Système immunitaire

Des souriceaux nouveau-nés, des souris juvéniles sevrées et des femelles gestantes sont commandés selon la demande d'utilisateurs académiques et industriels. 5 120 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, irradiées 218 secondes ou traitées chimiquement, puis greffées par injection de cellules souches humaines sous anesthésie. Environ 80 % passent le contrôle qualité et sont expédiées vivantes aux utilisateurs finaux qui poursuivront les expériences, les autres sont tuées dans les jours qui suivent puisqu'elles ne sont plus utilisables. Le porteur présente cette production de souris humanisées comme un "service" et la range dans la règle des 3R, au motif que ces animaux réduiraient le nombre d'individus utilisés plus tard.

Objectifs

Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules souches humaines capables de générer un système immunitaire humain. Le recours à ces souris humanisées permet de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine. Les objectifs du présent projet sont de générer une gamme de souris humanisées pour le système immunitaire afin de les distribuer à un large panel d’utilisateurs finaux (académiques et industriels) aussi bien dans une perspective de recherche fondamentale que d’évaluation préclinique industrielle dans des domaines tels que l’hématopoïèse, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccinologie, l’oncologie… Ce projet couvrira la génération de souris humanisées déjà validées en tant que "service" et également la génération de nouveaux modèles immunodéficients humanisés en tant que projet « nouveaux modèles en Recherche et Développement "R&D" ». Ceci permettra d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Bénéfices attendus

Le recours à ces souris humanisées devrait permettre de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine (souris humanisées pour des composants cellulaires et moléculaires du système hématolymphoïde).

Procédures

Procédure 1: Afin de rendre les souris permissives à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux immunodéficients seront soit injectés avec une molécule chimique (1 injection par jour pendant 2 jours d’une durée de 30 secondes), soit irradiés 1 seule fois pendant 218 secondes afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques puis, immédiatement traité avec un antibiotique pendant 2 semaines, dans le but de prévenir toute infection. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection intraveineuse de cellules souches humaines, et ce, après anesthésie générale gazeuse. Cette intervention dure 3 min pour la phase d’endormissement et 30 secondes pour la phase d’injection. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera suite à un unique prélèvement sanguin sur souris vigiles pour la partie « Service », ou suite à 9 prélèvements sanguins, toutes les 3 semaines sur une période de 23 semaines pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D". Le prélèvement sanguin dure 30 secondes par souris. Procédure 2: Afin de rendre les souriceaux permissifs à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux seront irradiés 1 seule fois (durée irradiation dépendante de la souche de la souris) afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection de cellules souches humaines dans le foie. Un prélèvement de phalange sera réalisé afin de permettre leur identification ainsi que leur génotypage. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera à l’aide de prélèvement sanguin à entre 9 et 12 semaines après l’humanisation.

Impact sur les animaux

Les effets néfastes du pré-conditionnement apparaissent sur environ 5% des animaux adultes humanisés et tardivement (6 mois après la greffe de cellules souches humaine). Ils se manifestent souvent par une perte de poids et une modification de l’apparence (extrémités blanches) et du comportement naturel de l’animal (animal sans énergie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour prévenir tout inconfort animal et prendre la décision appropriée selon notre grille d’évaluation de projet. Notre surveillance sera donc accentuée à 6 mois notamment pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D" » puisque les souris seront observées jusqu’à 32 semaines. De plus, du stress pourra être généré lors des prises de sang et du transport des animaux vers les utilisateurs finaux.

Devenir

Pour le Service : Tous les animaux humanisés validés par le ‘contrôle qualité’ soit environ 80% des animaux produits, présentant une proportion sanguine de leucocytes d’origine humaine >20% des leucocytes totaux sont expédiés aux utilisateurs finaux (utilisation continue chez l'utilisateur final). Les animaux ne satisfaisant pas le critère requis sont écartés de tout groupe expérimental ultérieur. Ces animaux sont mis à mort dans les jours suivants le contrôle qualité car ils ne pourront plus être utilisés dans d'autres protocoles expérimentaux. Pour les nouveaux modèles : A l’issue des 32 semaines, les animaux seront mis à mort pour caractérisation du système immunitaire reconstitué (=humain).

Remplacement

Ce projet vise à produire des souris humanisées comme modèle expérimental préclinique à destination d’utilisateurs finaux des secteurs académique et industriel. Un tel modèle correspond à une attente forte pour pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques transposables à l’Homme. En proposant comme modèle la souris humanisée pour le système immunitaire, nous offrons la possibilité d’utiliser un modèle expérimental préclinique permettant le criblage d’approches thérapeutiques directement adaptées à la situation humaine. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine sans avoir recours aux modèles de primates non humains.

