilote sert à choisir la lignée et le régime des études à venir, et le porteur annonce qu'il réduira le nombre d'animaux, sans qu'aucun calcul d'effectif ne soit donné pour ces 840 souris.
Objectifs
Ce projet est une étude pilote qui a pour objectifs de : 1) Déterminer le modèle murin génétiquement modifié le plus adapté dans le cadre de projets de recherche étudiant l’impact de l’altération du métabolisme des lipides dans les maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité : athérosclérose, troubles du rythme cardiaque, maladies du foie non alcoolique (stéatose, stéatohépatite et fibrose hépatique), résistance à l’insuline et diabète. En effet, les souris non génétiquement modifiées soumises à un régime riche en graisse ou en cholestérol ne développent pas l’ensemble du spectre des maladies observées chez l’Homme de manière spontanée. Pour cela il est nécessaire d’utiliser des souris dont le métabolisme des lipoprotéines, les transporteurs circulants de lipides, a été modifié pour se rapprocher de celui trouvé chez l’Homme. Cette étude pilote a pour but de valider quelle serait la meilleure lignée à utiliser pour permettre de répondre aux questions scientifiques du projet. 2) Déterminer le régime optimum qui permettrait d’étudier les différents aspects des maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité pour ces modèles. Ceci permettra de valider le choix de la lignée à utiliser, mais également de faciliter les échanges de données et donc de diminuer le nombre total d’animaux requis pour les différents aspects du projet..
Bénéfices attendus
Ce projet pilote permettra de sélectionner l’association régime/ génotype la plus adaptée pour répondre à différents objectifs scientifiques. Il permettra d’harmoniser les régimes et le modèle murin et de réduire le nombre d’animaux in fine. A plus long terme, le projet d’étude qui pourra être lancé permettra d’étudier les mécanismes associés à l’émergence de l’athérosclérose liés aux troubles métaboliques. De plus, ce projet permettra également de conforter l’hypothèse d’une programmation périnatale du développement de l’athérosclérose à l’âge adulte. L’ensemble de ces données permettra d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux impliqués dans ce projet (cohorte adulte et cohorte « développement » avec femelles gestantes et allaitantes) seront mis sous un régime riche en graisse et ou en fructose, et ou en cholestérol pour des durées variables (7, 8, 16 ou 24 semaines). La cohorte de souris adulte sera soumise à un prélèvement faible de sang sous anesthésie (moins de 10 min) avant la mise sous régime riche. Après le régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h), incluant un faible prélèvement de sang afin de mesurer le sucre dans le sang suite à une administration de glucose ou d’insuline. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes de la cohorte « développement » seront en hébergement individuel pendant 5 jours avant la mise-bas afin de préparer leur nid et assurer une alimentation comparable de leurs souriceaux, ce qui diminuera leurs interactions sociales pendant cette période. Elles seront exposées à un régime riche en graisse plus ou moins cholestérol plus ou moins fructose, ce qui pourrait générer un inconfort pour elles et le développement des fœtus. A partir de 8 semaines, les souris de la cohorte adulte seront exposées à des régimes riches en graisse plus ou moins cholestérol et plus ou moins fructose ou saccharose pendant 8,16 ou 24 semaines afin d’induire une obésité et les désordres métaboliques associés : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, etc. Ceci pourrait induire un inconfort. De plus, les souris seront soumises à deux tests d’évaluation du métabolisme qui inclus une mise à jeun et de très petits volumes de prélèvement de sang.
Devenir
Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins, sans induire plus d’inconforts aux animaux.
Remplacement
Le dialogue inter-organes (cœur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires ou organotypiques. Ainsi l’impact global d’un stress lipidique induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, il faut prendre en considération le concept que l’altération d’une fonction cellulaire (par exemple des macrophages) dans un environnement tissulaire spécifique peut avoir un écho profond dans des tissus/organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués.
Réduction
Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre de lignées potentiellement intéressantes pour le projet à 2 lignées qui seront testées en séquentielle, la seconde n’étant produite qu’en cas d’échec avec la 1ère. De même, le choix préalable des régimes a pu être réduit au maximum afin d’induire les altérations cardio-métaboliques souhaitées tout en évitant les biais. La sensibilité à l’émergence des maladies métaboliques présente une différence sexuelle importante. Il convient donc de caractériser finement les animaux des deux sexes ainsi que les mécanismes impliqués, en accord avec les recommandations des sociétés savantes internationales et des comités éditoriaux des journaux scientifiques .
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux seront manipulés avec douceur, par du personnel formés et compétents, qui sera vigilant en cas de réaction comportementale excessive, ou de mal-être. Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. L’enrichissement des cages sera renforcé pour les femelles gestantes et allaitantes qui seront en hébergement individuel avec leurs petits, avec minimum de la frisure de papier kraft et un bâton à ronger.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de valider les conditions nutritionnelles qui permettent de programmer le développement d’une athérosclérose suite à une exposition périnatale. L’étude chez l’adulte permettra de d’associer le développement de maladies cardiovasculaires au régime alimentaire périnatale, mais sans éliminer l’impact du vieillissement. L’étude chez les souriceaux âgés de 10 jours quand ceux-ci sont strictement nourris au lait maternel permettra d’estimer si ce lien existe dès ce stade précoce, et ainsi de valider l’hypothèse d’une transmission maternelle. Ceci a également une importance pour la santé humaine car des hausses sensibles de la pression artérielle ont été observées chez des pré-adolescents avec un historique fœtal (retard de croissance, prématurité).
