Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Développement de nouvelles immunothérapies cellulaires pour le traitement des tumeurs solides
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées porte des modifications qui les font développer spontanément des tumeurs : mélanomes chez 25 à 60 % d'entre elles à partir de deux mois, tumeurs de l'ensemble des glandes mammaires après une latence moyenne de 92 jours. 4 372 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la quasi-totalité, 54 étant tuées sans réveil. Elles reçoivent quatre à six injections sous anesthésie, trois à six injections intrapéritonéales vigiles, des prélèvements de sang à la queue ou en rétro-mandibulaire, et une irradiation de 2 grays ou une injection de busulfan, avec nécrose, ulcération et saignements des tumeurs annoncés. L'élevage croise des femelles sauvages avec des mâles qui ne développent leurs tumeurs mammaires qu'après leur période de reproduction, ce que le porteur compte au titre du raffinement.
Objectifs
L’immunothérapie connaît un grand essor depuis ces dernières années et est de plus en plus utilisée pour traiter différents cancers. Cette thérapie consiste à réactiver le système immunitaire du patient afin qu’il puisse lui-même reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Malgré de nombreux succès cliniques, l’efficacité des immunothérapies est encore limitée à un sous-ensemble de patients répondeurs. Une des principales limites réside dans l’infiltration de la tumeur par les cellules immunitaires. En effet, un faible effet thérapeutique corrèle avec une tumeur dite « froide », c’est-à-dire peu infiltrée et pauvre en cellules immunitaires. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes permettant l’infiltration des cellules immunitaires au sein de ces tumeurs et de développer des stratégies pour manipuler ce processus afin de contourner la résistance thérapeutique aux points de contrôle immunitaire (ICB). Ce projet a pour but de développer de nouvelles thérapies capables de remodeler le microenvironnement tumoral afin de rendre répondante une tumeur qui ne l’est pas initialement. Utiliser ces nouvelles thérapies en combinaison avec les immunothérapies déjà existantes pourrait ainsi permettre de surmonter la résistance primaire observée chez de nombreux patients. Ce projet nécessite la modélisation du contexte immunitaire dans des modèles vivants. Au fur et à mesure de l’avancement du projet, des modèles pré-cliniques (tumeurs endogènes et souris humanisées) seront utilisés afin d’imiter au mieux les effets présents chez l’Homme. Ainsi les modèles précliniques permettent de sélectionner les stratégies immuno-thérapeutiques les plus efficaces à tester dans le cadre d'essais cliniques et par conséquent réduire les risques associés aux essais cliniques infructueux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif fondamental d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents à l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs solides. En parallèle, il cherche à développer des thérapies innovantes capables de réguler et de maîtriser ce processus complexe. En réalisant cette double démarche, nous espérons ouvrir de nouvelles perspectives dans le domaine de la lutte contre les tumeurs solides, en exploitant ces connaissances pour élaborer des approches thérapeutiques plus efficaces et ciblées. Ces traitements seront conçus pour surmonter la résistance initiale souvent observée vis-à-vis des immunothérapies. Ils agiront en transformant une tumeur qui, au départ, ne répondait pas favorablement envers ces traitements en une tumeur réceptive, permettant ainsi une meilleure efficacité des immunothérapies. Cette approche novatrice vise à contourner les obstacles initiaux et à ouvrir la voie à des réponses positives là où elles étaient auparavant limitées, potentiellement révolutionnant ainsi le traitement des tumeurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à ces types d’interventions : - 4 à 6 injections en intraveineuse/sous-cutanée/intra-tumoral, sur animaux anesthésiés. Cet acte ne dure que quelques secondes. - 3 à 6 injections en intra-péritonéal, sur animaux vigiles. Cet acte ne dure que quelques secondes. - 1 à 3 prélèvements sanguins au niveau de leur queue, sur animaux vigiles. Cet acte dure quelques minutes. - 1 à 3 prélèvements sanguins en rétro-mandibulaire, sur animaux anesthésiés. Cet acte dure quelques minutes. - 1 prélèvement sanguin en rétro-orbital ou rétro-mandibulaire, sur animaux anesthésiés. Cet acte dure quelques minutes et est sans réveil. - 1 injection intra-péritonéale de buprénorphine. Cet acte dure quelques secondes. - 1 à 3 injections intra-péritonéales d’un anesthésique. Cet acte dure quelques secondes. - 1 anesthésie locale par injection sous cutanée d'une solution d’anesthésique. Cet acte dure quelques secondes. - 1 irradiation (générateur X, dose 2 Gy) ou 1 injection de busulfan dilué en solution saline. Cet acte dure quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont particulièrement liés à la croissance tumorale. En effet, l’ensemble des traitements utilisés sur les animaux ont été déjà publiés dans la littérature comme étant bien tolérés par les animaux dans les lignées de souris que nous utilisons. Ainsi, hormis les nuisances sporadiques parfois observées sur les animaux saints, l’initiation des possibles nuisances se fera à partir du début des expériences et pourra donc être promptement suivie. Certaines souris sont viables et fertiles, mais 25 % à 60 % ou plus développeront spontanément des mélanomes avec un début à l'âge de 2 à 12 mois. L'application topique d’une molécule entraîne le développement de lésions cutanées pigmentées en 21 à 28 jours, qui évoluent en mélanomes. D’autres souris développant des tumeurs mammaires spontanément, les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et poursuivre les éventuels signes de souffrance ou de stress. Les souris femelles d’un certain génotype développent des tumeurs au niveau de toutes les glandes mammaires (m1 à m10) avec un temps de latence moyen de 92 jours. Les tumeurs apparaissent progressivement à partir de 15 semaines jusqu’à un point limite vers 25 semaines. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales en sous-cutanées (cancer du sein, mélanome) sont : nécrose, uclération et saignements de la tumeur, gène à la locomotion et baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie, perte de poids. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales du cancer du poumon sont : perte de poids, difficultés respiratoires, baisse de la tonicité dans les derniers stades de la maladie. Les nuisances liées aux injections des thérapies et aux prélèvements sont égales à la douleur causée par l’insertion d’une aiguille. Cet inconfort est léger et passager. Les traitements utilisés n’induisent pas de réaction adverse chez la souris. Une autre lignée (phénotype dommageable) sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection, dans une cage individuelle sur portoir ventilé, la litière sera autoclavée, l’eau et les aliments irradiés, le matériel en contact avec les animaux sera au préalable autoclavé ou décontaminé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront porteurs de tumeurs. De plus les animaux “contrôles”, non porteurs de tumeur, devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentent dans les organes et nous devons absolument mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.
Remplacement
Dès qu’il est possible de remplacer un modèle murin par une approche in vitro, comme la culture cellulaire ou la création d'organoïdes en 3D, nous opterons pour cette solution, comme nous l'avons déjà fait par le passé. Les diverses thérapies cellulaires seront systématiquement soumises à une validation in vitro avant toute autre étape. Cependant, il est important de noter que ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne permettent actuellement d'étudier de manière exhaustive l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs ainsi que les réponses immunitaires anti-tumorales qu'elles déclenchent. Par conséquent, le modèle murin demeure un élément incontournable de ce projet, puisqu'il est le seul à permettre l'étude approfondie de l'infiltration immunitaire au sein des tumeurs et des réponses anti-tumorales qu'elle engendre. L'utilisation de souris s'avère essentielle pour tester de nouvelles thérapies anti-cancéreuses qui réactivent le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des avancées significatives dans le domaine de la lutte contre le cancer.
Réduction
Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animaux. Les expériences de croissance de tumeurs seront effectuées avec 7 animaux en accord avec les calculs de puissance statistiques. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques ou l’analyse de la variance . En outre, nous utiliserons des animaux mâles et femelles pour réduire le nombre d’animaux respirant non impliqués dans des expérimentations dans les lignées de souris génétiquement modifiées.
Raffinement
Une lignée de souris étudiée développe des tumeurs mammaires très progressivement sur 5 mois. La stratégie d’élevage participe au raffinement du projet, elle repose sur le croisement de femelles sauvages avec des mâles hétérozygotes qui développent tardivement des tumeurs mammaires (donc sans phénotype dommageable pendant la période d’utilisation comme reproducteurs. Les expérimentations avec une lignée de souris seront réalisées avant que les tumeurs se développent spontanément (à partir de 2 à 12 mois). Dans ce cadre nous utiliserons les souris mâles et femelles pour l'expérimentation. Les animaux seront régulièrement surveillés, et en cas d'apparition inattendue de tumeurs, ils serviront à standardiser
Choix des espèces
La souris se révèle être le modèle privilégié pour les expérimentations dans le domaine de l'onco-immunologie et de la thérapeutique du cancer. Ceci est principalement dû à la connaissance approfondie du génome murin, ce qui permet de tirer parti de nombreux outils soigneusement caractérisés. Parmi ceux-ci figurent les souris génétiquement modifiées pour exprimer des protéines spécifiques d'intérêt, ainsi qu'une variété étendue de modèles de tumeurs transplantées. La souris présente des avantages pratiques significatifs. Elle est aisément manipulable, dispose d'une courte période de gestation et peut donner naissance à plusieurs individus par portée, ce qui crée des conditions d'élevage optimales pour les expériences. Grâce à sa grande similitude génétique avec l'Homme, il est envisageable de transférer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Cette corrélation renforce la pertinence des découvertes réalisées avec les souris, ouvrant la voie à des avancées cliniques prometteuses dans la lutte contre le cancer. Les animaux seront mis en expérimentation entre 8 et 14 semaines après leur naissance, car c’est l’âge à partir duquel ils auront atteint le stade « adulte » et que leur système immunitaire sera pleinement développé.