Réduction

Nous réalisons le projet d’humanisation en fonction des besoins exprimés ou pressentis de nos partenaires utilisateurs finaux. De plus, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux pour un rendement maximum. En exprimant le système immunitaire humain, la souris humanisée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ses applications ultérieures. Grâce au contrôle qualité systématique sur chaque souris implantée et au retour d’expérience qui en découle, nous optimisons sans cesse notre modèle de souris humanisée pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris humanisée souhaité. De plus, la génération de nouvelles lignées humanisées permettra de se rapprocher au plus près du système immunitaire humain et d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera également à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Nous veillerons au bienêtre animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet, l’ajout de coton…

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. De plus, les conditions zootechniques actuelle et le niveau d’ingénierie génétique des souris de laboratoire sont tels qu’il est possible de construire à façon, des lignées profondément immunodéficientes, une condition sine qua non pour une prise efficace et durable de xénogreffe hématopoïétique humaine. L’âge des animaux au moment de leur inclusion dans le présent projet dépendra de la demande et de l’objectif scientifique de l’utilisateur final. Le projet pourra donc utiliser aussi bien des souriceaux nouveaux nés que des souris juvéniles après sevrage (4 à 5 semaines). Les doses, volumes et voies d’administration seront adaptés au stade de développement des animaux utilisés. Dans le cas de la procédure 1 nous pourrons : recevoir directement des souris sevrées avant envoie (juvénile) ; ou recevoir des femelles gestantes et réaliser la procédure sur les nouveau-nés une fois l’âge de 4 à 5 semaines atteint.

144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un composé chimique ajouté à leur eau de boisson déclenche une inflammation intestinale, en trois cycles de cinq jours à concentrations croissantes, entrecoupés de quatre jours d'eau avec ou sans antibiotiques. Le porteur indique que cette inflammation peut provoquer des diarrhées et une perte d'environ 25 % du poids initial, poids retrouvé deux à sept jours après la fin du traitement. Les souris sont hébergées sur un site et transportées vers un second uniquement pour y être mises à mort, leurs organes étant ensuite analysés par histologie et par cytométrie en flux.

Objectifs

Les bactéries du système digestif (microbiote intestinal) assurent des fonctions essentielles telles que la digestion et la protection contre les agents pathogènes, mais peuvent aussi exacerber l’inflammation intestinale chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique. Le système immunitaire, et notamment des globules blancs : les lymphocytes T, jouent un rôle central dans la surveillance du microbiote intestinal et dans la réduction de l’inflammation du colon. Décrypter les interactions entre les lymphocytes T et le microbiote, chez les sujets sains ouen cas d’inflammation intestinale chronique, est donc essentiel pour comprendre les nombreuses pathologies associées au microbiote. Les fonctions des lymphocytes T reposent sur leur capacité à reconnaitre des molécules microbiennes appelées antigènes. L’un de ces antigènes est produit par certaines bactéries du microbiote. Les lymphocytes reconnaissant cet antigène microbien sont activés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, ainsi que dans les modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Nous souhaitons maintenant déterminer le rôle des bactéries dans l'activation et dans la fonction protectrice des lymphocytes T au cours de l’inflammation du colon. L'étude permettra de mieux comprendre le mécanisme de protection des lymphocytes T au cours de cette inflammation. Le modèle de souris nécessite des conditions d’élevages particulières qui sont disponibles dans le laboratoire 1. L’euthanasie et les prélèvements d’organes seront réalisés dans le laboratoire 2.

Bénéfices attendus

Ce projet améliorera notre compréhension d’une nouvelle interaction entre le système immunitaire et les bactéries du système digestif. Cette interaction est impliquée dans l’inflammation intestinale et le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris recevront dans l’eau de boisson un composé chimique qui génère une inflammation intestinale pendant 3 cycles de 5 jours à des concentrations progressives. Chaque cycle est suivi de 4 jours d’eau avec ou sans traitement d’antibiotiques. Le projet est réalisé sur le site n°1 sauf l’acte de mise à mort qui est réalisé sur le site n°2.

Impact sur les animaux

L’inflammation intestinale est induite par administration d’un composé chimique dans l’eau de boisson et est associé à des effets indésirables attendus. Elle peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids d’environ 25% du poids initial. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour le reste du projet, les antibiotiques utilisés n’ont jamais montré d’effet indésirable lorsqu’ils sont utilisés pour éradiquer les bactéries. De plus, la bactérie utilisée pour le projet est une bactérie naturellement présente dans le système digestif. Le transport peut engendrer un stress supplémentaire.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par histologie ou cytométrie en flux.

Remplacement

Nous avons analysé in vitro la capacité de différentes cellules humaines et murines de différents tissus à capturer l’antigène microbien qui nous intéresse et à le présenter aux lymphocytes T spécifiques. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces cellules dans un organisme entier. Le rôle (bénéfique ou délétère) de l’interaction hôte-microbiote ne peut pas être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal est donc nécessaire à ce stade.

Réduction

Nous utiliserons des modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Les modèles ont déjà été mis en place, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.

Raffinement

Il y aura une observation quotidienne des animaux, une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (changes de cages etc…) et une observation accrue durant l’inflammation intestinale induite, susceptible d’entrainer de la douleur, de la souffrance ou du stress, et cela plusieurs fois dans la journée pour s’assurer qu’il n’y a pas d’effet délétère. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale et un gel hydratant sera placé dans la cage. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptés aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale. Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des procédures afin de les habituer aux manipulateurs. Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identique (3 par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. La litière sera constituée de copeaux stérilisés par irradiation. Les souris recevront ad libitum un aliment standard stérilisé par irradiation et de l’eau autoclavée. Pour le transport, les animaux seront transférés en cage de transport selon leur répartition d’origine afin de ne pas induire un stress supplémentaire dû à l’isolement ou à la cohabitation avec des nouveaux congénères. Les animaux seront transportés dans une boite de transport stérile à laquelle sera rajoutée de la litière, de l’enrichissement et de la nourriture provenant de leur cage d’hébergement. Le transport se fera dans un véhicule agréé et climatisé.