Étude de l’altération des réponses immunitaires innées lors de l’infection à Leptospira interrogans en phase de colonisation rénale chronique chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par injection d'une solution de leptospires, puis laissées porter la bactérie dans leurs reins pendant un à trois mois, 432 souris reçoivent ensuite dans l'urètre, sous trente minutes d'anesthésie, une seconde bactérie, Escherichia coli. Certaines reçoivent avant l'infection une injection destinée à supprimer un composant de leur système immunitaire. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec perte de poids, poil hérissé et mobilité réduite attendus, et toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs reins et de leur vessie. Le porteur décrit la colonisation rénale comme légère et asymptomatique, et annonce découper chaque paire de reins en quatre morceaux pour "rationaliser au mieux chaque individu".
Objectifs
La leptospirose est une zoonose ré-émergente causée par des bactéries du genre Leptospira avec Leptospira interrogans (L. interrogans), la principale espèce pathogène. Les leptospires sont transmis par différents mammifères dont certains rongeurs comme les rats et les souris (principal réservoir connu) qui les hébergent de manière asymptomatique dans leurs reins et les excrètent via leurs urines dans l’environnement. Cette maladie affecte tous les mammifères incluant l’Homme chez qui elle se manifeste diversement, allant de symptômes pseudo-grippaux à des formes sévères, le plus souvent fatales. De mauvaises conditions sanitaires dans les pays en développement, les inondations liées au réchauffement climatique sont des facteurs favorisant la transmission de L. interrogans. Il n’existe à ce jour aucun vaccin universel capable de conférer une protection durable et croisée pour les 350 types de leptospires identifiés. Les antibiotiques ne sont efficaces que s’ils sont administrés précocement, sinon ils s’avèrent incapables d’éradiquer l’infection dès lors que les leptospires s’installent et persistent dans les reins de l’hôte. Trop souvent négligée, la leptospirose est une maladie généralement diagnostiquée tardivement et se caractérise par une infection rénale chronique cause de morbidité dans les élevages de rente et suspectée chez l’homme. Des études sérologiques récentes suggèrent que certaines maladies rénales chroniques pourraient être associées à une infection antérieure asymptomatique par les leptospires. L’objectif de notre projet est d’étudier, grâce au modèle murin infecté par la leptospirose, les conséquences de l’infection chronique rénale induite par les leptospires et de son impact sur le système immunitaire inné, encore mal compris. Afin de mener à bien notre projet, nous souhaitons étudier la réactivité de l’hôte infecté chroniquement par les leptospires à une co-infection par les Eschetrichia coli pathogène urinaires (UPEC). A l’aide de ces modèles, nos travaux devraient permettre de caractériser les conséquences, pour l’instant inconnues, de l’infection rénale chronique induite par l’infection aux leptospires et de son impact sur le système immunitaire inné lors d’une infection du système urinaire.
Bénéfices attendus
L’infection aux leptospires se caractérise dans un premier temps par une phase de dissémination sanguine, puis par une réapparition dans les reins de l’hôte où ils établissent une colonisation stable et pérenne. Malgré une légère fibrose rénale, aucune détérioration de la fonction rénale, ni perte de poids n’ont été observées. Cependant, nous ignorons si ce portage chronique altère ou non la réponse immunitaire innée de l’hôte. L’idée, ici est de proposer une étude complète sur le système immunitaire innée en contexte de leptospirose chronique, afin de caractériser et définir les acteurs de la réponse immunitaire innée face à une seconde infection (ici Escherichia coli). Ces éléments pourraient apporter des éléments probants montrant que la colonisation rénale chronique des leptospires détériore le système immunitaire inné, rendant l’hôte plus sensible lors d’une co-infection.
Procédures
Au maximum, les souris seront soumises à 1 injection de solution saline ou bactéries (durée 1 minutes/souris), puis 1 à 3 mois post-infection à une injection d’un cocktail d’anesthésiques afin de procéder à 1 administration dans l’urètre d’une solution saline ou de bactéries sur animal anesthésié (durée du geste 3 minutes/souris, durée totale de l’anesthésie 30 minutes/souris). De plus les animaux pourront recevoir 1 injection avant l’infection aux bactéries, afin de supprimer un composant du système immunitaire ; toutes les injections sont réalisées sur animaux vigiles sous contention (1 minute/souris) sauf l’intraveineuse dans la veine de l’œil qui sera réalisée sous anesthésie gazeuse (2 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéales, réalisées par une piqure d’aiguille entraînent une douleur légère, et un inconfort de courte durée. Les agents infectieux administrés pourront provoquer des signes cliniques infectieux : perte de poids, poil hérissé, mobilité réduite.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, …). Cependant, nous investiguerons au maximum possible la mise en place d’étude in vitro complémentaire.