Caractérisation de l’orage cytokinique dans un modèle d’AVC préclinique murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Les souris suivies cinq jours qui perdent plus de 15 % de leur poids, ou dont le score de grimace dépasse 7 pendant les 48 heures critiques, sont mises à mort. 1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chacune subit une chirurgie provoquant un AVC dans l'artère cérébrale moyenne droite, reçoit une injection, passe une IRM pour une partie d'entre elles, et finit par une mise à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque. Le porteur classe lui-même comme sévères les douleurs postopératoires et les déficits fonctionnels ou cognitifs attendus, tout en affirmant que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement et n'émettent aucun son audible.
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer l'orage cytokinique se produisant à la suite d'un AVC. A la suite d’un AVC, le système inflammatoire s’active et produit différentes molécules. Cela perdure pendant plusieurs jours, voire semaine. L’inflammation se met en place au niveau de l’organisme entier et donc du cerveau. L’étude de la production de ces molécules inflammatoires n’a jamais été réalisée à ce jour. Il existe dès lors une nécessité d’évaluer, en pré-clinique, leur production dans le temps afin de mieux décrire l’inflammation au niveau cérébral et systémique. L’objectif étant de pouvoir découvrir potentiellement de nouveaux biomarqueurs de ce processus inflammatoires. Aujourd’hui l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est le seul traitement pharmacologique utilisé dans le cadre de l’AVC. Le tPA interagit avec un récepteur retrouvé dans de nombreux organes. Cette interaction module le système inflammatoire. De fait, le tPA en tant que traitement peut donc affecter le système inflammatoire et affecter la production des molécules inflammatoires. L’unité d’accueil travaillant particulièrement sur l’axe d’interaction entre le tPA et ce récepteur, celui-ci sera pris en compte pour voir de quelle manière il peut influencer l’orage cytokinique post-AVC.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour bénéfice principal la définition d'un ou plusieurs biomarqueurs de l'inflammation post-AVC. La finalité de ce projet serait d'utiliser ce/ces biomarqueur(s) en clinique pour une meilleure prise en charge des patients. De plus, l'identification de l'orage cytokinique permettra de mieux jauger l'intervention de différents traitements nécessaires au bien-être des patients et pouvant avoir des effets variables suivant le patient considéré.
Procédures
Chaque animal se verra induit une chirurgie provoquant un AVC au niveau de l'artère cérébrale moyenne droite. Ils auront tous une injection du traitement (rtPA ; solution saline) après l'induction de l'ischémie. Tous les animaux issus des groupes "24h" et "5 jours" passeront un IRM afin d'évaluer différents paramètres associés à l'AVC et notamment le volume de lésion. Enfin, la totalité des animaux sera mise à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque au terme des temporalités nécessaires à la caractérisation de l'orage cytokinique.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effet indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient : - une perte de poids anormale (nuisance modérée associée à l'état post chirurgie) - des douleurs post-opératoire (nuisance sévère associée à la chirurgie) - du stress induit par les déplacements des cages, la chirurgie, la manipulation des animaux par l'expérimentateur, les situations de réveil (nuisance modérée) - des déficits fonctionnels et/ou cognitifis (nuisance sévère associée à la chirurgie)
Devenir
A l'issu de la procédure, les animaux seront mis à mort par exsanguination pour prélèvement de sang et des organes nécessaires au projet.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. L'AVC est une pathologie complexe faisant intervenir de nombreux différents types cellulaires. Aujourd'hui, il est possible de représenter seulement des caractéristiques très particulières de l'AVC, généralement séparées les unes des autres. Il est par exemple possible de faire de la mise en culture cellulaire de neurones soumises à un protocole d'hypoxie afin de mimer l'effet de la réduction d'apport en oxygène que subissent les neurones in vivo. Il est également possible de réaliser de la micro-fluidique pour modéliser les caillots sanguins (à partir de sang humain) et évaluer différentes constantes de dynamiques associées à leur formation et leur dégradation. Toutefois, cette technique de permettrait pas d'intégrer le système inflammatoire et les cellules cérébrales afin d'étudier la production de cytokine suite à un AVC par exemple. Dans l'optique de travailler sur la production de cytokine associée à un AVC, une pathologie neuro-vasculaire globale, il n'est pas encore possible de modéliser l'ensemble de l'unité neuro-vasculaire pour avoir un résultat qui sera extrapolable à l'humain. De plus l'utilisation d'un organisme complexe est nécessaire au vu du fait que des cytokines pourraient être produites par des organes lymphoïdes primaires et secondaires. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l'espèce. L'ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons dans le contexte de l'AVC rend la souris indispensable à la réalisation de ces procédures. La physiopathologie de l'AVC étant globalement établie chez cette espèce, son utilisation n'en est que normale.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d'utiliser d'autres moyens que l'expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d'utiliser le nombre minimal d'animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. En fonction de l'expérimentateur (habilité, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquations avec les tests statistiques prévus lors de ce projet en prenant en compte un pourcentage d'animaux nécessaire à l'apprentissage. Pour les groupes d'animaux passant un IRM ("24h" et "5 jours"), des comparaison seront réalisées entre les souris traitées et non traitées. Entre toutes les souches de souris, pour ces mêmes groupes et ces mêmes résultats, les différences de volume de lésion seront établies. En résumé, pour toutes ces comparaisons, dès lors que les résultats nous le permettront, le nombre d’animaux utilisés pourra être réduit. De plus, le nombre d'animaux a été obtenu à partir de la spécificité et de la sensibilité des méthodes utilisées, ainsi que de nos travaux précédemment publiés dans la littérature. De plus l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes européennes avec un environnement enrichi (coton, paillettes, petites maisons) avec 5 souris par cage selon la directive 2010/63/UE. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limités fixés au préalable. Le bien-être des animaux est contrôlé 7J/7 pour détecter tous signes cliniques de souffrance et agir rapidement pour y mettre fin. L'ensemble des connaissances et des acquis du laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage, n'émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun "sickness behavior syndrom". Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Les animaux du groupe mis à mort 5j post-chirurgie seront pesés quotidiennement pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l'échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques aux modèles. Tout le matériel et consommable utilisé dans ces procédures expérimentales seront neufs, soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réuitiliser (pinces métalliques). Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal. Le jour de la chirurgie, afin de réduire le stress, les animaux seront emmenés dans la salle de chirurgie a minima 30 minutes avant celle-ci. Les cages y seront stockées dans une armoires ventilée spécifique, et dédiée, permettant de les maintenir dans un environnement avec une température et pression contrôlées. De plus, la sédation de l'animal pré-chirurgie sera faite sur une paillasse de sédation de type vétérinaire pour réduire au maximum le temps d'induction. Après la chirurgie, les animaux seront placés dans une enceinte de réveil chauffée et ventilée, isolés les uns des autres dans l'espace au maximum pendant 2h pour diminuer le stress dû au réveil. Toutes les douleurs des animaux sont prises en compte par une couverture anesthésique et analgésique adaptée.
Choix des espèces
La souris (Mus Musculus) est l'espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L'anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connus et sont proches de celles de l'Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L'ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Il n'existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l'Homme. Les souris seront âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à un âge de jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour les études précliniques sur l'AVC.
Test d’immunisation contre le virus de la grippe par voie muqueuse chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Marquées par entailles aux oreilles, vaccinées trois fois par voie sublinguale et trois fois par voie nasale sous anesthésie, saignées jusqu'à neuf fois par ponction à l'œil, 1 020 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est maintenue jusqu'à 22 mois pour tester les candidats vaccins sur des organismes vieillissants, le porteur signalant que cette durée d'hébergement peut entraîner alopécie, hypothermie et blessures de combat. La dernière étape est une trachéotomie terminale pour recueillir salive et mucus nasal, après quoi tous les animaux sont mis à mort pour prélever organes et fluides. Le porteur présente la lignée choisie comme proche de l'humain sur le plan immunitaire, tout en la décrivant comme une étape avant le passage à des animaux "plus pertinents et proche de l'humain", les primates non humains.
Objectifs
Actuellement, la vaccination classique dirigée contre la grippe utilise la voie d’injection par aiguille. Cependant, ce mode d’administration ne procure qu’une immunité partielle (production d’anticorps au niveau sanguin) ce qui n’empêche pas l’entrée des pathogènes dans notre corps. La voie muqueuse nez/bouche/gorge est une voie intéressante car ces muqueuses sont la porte d’entrée des pathogènes impliqués dans le cas de la grippe. Il a été décrit dans la littérature scientifique que la vaccination par cette voie peut permettre l’induction d’une double protection immunitaire dans le sang et dans les muqueuses, et ainsi diminuer le risque d’infection et de transmission du virus. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer et de comparer la réponse immunitaire vaccinale dirigée contre le virus de la grippe après vaccination par voie muqueuse : la muqueuse sublinguale ou la muqueuse nasale. Un rappel vaccinal sera pratiqué par injection pour réactiver la réponse immunitaire et l’amplifier. Ces paramètres seront étudiés sur des souris de deux âges différents (8 semaines et 16 mois) afin de mesurer l’efficacité de différents candidats vaccins sur des animaux vieillissant. En effet, les personnes âgées sont une population particulièrement à risque dans les cas d’infection par le virus de la grippe. L’objectif au long terme de ce projet est d’élaborer un vaccin capable d’induire une immunité durable dans le sang et les muqueuses à la fois chez les individus jeunes et âgées.