Choix des espèces

La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes T ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature.

Le flanc rasé sous anesthésie gazeuse, 176 souris reçoivent une injection de cellules tumorales de pancréas sous la peau, puis deux ou trois injections d'anticorps dans l'abdomen. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue, tumeurs, rates et ganglions prélevés. Il s'agit de tester l'inhibition de trois composants d'une voie moléculaire soupçonnée de faire progresser le cancer du pancréas et de le rendre résistant aux immunothérapies. Ni la voie, ni les protéines, ni les anticorps ne sont nommés, et le nombre de souris par groupe est dit défini "à minima" sans qu'aucun chiffre ni calcul n'apparaisse.

Objectifs

Le cancer du pancréas touche près de 500.000 personnes chaque année, et est la 4e cause de décès par cancer dans le monde. Malgré la révolution apportée par les immunothérapies dans certains types de tumeurs, les cancers de ces patients sont généralement résistants à ces traitements. Afin de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques, il apparaît indispensable de comprendre les mécanismes moléculaires supportant la progression de ces cancers. Nos données préliminaires, ainsi que les connaissances dans d’autres types de cancers, suggèrent qu’une voie particulière pourrait jouer un rôle crucial dans la progression du cancer du pancréas et la résistance aux immunothérapies. Nous souhaitons donc investiguer l’effet de l’inhibition de trois composants de cette voie dans la progression de ces cancers, dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier un nouveau mécanisme moléculaire permettant la progression du cancer du pancréas, et l’échappement au système immunitaire, constituant de fait une cible thérapeutique potentielle.

Procédures

- Rasage du flanc des souris sous anesthésie gazeuse (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – injections intrapéritonéales d’anticorps (2 ou 3x 5 secondes/souris).

Impact sur les animaux

Les volumes tumoraux et le poids sont évalués trois fois par semaine et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. Possible douleur légère ou gène autour de la tumeur. L’administration d’un des médicaments, peut induire une perte temporaire de poids légère, qui est restaurée rapidement après l’arrêt du traitement.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction de la voie d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro qui suggèrent que la voie d’intérêt est impliquée dans la prolifération des cellules de cancer du pancréas, mais aussi dans leur expression de certaines molécules impactant la réponse immunitaire. Cependant, la pertinence préclinique de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour valider la fonction de ces protéines. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation chez la souris est justifié par l’utilisation d’un modèle de cancer du pancréas, le plus utilisé dans la littérature car reflétant la pathologie humaine de façon fidèle, notamment concernant le rôle des cellules immunitaires. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever tumeurs, rates et ganglions lymphatiques. Sous anesthésie gazeuse, elles reçoivent des cellules de mélanome sous la peau du flanc puis des lymphocytes en intraveineuse, et sont transportées pour une irradiation de dix minutes qui peut leur faire perdre du poids et affaiblir un temps leurs défenses immunitaires. La tumeur est mesurée trois fois par semaine, l'objectif étant de voir si des lymphocytes modifiés pour surexprimer un facteur cellulaire deviennent efficaces contre les tumeurs solides, là où les thérapies par transfert de lymphocytes échouent aujourd'hui. Le porteur écrit que les interactions entre cellules immunitaires et microenvironnement "ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables", après avoir mené in vitro les expériences qui ont suggéré l'intérêt de ce facteur.

Objectifs

Les traitements d’immunothérapie ont révolutionné la prise en charge de certains cancers. Néanmoins, les thérapies par transfert de lymphocytes, qui sont très efficaces dans les cancers du sang, ne permettent aujourd’hui pas d’obtenir un bénéfice clinique chez les patients atteints de tumeurs solides telles que le mélanome. Un nouveau facteur cellulaire a été décrite comme importante pour la fonction des lymphocytes dans le mélanome. Nous souhaitons donc évaluer l’effet d’une augmentation génétique de l’expression du facteur d’intérêt dans deux types de thérapies par transfert de lymphocytes, dans le cadre du mélanome chez la souris.

Bénéfices attendus

A ce jour, les thérapies cellulaires par transfert de lymphocytes ne sont que très peu efficaces chez les patients atteints de tumeurs solides. Nos travaux pourraient permettre soutenir le développement d’une nouvelle génération d’immunothérapies par transfert de lymphocytes sur-exprimant le facteur d’intérêt.

Procédures

Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, de lymphocytes (1x 2 minutes/souris) – Transport sur le même site et irradiation à faible dose (10 minutes/souris).

Impact sur les animaux

Les volumes tumoraux et le poids sont évalués trois fois par semaine et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection. Possible douleur légère ou gène autour de la tumeur. L’irradiation peut entraîner une perte de poids temporaire et une immunodéficience partielle temporaire.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction de la molécule d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro qui suggèrent que l’augmentation de l’expression du facteur d’intérêt dans les lymphocytes, améliore leur potentiel thérapeutique. Cependant, le développement pré-clinique de cette thérapie de nouvelle génération nécessitera une série d'expériences in vivo pour confirmer son effet bénéfique. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris, via notamment l’anesthésie gazeuse et un anesthésique local. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles de mélanomes , de souris transgéniques, et de protocoles bien établis dans la littérature, nous permettant de mesurer le rôle de la molécule d’intérêt dans l’efficacité des immunothérapies.. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

Élevées dans un premier établissement pour ses conditions d'hébergement particulières, puis transportées vers un second uniquement pour y être tuées, 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un composé chimique dans l'eau de boisson déclenche une inflammation intestinale, par trois cycles de cinq jours à concentrations croissantes, entrecoupés de quatre jours d'eau avec ou sans antibiotiques. Le porteur indique que les diarrhées provoquées font perdre environ 25 % du poids initial et que ce poids est retrouvé deux à sept jours après la fin du traitement. Sur le remplacement, il écrit avoir déjà testé in vitro la présentation de l'antigène microbien aux lymphocytes T, et conclut que le rôle de l'interaction entre l'hôte et son microbiote ne peut être établi hors d'un "organisme entier".