Réduction
Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Dans notre analyse, nous avons souhaité introduire l’étude des deux sexes, c’est pourquoi chaque groupe expérimental sera constitué de 6 animaux, composé de 3 mâles et 3 femelles. Ce nombre a été défini d’après notre expérience, et avec l’aide d’un biostatisticien. Des tests statistiques appropriés seront appliqués pour déterminer la significativité des données. De plus, seules les expériences donnant des résultats intéressants seront répétées. L’étude de l’immunité innée en condition de co-infection (Leptospira interrogans et Escherichia coli) s’effectue sur deux compartiments différents, le rein et la vessie. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans l’expérimentation les différents organes prélevés sur un même animal, pourront servir pour 4 types d’analyses. En effet, le rein, principale cible d’étude, est un organe pair. Chaque rein pourra être coupé en 2 permettant l’obtention de 4 morceaux distincts, cependant homogènes sur le plan histologique, pour 4 types d’analyses indépendantes. La vessie, elle, sera prélevée en totalité pour l’analyse de charge en Escherichia coli.
Raffinement
L’administration dans l’urétre sera pratiquée sous anesthésie générale de l’animal permettant une administration sans gêne ni douleur. La dose de leptospires utilisée dans notre projet, pour induire une colonisation rénale, ne provoque qu’une infection légère, asymptomatique. La surveillance des souris et des points limites sont définis et spécifiques de la maladie, ils permettent d’anticiper de façon fiable toute souffrance animale inutile. L’infection dans l’urétre sous anesthésie de la bactérie Escherichia coli n’entraîne pas de septicémie et les souris se rétablissent et éliminent complétement les bactéries en moins d’une semaine. Dans notre étude, l’infection sera de courte durée chez l’animal (24h). Cependant, dans les heures suivant l’infection les souris seront attentivement observées pour tout signe de souffrance animale (poil hirsute, attitude prostrée, signes faciaux de souffrance, mobilité altérée) et le cas échéant, mises à mort. Au terme de chaque expérience, les souris seront mises à mort selon les règles établies et leurs organes prélevés pour rationaliser au mieux chaque individu.
Choix des espèces
Dans la présente demande, l’étude de la leptospirose implique un hôte et les bactéries qui l’infectent. La complexité des mécanismes d’induction des réponses immunitaires et de l’interaction hôte-pathogène ne peut pas être appréhendée dans sa globalité in vitro. La souris, hôte naturel asymptomatique, est idéale pour pouvoir mieux comprendre la leptospirose. Par ailleurs, la souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire très proches de ceux de l’Homme. Ainsi, les résultats expérimentaux et la compréhension des mécanismes immunitaires mis en place lors de l’infection par les leptospires seront très probablement transférables à l’Homme. Ce projet sera réalisé avec des souris adultes (entre 6 et 12 semaines), défini comme matures en termes de système immunitaire.
Etude de nouveaux médicaments dans le traitement des infections par des bactéries résistantes aux antibiotiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées est génétiquement déficiente pour une réponse immunitaire, ce qui permet de mesurer l'action des molécules testées sur un organisme privé de cette défense. 8 455 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes, aucune ne pouvant être réutilisée après avoir reçu des bactéries ou des molécules. Jusqu'à 3 370 d'entre elles subissent une instillation dans chaque narine sous anesthésie générale, avec un risque d'arrêt cardiaque si le liquide atteint les poumons, ou un gavage pouvant blesser l'œsophage, 2 240 reçoivent jusqu'à trois injections en vingt-quatre heures et 1 040 un prélèvement de fèces quotidien pendant quatorze jours. Le porteur écrit que la souris présente une "remarquable similitude (99%)" avec le génome humain, et que le modèle insecte, sur lequel ces molécules ont déjà été testées, ne suffit pas pour une validation préclinique.