Bénéfices attendus
Les bénéfices scientifiques du projet concernent majoritairement la compréhension des mécanismes de la réponse immunitaire vaccinale au niveau des muqueuses, en fonction de l’âge et des différents candidats vaccins étudiés. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à administration muqueuse qui réduira drastiquement l’infection et la transmission des virus respiratoires. En cas de succès, ce projet sera étendu à d’autres virus respiratoires (SARS-Cov-2, Virus Respiratoire Syncytial…).
Procédures
Ci-dessous, la liste des interventions réalisées sur l’animal à chaque étape du projet : - L’identification : le marquage sera réalisé sur l'animal anesthésié par de petites entailles au niveau sur les bords des oreilles (1 fois/animal, durée : 1 minute). - Les administrations par voie sublinguale sont des actes induisant une douleur légère mais pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie gazeuse (3 fois/animal, durée : 15 minutes). - Les administrations par voie intranasale sont des actes induisant une douleur légère mais pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale (3 fois/animal, durée : environ 30 minutes). - Les injections par voie sous-cutanée sont des actes induisant une douleur légère et ne nécessitant pas d’anesthésie au préalable (1 fois/animal, durée : 5 minutes). - Le prélèvement sanguin à l’œil est un geste qui dure 30 secondes maximum. Ce geste est une technique pouvant induire une douleur modérée et un stress supplémentaire à l’animal, notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale additionnée d’une anesthésie locale (1 à 9 fois/animal, durée : 5 minutes). - Les prélèvements de salive et du mucus nasal nécessitent une trachéotomie et une immobilisation de l’animal. Pour ces raisons, nous réaliserons ces prélèvements en phase terminale sous analgésie et anesthésie (1 fois/animal, durée : 40 minutes).
Impact sur les animaux
- Identification des animaux : ce geste d’inconfort peut entrainer la fragilisation de l’oreille et augmenter les risques de blessure en cas de combats. - Prise de température : la prise de la température au niveau de l’abdomen nécessite une contention pouvant générer un stress chez l’animal. - Administration sublinguale et intranasale : ces gestes seront réalisés sur l’animal anesthésié et peuvent induire un inconfort léger après leur réveil. - Injection en sous-cutané et dans l’abdomen : ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles et sous contention pouvant générer un stress chez l’animal. - Immunisation : Une petite fièvre passagère est envisageable après les vaccinations. - Prélèvement de sang en rétro-orbitaire : Ces prélèvements sont réalisés sous anesthésie et peuvent induire des lésions au niveau de l’œil ainsi un inconfort léger après leur réveil. - Vieillissement des animaux : pour les expériences concernant les animaux de 16 mois, les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 8 semaines et seront hébergées jusqu’à un âge maximal de 22 mois. Cette durée prolongée d’hébergement peut être la source de stress et d’anxiété chez l’animal pouvant entrainer divers symptômes liés au vieillissement (alopécie, hypothermie, blessure liée au combat…). Pour éviter cela, une surveillance hebdomadaire et un enrichissement de l’environnement sera appliqué.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort en fin de procédure pour procéder à des prelèvements d’organes et de quantités importantes de fluides (sang, mucus).
Remplacement
Avant l’utilisation des candidats vaccins sur l’animal, des études de toxicité et de réponse inflammatoire ont été menées sur des cultures cellulaires épithéliales et immunitaires. De manière générale, la vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes, dont les ganglions lymphatiques et la rate, et dans différents organes ciblés. Le recours à l’animal est donc incontournable, nous n’avons donc pas d’autre solutions que d’utiliser l’animal dans son entier pour étudier la réponse immunitaire de nos candidats vaccins.
Réduction
Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé a été réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et la significativité statistique des expérimentations. Il a été évalué pour 5 ans à 1020 souris. Pour les 3 procédures, des groupes de 10 souris/lot ont été calculés pour répondre à l’objectif. Les analyses se feront avec des statistiques classiquement décrites pour les études vaccinales. Un choix restreint de groupes expérimentaux a été fait après sélection de candidats vaccins in vitro. Les temps de chaque procédure ont été sélectionnés d’après nos précédentes expériences et par la littérature scientifique pour se focaliser uniquement sur les 3 temps d’analyses les plus pertinents. Nous avons également réduit le nombre d’animaux contrôles au strict minimum : 10 animaux contrôles « naïf » pour chaque âges (8 semaines et 16 mois) soit deux groupes par procédure. C’est-à-dire que dans chaque procédure, tous les groupes expérimentaux se réfèrent au groupe contrôle du même âge. De plus, selon l’avancée du projet, le nombre d’animaux est susceptible d’être réduit. En fonction des groupes expérimentaux, si les résultats obtenus lors des premières expérimentations ne donnent pas de données robustes, alors les expériences prévues pour les groupes similaires à des temps plus tardifs ne seront pas réalisées.
Raffinement
Dans ce projet, des points limites assez prédictifs ont été établis pour pouvoir anticiper tout stress et souffrance des animaux. Dans l’ensemble du projet, voici les mesures appliquées afin de limiter la souffrance et le stress des animaux : - De l’enrichissement du milieu sera appliqué dès la réception de animaux. - Une période d’acclimatation d’une semaine dans l’animalerie sera respectée après la réception des animaux. - L’identification individuelle des animaux sera réalisée grâce à des petites entailles au bord de l’oreille (moins sensible) et sous anesthésie générale. - La période de vieillissement (de 2 à 16 mois) sera ponctuée par des observations et des pesées hebdomadaires, additionnées à partir de 15 mois de mesures de la température corporelle. - Les administrations sublinguales et intranasales se feront sous anesthésie générale. - Les prélèvements sanguins et des mucus se feront sous analgésie et anesthésie générale. - Après chaque anesthésie, le bon réveil des souris sera vérifié (mouvement de la souris, comportement, prise de boisson ou de nourriture, etc) avant de les renvoyer dans leur pièce d’hébergement. - Un suivi des animaux à 4h/24h après chaque étape des procédures (identification, immunisations, prélèvements) et/ou au moins une fois par semaine sera réalisé. Ce suivi comprend : la réalisation d’une pesée de l’animal et l’observation de l’activité/comportement (isolement, dos vouté, etc…), des modifications physiques (inflammation/rougeur au niveau des sites d’administration : gueule/langue, museau ou abdomen) et des modifications végétatives (respiration anormale). En complément, une prise de la température de l’animal sera effectuée, à 24h après chaque immunisation afin de détecter d’éventuelle montée de température. Concernant les souris âgées de plus de 16 mois, une prise de la température sera aussi réalisée au moins une fois par semaine afin de détecter une éventuelle hypothermie. - En cas de perte de poids importante, de la nourriture se mise à disposition au sol dans la cage. - En cas de variation importante de la température, une nouvelle mesure sera effectuée toutes les 24h et des moyens seront mis en œuvre pour la rétablir (anti-inflammatoire, armoire chauffante). - En cas de lésion cutanée, une pommade nettoyante et cicatrisante sera appliquée sur la zone et si besoin un isolement de l’animal sera effectué.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris qui sont un modèle très adapté aux études de l’immunité car il existe beaucoup d’outils biologiques d’analyses de la réponse immunitaire chez la souris, qui est bien caractérisée. Les souris seront utilisées à partir de 10 semaines de vie, ce qui correspond à un jeune adulte avec une système immunitaire mature. De plus, la lignée choisie présente des caractéristiques immunitaires proches de l’humain. Cette faculté est primordiale pour l’analyse de candidat vaccin. Ces modèles sont essentiels avant de passer à des animaux plus pertinents et proche de l’humain dans un contexte d’infection viral, tel que le primate non humain.
Impact d’une tumeur transitoire sur la mémoire immunitaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Deux à quatre injections sous anesthésie et un prélèvement de sang qui expose à une infection de l'œil : 566 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort ensuite pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent des cellules tumorales, qui forment une tumeur rejetée en quatorze jours, ou une infection virale, afin de comparer les cellules immunitaires mémoires produites dans les deux cas. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension du développement d'un cancer. L'effectif de 566 animaux n'est justifié que par un "minimum nécessaire et suffisant" à l'analyse statistique, sans autre précision.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer si une tumeur transitoire, rapidement éliminée de l’organisme par le système immunitaire, est suffisante pour altérer la réponse immunitaire mémoires. Pour cela, les cellules mémoires générées en réponse à un virus ou un tumeur transitoire seront comparées.
Bénéfices attendus
L’objectif est d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes mise en place lors du développement d'un cancer.
