Système immunitaire

848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'abdomen et un prélèvement de sang sous anesthésie, puis développent des lésions intestinales bénignes, effet recherché par le protocole. Le bénéfice annoncé tient à la découverte éventuelle de marqueurs précoces du cancer colorectal, quand l'atteinte est provoquée dès le départ chez chaque animal. L'effectif de 848 n'est rattaché à aucun calcul, le porteur indiquant seulement s'appuyer sur des données antérieures et vouloir engager de petits groupes pour abandonner vite les pistes non concluantes.

Objectifs

Le cancer colorectal (CCR) reste un problème majeur de santé publique malgré les progrès réalisés ces dernières années. De ce fait, il est urgent de développer des outils permettant un suivi précoce de patients à risque, permettant la mise en place de traitements adaptés minimisant l’évolution des lésions précoces en lésions cancéreuses. A ce titre, ce projet se focalisera sur les mécanismes biologiques impliqués dans l’initiation tumorale, l’élucidation de ces derniers pouvant aboutir à de nouvelles cibles thérapeutiques ou aider au dépistage. Plusieurs études ont montré le rôle critique de certaines cellules tapissant l'intestin dans la mise en place d’une réponse immunitaire dérégulée, pouvant potentiellement favoriser l’initiation tumorale. L’objectif de ce projet est de découvrir comment ces cellules peuvent dialoguer avec le système immunitaire et favoriser l’inflammation. Nous nous focaliserons sur le rôle d'une classe de molécules messagères particulières de l’inflammation. Notre stratégie expérimentale visera à comparer la fréquence d’initiation de lésions intestinales bénignes dans des souris pour lesquelles un gène responsable de la production de ces molécules sera inactivé ou non.

Bénéfices attendus

Nous attendons des résultats prometteurs, permettant une meilleure compréhension des toutes premières étapes de la mise en place d'un environnement inflammatoire dans le tube digestif, connu comme facteur augmentant le risque de développement de lésions précancéreuses. A ce titre, ce projet peut avoir des bénéfices en termes de découverte de biomarqueurs précoces (à visée préventive et diagnostique).

Procédures

Les animaux recevront des injections de substances (les injections durent moins d’une minute), et un seul prélèvement sanguin sous anesthésie (d’une durée de 5 min).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis aux nuisances suivantes : injection de substances par voie intrapéritonéale et prélèvement sanguin, générant un stress et une douleur de manière ponctuelle. L'effet indésirable est le développement, à terme, de lésions intestinales bénignes.

Devenir

Les individus seront euthanasiés et utilisés pour prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Les questions posées dans le cadre de ce projet (interactions entre types cellulaires et organes différents) impliquent l’utilisation de modèles murins reflétant au mieux la physiologie d’un point de vue intégrée. La réponse aux questions soulevées dans ce projet ne peut en aucun cas être abordée par un seul modèle de substitution.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini en nous appuyant sur les données précédemment obtenues, afin de nous permettre d’obtenir des données interprétables. Notre stratégie pour réduire le nombre d’animaux consistera à engager de petits groupes d’individus, nous permettant de valider ou d’invalider nos hypothèses de travail le plus rapidement possible. Si une de nos pistes de travail ne s’avère plus pertinente, les expériences associées seront abandonnées, réduisant de fait le nombre d’animaux engagés en procédures.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale consiste à analyser les individus à des temps très précoces, pour minimiser la mise en place de l'initiation de lésions intestinales, et demander un suivi de ces derniers lors des changes hebdomadaires. Afin de réduire au maximum la douleur et l’angoisse que certaines procédures pourraient engendrer chez les animaux, les animaux seront traités avec des anesthésiques et des analgésiques. Une stratégie de suivi adaptée sera mise en place pour le devenir des animaux (grilles de scores), incluant des points limites suffisamment prédictifs.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif et immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet sont d'excellents modèles pour induire l'apparition de lésions intestinales, récapitulant leur développement chez l'homme. Les animaux seront étudiés entre 6 et 20 semaines d'âge, dès lors que le système digestif est mature.

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, dépourvue des défenses qui lui permettraient de rejeter les cellules tumorales qu'on lui greffe. 8 172 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Éveillées, elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous la peau du flanc, puis des traitements deux fois par semaine jusqu'à l'atteinte du point limite, environ trois semaines pour les groupes non traités, et pour certaines quatre injections directement dans la tumeur dès qu'elle atteint 100 mm3. Leur mort permet les analyses post-mortem, le porteur revendiquant la nécessité de valider dans "un organisme dans son intégralité" des observations qu'il a d'abord obtenues sur lignées cellulaires.