Objectifs
Les bactéries résistantes aux antibiotiques représentent l'une des plus grandes menaces de ce siècle. Il est impératif d’une part de protéger les antibiotiques actuels et d’autre part d’accélérer la découverte de nouveaux antibiotiques. Notre projet vise à caractériser de nouveaux antimicrobiens ciblant un nouveau mécanisme d’action, par une approche multidisciplinaire alliant recherche fondamentale et translationnelle. Notre laboratoire a identifié et caractérisé une protéine bactérienne comme une nouvelle cible thérapeutique dans la lutte contre les infections bactériennes. L’objectif du projet est de caractériser de nouveaux antimicrobiens en utilisant cette protéine comme cible moléculaire. Cette approche constitue une nouvelle voie thérapeutique puisque contrairement à la plupart des antibiotiques actuels, nous avons identifié des molécules capables de cibler des protéines importantes spécifiquement pour les bactéries pathogènes au cours d’une infection. Cette approche devrait permettre de préserver la grande majorité des bactéries non pathogènes présentes normalement au niveau de notre intestin, et ainsi de perturber le moins possible l’équilibre de notre microbiote. Un criblage ciblé de 5 millions de composés chimiques a permis la sélection de 105 inhibiteurs potentiels ciblant spécifiquement la fonction de notre protéine bactérienne ciblée. Des études préliminaires ont été menées pour déterminer l'efficacité et la toxicité de ces inhibiteurs sur des modèles in vitro, sur cellules eucaryotes et dans des modèles d’infection chez l’insecte et la souris. Toutes ces étapes ont permis d’identifier un candidat médicament prometteur. Ce candidat a été ensuite modifié chimiquement pour obtenir 5 molécules optimisées plus solubles et correspondant à des critères chimiques plus adaptés pour effectuer des tests physiologiques. Ces 5 molécules améliorées doivent désormais être testés in vivo chez la souris pour valider leur efficacité contre des bactéries pathogènes présentant un intérêt thérapeutique élevé. À la fin du projet, nous visons à obtenir au moins une molécule candidate préclinique avec un potentiel thérapeutique élevé. Ce projet répond donc à un besoin médical et sociétal et devrait permettre de trouver des alternatives aux antibiotiques actuels pour lutter contre les phénomènes d’antibiorésistance.
Bénéfices attendus
Nous proposons d'utiliser un modèle mammifère pour valider l'efficacité et la toxicité des candidats médicaments que nous avons préalablement identifiés. Sur la base de nos résultats préliminaires très prometteurs, notre objectif est de tester l'efficacité de ces inhibiteurs sur des bactéries pathogènes présentant un intérêt thérapeutique élevé et de valider l'innocuité des molécules vis-à-vis de l'hôte. Nous visons à obtenir des résultats robustes qui aboutiront à au moins une molécule candidate préclinique avec un potentiel thérapeutique élevé. Ce projet répond à un besoin médical et sociétal et devrait permettre de trouver des alternatives aux antibiotiques actuels pour lutter contre les phénomènes d'antibiorésistance.
Procédures
Interventions : Prélèvement de fécès : 1 fois par jour sur 14 jours, durée des prélèvements : 5 min (1040 souris). Instillation nasale dans chaque narine après anesthésie générale, durée de l'intervention 10 à 20 min (Nombre total de souris peut varier selon si cette méthode d’infection est conservée, nombre maximum : 3370 souris). Injection en vigile (3 injections maximum sur 24h), durée de l'intervention 1 à 5 min (nombre maximum : 2240 souris). Imagerie in vivo sous anesthésie générale, durée de l’intervention 20 à 30 min (274 souris). Gavage : contention de l’animal pendant 1 à 2 minutes (Nombre total de souris peut varier selon si cette méthode d’administration est conservée, nombre maximum : 3370 souris). Les méthodes d’anesthésies sont identiques pour chaque procédure et voie d’administration. Pour l’anesthésie par inhalation d’isoflurane, cela nécessite une contention de l’animal pendant 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les infections bactériennes sont sublétales et peuvent entrainer des effets indésirables sur les souris, tels que perte transitoire de poids, tremblements ou défaut de locomotion pendant tout le temps de la procédure. La toxicité des nouveaux candidats médicaments sera étudiée dans la procédure 1 du projet, il est possible qu’ils aient un impact sur la santé de la souris tels que perte transitoire de poids, tremblements ou défaut de locomotion pendant tout le temps de la procédure. Aucun effet n’est attendu sur la texture des selles (diarrhée…). Les voies d’administration des molécules seront par instillation intranasale, par gavage (per os), par injection intrapéritonéale et intraveineuse dans le sinus rétro-orbitaire. Les injections peuvent engendrer une douleur liée à la piqûre et un stress. Les animaux pourront subir un stress transitoire pour la contention pour les injections IP et le gavage bien que le geste ne dure que quelques secondes car maitrisé. Les injections à l'œil peuvent engendrer une douleur liée à la piqûre et un stress. Les instillations nasales peuvent éventuellement présenter un risque d’arrêt cardiaque si le liquide arrive dans les poumons. Le gavage peut entrainer un risque de traumatisme de l’œsophage ou une fausse route. Pour les prélèvements de fèces et les pesées, les animaux pourront subir un stress transitoire de quelques minutes dans le pot ou sur la balance. Pour la prise de température les animaux pourront subir un stress transitoire de quelques secondes pour la contention et la gêne due au thermomètre rectal.
Devenir
Les souris ayant reçu des bactéries ou des molécules ne peuvent pas être réutilisées et seront euthanasiées à la fin de chaque protocole pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Notre projet se base sur de nombreux résultats préliminaires qui ont permis de valider l'innocuité des molécules et leur efficacité sur des modèles in vitro et sur un modèle in vivo d'insectes. Toutes ces étapes préalables permettent de réduire le nombre de souris nécessaires pour valider l'efficacité et la toxicité des médicaments candidats les plus prometteurs. Ce projet vise à obtenir de nouveaux médicaments qui pourraient être utilisés pour des études précliniques. En raison de son application en thérapeutique humaine, les données doivent obligatoirement être validées dans un modèle mammifère d'infection.