Objectifs

Les bactéries du système digestif (microbiote intestinal) assurent des fonctions essentielles telles que la digestion et la protection contre les agents pathogènes, mais peuvent aussi exacerber l’inflammation intestinale chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique. Le système immunitaire, et notamment des globules blancs : les lymphocytes T, jouent un rôle central dans la surveillance du microbiote intestinal et dans la réduction de l’inflammation du colon. Décrypter les interactions entre les lymphocytes T et le microbiote, chez les sujets sains ouen cas d’inflammation intestinale chronique, est donc essentiel pour comprendre les nombreuses pathologies associées au microbiote. Les fonctions des lymphocytes T reposent sur leur capacité à reconnaitre des molécules microbiennes appelées antigènes. L’un de ces antigènes est produit par certaines bactéries du microbiote. Les lymphocytes reconnaissant cet antigène microbien sont activés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, ainsi que dans les modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Nous souhaitons maintenant déterminer le rôle des bactéries dans l'activation et dans la fonction protectrice des lymphocytes T au cours de l’inflammation du colon. L'étude permettra de mieux comprendre le mécanisme de protection des lymphocytes T au cours de cette inflammation. Le modèle de souris nécessite des conditions d’élevages particulières qui sont disponibles dans le laboratoire 1. L’euthanasie et les prélèvements d’organes seront réalisés dans le laboratoire 2.

Bénéfices attendus

Ce projet améliorera notre compréhension d’une nouvelle interaction entre le système immunitaire et les bactéries du système digestif. Cette interaction est impliquée dans l’inflammation intestinale et le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris recevront dans l’eau de boisson un composé chimique qui génère une inflammation intestinale pendant 3 cycles de 5 jours à des concentrations progressives. Chaque cycle est suivi de 4 jours d’eau avec ou sans traitement d’antibiotiques. Le projet est réalisé sur le site n°1 sauf l’acte de mise à mort qui est réalisé sur le site n°2.

Impact sur les animaux

L’inflammation intestinale est induite par administration d’un composé chimique dans l’eau de boisson et est associé à des effets indésirables attendus. Elle peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids d’environ 25% du poids initial. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour le reste du projet, les antibiotiques utilisés n’ont jamais montré d’effet indésirable lorsqu’ils sont utilisés pour éradiquer les bactéries. De plus, la bactérie utilisée pour le projet est une bactérie naturellement présente dans le système digestif. Le transport peut engendrer un stress supplémentaire.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par histologie ou cytométrie en flux.

Remplacement

Nous avons analysé in vitro la capacité de différentes cellules humaines et murines de différents tissus à capturer l’antigène microbien qui nous intéresse et à le présenter aux lymphocytes T spécifiques. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces cellules dans un organisme entier. Le rôle (bénéfique ou délétère) de l’interaction hôte-microbiote ne peut pas être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal est donc nécessaire à ce stade.

Réduction

Nous utiliserons des modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Les modèles ont déjà été mis en place, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.

Raffinement

Il y aura une observation quotidienne des animaux, une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (changes de cages etc…) et une observation accrue durant l’inflammation intestinale induite, susceptible d’entrainer de la douleur, de la souffrance ou du stress, et cela plusieurs fois dans la journée pour s’assurer qu’il n’y a pas d’effet délétère. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale et un gel hydratant sera placé dans la cage. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptés aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale. Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des procédures afin de les habituer aux manipulateurs. Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identique (3 par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. La litière sera constituée de copeaux stérilisés par irradiation. Les souris recevront ad libitum un aliment standard stérilisé par irradiation et de l’eau autoclavée. Pour le transport, les animaux seront transférés en cage de transport selon leur répartition d’origine afin de ne pas induire un stress supplémentaire dû à l’isolement ou à la cohabitation avec des nouveaux congénères. Les animaux seront transportés dans une boite de transport stérile à laquelle sera rajoutée de la litière, de l’enrichissement et de la nourriture provenant de leur cage d’hébergement. Le transport se fera dans un véhicule agréé et climatisé.

Choix des espèces

La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes T ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature.

1 712 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune portant une tumeur greffée dont le volume est mesuré trois fois par semaine pendant soixante jours. Douze jours après la greffe, elles reçoivent une séance de radiothérapie d'environ quinze minutes, avec fatigue générale et irritation cutanée à la clé. Le porteur indique que la tumeur sous-cutanée peut provoquer une perte de poids, une plaie nécrosante, des douleurs et la mort, et que les souris non guéries seront tuées quand ces effets deviendront importants. Il écrit aussi que les anti-inflammatoires ne pourront pas être utilisés, la réponse immunitaire étudiée y étant trop sensible, et s'en remet à une grille de six items relevée trois fois par semaine.