Objectifs

Les immunothérapies anti-tumorales visent à détruire les cellules cancéreuses en stimulant ou en réorientant le système immunitaire (SI). Ces traitements sont prometteurs et permettent déjà de guérir des patients, mais certaines tumeurs échappent au SI et il est essentiel d’améliorer ces approches. Les lymphocytes T tueurs sont des cellules essentielles pour l’immunité anti-tumorale. Pour fonctionner, elles ont besoin de reconnaître un peptide (appelé néoantigène - néoAg), exprimé par les cellules cancéreuses. Identifier les mécanismes de production de néoAgs et des stratégies pour moduler leur expression est un enjeu central de la recherche en immunothérapie. Les chercheurs ont longtemps cherché des néoAgs provenant de gènes codants, dérivant de mutations acquises par les cellules tumorales pendant le développement du cancer. Mais ces mutations sont souvent spécifiques à chaque patient, et donc difficiles à cibler. Il faut donc trouver d’autres sources de néoAgs. On parle souvent du rôle des gènes dans le développement de pathologies humaines, mais ils représentent seulement 2% du génome. On a longtemps pensé que le reste du génome (dit silencieux) ne s’exprimait pas. Plusieurs études récentes ont montré que le génome silencieux peut s’exprimer dans les tumeurs et favoriser leur destruction par le système immunitaire. L’inactivation de gènes impliqués dans « la mise sous silence » du génome silencieux permet son expression et conduit à une meilleure reconnaissance des tumeurs par le SI. Ils sont donc des candidats prometteurs pour le développement de thérapies. Il reste cependant beaucoup à comprendre sur la nature exacte de la régulation de ce génome silencieux et c’est le but de ce projet. Le premier objectif est d’identifier des gènes participant à sa « mise sous silence ». Le deuxième est de cibler ces gènes pour améliorer la réponse immunitaire anti-tumorale. Le troisième est de déveloper un traitement pour spécifiquement réveiller une partie du génome silencieux codant pour un néoAg pour améliorer les réponses immunitaires anti-tumorales. L’objectif général du projet est de comprendre les mécanismes de régulation du génome silencieux pour mieux instruire l’établissement de protocoles d’immunothérapie.

Bénéfices attendus

Il est essentiel de noter que la très grande majorité des cancers développent des mécanismes très efficaces qui inhibent la réponse immunitaire. Un enjeu actuel de la recherche en immunothérapie est d’identifier des mécanismes de productions de néoantigènes (qui seraient des nouvelles cibles) par les cellules tumorales et d’établir des traitements ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet. Ces expériences vont permettre de mieux caractériser le ou les mécanismes de régulation du génome silencieux dans les cellules tumorales. En effet, certains éléments du génome permettent de produire des protéines spécifiques de la tumeur et capables d’augmenter la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur et non les tissus sains. Par ailleurs, ce projet cherche à mettre en place un protocole permettant d’augmenter l’expression de ces néoantigènes afin de pouvoir les utiliser dans des stratégies thérapeutiques pour améliorer de manière large la réponse des cancers à l’immunothérapie.

Procédures

Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées à des souris par voie sous-cutanée au niveau d’un des flancs, sur animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une deuxième procédure, après l’injection de cellules tumorales (identique à la 1ère procédure), les animaux seront traités par injection sur animaux vigiles 2 fois par semaine (durée du geste inférieure à 10sec), jusqu’à l’atteinte du point limite (environ 3 semaines pour les souris recevant les tumeurs sans traitement) ou pour un maximum de 60 jours (si les tumeurs sont rejetées). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une troisième procédure, les animaux seront injectés par voie sous-cutanée au niveau du flanc (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dans une quatrième procédure, des cellules tumorales seront injectées sur les animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dès que les tumeurs atteignent environ 100mm3, le traitement sera injecté dans la tumeur des animaux vigiles à raison de 4 injections tous les 4 jours ( durée du geste inférieure à 10 sec). Un des groupes d’animaux sera également injecté en intraveineuse 24h avant le début du traitement.

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Pour les expériences d’injections de cellules tumorales ou des traitements, il est attendu une douleur directe associée à l’utilisation d’une aiguille. Pour le prélèvement de sang, il est attendu une douleur légère liée à la réalisation (gène de courte durée). En ce qui concerne les injections intratumorales, nous utiliserons un format de traitement utilisé en routine pour traiter des patients par injections locales. Aucune inflammation n’est attendue après ce traitement, mais les souris peuvent ressentir de la douleur pour un temps limité après l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour des analyses post-mortem

Remplacement

Les lignées tumorales ont d’abord été étudiées in vitro (marqueurs de surface, croissance). Dans le cas des traitements visant à manipuler spécifiquement l’expression de néoantigènes dérivant du génome silencieux, des expériences ont été réalisées in vitro dans les lignées cancéreuses, nous savons donc qu’elles réagissent à ce traitement. Le projet est aussi avancé que possible, cependant des tests in vivo sont maintenant nécessaires pour comprendre le rôle de ces lignées sur la réponse immunitaire dans un contexte physiologique entier. En effet, dans le cas des lignées cellulaires déficientes pour des gènes de régulation, nous allons analyser la présence de cellules immunitaires entre les conditions déficientes et contrôles grâce à un prélèvement de sang.