Procédures
Chaque animal reçoit : 2 à 4 injections (15 secondes) sous anesthésie / 1 prélèvement sanguin (150 uL) sous anesthésie (10 secondes) / Anesthesie : 3 minutes pour anesthésie gazeuse , 30 minutes pour anesthésique injecté
Impact sur les animaux
Injection intraveineuse de cellules ou prélèvements : possibilité d'infection au niveau de l'oeil (très rare) Infection virale : Aucun signe clinique attendu Injection de tumeur : La tumeur n’est pas métastatique, n’excède pas 200 mm3 et est rejetée par les animaux en 14 jours.
Devenir
Mis à mort pour prélèvements des organes
Remplacement
La réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différents organes. Les procédures ne peuvent donc être reproduites in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été defini au minimum nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique des résultats
Raffinement
Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie et en condition stérile afin de prévenir tout risque d’infection. Un collyre anesthésique est administré avant chaque prélèvement sanguin en prévention d'éventuelles infections. Des points limites bien définis et suffisament précoces permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront âgées de 7-12 semaines au moment de l’immunisation, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Validation de l’effet de la molécule Ma sur la production d’anticorps après immunisation par un antigène modèle
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, quatre-vingts d'entre elles subissant jusqu'à neuf prélèvements sanguins et deux injections sous la peau au cours d'une expérience de soixante-dix jours. Le traitement testé est ajouté à l'eau de boisson, ce qui peut en dégrader le goût au point que les souris boivent moins, et modifier leur transit. L'objet immédiat reste modeste : vérifier qu'une molécule freine la production d'anticorps après une vaccination à l'ovalbumine, modèle retenu comme moins invasif qu'une greffe. Le bénéfice avancé pour les patients transplantés, la prévention des rejets tardifs, est renvoyé au moyen et au long terme, après d'autres expériences sur des animaux non-humains greffés.
Objectifs
Les transplantations d’organes améliorent et sauvent la vie de nombreux patients. La survie des greffons est possible grâce à des traitements qui bloquent la réponse immunitaire responsable des rejets. Les traitements actuels sont souvent bien tolérés et efficaces, notamment pour le contrôle des rejets aigus. Cependant, les rejets tardifs sont responsables de perte de greffons que les traitements actuels ne parviennent pas à juguler. Le mécanisme responsable de ces rejets tardifs implique la production par le système immunitaire d’anticorps qui attaquent les greffons. C’est cette réponse anticorps qui est imparfaitement contenue par les traitements immunosuppresseurs actuels. Il existe donc un besoin de nouveaux traitements pour prévenir les rejets tardifs par un contrôle de la production d’anticorps anti-greffons. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet d’une nouvelle molécule sur la réponse anticorps dans un modèle de souris. Ces études sont des préalables obligatoires avant d’envisager un passage en clinique de nouveaux traitements. La preuve de concept de l’efficacité de la molécule sera étudiée dans ce projet avec un modèle moins invasif que la transplantation, à savoir un modèle de vaccination faisant intervenir les mêmes réactions immunitaires. Les souris seront vaccinées avec une molécule modèle et seront traitées via l’eau de boisson par la molécule candidate pour évaluer la réponse immunitaire vaccinale en présence ou non de cette molécule. Différents dosages sanguins seront réalisés au cours des expériences pour suivre la réponse immunitaire. Ce projet sera découpé en 3 étapes :1) s’assurer que l’ajout de la molécule n’affecte pas l’appétence des animaux pour leur eau de boisson ; 2) valider la dose dans l’eau de boisson pour obtenir une concentration sanguine efficace et 3) valider l’effet de cette molécule sur la réponse anticorps suite à une immunisation par un antigène modèle. Au total, ce projet nécessite 190 souris sur une durée de 3 ans.
Bénéfices attendus
A court terme, cette étude nous permettra de valider in vivo l’efficacité de la molécule candidate sur un modèle de vaccination (protéine vaccinale modèle Ovalbumine) A moyen terme, l’étude de l’effet thérapeutique de la molécule candidate permettrait de valider son utilisation pour réduire le risque de rejet de greffe associé aux anticorps dans des modèles vivo de greffe pour in fine, à long terme, etre utilisée en clinique chez les patients.
Procédures
Toutes les souris subiront un changement d’eau de boisson (+/- sucre) et +/- molécule dans des biberons opaques tous les 2 ou 3 jours maximum Elles seront pesées tous les 3 jours à toutes les semaines selon l'étape du projet. Pour 30 souris : elles subiront maximum 3 prélèvements sanguins (sous anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (pour la récolte sang + organes). Experience de maximum 14 jours Pour 80 souris : elles subiront maximum 5 prélèvements sanguins (anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (récolte sang + organes). Experience de maximum 21 jours Pour 80 souris : elles subiront maximum 2 Injections sous la peau (vaccination) sous anesthésie gazeuse et au maximum 9 prélèvements sanguins (avec anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (récolte sang + organes). Experience de maximum 70 jours
Impact sur les animaux
Les injections sous la peau (vaccination) et les prélèvements de sang sont susceptibles d’entrainer un stress et une douleur. L’ajout de la molécule dans l’eau de boisson des souris peut entraîner une perte d’appétence pour l’eau et donc une diminution de la prise hydrique. L’ajout de la molécule dans l’eau peut également entraîner des modifications du transit des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des protocoles afin de prélever le sang et collecter les tissus pour réaliser les analyses et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires nécessaire pour étudier les réponses vaccinales ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro
Réduction
Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs avec des analyses statistiques définies selon les paralètres étudiés. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 190 souris (mus musculus).
Raffinement
Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement, aspect général) . Différents traitements seront administrés : - anesthésie générale avant le prélèvement final - Analgésie locale pour les prélèvements sanguins - Anésthésie gazeuse avant l’injection du vaccin sous la peau. Le suivi se fait 2 à 3 fois par semaine et la fréquence est augmentée selon l’apparition des signes cliniques précoces et anticipés qui ont été définis pour éviter toute souffrance animale. Une semaine d’habituation à l’eau est prévue avant tout début de procédure. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature. Age maximum 12 mois en fin de projet (les animaux plus agés ne seront pas utilisés pour éviter une variabilité trop important due à l’age entre les souris jeunes et > 12 mois).
Elevage de souris transgéniques utilisées pour l’étude des syndromes myélodysplasiques, maladies avec un développement anormal des cellules du sang et pouvant progresser en leucémies (cancer du sang).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées quand elles ne portent pas la mutation recherchée, quand elles sont trop âgées pour la reproduction ou quand elles n'ont plus donné de portée depuis deux mois, même sans aucun signe de mal-être, 8 500 souris vont être utilisées dans un élevage de six lignées génétiquement modifiées. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. À trois ou quatre semaines, l'extrémité de la queue de chaque petit est coupée aux ciseaux pour vérifier la présence de la mutation, et certaines lignées développent des tumeurs à partir de deux mois. L'établissement affirme que seul un animal vivant et entier permet d'étudier la réponse immunitaire, et présente ce projet comme la fourniture d'animaux à d'autres protocoles déjà autorisés.
Objectifs
Les syndromes myélodysplasiques (SMD) marquent une étape préalable à la leucémie, caractérisée par une moelle osseuse défaillante qui entraine une production insuffisante de cellules sanguines saines. Lorsque des mutations génétiques perturbent le renouvellement, la multiplication et la maturation des cellules souches (= cellules à l'origine de toutes les cellules du sang) dans la moelle osseuse, cela conduit à la leucémie myéloïde aigue (LAM). Parmi les mutations décrites dans la littérature scientifique, nous nous intéressons tout particulièrement à deux d'entre elles pour lesquelles nous disposons de souris génétiquement modifiées (modifications génétiques reproduisant celles observées chez les patients atteints de ce type de cancer). Notre projet consiste à identifier (mise en place d'une boucle numérotée à l'oreille) et à vérifier la présence des modifications génétiques chez ces souris afin de disposer d'animaux pouvant ensuite être inclus dans des projets de recherche faisant l'objet d'une autorisation délivrée par les instances.
Bénéfices attendus
Les modèles murins utilisés sont essentiels pour comprendre les mécanismes impliqués mais aussi pour évaluer le développement de nombreuses pathologies comme dans notre projet SMD/LAM. Cela pourrait nous permettre d’ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques en testant des drogues et ce, pour aider les patients souffrant de ces maladies souvent encore incurables.
Procédures
Ce projet consiste en l'élevage de 6 lignées de souris génétiquement modifiées. Afin de caractériser les souris, issues des différents croisement, exprimant les gènes modifiés, l’extrémité de la queue (moins de 5 mm) sera coupée à l’aide de ciseaux fins, parfaitement aiguisé et préalablement désinfectés. Ce geste, réalisé à l'âge de 3-4 semaines, est très rapide et ne dure pas plus de quelques secondes. Ce fragment de tissu permettra d'obtenir l'ADN de la souris et ainsi s'assurer de la présence de la mutation génétique d'intérêt. Certaines lignées de souris peuvent développer des tumeurs (à partir de l'âge de 8-9 semaines). Nous réaliserons donc un suivi clinique une fois par semaine afin de détecter l'apparition de ces pathologies, se caractérisant par un affaiblissement général de l'animal.