Objectifs

Les traitements anti-cancéreux ont fait des progrès réguliers depuis des décennies. Pourtant, une grande partie des patients meurent encore de cette maladie. Depuis quelques années, une nouvelle sorte de traitement a montré une efficacité remarquable : l’immunothérapie. Ce traitement favorise une réponse anti-cancéreuse naturelle : la réponse immunitaire. Ces résultats ont conduit les chercheurs à ré-analyser d’anciens traitements, ce qui a permis de montrer que la radiothérapie, un traitement dont bénéficie plus de la moitié des patients, stimule aussi la réponse immunitaire. Malheureusement, on connait encore trop mal cet aspect de la radiothérapie pour pouvoir l’utiliser efficacement. Notre laboratoire a trouvé des conditions qui améliorent la réponse immunitaire induite par une radiothérapie. Nous avons identifié en partie les raisons de cette amélioration. Malheureusement, nous ne comprenons pas totalement les mécanismes mis en jeu. Ce projet vise à identifier et comprendre ces mécanismes, avec un double objectif. D’une part, la possibilité d’une application chez l’humain nécessite une excellente compréhension des effets d’un éventuel traitement. D’autre part, l’amélioration que nous obtenons n’est que partielle. La compréhension de ses mécanismes précis permettra d’améliorer encore l’efficacité de la radiothérapie en optimisant les conditions de traitement. Enfin, il est clair que notre objectif final est de développer un médicament utilisable chez l’humain. C’est pourquoi ce projet prévoit de mettre en place une stratégie thérapeutique faisant appel uniquement à des technologies utilisables chez les patients.

Bénéfices attendus

Les médecins fondent des espoirs importants sur l’utilisation d’une réponse anticancéreuse naturelle, la réponse immunitaire, pour soigner les patients. Ces espoirs sont le fruit de la découverte d’un type de médicaments nouveaux, montrant une grande efficacité : les immunothérapies. Les chercheurs essayent maintenant de trouver les conditions dans lesquelles cette réponse anticancéreuse naturelle peut être stimulée par des traitements classiques comme la chimiothérapie et la radiothérapie. Notre projet s’inscrit dans cette démarche, puisqu’il repose sur nos travaux qui ont identifié une méthode permettant d’améliorer la réponse immunitaire induite par la radiothérapie. Le premier bénéfice attendu est d’ordre fondamental : étudier comment on peut modifier la réponse immunitaire anticancéreuse par la radiothérapie permet de comprendre comme elle fonctionne. Or il s’agit d’un mécanisme extrêmement fin, mettant en jeu plusieurs types de cellules et de molécules. Le deuxième bénéfice attendu est orienté vers l’amélioration du traitement des patients. C’est en comprenant comment on a pu améliorer la radiothérapie qu’on pourra l’améliorer encore mieux. Enfin le troisième bénéfice est directement médical. Si nous parvenons à reproduire notre traitement en utilisant uniquement des technologies utilisables chez les patients, nous pourrons proposer aux cliniciens de traiter leurs patients avec ces technologies, dans des essais cliniques contôlés.

Procédures

Afin d’étudier la radiothérapie, nous utiliserons des modèles animaux dans lesquels ceux-ci seront d’abord greffés avec des cellules tumorales par injection (environ 2 minutes par animal) puis traités par radiothérapie 12 jours après. Nous utilisons un système d’irradiation préclinique spécialement conçu pour les petits animaux, dans lequel l’ensemble de la procédure prend environ 15 minutes. Nous pourrons alors suivre l’efficacité du traitement en mesurant le volume tumoral au cours du temps. Ces mesures seront réalisées 3 fois par semaine pendant une durée n’excédant pas 60 jours. Par ailleurs, dans certaines expériences, les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever les tumeurs 1 à 3 jours après radiothérapie, afin d’en étudier la composition, et notamment leur infiltration par des cellules du système immunitaire. D’autres tissus (sang, rate, ganglions lymphatiques drainants) pourront alors être prélevés en même temps.

Impact sur les animaux

La présence d’une tumeur peut induire chez l’animal qui la porte une série de conséquences indésirables. Dans le cas d’une tumeur sous-cutanée, les animaux peuvent subir une perte de poids, une plaie nécrosante, des douleurs, un stress, et finalement la mort. Pour une tumeur greffée dans un organe particulier, les conséquences peuvent comporter un dysfonctionnement de cet organe, induisant des pathologies dépendant de l’organe ciblé.. Enfin, la radiothérapie induit un certain nombre d’effets secondaires connus, comme une fatigue générale, ou une irritation de la peau au site d’irradiation. Les prélèvements et injections au sinus rétro-orbital provoquent un stress temporaire, et peuvent causer une irritation ou une infection oculaire.

Devenir

Dans les expériences de suivi de croissance tumorale, les animaux non-guéris devront être mis à mort lorsque la tumeur provoquera des effets délétères importants, définis à l’avance. L’ensemble des animaux sera mis à mort au bout de 60 jours. Dans certaines expériences, l’analyse de la réponse immunitaire nécessitera de déterminer les cellules immunitaires présentes dans la tumeur, et dans différents organes, ce qui ne pourra se faire qu’après avoir mis à mort les animaux.

Remplacement

Nous avons développé un système expérimental in vitro qui nous permet d’étudier le mécanisme moléculaire du contrôle de l’expression de l’interféron béta dans les cellules myéloïdes par la protéine TRIM33. Toutefois, la réponse immunitaire est un processus complexe, pluricellulaire et intégré, que l’on ne sait pas reproduire correctement in vitro. Son activation par la radiothérapie ne peut donc pas être étudiée in vitro.