Réduction
En plus de nos résultats préliminaires in vitro et in vivo chez l’insecte, une étude précédente a déjà permis de déterminer les bactéries d’intérêt et les paramètres optimums d’inoculation des bactéries chez l’animal. Ils ont permis d’identifier 1 candidat médicament. Des analogues de ce candidat médicament ont été synthétisés chimiquement ce qui a permis d’obtenir une famille de ce candidat médicament dont 5 dérivés ont été retenus pour être testés dans la présente DAP. Les conditions optimales déterminées à partir de l’étude précédente sont exploitées dans cette présente étude pour analyser l’effet antimicrobien des 5 nouveaux candidats pendant l’infection pour l’efficacité simple ou combinée des molécules contre 3 pathogènes d’intérêt médical. Le meilleur candidat sera testé pour sa spécificité. Le nombre d’animaux a été calculé grâce à une estimation de taille d’échantillon adaptée au plus juste pour permettre une évaluation de l’innocuité des molécules et leur efficacité. Le nombre total de souris nécessaires à cette étude est de 8455.
Raffinement
Le protocole expérimental préconise l’anesthésie des animaux pour limiter la douleur. D’autre part, l'état de santé des souris sera contrôlé quotidiennement pendant toute la durée de la procédure à l'aide d'une grille de score. Cela permettra de décider d’une euthanasie prématurée en cas de comportements anormaux des animaux suite à l’infection traduisant un mal être. Les marqueurs classiques de la santé animale seront surveillés, tels que le poids, le comportement général, la récupération et des signes de détresse (animal prostré, poil hirsute…). Les animaux seront hébergés dans les conditions standard d’habitat avec enrichissement comprenant des maisons en carton, des nids composés de lanières de papier ou des carrés de cotons, des bâtons de bois et des hamacs surtout pour les cages de mâles où il y a plus de compétitivité et un besoin d’isolement plus important. Les animaux seront regroupés à plusieurs par cage pour respecter le caractère social des souris.
Choix des espèces
La souris, avec sa remarquable similitude (99%) avec le génome humain, est une espèce de référence et un modèle largement utilisé dans le domaine de la Recherche et Développement pharmaceutique. Les souris développent naturellement des pathologies qui imitent les maladies humaines. Dans ce projet la seule utilisation du modèle insecte in vivo n’est pas suffisante pour la sélection de molécules et pour une validation préclinique de cibles. D’une part, tous les pathogènes ne peuvent pas être testés chez l’insecte, d’autre part, ce modèle est limité de par son immunité (uniquement innée), et enfin, pour toute validation de molécules d’intérêt biomédical, un modèle mammifère est nécessaire. L’utilisation du modèle souris est nécessaire pour notre projet et le plus opportun car les données préliminaires menant à ce projet ont été validées à l'aide de modèles murins. L’utilisation d’animaux déficients pour la réponse immunitaire de stress nitrique (iNOS synthase) permet d’étudier la spécificité des candidats médicaments vis-à-vis du système immunitaire de l’hôte. Cette étude est indispensable pour connaitre et, éventuellement, pouvoir limiter les effets non spécifiques des médicaments et permettre un traitement ciblé au site d’infection. Des souris âgées de 6-8 semaines sont utilisées pour le projet. L’âge des souris, après le sevrage, assurera la présence d’un microbiote et d’une immunité développée.
Impact des bactéries du phylum firmicutes sur l’immunité intestinale, la migration lymphocytaire et le rejet de greffe
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées avec une suspension bactérienne, puis greffées d'un morceau de peau au cours d'une chirurgie de trente minutes, 72 des 92 souris reçoivent ensuite des injections abdominales tous les deux jours pendant une semaine, puis deux fois par semaine pendant deux à trois semaines. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Il s'agit de savoir si modifier le microbiote intestinal allonge la survie d'une greffe de peau sous immunosuppresseur, piste ouverte par le constat que le taux de rejet varie selon le lieu de vie des patients greffés. Le porteur indique que la chirurgie induit une douleur et que l'isolement qui la suit comme la répétition des gavages stressent les souris, et prévoit leur mise à mort si la douleur persiste au-delà de 48 heures, avant les prélèvements terminaux qui ferment le protocole.