Réduction

Lorsque cela est possible, afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés, les études sont réalisées au préalable sur des lignées cellulaires in vitro, modifiées pour les gènes d'intérêt. Nous pouvons ainsi tester un nombre important de paramètres, puis passer aux modèles animaux uniquement quand le projet est aussi avancé que possible. Cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Néanmoins, il est nécessaire de valider ces observations dans le contexte d'un organisme dans son intégralité plus physiologique. Le nombre d'animaux par groupe est défini à l'aide d'un outil statistique.

Raffinement

Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte des points limites. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés 2 à 3 fois par semaines pour leur état général et pour mesurer la taille de la tumeur.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes. Enfin, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantables disponibles.

Tuées au cours d'une chirurgie de perfusion du foie dont elles ne se réveillent pas, 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines portent un foie ou un système immunitaire humanisé, construit à partir d'hépatocytes humains ou de sang de cordon. Avant l'opération elles reçoivent pendant deux à trente semaines un régime gras et sucré, occidental hypercalorique ou déficient en choline, destiné à provoquer une stéatose ou une fibrose du foie, puis des candidats médicaments par gavage ou injection dont le porteur admet que certains peuvent être toxiques pour le foie. Il passe en revue lignées cellulaires, hépatocytes humains isolés, cellules souches et organoïdes, écarte chacun d'eux et conclut que la souris humanisée constitue un modèle "indispensable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments sur la fonction hépatobiliaire et d’isoler les différentes populations cellulaires hépatiques (= du foie) par une perfusion in situ du foie, chez des souris saines et pathologiques. Deux pathologies seront ciblées : le modèle de stéatose hépatique d’origine métabolique (maladie du foie gras) et le modèle de fibrose hépatique. Pour ce faire, nous pourrons travailler chez différentes souches de souris immunodéficientes (diminution de l’état d’immunité de l’organisme) ou immunocompétentes (≠immunodéficience, capacité normale de l’organisme à se défendre contre une infection). Les souris pourront présenter un système immunitaire humanisé à l’aide de cellules souches issues de sang de cordon humain ou de cellules sanguines provenant du sang périphérique humain (PBMC), et/ou un foie humanisé à l’aide d’hépatocytes humains. Les tests fonctionnels pourront être réalisés et nous permettront d’évaluer directement au niveau de l’organe les effets de molécules à visée thérapeutique, administrées préalablement et/ou au moment de la perfusion, mais également leur métabolisation. Par ailleurs, l’isolement des différentes populations cellulaires hépatiques par cette méthode nous permettra non seulement de déterminer les effets cellulaires des candidats médicaments, mais aussi de congeler ou de mettre en culture des cellules pour une utilisation ultérieure (essais in vitro, transplantation chez de nouvelles souris).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’établir les effets fonctionnels de molécules à visée thérapeutique sur le foie, ainsi que leur métabolisation par cet organe, dans des modèles pathologiques d’intérêt. Par ailleurs, ce projet nous permettra d’isoler différents types cellulaires hépatiques en vue de leur utilisation ultérieure. L’utilisation de souris humanisées dans ce contexte permettra l’obtention de données particulièrement pertinentes, en offrant un modèle préclinique se rapprochant de la physiologie de l’espèce cible, l’Homme.