Réduction

Afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux requis pour les expériences, nous avons utilisé un logiciel qui permet de calculer la taille minimale des groupes permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif pour les effets attendus dans les conditions expérimentales que nous utilisons. Les expériences seront analysées au fur et à mesure, et la mise en évidence d’un effet supérieur à l’effet attendu permettra de réduire la taille des lots.

Raffinement

Toutes les manipulations seront réalisées après anesthésie, afin de réduire le stress et/ou la souffrance liés à la manipulation. D’autre part, le fait de travailler sur des femelles nous permettra le cas échéant de regrouper les animaux afin de les maintenir dans des conditions de sociabilité satisfaisantes. Dans la mesure où nous travaillons sur la réponse immunitaire, qui est très sensible aux agents anti-inflammatoires, leur utilisation ne sera malheureusement pas possible. Nous avons défini une grille de score comportant 6 items qui seront analysés sur chaque animal trois fois par semaine, et un algorithme permettant de décider la poursuite ou non de l’expérience pour l’animal considéré.

Choix des espèces

Les questions que nous posons requièrent la possibilité d’étudier la réponse immunitaire dans un modèle préclinique de radiothérapie. Nous ne pouvons donc pas nous affranchir d’un modèle expérimental animal. Nous avons choisi la souris d’élevage, car elle donne la possibilité d’accéder à de nombreux outils expérimentaux qui permettront une plus grande efficacité dans les approches expérimentales, et donc une moindre utilisation des animaux. D’autre part, le développement d’un système immunitaire mature nécessitera d’attendre que les souris aient atteint l’âge adulte.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour produire la version humaine d'une molécule de l'inflammation, elles reçoivent une puce sous-cutanée, un prélèvement au bout de la queue, une injection déclenchant soit une inflammation cérébrale soit une inflammation systémique avec insuffisance cardiaque et lésions multi-organes, puis un cathéter et une séance d'imagerie. Le porteur indique qu'elles peuvent cesser de manger et de boire, maigrir et rester prostrées, et précise qu'elles ne seront pas gardées au-delà des 24 heures que durent les modèles. Sur le remplacement, il affirme qu'il faut mesurer l'affinité de l'agent de contraste à l'échelle d'un "organisme entier" et conclut au "caractère de stricte nécessité" des procédures.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de valider une nouvelle technique d'imagerie ciblée sur une souris génétiquement modifiée qui exprime la version "humaine" de la cible d'intérêt. En effet, au sein de notre équipe de recherche, nous développons un nouvel agent de contraste, une substance qui augmente artificiellement le contraste d'une imagerie médicale. Cet agent de contraste est conçu pour se fixer sur des molécules qui apparaissent spécialement pendant l'inflammation. Nous avons développé une version de cet agent de contraste qui pourrait potentiellement être utilisable chez l'Homme, notamment pour évaluer l'inflammation cérébrale (dans le cadre du diagnostic de l'AVC par exemple) ou encore dans le cadre de l'inflammation cardiaque (infarctus du myocarde ou atteinte cardiaque inflammatoire). Cet agent de contraste a la particularité d'être "ciblé" c'est-à-dire qu'il reconnaît une molécule exprimée lors de l'inflammation. Le but de ce projet est de tester si cet agent de contraste est efficace pour imager l'inflammation cardiaque ou cérébrale chez des souris modifiées génétiquement pour exprimer (c'est-à-dire "produire") la version humaine de cette molécule cible.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation cérébrale et cardiaque chez des souris non génétiquement modifiées et qui expriment donc la version murine de la molécule cible. Il est donc attendu que l'agent de contraste cible tout aussi bien la version humaine de la molécule exprimée par les souris modifiées génétiquement. Si les résultats de cette étude sont pertinents, cela permettrait d'ajouter des preuves solides au fait que l'agent de contraste développé ici pourrait être un jour utilisé en clinique chez l'Homme pour mieux diagnostiquer, évaluer et prendre en charge les pathologies inflammatoires cérébrales et cardiaques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o 1 prélèvement d'ADN pour confirmation du génotype (prélèvement d'un bout de queue) et insertion d'une puce en sous-cutanée (durée: 5min) o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 20min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o 1 pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o 1 imagerie avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).

Impact sur les animaux

L'étape de génotypage par puçage et prélèvement d'ADN peut induire un inconfort chez l'animal, tels que la douleur au niveau du site d'insertion de la puce sous-cutanée et des saignements, surtout au bout de la queue prélevée. Les deux modèles d'inflammation utilisées chez la souche de souris transgéniques peuvent produire des effets indésirables chez les animaux. Dans le premier modèle, une inflammation cérébrale créée pourra mener à des altérations de la signalisation neuronale et donc des problèmes cognitifs et comportementaux. Les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur de courte durée au niveau des points sutures et du site d’injection. Le deuxième modèle induit une inflammation systémique avec insuffisance cardiaque et des lésions multi-organes. Les animaux pourraient ressentir un inconfort physique et une souffrance de courte durée. Cette situation de mal-être et de stress pourra alors être repérée par une malnutrition liée à un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids, de la prostration et une inactivité dans la cage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux (cerveau, coeur, foie, rate), permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem (biodistribution, caractérisations immunohistologiques). De plus, les caractérisations histologiques sont très souvent demandées pour justifier les résultats obtenus lorsqu'une nouvelle technique d'imagerie pré-clinique est étudiée.