Objectifs
La transplantation d’organes est le seul traitement de certaines pathologies, elle augmente de plusieurs années la durée de vie des patients. Cependant, le système immunitaire du patient reconnaît l'organe greffé comme étranger ce qui provoque un rejet de l'organe. Plusieurs traitements sont utilisés pour contrer le système immunitaire et donc le rejet. Les traitements historiques de prévention du rejet de greffe présentent de nombreux effets secondaires, ils réduisent l'espérance de vie des patients. Un des derniers traitements développés, le bélatacept, présente moins d'effets secondaires que les traitements historiques, mais il est moins efficace pour prévenir certains rejets spécifiques. Le risque de subir un rejet avec ce traitement semble relié à l'environnement des patients et leur microbiote. En effet, le pourcentage de rejet cellulaire aigu des patients traités par bélatacept varie fortement en fonction de leur lieu de vie mais n’est pas associé à d’autres paramètres d’ordre génétique. De plus nos résultats, issus d’échantillons de patients pré-transplantation, montrent une association entre un moindre risque de rejet cellulaire aigu et la translocation d’ADN de bactéries appartenant au genre Coproccocus, qui fait partie des espèces commensales du microbiote digestif. Le microbiote est l’ensemble des bactéries présentes naturellement sur et dans le corps humain. Il influence la fonction des organes et cellules, il peut provoquer la production de certaines molécules. Ce projet a pour objectif de modifier le microbiote des animaux puis d'évaluer l'effet de cette modification sur le rejet de greffe. Nos résultats précédents laissent envisager que la prépondérance de Coproccocus au sein du microbiote induirait une population de cellules immunitaires régulatrices. Ces cellules pourraient être à l’origine d’une moindre prévalence du rejet de greffe aigu. Dans un modèle de greffe de peau de souris, nous analyserons la durée de greffe et l'effet du microbiote sur les systèmes immunitaire et digestif.
Bénéfices attendus
Les données obtenues permettront de comprendre le lien entre le microbiote et le rejet aigu. Nos études précédentes, sur des échantillons de patients, ont montré que certaines bactéries pourraient avoir un effet bénéfique, réduisant le nombre de rejet. Ce projet nous permettrait de valider l'effet bénéfique des bactéries du genre Coprococcus et de comprendre par quel moyen ces bactéries agissent. Il est connu que le microbiote modifie le fonctionnement et le nombre des cellules immunitaires au niveau des intestins. Ainsi, nous modifierons le microbiote des animaux puis nous analyserons les modifications de l’immunité en présence ou non d’un traitement utilisé en prévention du rejet de greffe. Nous étudierons également la survie de greffe dans ce contexte. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les causes du rejet de greffe des patients greffés et traités par de nouvelles thérapies immunomodulatrices. Ces résultats permettront de mettre au point un test pour déterminer quels patients feront plus probablement un rejet de greffe avec ce nouveau traitement. Il sera ainsi possible de mieux cibler les patients pouvant recevoir ce traitement et de concevoir des thérapies pour modifier le microbiote des patients susceptibles de subir un rejet.
Procédures
92 souris seront gavées par une solution non-irritante, le gavage durant moins de 5 min. Par la suite, nous réaliserons une greffe de peau sur 72 souris (ayant été préalablement gavées), la chirurgie durera 30 min par animal. Ces animaux recevront un traitement dans l'abdomen ; tous les 2 jours pendant une semaine puis deux fois par semaine pendant 2 à 3 semaines. Les injections dureront moins d'une minute chacune.
Impact sur les animaux
La réalisation d'une greffe de peau est une procédure chirurgicale qui induit une douleur pour l'animal. La chirurgie et l'isolement à la suite de celle-ci peuvent également être source d'un stress. De même, la répétition des gavages est à prendre en compte dans les éléments de stress pour les animaux. L'ensemble de ces éléments a été considéré dans la méthodologie décrite dans les procédures. Le traitement par la molécule étudiée (CTLA4-Ig) n'est pas décrit comme ayant des effets délétères.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour procéder aux prélèvements terminaux. Il n’est pas envisageable de procéder à un réveil des animaux suite à ces prélèvements.
Remplacement
Nous avons jusqu'alors utilisé des échantillons issus des patients traités par la molécule étudiée (CTLA2-Ig). Nos précédentes études, portant sur la réponse au CTLA4-Ig, utilisaient des cellules humaines isolées de prélèvements ou des sérums issus de cohortes de patients. Toutefois, l'utilisation d'un modèle murin nous permettra de valider nos observations dans un contexte d'interaction entre la greffe, le microbiote intestinal et les cellules immunitaires. Une étude in vitro ne mime pas l’interaction de l’ensemble de ces acteurs, elle ne permettrait pas l’étude des mécanismes associant le traitement et le microbiote au rejet de greffe. Le modèle de greffe de peau permet une dose de CTLA4-Ig, sur le site de greffe et dans les ganglions drainant, proche de celle présente chez les patients transplantés.
Réduction
Nous nous sommes attachés à réduire le nombre d'animaux dans cette expérimentation. La validation de la méthode de colonisation intestinale par des bactéries du genre Coprococcus nécessitera 20 animaux, 10 par groupe. Le gavage sera réalisé jusqu’à 3 fois par animal avec des suspensions bactériennes différentes permettant de limiter la variabilité issue des lots de suspensions bactériennes. A l’issus des trois premières répétitions (12 animaux) nous évaluerons la nécessité de réaliser le reste de la procédure en fonction de la variabilité des résultats obtenus. Si ce nombre est suffisant pour déterminer les conditions d’une colonisation effective ou inductrice d’une modification immunitaire la procédure sera arrêtée, sinon nous réaliserons les 2 répétitions supplémentaires. L'étude de la durée de greffe avant rejet par des souris OMM-12 nécessitera 16 animaux, 8 par groupe, afin de déterminer des moyennes, écart-types et délais de rejet minimum attendus Cette étape a été intégrée à la procédure permettant de répondre à la question scientifique, réduisant ainsi le nombre d’animaux. L’obtention d’un nombre suffisant de données pour observer un allongement de la survie de la greffe nécessitera la greffe de 72 souris. Mais le nombre de répétition sera affinée à la suite de l’étude sur les 16 premiers animaux. Des mâles et des femelles en nombre équivalent seront inclus dans l’ensemble des procédures et à chaque répétition, afin d’évaluer la variabilité de réponse entre les sexes. Cette évaluation nécessite d’inclure un plus grand nombre d’animaux mais permettra de ne pas renouveler la procédure à l’avenir pour tester l’effet dépendant du sexe.