Procédures

Afin d’induire la stéatose, les régimes suivants pourront être administrés ad libitum pendant 2 à 30 semaines avant perfusion : - Diète enrichie en graisses et en sucre - Diète dite « western » (régime occidental hypercalorique) - Diète déficiente en choline (export des lipides du foie) et/ou méthionine (régulation de l’expression des gènes) L’administration de composés de recherche pourra être réalisée préalablement à la perfusion hépatique par voie entérale (gavage, incorporation dans l’alimentation ou dans l’eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire). L’administration des thérapies pourra également être réalisée directement pendant la perfusion, par incorporation dans la solution de perfusion, ou sur les cellules isolées. Une chirurgie sous anesthésie générale sera réalisée sur les souris afin de perfuser le foie. Une seule chirurgie sera réalisée, sa durée minimale sera de 10min, le temps nécessaire à la mise en place de la perfusion. Le temps maximal sera fonction de l’objectif de la perfusion. Pour un isolement de cellules, il faudra compter environ 45min ; pour les tests de composés à visée thérapeutique, le temps sera adapté au cas par cas selon les données disponibles de pharmacocinétique/pharmacodynamique et de métabolisation hépatique de la molécule.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par les procédures préalables à la perfusion du foie (par ex. perte de poids en réponse à un régime). Par ailleurs, les composés médicamenteux expérimentaux administrés pourraient potentiellement exercer des effets secondaires hépatotoxiques (toxiques pour le foie) qui pourraient provoquer des nuisances. Chez la souris vigile, la douleur peut se manifester, entre autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux sont mis à mort car la procédure de perfusion du foie est terminale et ne permet pas leur réveil. Les animaux sont également euthanasiés avant la fin d’étude s’ils ont atteint les point limites éthiques prédéfinis ou sur demande du vétérinaire d'établissement.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de lignées cellulaires hépatiques existent, leur utilisation est limitée car ils ne permettent actuellement pas de refléter l’environnement hépatique avec le niveau de fidélité et de complexité nécessaire à une évaluation fiable et pertinente des effets d’un composé à visée thérapeutique, de ses potentiels effets secondaires et de sa métabolisation. Les hépatocytes humains fraîchement isolés, qui seraient le modèle le plus pertinent, bien que ne représentant qu’une seule population cellulaire, se dédifférencient rapidement après isolement et ne se maintiennent pas en culture. Les lignées cellulaires immortalisées ou dérivées de cellules souches pluripotentes induites en laboratoire (IPS), quant à elles, sont sujettes à des dérives génétiques et à l’activation d’oncogènes (gènes dont l'expression favorise la survenue de cancers). Enfin, les systèmes plus complexes et multicellulaires, tels que les organoïdes (culture de cellules en 3D) dérivés de cellules souches hépatiques, sont complexes à obtenir et présentent une variabilité liée au donneur de cellules souches. Par ailleurs, ces systèmes ne permettent actuellement pas de rendre compte du niveau de complexité fonctionnelle de l’organe et des interactions entre les multiples populations cellulaires présentes dans le foie (hépatocytes, cellules non-parenchymateuses, cellules du système immunitaire, …). À l’heure actuelle, la souris, et à plus forte raison la souris humanisée, constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total maximum de 2 500 souris sera utilisé sur une période de 5 ans, permettant de mener 50 études de 50 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques. Par ailleurs, l’isolement de cellules hépatiques permettra, d’une part, leur cryoconservation pour de futurs essais in vitro et, d’autre part, leur mise en culture, sous forme d’organoïdes. Ces techniques participeront à la réduction du nombre d’animaux utilisés pour les futures études.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires (type gel nutritif enrichi en électrolytes et vitamines) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (perte de poids), si leur utilisation n’est pas amenée à biaiser les résultats scientifiques de l’étude. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de coton. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées à la présence humaine régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids. Enfin, un protocole d’anesthésie-analgésie raffiné sera mis en place pour la conduite de la procédure de perfusion.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, âge de première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.

Jusqu'à seize prises de sang dans la joue sur animal vigile, réparties sur vingt-quatre semaines : 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cœur et des organes. Une partie subit une chirurgie de trente minutes provoquant un infarctus du myocarde, avec douleur postopératoire et mobilité réduite pendant huit heures. L'objectif est de mettre au point un anticorps ciblant une population immunitaire, à administrer chez des patients en phase aiguë d'infarctus. Le porteur retient la souris parce qu'elle se reproduit vite et donne beaucoup de petits, et parce que les lignées mutantes voulues n'existent que chez elle.

Objectifs

L’incidence de l’insuffisance cardiaque consécutive à un infarctus du myocarde (IM) est en augmentation constante et la mortalité à moyen et long termes reste élevée, ce qui constitue un enjeu médical et sociétal majeur. Si la prise en charge aigüe a permis de diminuer la mortalité dans les premiers jours, les conséquences chroniques de la perte de fonction cardiaque restent importantes et sont associées à une perte de qualité de vie et un coût conséquent pour la société. Notre projet a pour but de développer un outil thérapeutique à utiliser en clinique à la suite d'un infarctus du myocarde afin de limiter l'atteinte cardiaque. A cette fin, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées pour développer un anticorps ciblant une population immunitaire particulière. Nous traiterons des souris avec cet anticorps pour confirmer son effet en condition non pathologique. Pour valider son efficacité, nous l'utiliserons dans des modèles de souris soumises à un infarctus du myocarde induit chirurgicalement sous anesthésie générale. L’analyse consistera à étudier la fonction cardiaque, le remodelage cardiaque et la réponse inflammatoire post-infarctus.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à limiter les dommages tissulaires après un infarctus du myocarde et par conséquent, réduire la mortalité post-infarctus et limiter le développement de l’insuffisance cardiaque. Ce développement d'un nouveau traitement à utiliser en phase aiguë de l'infarctus du myocarde et visant à réduire les dommages et le remodelage cardiaque présente de nombreux avantages potentiels, permettant d’améliorer la qualité de vie des patients, diminuer les ré-hospitalisations, réduire les coûts de santé et diminuer la morbidité.