Remplacement

Des tests de ciblage in vitro ont été réalisés pour évaluer l'affinité de l'agent de contraste ciblant la molécule d'intérêt sur des cultures de cellules endothéliales humaines mises en conditions inflammatoires. Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour la molécule humaine exprimée à l'échelle d'un organisme entier sans pouvoir pour autant tester chez l'Homme de suite. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets ayant utilisé les mêmes modèles animaux et les mêmes types d'agents de contraste. Dans ces deux études précédentes, différents groupes de souris avec des doses variables du produit induisant l’inflammation avaient été mis en place et il semble nécessaire de reprendre ces mêmes groupes afin de comparer rigoureusement l'efficacité de ciblage des agents de contraste entre les molécules d'intérêt murine (résultats des études précédentes) et humaine (nouveaux résultats attendus). De plus, il est nécessaire qu'un groupe contrôle soit mis en place avec des souris recevant des agents de contraste dits « contrôle » (non ciblés) pour mettre en évidence la spécificité de détection chez les souris transgéniques. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a en plus été confirmé par un calcul de taille d'échantillons.

Raffinement

Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des souris est prévu. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Avant toute mise en place des modèles, un génotypage des animaux sera réalisé par puçage et prélèvement d'ADN. Cela se fera sous anesthésie générale à l'isoflurane et au protoxyde d'azote. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une coupelle de croquettes humides aura été préalablement placée dans la cage afin de permettre aux animaux malades de s'alimenter et de s'hydrater plus facilement. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite 15 minutes après les injections du produit induisant l'inflammation, puis 1 heure après et 2 fois par jour jusqu’à la mise à mort des animaux. De plus, la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir les temps d'étude par une analgésie. Enfin, les animaux ne seront pas gardés pour des études sur le long terme pour ne pas les laisser en souffrance au-delà des 24 heures que durent les modèles.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies de type inflammatoire. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 8 semaines, en rapport avec l’âge des animaux utilisés dans les études pilotes.

Un agent cancérigène dans l'eau de boisson pendant seize semaines, ou une injection de cellules cancéreuses dans la bouche suivie d'une tumeur buccale qui gêne l'alimentation. 1 500 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tumeurs et des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet déclaré est de comprendre comment un composant de la matrice extracellulaire bloque les cellules immunitaires autour des cancers de la tête et du cou. Les atteintes décrites se limitent à l'anxiété et à la douleur transitoire des injections buccales, sans que soit précisé ce que quatre mois d'ingestion d'un cancérigène font subir aux 419 souris du modèle chimique.

Objectifs

Les cancers de la tête et du cou (ORL) représentent la 6ème cause de cancer humain avec une espérance de vie à 5 ans de 50%. On distingue ceux liés à une infection virale préalable et ceux provoqués par une exposition aux agents cancérigènes (tabac/alcool). La défense immunitaire permet de lutter contre le développement du cancer. Comprendre l’impact de l’environnement immédiat de ces cancers sur la défaillance immunitaire est donc cruciale. La Matrice Extra Cellulaire (MEC) structurant les tissus cancéreux a une constitution et une organisation spécifique qui favorise la progression cancéreuse. Nous avons identifié qu’un composant de la MEC des cancers ORL impacte la position des cellules immunitaires et la sévérité du cancer humain et d’un cancer ORL murin. Lorsque ce même modèle de cancer ORL se développe chez des souris qui n’expriment ce composant structurant, le cancer est moins grave et les cellules immunitaires ne sont pas séquestrées dans l’environnement de la tumeur. Notre objectif est de comprendre la nature des relations de contact entre les cellules immunitaires et ce composant au cours du développement du cancer et de déterminer quand et comment ce composant modifie les performances immunitaires. Ceci permettra d’améliorer nos connaissances sur les relations de proximité au sein des cancers ORL et sera important pour la recherche préclinique en identifiant de nouveaux traitements pour stimuler la défense immunitaire. Sur cinq ans, nous développerons trois modèles de cancers mimant les cancers ORL humains chez la souris normale, sans ce composant structurant ou sans un type immunitaire pour dévoiler les relations entre la défense immunitaire et notre composant structurant au cours de la croissance tumorale: Le premier modèle consiste en l’administration pendant 16 semaines d’un dérivé de la nicotine dans la boisson des souris pour mimer le cancer lié au tabac. Les tumeurs collectées en fin de procédure permettront d’identifier les défaillances de la défense immunitaire à différents stades du cancer; Deux modèles de greffe tumorale buccale par injection de cellules cancéreuses indépendantes d’une infection virale ou dépendante d’une infection virale. Ils permettront de comparer les mécanismes de défense immunitaire dans les cancers dépendant ou non d’une infection virale et leur défaillance. Ces modèles courts seront utiles pour déterminer le rôle de cellules particulières de la défense immunitaire et pour l’évaluation de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’identifier les relations microscopiques entre la défense immunitaire et un composant structurant et les conséquences de ces interactions sur la nature, la fonction des cellules immunitaires, la croissance cancéreuse et la structure du tissu malade. A terme, ces travaux permettront d’identifier des pistes nouvelles de stimulation du système immunitaire dans les cancers ORL afin de stimuler la défense immunitaire. Les modèles murins de développement de cancer ORL que nous proposons de développer et caractériser représente un outil indispensable pour déterminer les relations complexes et temporelles en place au sein des tumeurs. Ces études chez la souris poseront les bases d'une étude translationnelle chez l'Homme. Les résultats de cette étude serviront aussi au developpement de modèles in vitro pertinents.