Raffinement
Les souris seront maintenues en groupe et dans des conditions d’hébergement habituelles tout au long de leur vie. L'alimentation des animaux sera adaptée (aliment humide au sol) suite aux procédures de chirurgie ou en cas de douleur limitant la mobilité. Au cours de l'expérimentation et en cas de douleur, un protocole d'analgésie sera défini. Toutefois, en cas de non-résolution de cette douleur dans les 48h, de rejet de greffe supérieure à 80% de la surface du greffon ou de perte de poids supérieur à 20%, l'animal sera mis à mort. Les greffes de peau seront réalisées sous anesthésie. La douleur post-chirurgicale sera anticipée et un protocole d’analgésie sera appliqué préventivement. La douleur sera évaluée et traitée si besoin tout au long des protocoles expérimentaux et du suivi post-opératoire des animaux.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle murin les facteurs d'histocompatibilité du donneur et du receveur de greffe de peau. La greffe de peau est une technique parfaitement décrite dans ce modèle. L'utilisation de ce modèle permet dans le même temps une modification maîtrisée du microbiote intestinal, la greffe et l'utilisation d'un immunosuppresseur. Le modèle murin nous permet d'analyser l'interaction de ces trois composants (microbiote, greffe, traitement) avec l'immunité intestinale. Les animaux seront utilisés à un âge de 2-3 mois. Une étude de l'effet du CTLA4-Ig en fonction de l'âge ayant montré que l'âge des animaux influe sur leur réponse au CTLA4-Ig. Nos résultats devant être transférables dans un modèle de greffe murine, l'étude de colonisation pilote sera réalisée également sur des animaux de 2-3 mois.
Effet des dérivés de probiotiques sur un modèle murin de péri-implantite.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un implant dentaire leur est posé, puis, quatre semaines plus tard, un fil de soie est noué autour pour déclencher l'inflammation, fil vérifié chaque semaine sous anesthésie gazeuse et remplacé s'il s'est relâché. Le porteur qualifie la pose de la ligature et l'application quotidienne du gel de non douloureuses, tout en prévoyant une évaluation quotidienne de la douleur par score de grimaces. Il indique travailler avec une équipe qui développe un modèle artificiel de gencive et d'os, ces expériences servant précisément à le valider, ce qui reviendrait à réduire plus tard le recours aux souris.
Objectifs
Les implants dentaires sont des racines artificielles qui permettent de remplacer une dent. Dans plus d’un tiers des cas, 2 ans après leur pose, une maladie inflammatoire localisée autour de l’implant survient et peut entrainer sa perte : la péri-implantite. Cette maladie est causée par un déséquilibre des bactéries orales avec la présence en excès de bactéries néfastes qui vont jouer un rôle dans l’inflammation. Ce projet a plusieurs objectifs : 1. fournir des données sur l’os et la gencive autour des implants qui serviront de références pour la réalisation d’un modèle artificiel de gencive et d’os en condition saine 2. fournir des données sur l’os et la gencive autour des implants qui serviront de références pour la réalisation d’un modèle artificiel de gencive et d’os lors de la péri-implantite 3. tester l’efficacité d’un nouveau traitement dans la péri-implantite : les dérivés de probiotiques. Les dérivés des probiotiques sont définis comme une préparation de micro-organismes inanimés et/ou de leurs composants exerçant un bénéfice pour la santé de l'hôte. Ils sont utilisés pour rééquilibrer les bactéries, réduire l’inflammation et pourraient améliorer la maladie de la péri-implantite. Ces 3 objectifs correspondent aux 3 procédures expérimentales du projet : la procédure 1 avec la mise en place d'un implant dentaire, la procédure 2 avec la mise en place d’un implant dentaire qui sera entouré dans un second temps par un fil de soie (ce qui induit la péri-implantite), et la procédure 3 qui correspond à l'application thérapeutique d'un gel contenant des probiotiques dans la péri-implantite.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Les données obtenues sur la gencive et l’os autour des implants chez la souris serviront de référence pour la réalisation d’un modèle artificiel de gencive et d’os en condition saine et de péri-implantite. La validation du modèle artificiel pourrait permettre de réduire l’utilisation des modèles animaux dans les études des implants dentaires dans le futur. En effet, en fonction de sa validation, il pourrait être utilisé en première intention, en remplacement des animaux. Les traitements utilisés à l’heure actuelle pour la péri-implantite ont des effets imprédictibles et variables d’un patient à l’autre. Les dérivés de probiotiques pourraient constituer un nouveau traitement prometteur dans cette maladie où un déséquilibre des bactéries a été retrouvé.