Impact sur les animaux
L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 5mm) nécessite une contention de courte durée, pouvant entrainer un stress, et peut conduire à une légère perte de sang. Une partie des animaux génétiquement modifiés peuvent développer (à partir de l'âge de 8-9 semaines) des tumeurs conduidant à un affaiblissement général.
Devenir
Les animaux comportant la mutation d’intérêt seront utilisés pour de la reproduction, le prélèvement de tissus post- mortem ou seront utilisés dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées par le comité d’éthique et le ministère. Les animaux ne comportant pas la mutation d’intérêt ou trop âgés (pour être utilisées en accouplement ou incluses dans un protocole de recherche) ou n'ayant plus donnés de portées depuis 2 mois seront euthanasiés, même s'ils ne présentent pas de signes de mal-être. Les souris seront euthanasiées de manière anticipée si elles présentent des signes de souffrance. Les souris incluses dans un projet de recherche seront euthanasiées à l'issue des procédures expérimentales, conformément au protocole autorisé.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité la réponse immunitaire et l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale, ainsi que les relations entre les différentes cellules dans un contexte physiologique ou pathologique. Cela est impossible à reproduire in vitro (dans des cultures de cellules) en raison de la complexité des interactions entre les différents types de cellules jouant un rôle dans le développement et la progression de la maladie.
Réduction
Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. Nous avons déterminé le nombre de souris inclus dans ce projet afin de ne produire que le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de nos projets de recherche.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents pathogènes. Elles sont maintenues en groupe dans un environnement enrichi (présence de tunnel en carton, papier kraft pour faire des nids et buchettes en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Différentes actions seront mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Pour les souris pouvant développer une pathologie (type cancer), la surveillance sera renforcée par un suivi clinioque hebdomadaire afin de détecter de manière anticipée l'affaiblissement de l'animal. Les souris seront utilisées autant que possible avant l'âge d'apparition de la maladie. Après coupure de l'extremité de la queue de la souris, nous surveillerons qu'il n'y a pas de saignement et dans le cas contraire, un point de compression sera fait pour favoriser la coagulation.
Choix des espèces
L'utilisation de ces différentes lignées de souris génétiquement modifiées pour l’étude des SMD/LAM est largement décrit dans la littérature scientifique. Ces modèles sont robustes et reproductibles et leur élevage permettra d'inclure ces souris dans des projets de recherche permettant de mieux comprendre le développement de ces maladies et de trouver de nouvelles pistes de thérapie. Les souris seront mises en accouplement à l'âge adulte (8 semaines), stade qui correspond à leur maturité sexuelle. Le sevrage, l’identification et le prélèvement de tissu en vue de l’analyse génétique seront réalisés entre 3 et 4 semaines.
Rôle des cellules des vaisseaux sanguins dans la survie et le maintien des monocytes en condition physiologique et inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Irradiées puis greffées de moelle osseuse par une injection dans la veine située derrière l'œil, saignées jusqu'à sept fois à la veine de la mâchoire, 240 souris vont être utilisées dans des procédures dont le niveau de souffrance va de léger à sévère. Soixante d'entre elles reçoivent un agent inflammatoire par voie intraveineuse avant une série de prélèvements étalés sur une semaine, et l'irradiation laisse leur système immunitaire incomplet pendant quinze jours. Le projet cherche à établir quels facteurs produits par les parois des vaisseaux maintiennent en vie les monocytes du sang, avec l'espoir déclaré de retombées sur les maladies cardiovasculaires. Toutes sont tuées à la fin des procédures pour prélever le sang et les organes.
Objectifs
Les monocytes sont des cellules immunitaires présentes dans le sang qui surveillent et préservent la santé des vaisseaux sanguins. Leur travail consiste à se fixer aux parois des vaisseaux pour éliminer les cellules mourantes et prévenir l'accumulation de débris ou de graisses. Les monocytes se caractérisent par leur mouvement constant, dû à leur localisation dans le sang, soulevant des interrogations sur les signaux nécessaires à leur survie. Grâce à des modèles murins innovants, nous avons découvert que des facteurs de croissance, qui sont des substances produites par les cellules et qui stimulent la croissance, la différenciation, ou la survie d'autres cellules, dérivés des cellules constituant les vaisseaux sanguins sont indispensables au maintien des monocytes dans la circulation sanguine. De plus, nous avons constaté que lorsque les monocytes se fixent aux vaisseaux sanguins, ils sont mieux à même de capter ces facteurs de croissance. Cette étude vise à clarifier par quel mécanisme (prolifération, différenciation, ou la survie) ces facteurs de croissance influent sur le nombre de monocytes dans le sang. Bien que notre attention se soit principalement portée sur le rôle physiologique des facteurs produits par les vaisseaux sanguins, l’un de nos autres objectifs est également de comprendre leur rôle dans la réponse des monocytes à l'inflammation.
Bénéfices attendus
Les monocytes sont fortement associés au développement de pathologies cardio-vasculaires. Par exemple, les souris déficientes en monocytes souffrant d’athérosclérose présentent des vaisseaux plus endommagés que leurs homologues contrôles. Notre étude sur les mécanismes régissant la survie des monocytes vise à mieux contrôler leur nombre dans certaines pathologies dans lesquelles leur présence (ou leur absence) serait bénéfique. En outre, ce projet va générer de nouveaux modèles murins pour manipuler les monocytes, ce qui est essentiel pour étudier leur rôle dans des contextes pathologiques et homéostatiques. Enfin ce projet met en évidence les voies moléculaires mises en jeu dans l’interaction entre les endothéliums et les monocytes. La manipulation de ces voies pourrait contrôler le développement de certaines maladies cardio-vasculaires, aboutissant in fine à la découverte de nouvelles voies thérapeutiques immunomodulatrices.
Procédures
Procédure 1 : - 20 souris vigiles recevront une injection d'anesthésique, puis seront irradiées partiellement pendant 8 min et recevront une injection intraveineuse via la veine située derrière l’œil de cellules de moelle osseuse. - 40 souris vigiles seront complètement irradiées, puis anesthésiées afin de recevoir une injection intraveineuse via la veine qui se trouve derrière l'œil de cellules de moelle osseuse. Procédure 2 : 60 souris anesthésiées recevront du sang par voie intraveineuse par la veine qui se trouve derrière l'œil. Puis 4 prélèvements sanguins à la veine située près de la mâchoire seront effectués à jour 0, 1, 3, 5 et 8 post-injection de sang. Procédure 3 : 40 souris seront injectées pendant 4 jours (1 injection/par jour) avec un facteur de croissance (20 souris) ou avec une solution contrôle (20 souris) Procédure 4 : 60 souris vigiles seront injectées avec un agent inflammatoire par voie intraveineuse par la veine située dans la queue. Puis 7 prélèvements sanguins à la veine située près de la mâchoire seront effectués à jour 0, 1, 2, 3, 4, 5 et 7 post-injection de l’agent inflammatoire. 20 souris vigiles recevront une injection intrapéritonéale l’agent inflammatoire et seront euthanasiées 24h après cette injection.
Impact sur les animaux
-le stress à court terme lié à la contention et aux différentes injections, - Le système immunitaire des souris est incomplet pendant 2 semaines suite à irradiation, ce qui les rendra plus susceptibles aux infections -Des blessures légères ou symptômes d’irritation cutanée sont des effets secondaires de l'irradiation, - Une perte de poids attendue sur 3j liée à l’injection d’un agent inflammatoire
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des différentes procédures afin de prélever le sang total ainsi que les organes dans le but de les analyser.
Remplacement
La complexité des interactions entre les monocytes sanguins et les différents types de cellules composant les vaisseaux sanguins présentes dans l'organisme ne peut par définition pas être reproduite in vitro puisque ces dernières ont lieu dans la circulation sanguine. L'ensemble des modèles murins générés dans ce projet permet d'étudier le maintien des monocytes dans un environnement où seulement quelques sous-types de cellules formant les vaisseaux sanguins ne sont plus capables de produire de facteur de croissance, tandis que le reste de l'organisme est toujours capable de le produire. Ceci permettra d'identifier spécifiquement les sous-types de vaisseaux sanguins impliqués dans la production du facteur de croissance essentiel à la survie des monocytes. D'autre part nous savons que la différentiation, l’identité et les fonctions spécifiques des monocytes dépendant d’une multitude de facteurs produits par les cellules formant les vaisseaux sanguins mais aussi pour les autres types cellulaires de l'organisme. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permettrait donc pas de refléter cet environnement complexe et dynamique impliqué dans le maintien des monocytes. Le projet vise également à comprendre quelles sont les conséquences de l'absence de monocytes sur l'organisme. Là encore, seule l’étude d’un animal entier nous permettra d’observer des phénotypes à l’échelle de l’organisme.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés et de garantir des résultats exploitables, le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé à l’aide du logiciel statistique. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour les analyses des données.
Raffinement
Les animaux seront examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur/souffrance et veiller à ne pas dépasser des points limites. Les conditions d'hébergement des souris respectent les règles suivantes : - Les cages utilisées peuvent héberger 5 souris adultes. Les souris sont donc élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. – Les cages seront supplémentées en enrichissement tel que du coton, ou un dôme pour confectionner des nids - Les animaleries bénéficient d'une température régulée, d'une hygrométrie ainsi que d'une photopériode contrôlée. -Les animaleries sont calmes. Par ailleurs, la mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation quotidienne des animaux, de l’évolution de leur poids, de leur apparence et de leur comportement au cours de chaque procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. L’utilisation d’analgésiques sera également proposée quand cela sera possible et jugé nécessaire.