Procédures

Une partie des animaux va subir des prélèvements sanguins répétés par voie submandibulaire, étant vigile. Ces prélèvements sont d'une durée inférieure à 1 minute. Il y aura jusqu'à 16 prélèvements, espacés au minimum d'une semaine et répartis sur une durée allant jusqu'à 24 semaines. Une partie des animaux va subir une chirurgie de 30 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde est réalisé sous anesthésie générale. Un minimum de quatre injections sous-cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents temps après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 15 minutes. Une partie des animaux va subir une injection intraveineuse d'une durée maximale de 30 seconde sous anesthésie générale. Une autre partie des animaux va subir deux injections par voie intraveineuse d'une durée maximale de 30 secondes sous anesthésie générale, espacées de 3 jours.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, potentielle douleur au point d'injection, stress lié à l'anesthésie, stress/potentielle douleur lors de la pose de la bague à l'oreille pour identification; douleur au site de prélèvement dans les cadre des prélèvements sanguins répétés. Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire, mobilité transitoirement réduite suite à l'anesthésie (8 heures).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur et les organes.

Remplacement

Afin de respecter le principe des 3R, les anticorps seront générés en utilisant des lignées cellulaires. Par ailleurs, les différents clones seront au préalable caractérisés sur des cellules afin pré-sélectionner les clones les plus intéressants à tester chez la souris. Ces modèles animaux représentent une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes impliquant un grand nombre de types cellulaires, ce que des modèles artificiels ne pourraient pas permettre de recréer dans leur entièreté. Nous voulons étudier chez l'animal, le phénomène de réparation tissulaire consécutif à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 15 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents à la procédure chirurgicale, nous estimons une taille de groupe à 20 animaux. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Par ailleurs, il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas particuliers. La souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation d’anesthésie générale et d’analgésie adaptées, et par l’établissement et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et renforcée par les expérimentateurs confirmés et par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grace à ces modèles murins, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 8 à 10 semaines minimum et chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité.

Un niveau de douleur jugé trop élevé déclenche la mise à mort anticipée, seuil que le porteur fixe au moyen d'une grille de score. 1 020 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue après un prélèvement sanguin intracardiaque. Une tumeur leur est greffée dans le rectum sous anesthésie générale, suivie de deux injections de chimiothérapie sur animal vigile, d'un gel immunostimulant administré par l'anus et d'un suivi par imagerie deux fois par semaine, la tumeur pouvant provoquer ulcères, douleurs et occlusion du côlon. Les groupes comptent vingt souris parce que le porteur anticipe 20 % d'échecs de greffe et jusqu'à 40 % de morts sous chimiothérapie seule, de sorte qu'il en reste dix à analyser.

Objectifs

La radiothérapie combinée à la chimiothérapie est chez le patient actuellement, le traitement de référence des cancers du rectum avant la chirurgie. Cependant, la radiothérapie est associée à d’importants effets secondaires (Incontinence urinaire, incontinence fécale...). Des travaux publiés récemment suggèrent que la chimiothérapie seule pourrait être une alternative à ce protocole de traitement. Cependant la guérison complète après traitement médical, qui permet alors d'éviter la chirurgie, est inférieure à 20%. La survie globale à 10 ans, liée à la récidive généralisée du cancer, est de 50%. En parallèle, il est démontré que l’immunothérapie améliorait la réponse du traitement sur des modèles de cancer colorectal. En effet, l’activation de l’immunité permettrait de majorer l’effet des traitements des cancers du rectum. C’est pourquoi nous souhaitons évaluer l’effet d’une immunothérapie locale associée à la chimiothérapie dans le cancer du rectum en remplacement de la radio-chimiotherapie. Pour valider notre hypothèse, nous souhaitons mettre en place un modèle de cancer du rectum chez la souris, et associer à la chimiothérapie une immunothérapie locale par administration intra rectale de notre immunogel. L'efficacité du traitement sera étudiée en suivant la croissance tumorale des tumeurs par imagerie optique et en échographie, en suivant la survie des souris, et en étudiant la réponse immunologique.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de définir et valider l’immunochimiothérapie pour améliorer le taux de guérison et diminuer le risque de développement de métastases du cancer du rectum. L’amélioration de cette guérison après traitement médical serait un argument en plus permettant d'avoir moins recours à la chirurgie. Le non recours à la chirurgie du rectum après une réponse complète aux traitements médicaux est au coeur des essais cliniques actuels sur les traitements du cancer du rectum, car elle permet de diminuer la morbidité et les séquelles liées à la chirurgie. Les résultats de cet essai préclinique pourront aboutir au design d’une étude clinique incluant l’immunothérapie locale aux standards de traitement du cancer du rectum chez l'Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure de greffe tumorale en début de chaque procédure, correspondant à une injection intra rectale de cellules tumorales. Cette injection se fera une fois par procédure et sera réalisée sous anesthésie générale. Pour le suivi de croissance tumorale par imagerie bioluminescente 2 fois par semaine, les souris seront anesthésiées par inhalation de gaz. Elles recevront également à ce moment une injection intrapéritonéale de luciférine. Les chimiothérapies administrées pendant le projet seront injectées vigile par voie intrapéritonéale. Les souris traitées recevront 2 injections de chimiothérapie. Les souris traitées par notre gel recevront une injection de gel par l'anus sous anesthésie générale. En cas d'échec de cette voie, le gel sera injecté directement dans la tumeur, par voie anale, sous anesthésie générale également. En cas de douleur au cours du projet, les souris recevront une analgésie par injection sous-cutané d'antalgique. Au moment de leur mise à mort, un prélèvement sanguin intracardiaque sera effectué. Ce prélèvement sera effectué sous sédation profonde par une injection intrapéritonéale de médicaments anesthésiants. Les souris seront par la suite mises à mort sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La greffe de tumeur orthotopique pourrait être responsable de douleurs (ulcères, lésions) et de perte de poids. Les chimiothérapies incluent dans cette étude, peuvent entrainer chez l’Homme des mucites, des troubles du rythme cardiaque, des neuropathies périphériques. Les signes généraux de douleur, d’asthénie, de diarrhées ou de troubles de la mobilité seront particulièrement surveillés chez la souris après injection. De par sa localisation, on peut supposer que la tumeur pourrait-être responsable d’occlusion du côlon, malgré l’absence de description dans la littérature. Nous serons donc particulièrement attentifs à des signes de gonflement de l’abdomen, en plus des signes d’altération de l’état général.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mises à mort à l'issu de chaque procédure pour prélèvement et analyse anatomopathologique