Procédures
Pour la procédure expérimentale 1, de 25 à 45 souris bénéficieront de la mise en place d’un implant dentaire (le protocole de mise en place de l'implant dure environ 3 minutes). Pour la procédure expérimentale 2, de 30 à 45 souris bénéficieront de la mise en place d’un implant dentaire, puis 4 semaines après de l’induction de la péri-implantite par mise en place d’une ligature péri-implantaire (le protocole de mise en place d'une ligature péri-implantaire autour de l'implant dentaire dure environ 5 minutes). Pour le procédure expérimentale 3, de 20 à 40 animaux bénéficieront de la chirurgie de la mise en place d’un implant dentaire, puis 4 semaines après de l’induction de la péri-implantite par mise en place d’une ligature péri-implantaire et de l’application quotidienne de gel au niveau de l’implant dentaire (l'application de gel autour de l'implant dentaire dure moins d'une minute).
Impact sur les animaux
La mise en place des implants dentaires a déjà été effectuée par d'autres équipes chez la souris : il n'y a pas de perte de poids ou de comportements anormaux entrainés par la chirurgie. Des antidouleurs sont administrés aux souris avant la chirurgie de façon systématique et après la chirurgie en fonction de l'évaluation de leurs douleurs (score de grimaces). L'évaluation de la douleur se fera quotidiennement au minimum et de façon renforcée si un signe de douleur est détecté. Pour induire l'inflammation autour de l'implant dentaire, dans les procédures expérimentales 2 et 3, un mois après la pose des implants, sous anesthésie générale, un fil sera placé autour de l'implant au-dessus de la gencive. La mise en place de cette ligature est non douloureuse. Chaque semaine, sous anesthésie gazeuse courte, on viendra vérifier que la ligature est en place ; si on observe un relâchement ou une perte de celle-ci, il en sera repositionné une autre. Une partie de la procédure expérimentale 3 consiste en l'application quotidienne d'un gel au niveau de l'implant dentaire. Cet acte sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse courte : il s'agit d'une application indolore.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour la réalisation de coupes histologiques, de mesure de la hauteur osseuse.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas de modèle n'utilisant pas d'animaux qui permet d'étudier le comportement de la gencive et de l'os après la mise en place d'un implant dentaire. Notre projet s'inscrit dans un projet collaboratif avec une équipe qui tente de développer un modèle de substitution n’ayant pas recours aux animaux. Ainsi nos expérimentations vont servir à valider ce nouveau modèle qui permettrait de diminuer l'utilisation d'animaux dans le futur. Nous ne pouvons pas remplacer les souris par des invertébrés car nous étudions en partie le comportement de l'os.
Réduction
Afin de réduire le plus possible le nombre d'animaux utilisés, nous allons effectuer des études préliminaires sur un petit nombre d'animaux. Ces études préliminaires nous permettent d'observer et de quantifier la réaction de la gencive et de l'os à l'inflammation dans les modèles que nous allons utiliser. A l'aide d'outils statistiques, nous pourrons ensuite calculer le nombre minimal d'animaux à utiliser par la suite dans les expérimentations pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les animaux, à la suite de leur arrivée dans l'animalerie, auront une période d'acclimatation d'une semaine afin qu'ils se familiarisent avec leur nouvel environnement. Ils seront hébergés par groupes de 5 dans des cages de taille adaptée. Des enrichissements de type de frisottis seront présents dans toutes les cages de souris. L'eau et l'alimentation seront proposées à volonté et en permanence aux souris. Après la chirurgie, une visite, au minimum quotidienne, sera effectuée pour observer les souris et évaluer la présence de signes douloureux : si un signe est repéré, des anti-douleurs seront donnés aux animaux et la fréquence de surveillance renforcée pour vérifier leur disparition. Si les animaux montrent une souffrance qui n'est pas soulagée par les traitements, ou un comportement reflétant un mal être ne pouvant pas être résolu, les animaux seront sacrifiés dès l'arrivée de ces signes (sans attendre la fin de l'expérimentation) : le bien-être animal étant un prérequis indispensable à nos procédures.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux fréquemment utilisés pour étudier les implants dentaires. L'utilisation de cette espèce a l’avantage de permettre la réalisation des protocoles sur des temps plus courts (entre 1 et 3 mois) que sur d'autres espèces (par exemple, les durées chez le lapin sont de 10 mois). Par ailleurs, les souris ont une maturité osseuse plus précoce que les autres mammifères (à 3 mois) : les protocoles peuvent donc avoir lieu sur des animaux plus jeunes. Utiliser des souris, nous permettra également d'avoir éventuellement recours à des modèles de souris génétiquement modifiés dans des études futures. Ceci pourrait nous permettre d’étudier certains mécanismes de l'immunité et de l'inflammation.