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est nécessaire pour répondre aux questions scientifiques posées. Des animaux âgés de 6 semaines seront utilisés, puisque nous nous intéressons aux monocytes chez l’adulte.
Elevage de lignées de souris immunodéficientes et prélèvements pour génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
79 950 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune pour une biopsie d'oreille au poinçon de deux millimètres ou une prise de sang, contention comprise, en une trentaine de secondes. Aucun anesthésique ni analgésique n'est prévu, le porteur estimant la douleur aiguë mais limitée à deux secondes environ. Ces prélèvements servent au génotypage de lignées de souris immunodéficientes élevées en vue d'être utilisées dans d'autres projets, et le porteur indique qu'une méthode non invasive sur poils ou salive sera privilégiée quand elle sera au point. Une partie des souris est gardée vivante selon les génotypes recherchés et les besoins de reproduction, les autres sont tuées faute de génotype utile, en fin de reproduction, ou parce qu'aucune procédure ne les attend.
Objectifs
Il concerne donc toutes les méthodes de prélèvements invasives d’échantillons en vue des génotypages (biopsies oreilles ou prélèvements sanguins) ainsi que l’hébergement de souris immunodéficientes. Le génotypage des animaux est indispensable afin de définir le génotype de chaque individu, ce qui permettra par la suite d’identifier les animaux qui seront utilisés en reproduction ou à des fins scientifiques dans le cadre de projets/procédures de recherche autorisés. A terme, lorsque la technique de génotypage sur échantillon de poils ou salivaire sera mise au point et que cela sera possible techniquement, une méthode non-invasive sera privilégiée.
Bénéfices attendus
Pouvoir fournir des animaux d’intérêts de lignées de souris génétiquement altérées qui seront utilisés dans les différentes procédures expérimentales des projets autorisés. De manière à atteindre les objectifs scientifiques dans les domaines de l’inflammation, du cancer et de l’infectiologie.
Procédures
Biopsies oreilles : animaux vigiles, prélèvement unique, durée de l’intervention moins de 20 secondes (30 secondes avec la pose de la bague) Prélèvements de sang : animaux vigiles, prélèvement unique, durée de l’intervention moins de 20 secondes (30 secondes avec la pose de la bague)
Impact sur les animaux
Les nuisances pouvant être causées aux animaux sont : - le stress lié à la contention (environ 30 secondes) - la douleur, aigue mais de très courte durée, ressentie lors du poinçonnage de l’oreille (environ 2 secondes) ou au point de ponction pour le prélèvement sanguin (environ 2 secondes)
Devenir
Les animaux sont gardés en vie, en fonction des procédures expérimentales en cours, des génotypes d’intérêts ainsi que des besoins en reproduction. Les animaux mis à mort concernent les animaux ayant un génotype ne présentant pas d’intérêt, arrivant en fin de reproduction, n’étant pas inclus dans une procédure expérimentale.
Remplacement
L’utilisation du modèle animal est incontournable dans certains projets des équipes de l'institut. En effet, la nature des travaux qui sont menés imposent le choix du modèle murin, dans la mesure où les processus développementaux étudiés ne peuvent être abordés dans leur complexité physiopathologique dans des lignées cellulaires ou d’autres systèmes in vitro.
Réduction
Une gestion raisonnée des accouplements est mise en place au sein du service de zootechnie. Nous adaptons au mieux le schéma de reproduction en fonction de la spécificité de chaque lignée et/ou des besoins expérimentaux. Cela ayant pour objectif de limiter au maximum la production d’animaux.
Raffinement
Les procédures expérimentales ont été optimisées afin de générer le moins de stress et de douleurs aux animaux. Le personnel étant formé et sensible au bien-être animal et les animaux habitués à la manipulation, le stress engendré lors de la préhension (pince au-niveau de la peau du cou ou tunnel) et de la contention est moins présent. De plus, toutes les mesures sont prises lors des gestes techniques afin de minimiser au maximum les dommages causés aux animaux. Le matériel est adapté à l’espèce et la taille ou le volume de prélèvement est minimisé (poinçon de 2 mm pour la biopsie d’oreilles et volume de 50µl pour le sang). Tous ces éléments font qu’il n’est pas prévu d’utiliser d’anesthésiques volatils, d’analgésique et/ou anesthésique local.
Choix des espèces
Le modèle murin offre plusieurs avantages : 1) sa génétique est bien connue ce qui permet une certaine souplesse dans le choix du fond génétique approprié aux questions posées, 2) il existe de nombreuses lignées mutantes permettant des analyses génétiques et développementales fines, 3) le fonctionnement de son système immunitaire est relativement bien connu et est à maints égards semblable au système immunitaire humain. Les animaux seront prélevés au sevrage soit entre 21 et 27 jours pour les biopsies d’oreilles et à partir de 28 jours pour les prélèvements sanguins.
Evaluation de l’immunité et de l’inflammation mammaires chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
Jusqu'à treize anesthésies en dix jours pour une même souris : 260 souris vont être utilisées, 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 100 un niveau modéré. Elles sont épilées, reçoivent des bactéries en injection dans la mamelle, parfois une sonde fluorescente dans la veine de la queue, et certaines sont gavées tous les jours pendant deux semaines. Le modèle sert à étudier l'immunité mammaire des ruminants, le porteur indiquant que le passer chez la souris évite "des protocoles plus dommageables sur des espèces telles que la brebis". Les mères infectées sont tuées pour mesurer la charge bactérienne dans leur glande mammaire, et leurs souriceaux le sont aussi, l'allaitement s'interrompant avant le sevrage sans possibilité d'adoption dans la zone d'expérimentation.
Objectifs
L'occurence des mammites dans les élevages représente un problème majeur en santé animale. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l'immunité mammaire est nécessaire pour améliorer la santé et le bien-être des animaux d'élevage, ainsi que la qualité (nutrionnelle, microbiologique...) des produits d'origine animale tout en réduisant le recours aux intrants chimiques dont les antibiotiques.
Bénéfices attendus
Le caractère inédit du protocole mis en place, ainsi que l'utilisation d'une technique d'imagerie innovante permettront d'apporter des informations de grande importance dans le domaine de l'immunité mammaire. De plus, la mise en place de ce modèle chez la souris évite l'application de protocoles plus dommageables sur des espèces telles que la brebis.
Procédures
Les souris sont anesthésiées par inhalation d'un anesthésiant à plusieurs reprises : - une fois pour leur épilation, pour une durée maximale de 20 minutes - une fois pour les injections intra-mammaires pour une durée maximale de 30 minutes - potentiellement une fois pour une injection de sonde fluorescente pour une durée maximale de 15 minutes - une fois par jour pour les analyses pour une durée maximale de 15 minutes, durant la durée du protocole (durée maximale de 10 jours), soit un nombre maximal de 13 anesthésies. Les souris sont également soumises à des injections de bactéries intra-mammaires (sous anesthésie gazeuse comme indiqué ci-dessus) qui durent environ 5 à 10 sec. Elles seront aussi potentiellement soumises à une injection de sonde fluorescente (sous anesthésie gazeuse comme indiqué ci-dessus) dans la veine caudale des souris qui doivent durer environ 5 à 10 sec. Enfin, elle subissent une euthanasie à la fin du protocole. Pour le deuxième projet, les souris sont prélablement gavées quotidiennement pendant 2 semaines, la durée de l'intervention est d'environ 5 à 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés lors des expériences d’infections réalisées à ce jour dans le cadre de ce projet ont montré une légère perte de poids mais cette perte s'est rapidement résorbée au cours de l'expérimentation. Des signes de prostration ont pu être observés sur certaines souris après réveil suite aux injections mais n'étaient plus visibles dès le 1er jour post-infection. Aucun autre signe de souffrance ou d'altération du bien-être des animaux n'a pu être observé au cours de ces expériences.
Devenir
Les souris adultes sont euthanasiées à la fin des expériences afin de pouvoir faire des prélèvements de glande mammaire dans le but de faire des mesures de charge bactérienne. De plus, l'infection subie par les animaux induit une modification de leur statut immunitaire ce qui empêche leur utilisation dans de nouvelles expériences d'infection qui nécessitent l'utilisation d'animaux n'ayant jamais été infectés. Les souriceaux sont également euthanasiés car l'interruption de la lactation survient avant le sevrage (du fait de l'euthanasie des mères) et il n'est donc plus possible de les maintenir en vie du fait de l'impossibilité de réaliser des adoptions et des déplacements d'animaux dans une nouvelle zone à cause des spécificités de la zone d'expérimentation.
Remplacement
Les infections expérimentales réalisées chez la souris ont pour but la compréhension du rôle d'une protéine et de l'administration d'alicaments sur la sévérité et l'issue de l'infection, ainsi que le recrutement des cellules immunitaires. Ces expériences ne peuvent être réalisées qu'à l'échelle de l'organisme d'animaux vivants et ne peuvent être reproduites in vitro puisqu'elles impliquent des interactions entre les différents acteurs du système immunitaire de l'organisme, après contact avec les bactéries en multiplication. Elles permettront ainsi une analyse pertinente et complète du point de vue physiopathologique, dont les résultats seront à priori plus fiables et auront une plus grande probabilité d'être transférables aux espèces de ruminants.