Remplacement

Nous avons préalablement évalué par des expériences in vitro plusieurs formulations de gel pour ne tester chez l’animal que les formulations finales. A la suite de ces expériences in vitro, notre modèle doit maitenant être appliqué à l'animal pour tendre vers une approche clinique chez l'Homme. La modification de l'environnement de la tumeur, qui est particulièrement riche et complexe chez l'Homme et sur modèle animal, est la cible de notre traitement et ne pourrait être évalué uniquement in vitro.

Réduction

Le projet a été consciencieusement pensé et élaboré afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Le nombre d’animaux doit être de 12 souris par groupe pour les expériences qui présentent une faible variabilité. Cependant, pour l’étude de l’efficacité, nous nécessiterons l’utilisation de 20 souris par groupe car les expériences présentent une variabilité importante particulierement lié aux reponses à la chimiothérapie. Ce nombre est calculé selon notre expérience et la littérature et en tenant compte de la variabilité interindividuelle. En effet, il est nécessaire de prévoir 20 animaux par groupe pour avoir des données statistiquement analysables car d’après notre expérience la prise tumorale pour la tumeur primaire et secondaire est de 80% et sa mortalité de 8%. La mortalité à distance de la chimiothérapie seule est de 40% dans la littérature. Considérant cela, il restera, dans le pire des cas, 10 animaux par groupe ce qui permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. De plus, l'utilisation de l'imagerie optique et plus ou moins de l’échographie nous permet de réaliser en temps réel le suivi de l’évolution tumorale. Ces techniques non invasives nous permettront ainsi de réduire au maximum le nombre d'animaux.

Raffinement

Nous nous attacherons à réduire au maximum la souffrance des souris. Nous utiliserons l’imagerie optique, non invasive et non traumatisante, pour évaluer l’efficacité du traitement. L’implantation des tumeurs, ainsi que l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Une grille d'évaluation de la douleur adaptée à ce projet a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera la mise a mort anticipée de l'animal. Chez la souris anesthésiée, tout signe de douleur (mouvement soudain, vocalisation) induira un arrêt de la procédure, une analgésie et une nouvelle induction de l’anesthésie. Une surveillance du volume tumoral 2 fois par semaine et du poids tous les 2-3 jours sera assurée après les implantations de tumeurs. Après l’anesthésie, la souris sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post interventionnelle et post examen d’imagerie. Plus généralement, un animal peut être isolé de ses congénères s’il y a présence de blessures. Les blessures seront le cas échéant désinfectées à la vetedine. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé dans la littérature pour les études de vaccination antitumorales. De plus, une première preuve de concept a été réalisée avec cette espèce, cela est donc plus cohérent pour la poursuite de nos expériences. Nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines car leur système immunitaire est adéquat et suffisamment développé à cet âge-là.

Infectées par le paludisme puis exposées quarante-cinq minutes durant aux piqûres de moustiques, une partie des 860 souris de ce projet est utilisée pour faire circuler le parasite entre rongeur et insecte. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec un affaiblissement et une anémie liés à l'infection, et des prises de sang tous les un à deux jours sur animal vigile. Le porteur présente pourtant cette production de parasites comme "une solution de remplacement", au motif que les sporozoïtes ainsi obtenus alimentent des cultures cellulaires qui auraient sinon exigé davantage d'animaux. Toutes sont tuées, les unes sous anesthésie au moment du prélèvement terminal destiné aux stocks congelés, les autres pour éviter qu'elles n'atteignent les points limites de l'infection.