Procédures

1 Modèle chimique: Administration d'un agent cancérigène dans l'eau de boisson pendant 16 semaines n'ayant pas d'impact direct sur l’alimentation (16 semaines par souris, 419 souris maximum). 2 Modèles de greffe buccale: 1 injection de cellules cancéreuses dans la bouche et une injection dans l'abdomen pour l'anesthésie pour contrôler la douleur et l’anxiété due à l'injection des cellules cancéreuses dans la bouche (2 injections totales par souris, 780 souris maximum). Elimination d'une population de la défense immunitaire pour évaluer son rôle dans la croissance cancéreuse par injection dans l'abdomen d'une drogue: 8 injections dans l'abdomen par souris (modèle chimique) sur 80 souris maximum et 2 injections dans l'abdomen par souris (modèles de greffe tumorale) sur 160 souris maximum.

Impact sur les animaux

les injections de cellules cancéreuses dans la bouche peuvent générer de l'anxiété et une douleur transitoire correspondant à une nuisance modérée. Lla croissance des tumeurs buccales peut avoir un impact sur l'alimentation correspondant à une nuisance modérée

Devenir

TOUS mis à mort en fin d'expérimentation afin de réaliser des gestes post-mortem (prélèvementsde tumeurs et d'organes pour analyses biologiques)

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre les relations complexes des cellules immunitaires avec l'environnement immédiat du cancer. Ce type d'étude est difficilement envisageable chez l'Homme car les prélèvements de cancer accessibles pour la recherche sont de très petites tailles et la rareté de nos cellules nous oblige à travailler sur du matériel biologique suffisamment important. Par ailleurs, nous ne pouvons pas étudier l’effet de traitements innovants visant soit à éliminer ou bloquer l’infiltration des tumeurs par certaines cellules dans des modèles in vitro. Or ce type d'analyse est un pré-requis pour pouvoir valider de nouvelles cibles d'immunothérapie chez l'homme. Ces travaux permettront également de mieux comprendre les relations complexes responsables de la croissance cancéreuse, ce qui permettra dans le futur de développer des modèles alternatifs in vitro découlant de nos résultats par ingenierie du tissu.

Réduction

Nous avons déterminé les effectifs de nos groupes de manière à obtenir une forte validité statistique (avec puissance de 0.8) avec un minimum d’individus et notre projet a été conçu pour optimiser la quantité d’informations analysables. Le nombre total d'animaux requis est de 1500 pour l'ensemble et la durée totale du projet. Afin de réduire au mieux le nombre d’animaux, nous procéderons à une analyse séquentielle. Une première série d’expériences permettra de développer les modèles murins et de définir les conditions optimales d'expérimentation (n: 260 souris/an sur deux ans). Nous utiliserons ensuite trois modèles tumoraux optimisés dans des souris sans composant structurant et leur contrôle. Le schéma d'accouplement de ces souris a été optimisé pour obtenir 50% de souris avec et sans composant structurant par couplage et les males et les femelles seront utilisés pour réduire le nombre d'animaux inutiles (n: 150 souris par an pendant 4 ans). De plus, nous utiliserons également des souris males et femelles dans laquelle une population immunitaire est éliminée et leur contrôle dans les trois modèles tumoraux (n: 480 souris maximum). Nous réduirons ce nombre de 160 souris si nos résultats antérieurs démontrent que le modèle chimique et un modèle de greffe ont des caractéristiques similaires. Dans ce cas les expériences ne seront menées que sur deux des trois modèles tumoraux.

Raffinement

Afin d’améliorer les conditions d’hébergement réglementaires des animaux (porteurs ventilés, 5 animaux par cage, objets déplacés régulièrement pour stimuler la curiosité) dans le contexte de cette pathologie buccale, du gel nutritif est ajouté dans la cage afin de faciliter l’alimentation après les injections de cellules cancéreuses. Les injections de cellules cancéreuses sont réalisées sous anesthésie en présence d'un médicament anti-douleur afin de contrôler l'anxiété et la douleur liée à l'injection. Les signes de l'évolution du cancer, le suivi des animaux seront effectués conformément à une grille d’évaluation permettant de définir un niveau de douleur/souffrance à partir duquel les animaux concernés seront mis à mort. Plus particulièrement, il est à noter que les modèles cancéreux seront établis de façon à limiter la croissance tumorale a un volume de 20% en deça du point limite éthique afin d’éviter une souffrance liée à un problème nutritionnel et le suivi quotidien du comportement et une pesée bi-hebdomadaire des animaux permettra de détecter les signes précoces de souffrance. Enfin les souris dans lesquelles notre population immunitaire d'intérêt peut être éliminée par injection d'une drogue ont un phénotype attendu non dommageable mais le bien-être des souris (poids, posture et mobilité) sera documenté hebdomadairement dès le début de l'expérimentation afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Les modèles murins de tumeurs ORL que nous proposons de développer et d'utiliser permettront de caractériser un environnement complexe qui mime les tumeurs humaines. Ce type d’analyse détaillée est un pré-requis pour pouvoir identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et identifier de nouvelles approches d’immunothérapie chez l’homme. Les souris seront mises en expérimentation à un âge de 8 semaines, âge auquel le système immunitaire est mature.