Réduction
Cette technique d'imagerie a été choisie car elle est non invasive et qu'elle permet d'analyser plusieurs paramètres simultanément sur les mêmes souris tout en réalisant une cinétique de suivi de l'infection. Cette méthode permet donc de limiter grandement le nombre d'animaux utilisés pour obtenir un grand nombre d'informations sur les mêmes souris : intensité de l'infection et du recrutement des cellules immunitaires à différents temps post-infection. Des premiers essais tests seront réalisé sur des lots successifs de nombres réduits d'animaux pour optimiser les conditions expérimentales au fur et à mesure et ajuster la cinétique pour avoir le maximum d'information et de fiabilité des résultats tout en limitant au mieux la durée du protocole et la souffrance des animaux. Les expériences seront ensuite réalisées sur des lots successifs de souris et les résultats obtenus analysés à l'aide de tests statistiques pour évaluer leur fiabilité, et ainsi déterminer la nécessité ou non d'augmenter les effectifs examinés pour l'obtention de résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Les anesthésiques choisis sont peu toxiques et permettent ainsi une anesthésie de courte durée pour les analyses (15min maximum) et le réveil rapide avec une reprise immédiate de l'activité. L'infection des souris se fera par injection intra-mammaire, geste non traumatisant pour la glande mammaire. Le nombre d'analyse sera limité à un ou deux par jour et un suivi régulier des animaux sera effectué pendant toute la durée du protocole. Tout animal présentant des signes de souffrance ou de léthargie, dont la gravité sera évaluée en fonction des points limites pré-établis, sera exclu de l'étude puis euthanasié.
Choix des espèces
Les protocoles de modifications génétiques sont beaucoup plus faciles à mettre en place chez la souris que dans les autres espèces. La souris a donc été choisie pour créer un modèle d'intérêt de souris génétiquement modifiées. De plus, la grande majorité des données publiées sur l'immunité et les thématiques d'intérêt des projets d'intérêt ont été acquises chez la souris. Il est donc nécessaire de prolonger les analyses dans la même espèce afin de pouvoir s'appuyer sur les résultats déjà obtenus pour la réalisation des protocoles et pour compléter les données pré-existentes tout en ayant des points de référence. Enfin, l'utilisation de la souris permet d'éviter la mise en oeuvre de protocoles beaucoup plus dommageables sur des espèces telles que la brebis. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, entre 14 et 16 semaines, puisqu'elles doivent être en lactation.
Essais in vivo d’injection de nanoparticules lipidiques contenant de l’ARNm luciferase.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection intramusculaire d'une formulation de nanoparticules lipidiques et trois injections dans le péritoine, puis des séances répétées d'imagerie sous anesthésie, le porteur citant comme nuisances une infection possible au point d'injection, de la douleur, une inflammation et la fatigue liée aux anesthésies répétées. L'ARN messager injecté ne code aucun principe actif mais une protéine luminescente, servant seulement à visualiser où les nanoparticules se rendent. Le bénéfice avancé se limite à "évaluer le potentiel" de nouvelles formulations dans l'optique d'améliorer les vaccins à ARN, quand les atteintes décrites sont, elles, immédiates.
Objectifs
L’objectif est de tester différentes formulations de nanoparticules lipidiques qui pourraient être utilisées pour la fabrication de vaccin. Afin de visualiser l’efficacité des nanoparticules, un ARN messager permettant l’expression d’un rapporteur d’imagerie sera utilisé dans les formulations.
Bénéfices attendus
Evaluer le potentiel de nouvelles formulations de nanoparticules lipidiques dans l’optique d’améliorer les vaccins ARN.
Procédures
Injection dans le muscle des formulations : 30 secondes, 1 fois. Injection dans le péritoine : 10 secondes, 3 fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances peuvent provenir de : 1. L’injection intramusculaire : infection au niveau du site d’injection, douleur, inflammation. 2. Suivi en imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention.
Devenir
Nous envisageons de prélever des organes après l'euthanasie afin de faire des tests complémentaires.
Remplacement
L’objectif est de développer de nouvelles formulations de nanoparticules lipidiques qui pourraient être utilisées pour la fabrication de vaccin . Même si les formulations seront validées en amont sur des cultures cellulaires, la finalité est le test sur des modèles in vivo avant d’envisager un passage en clinique.
Réduction
Les formulations seront préalablement testées et validées in vitro avant d’être injectées à l’animal. Seules les formulations validées seront utilisées. Le suivi se fait par imagerie de bioluminescence qui est une technique d’imagerie non invasive permettant de faire un suivi du début à la fin sur un même animal ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque animal est son propre témoin. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. En cas de léger mal être un antidouleur sera administré à l'animal.
Choix des espèces
L'imagerie optique est plus sensible et facilement réalisable sur le petit animal tel que la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation.
Etude du rôle d’EZH2 sur un modèle expérimentale de polyarthrite rhumatoïde murin
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux injections d'une émulsion de collagène à la base de la queue, à vingt et un jours d'intervalle, déclenchent l'arthrite, ce qui peut provoquer des grattages et des plaies. Les articulations des pattes gonflent, avec des difficultés possibles à se déplacer, à saisir et donc à se nourrir, tandis que chaque souris est contenue cinq à dix minutes par jour et soumise jusqu'à une heure trente de tests de réponse à la douleur, deux à trois fois par semaine pendant six semaines. Le porteur conclut que la mesure de la réponse aux stimulations thermiques et mécaniques est une méthode "irremplaçable" pour estimer la douleur et que la procédure présente un "caractère de stricte nécessité".
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique, caractérisée par une atteinte articulaire, souvent bilatérale et symétrique, évoluant par poussées vers la déformation et la destruction des articulations atteintes. Il s’agit du plus fréquent rhumatisme inflammatoire chronique, touchant entre 0,5 et 1% de la population mondiale, et touchant 4 fois plus les femmes que les hommes. Les premiers symptômes se traduisent par des douleurs articulaires, des rougeurs et des gonflements des articulations, en particulier des mains et des pieds. A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement de la PR, seulement des moyens de soulager la douleur ou réduire l’intensité des symptômes. Il est donc nécessaire de développer des médicaments à la fois efficaces contre la progression de la maladie mais aussi ses symptômes et notamment la douleur. Différentes études suggèrent que la modulation d’EZH2, une histone méthyltransférase, pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour le traitement de la PR. En effet, des études in vitro et in vivo ont démontré que l’inhibition d’EZH2 permet de réduire l’inflammation dans de nombreux contextes physiopathologiques. Plus particulièrement, le laboratoire a démontré que dans des modèles murins d’arthrose, une autre pathologie articulaire inflammatoire, l’inhibition d’EZH2 par l’EPZ-6438 permet de réduire la progression de la maladie (destruction de l’articulation), et la douleur associée. Dans la mesure où, comme dans l’arthrose, l’expression d’EZH2 est augmentée dans l’articulation des patients arthritiques, il a été proposé que l’inhibition d’EZH2 pourrait réduire la progression de la PR. Dans ce contexte, le but de cette étude est d’évaluer l’effet de l’inhibition d’EZH2 dans un modèle expérimental d'arthrite afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’envisager de nouvelles pistes de traitements. Contrairement à la plupart des études pré-cliniques qui visent à évaluer uniquement la capacité de nouveaux traitements à inhiber l’inflammation et la destruction des articulations, nous évaluerons ici à la fois ces paramètres (inflammation, destruction et/ou gonflement de l’articulation) mais aussi la capacité de l’inhibiteur d’EZH2 à réduire la douleur. En effet, c’est l’intérêt clinique majeur pour les patients.
Bénéfices attendus
Plusieurs laboratoires dont le nôtre ont démontré que l’inhibition d’EZH2 par l’EPZ-6438 ralentit la progression de l’arthrose en réduisant la dégradation du cartilage et l’inflammation articulaire, et améliore les fonctions motrices des souris ainsi que la douleur, ce qui suggère qu’EZH2 serait une cible thérapeutique intéressante dans le traitement de cette pathologie articulaire. Pour cette étude, nous nous attendons à des effets comparables voire plus prononcés dans la mesure où l’arthrite est une maladie articulaire à forte composante inflammatoire. Les bénéfices attendus sont donc l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la PR, capable d’induire une réduction des signes cliniques (réduction du gonflement et de l’inflammation sur les pattes des animaux, réduction de la douleur/sensibilité tactile). L’EPZ-6438 étant un traitement déjà utilisé en médecine humaine pour le traitement de certains cancers, une stratégie de repositionnement du médicament dans cette nouvelle indication pourrait être envisagée.