Objectifs

L'objectif du projet est de produire des sporozoïtes de Plasmodium, les formes transmises par le moustique de l'agent du paludisme, à l'aide de modèles murins d'infection par Plasmodium yoelii et Plasmodium berghei. Les sporozoïtes produits serviront à des études in vitro en modèles cellulaires des stades pré-érythrocytaires de ces parasites. Ces études in vitro sont nécessaires pour mieux comprendre la biologie de ces parasites et les mécanismes d'infection, et pour évaluer l’activité de nouvelles molécules antipaludiques ou optimiser l’activité de molécules existantes. Les modèles d’études in vitro reposent sur l’infection de cellules hépatiques par des sporozoïtes isolés à partir de moustiques Anopheles préalablement infectés à partir de souris infectées. Ces modèles d’infection in vitro de cellules hépatiques par les parasites de rongeur P. yoelii et P. berghei reproduisent de nombreux aspects de la biologie des espèces de Plasmodium infectant l'homme, et permettent d’étudier le rôle de facteurs parasitaires ou de l’hôte au cours de l’infection, notamment à l’aide de parasites génétiquement modifiés, ainsi que d’évaluer l’efficacité de molécules à visée antiplasmodiale.

Bénéfices attendus

Le paludisme, avec près de 250 millions de cas annuels et plus de 600 000 décès, pour la plupart des enfants de moins de cinq ans, reste un problème majeur de santé publique. Ce projet, nécessaire pour assurer la production régulière des lots de sporozoïtes requis pour les études in vitro menées dans le laboratoire, devrait permettre d'améliorer nos connaissance des mécanismes fondamentaux d'infection par Plasmodium, afin de définir des cibles thérapeutiques et vaccinales innovantes et de permettre l’évaluation de l’activité de molécules à visée antiplasmodiale dans le but d’élaborer ou d’optimiser de nouveaux traitements antipaludiques.

Procédures

Un premier groupe d'animaux est engagé dans des protocoles de production de parasites pour la congélation, destinés à l'infection standardisée d'autres souris. Ces animaux seront soumis à une injection intra-veineuse unique d’une suspension de sporozoïtes de Plasmodium (durée d'environ 15 secondes, sous anesthésie gazeuse), puis seront soumis à des prélèvement d'une goutte de sang tous les 1 à 2 jours à partir du 4ème jour post inoculation des parasites, pendant au maximum 7 jours (durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Ces animaux seront finalement soumis à un ultime prélèvement de sang, sous anesthésie et analgésie, pour la constitution des stocks de parasites cryopréservés (acte unique, durée 10 minutes), et euthanasiés avant leur réveil à l'issu de ce prélèvement. Un autre groupe d'animaux sera engagé dans des protocoles de transmission du parasite plasmodium aux moustiques. Ces animaux seront soumis une à injection intrapéritonéale de parasites (1 injection unique de parasites issus des stocks cryopréservés/standardisé, préparés à partir du premier groupe d'animaux ; durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), puis seront soumis à des prélèvement d'une goutte de sang par jour à partir du 3ème jour post inoculation des parasites, pendant au maximum 3 jours (durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Ces animaux seront finalement exposés à des piqûres de moustiques pour transmettre les parasites aux moustiques (acte unique réalisé sous anesthésie et analgésie, durée 45 minutes), puis euthanasiés avant leur réveil.

Impact sur les animaux

Stress lié à la préhension/contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour la constitution des cryostocks de parasites dans le cadre de ce projet, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Ce projet vise à produire les parasites au stade sporozoïtes, nécessaires à des expérimentations in vitro pour étudier les stades préérythrocytaires du paludisme. Il s’agit d’une solution de remplacement puisque les expériences menées in vitro à partir de chaque lot de sporozoïte produit permettent de collecter de façon très robuste et reproductible de nombreuses données pour lesquelles il aurait été nécessaire d’utiliser un bien plus grand nombre d’animaux si l’on avait cherché à collecter ses données à partir d’expériences menées in vivo, chez la souris. En particulier, l’utilisation de systèmes de cultures cellulaires (lignées hépatocytaires et hépatocytes primaires) permet d‘analyser l'infection des cellules du foie par les parasites provenant des moustiques infectés. Si quelques protocoles décrivent la production axénique des sporozoïtes de Plasmodium, ils ne permettent malheureusement toujours pas de produire des sporozoïtes complètement matures et infectieux. Les protocoles décrivant la production des sporozoïtes de Plasmodium de rongeurs reposent de plus sur l’utilisation de gamétocytes (formes sexuées mâles et femelles), donc de stade sanguin, pour lesquels il n’existe pas de méthode de culture continue in vitro, et requièrent donc leur production chez l’animal.

Réduction

Au total ce projet utilisera 860 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires à la constitution des stocks de parasites et à l’infection des lots de moustiques nécessaires à la production des sporozoïtes destinés aux études in vitro sur 5 ans. Ces protocoles de production de parasites n'impliquent pas de tests statistiques. Le calcul des effectifs d'animaux nécessaires s'appuit sur une expérience de l'équipe acquise depuis plus de vingt ans dans la réalisation de ces protocoles.