Procédures
Les animaux recevront deux injections à 21 jours d’intervalle pour induire l'arthrite ainsi que deux injections par semaine pendant 3 semaines pour le traitement. Une contention régulière afin d’observer les animaux et les signes cliniques de la maladie seront nécessaires quotidiennement (5-10 min par jour et par animal). Des tests de comportement permettant de mesurer la réponse à la douleur seront effectués 2 à 3 fois par semaine (1h30 par jour par animal maximum) pendant 6 semaines. Un prélèvement sanguin sera effectué sous anesthésie générale avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
L’induction de l’arthrite se traduit généralement par le gonflement des articulations des pattes ainsi que par l’apparition de rougeurs. Ces gonflements, s’ils atteignent un stade élevé, peuvent induire des difficultés à se déplacer et à la préhension et donc des difficultés à se nourrir et à une réduction de la mobilité. Une perte de poids peut donc être attendue. L'injection de l'émulsion de collagène à la base de la queue peut générer une irritation conduisant la souris à se gratter au point d'injection et à former des plaies. Aucun effet secondaire ou mortalité n’ont été mis en évidence sur les souris après administration répétées d’EPZ-6438 dans la littérature.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de procéder à des analyses des tissus.
Remplacement
Au sein de notre projet scientifique, nous étudierons l’impact d’un traitement contre la PR, une maladie inflammatoire chronique qui touchent plusieurs articulations. La physiopathologie est complexe avec l’implication de nombreuses cellules immunitaires (lymphocytes, macrophages, etc) et articulaires (chondrocytes, synoviocytes), ne permettant pas de récapituler l’ensemble des processus in vitro. Ainsi, l’impact du traitement par l’EPZ-6438 sur l’évolution de la maladie (notamment gonflement des pattes et rougeurs) ne peut pas être évalué sur un modèle ex vivo ou in vitro. De même, l’analyse comportementale et notamment l’évaluation de la réponse à des stimulations thermiques et mécaniques est une méthode irremplaçable pour estimer la douleur, que nous ne pouvons pas substituer par des méthodes alternatives. Ainsi, la procédure expérimentale décrite dans ce projet a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Notre projet scientifique applique le principe de la réduction puisque pour déterminer le nombre d’animaux prévu pour cette étude, des tests statistiques notamment le test de puissance a été réalisé. Le nombre d’animaux requis pour l’étude a été déterminé après avoir effectué un test statistique de puissance. En se basant sur les données de la littérature correspondant à notre étude (score clinique de l’arthrite et évaluation de la douleur), l’effectif par groupe a été déterminé à 15 animaux par groupe soit un total de 180 animaux. Cependant, les données cliniques de l’arthrite indiquent que le sexe a une influence significative sur le développement de la pathologie et notamment la mise en place de la réponse du système immunitaire, nous souhaitons donc étudier l'effet du sexe. Nous prévoyons donc des groupes composés de 15 souris mâles et 15 souris femelles. Un total de 90 animaux par modèle d’arthrite est donc nécessaire. Les deux modèles d’arthrite (modèle de poussée à fort caractère inflammatoire et modèle précoce) seront étudiés. Ce projet nécessite donc un total de 180 animaux.
Raffinement
Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Des points limites ont été definis pour chaque procédure. Les gestes susceptibles d’entraîner une douleur ou un stress seront réalisés sous anesthésie et l'administration d'un analgésique est prévu pour limiter la douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de matériel de nidication et igloo en carton).
Choix des espèces
Deux souches de souris seront utilisées dans ce projet. L'injection de collagène de type II chez la souris DBA/1J entraine le développement d’arthrites sévères par réaction auto-immune, ce qui représente un bon modèle des phases de poussées de la maladie. La deuxième souche de souris mime les phases précoces de la maladie chez l’homme, avec l’apparition d’une arthrite moins sévère. Les souris utilisées sont âgées de 7 semaines, elles sont alors adultes et ont fini leur croissance.
Etude de la fonction des macrophages de la cavité péritonéale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une unique injection dans l'abdomen d'une dizaine de secondes, susceptible de provoquer une inflammation au point d'injection, avant que le contenu de sa cavité péritonéale ne soit analysé après sa mort. Le projet vise à décrire une population de cellules immunitaires, les petits macrophages péritonéaux, dont la fonction reste inconnue, avec l'espoir lointain d'applications lors de dialyses péritonéales humaines. Aucun calcul ne vient étayer l'effectif de 1 040 animaux, le porteur indiquant seulement qu'il utilisera un nombre minimum mais nécessaire à des analyses statistiques pertinentes.
Objectifs
La cavité péritonéale est l’espace physique contenant les organes de l’abdomen comme le foie, l’estomac et les intestins. Cette cavité contient du fluide péritonéal, qui agit comme un lubrifiant facilitant les mouvements et réduisant la friction entre les organes. De nombreuses cellules immunitaires résident au sein de cette cavité. Chez la souris comme chez l’Homme, la majorité de ces cellules immunes sont des macrophages et des cellules dendritiques qui jouent un rôle clé au cours des réponses immunitaires. En particulier, une population de cellules appelée « petits macrophages péritonéaux » (PMP) a été identifiée chez la souris et chez l’Homme. La fonction des PMP reste totalement inconnue. Des études préliminaires chez l’Homme et chez la souris ont révélé une forte ressemblance entre les PMP et les macrophages (ce qui explique leur nom), mais aussi des points communs avec d’autres cellules immunitaires appelées cellules dendritiques. Leur profil « hybride » suggère que ces cellules puissent avoir la capacité d’activer la réponse immunitaire adaptative, menant notamment à la production d’anticorps. Les PMP circulent librement au sein du fluide péritonéal, mais ils peuvent également adhérer à la surface des organes péritonéaux et en particulier à l’omentum. L’omentum est un organe juxtaposé à l’estomac, qui contient des aggrégats de cellules immunitaires. Les PMP peuvent également être recrutés à l’omentum et nous émettons l’hypothèse que ces cellules peuvent y intéragir avec d’autres cellules immunitaires pour les activer. Les objectifs du projet sont : 1/ Caractériser précisémment les PMP au sein de la cavité péritonéale. 2/ Caractériser la capacité des PMP à intéragir avec les autres cellules immunes au sein de l’omentum activer la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
La cavité péritonéale contient de nombreuses cellules immunitaires ayant la capacité de phagocyter des pathogènes au cours de la réponse immunitaire innée, mais également de présenter des antigènes et activer le système immunitaire adaptatif. En particulier une partie de ces cellules appelées « PMP » sont parfaitement homologues chez la souris et chez l’Homme, cependant l’origine et la fonction de ces cellules restent indeterminées. Ce projet permettra d’étudier en détails la biologie des PMP afin de comprendre la fonction de ces cellules. Notre étude sur modèles murins est réalisées en parallèles d’une étude de PMP humains obtenus chez des patients nécessitant un recours à des dialyses péritonéales. A long terme, l’identification de facteurs régulant la génération, la survie et les fonctions des PMP permettrait de cibler ces cellules. Il est envisageable que nos approches d’édition génétique et transfert intrapéritonal soient applicables à l’Homme, au cours de dialyses péritonéales par exemple.
Procédures
La seule intervention réalisée au cours de nos protocoles est une injection intrapéritonéale, effectuée sur animaux vigiles. Chaque souris incluse dans notre protocole (1040 animaux) recevra une injection intrapéritonéale au cours de sa vie. La durée de cet acte (contention, injection et remise en cage) est d’environ 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets négatifs attendus sont liés au stress subit par les souris lors de la contention et de l’injection péritonéale. Lors de ces injections, une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure dans le but d’analyser le contenu cellulaire de la cavité péritonéale et répondre aux objectifs scientifiques définis.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, des études in vitro seront réalisées sur des cellules primaires et lignées cellulaires. Cependant, pour comprendre en détails l’origine et les fonctions des PMP, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans la cavité péritonéale et entre les différents organes. Notamment, les cellules stromales de la cavité péritonéale sont source de facteurs de croissance permettant la différenciation et le maintien des cellules immunitaires. Ces cellules diffèrent selon leur localisation au sein de la cavité et l’aspect spatial est donc essentiel dans notre étude.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, les souris seront maintenues au sein de notre élevage, 100% d'entre elles pourront être utilisées pour l’expérimentation. Si une cohorte numériquement plus importante est nécessaire, nous achèterons ces souris auprès d’un fournisseur agréé pour répondre à ce besoin ponctuel. Afin de réduire davantage le nombre de souris, nous utiliserons une approche d’édition génétique, ce qui permettra d’éviter la génération de nombreuses lignées murines. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Dans le cas d’une injection intrapéritonéale, nous surveillerons l’aspect du site d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (dont la fréquence est adaptée à la procédure) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des grilles d’observation ont été établies et des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure. Un animal avec une blessure sans perte de substance sera isolé et la blessure sera traitée avec un antiseptique (une fois par jour s’il n’y a pas de suintement et 2 fois par jour s’il y a suintement). Nous éviterons l’utilisation de méthodes d’identification ou de biopsies pour ces animaux et confirmerons seulement leur genotype post mortem, ce qui permettra d'éviter un geste invasif sur ces souris.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. D’autre part, nous disposons des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. De plus, nous étudions des populations cellulaires présentes chez l’Homme comme chez la souris. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Ces critères font de la souris l’espèce la plus adaptée pour répondre à nos questions scientifiques. Nous utiliserons des souris âgées d’au moins 6 semaines, correspondant à un stade auquel le développement est complet et la maturité sexuelle est atteinte.