Raffinement

Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur ou le stress (inoculation de parasites par injection intraveineuse et expériences de transmission aux moustiques notamment). La présence de points limites définis permet d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection, en particulier lors de l’infection par le parasite de rongeur Plasmodium berghei, les souches de Plasmodium yoelii n’engendrant quant à elles que peu de symptômes. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.

Choix des espèces

Le modèle d'infection chez la souris par les parasites de rongeur Plasmodium yoelii et P. berghei reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites du genre Plasmodium, responsables du paludisme chez l'Homme. Ce modèle permet l'infection du foie par les sporozoïtes (la forme infectieuse du parasite transmise lors de la piqure d'un moustique infecté), une croissance parasitaire sanguine et la transmission de ces parasites aux moustiques pour la production de sporozoïtes infectieux selon le même schéma que ce qui est décrit chez l'Homme. L’infection in vitro de cellules hépatiques par des sporozoïtes de ces espèces parasitaires représente un modèle pertinent pour étudier la biologie des stades précoces du paludisme dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et vaccinales, et d’évaluer l’activité de molécules à visée antipaludique dans le but de développer de nouveaux médicaments. Dans ce projet, des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures sont utilisées, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.

Tester si une cible identifiée en culture cellulaire améliore l'effet de la radiothérapie suppose ici de greffer une tumeur à 432 souris. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées, à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post mortem. Après l'injection sous-cutanée de cellules tumorales viennent un gavage puis une irradiation sous anesthésie, en trois doses sur trois jours consécutifs ou en dose unique par mini-faisceaux, avec diarrhée, perte de poids et dermite possibles. Le porteur affirme que le développement de ces tumeurs n'entraîne ni douleur ni gêne et conclut que le modèle animal reste "indispensable" pour passer à la clinique.

Objectifs

L‘arsenal des traitements contre le cancer comprend la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie, c’est-à-dire la manipulation du système immunitaire du patient pour combattre la tumeur. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces contre tous les cancers ou seule une partie des patients répondent au traitement. L’efficacité du traitement dépend souvent de l’implication des cellules du système immunitaire. Ces dernières années, le rôle essentiel d’une population particulière de cellules immunitaires, appelées monocytes, a été mis en évidence. Le but de ce projet est de manipuler ces cellules afin de stimuler les réponses immunitaires contre les tumeurs, et de tester une stratégie thérapeutique permettant d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie.

Bénéfices attendus

Nous avons identifié par des expériences in vitro une nouvelle cible thérapeutique potentielle qui pourrait stimuler les réponses immunitaires dans le contexte du cancer. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances essentielles pour évaluer l’intérêt de cette nouvelle cible thérapeutique dans un système physiologique in vivo. Ce projet permettra également de mieux comprendre l’importance des cellules immunitaires appelées monocytes dans les réponses immunitaires anti-tumorales. Ces avancées seront communiquées à la communauté scientifique dès la fin du projet. A plus long terme, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles applications thérapeutiques chez l’homme, en particulier de nouvelles stratégies pour optimiser l'efficacité des traitements anti-tumoraux.

Procédures

Des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée à tous les animaux de ce projet (injection sur animaux vigiles1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inf à 10 sec). Puis les animaux vigiles recevront un traitement par gavage (durée du geste inf à 10 sec) en préalable à l’irradiation. Ensuite, les animaux seront anesthésiés et ces animaux recevront un traitement de radiothérapie conventionnelle (une dose pendant 3 jours consécutifs, 3 doses au total) ou un traitement de radiothérapie par mini-faisceaux (1 dose unique) (durée de l’anesthésie pour ces irradiations : 30 min).

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs sous-cutanées au niveau du flanc qui seront mesurées régulièrement. Le développement de ces tumeurs n’entrainera pas de douleur ni de gêne pour l’animal Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non irritants par voie intrapéritonéale (directement dans l’abdomen) (gêne de courte durée),celles liées au gavage oral (gêne de courte durée), et celles liées à une irradiation (possible diarrhée, perte de poids et dermite)

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation dans un modèle de culture in vitro, nous avons formulé l’hypothèse que notre cible d’intérêt pourrait stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. Cette hypothèse ne peut être testée que dans un modèle in vivo, dans un système physiologique représentant un organisme vivant intégré et autonome tel que la souris. Cette étape est indispensable à la compréhension du processus biologique et à l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’approche proposée dans ce projet. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.

Réduction

Le nombre de souris par condition est de 18 (6 par expérience, répétée 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, selon la différence que l’on souhaite mettre en évidence. Dans notre expérience préalable, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Dans certaines expériences, plusieurs organes seront prélevés post-mortem pour des analyses, ce qui optimise le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement par l'équipe pour l’état général (7j/7). La radiothérapie sera réalisée sous anesthésie générale et les éventuelles douleurs soulagées par des analgésiques. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte des points-limite les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 5 à 7 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.