Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de l’activation des cellules myéloïdes dans les maladies d’inflammation vasculaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris dont la douleur ne cède pas au traitement analgésique sont tuées, l'atteinte d'un point limite entraînant l'arrêt du protocole. 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs organes. Les modèles de vascularite rénale et pulmonaire qui leur sont imposés peuvent provoquer une insuffisance rénale, une gêne respiratoire, un affaiblissement général et une perte de poids, et chaque souris subit selon le protocole des injections dans le péritoine à l'état vigile, trois injections derrière l'œil sous anesthésie, une instillation dans le nez et jusqu'à huit heures en cage métabolique. Les retombées annoncées tiennent à des molécules ciblant deux récepteurs, déjà en développement pour d'autres maladies, dont le porteur écrit qu'elles pourraient ouvrir des perspectives dans les vascularites.
Objectifs
Les vascularites, maladies inflammatoires des vaisseaux sanguins, représentent un groupe hétérogène de maladies systémiques avec des mécanismes physiopathologiques distincts et des stratégies thérapeutiques distinctes. Les vascularites sont classées selon la taille des vaisseaux affectés et peuvent conduire à l’altération d’autres organes tels que les poumons et les reins. Ces pathologies se caractérisent par la présence d’un infiltrat inflammatoire, composé particulièrement de cellules immunitaires, qui viennent envahir la paroi aortique, entraînant un remodelage de cette dernière pouvant aller jusqu’à l‘occlusion du vaisseau. Une meilleure compréhension des facteurs impliqués dans la régulation des cellules inflammatoires et aortiques est indispensable. Les objectifs du projet est d’étudier le rôle de deux récepteurs présents à la surface des cellules immunitaires, les monocytes/macrophages, et leur modulation au cours des maladies inflammatoires. Les modèles murins de maladies inflammatoires étudiés seront des modèles de vascularites rénales, pulmonaires et des gros vaisseaux, et un modèle de réponse inflammatoire systémique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence l’implication potentielle de deux récepteurs membranaires présents à la surface des monocytes/macrophages dans la physiopathologie de maladies inflammatoires, notamment les vascularites affectant les vaisseaux de gros et petit calibre, entraînant l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Des molécules venant cibler ces récepteurs sont en cours de développement dans d’autres pathologies, et les travaux réalisés pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans les vascularites.
Procédures
Prélèvement à la queue (1fois 30sec) sur souris vigile, une injection intra-péritonéale (10 secondes, nombre d'injections variant selon le protocole), une injection rétro-orbotaire sous anesthésie (15 secondes, 3fois), une instillation intranasale sous anesthésie (1fois), une injection intraveineuse (45sec, nombre d'injections variable selon le protocole), un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie (45 sec). Cages métaboliques : inférieur à 8h avec accès à l'eau.
Impact sur les animaux
Les différents modèles peuvent induire un affaiblissement général de l’animal, asthénie, perte de poids, insuffisance rénale (modèle de glomérulonéphrite et vascularite rénal), gène pulmonaire (modèle de vascularite pulmonaire). L’ensemble des modèles peut induire des douleurs de courtes durées et peu intenses liées aux injections. Enfin, un stress chez les animaux peut survenir subissant des contentions et manipulations répétées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever le sang et les organes pour y réaliser des analyses cytologiques et histologiques.
Remplacement
Les vascularites et maladies systémiques impliquent des réponses immunitaires complexes au sein de divers organes. Actuellement, les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire finement l’environnement physiopathologique dans lequel la réponse immunitaire est mise en jeu. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de la physiopathologie de ces maladies observées chez l’Homme. Les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitment, doses et voies d’administration). Nous avons déterminé un nombre d’animaux restreint au maximum, de sorte à obtenir des résultats permettant d'obtenir la puissance statistique nécessaire pour y ttirer des conclusions biologiquement pertinentes. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Les méthodes d'imagerie étant non invasives et non douloureuses, les animaux pourront être suivis au cours temps et les paramètres étudiés seront mesurés à chaque passage pour chaque animal. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.
Raffinement
Les injections intra-péritonéales seront réalisées sur animal vigile tandis que les injections rétro-orbitaires et pulmonaires seront réalisées sur animal anesthésié et posé sur un tapis chauffant pour le confort de l’animal. Pour les injections répétées nous alternerons les points d’injections afin de maintenir le confort de l’animal. Une évaluation générale de l’animal, basée sur son apparence physique et comportemental, sera faite grâce à l'établissement de points limites. Le poids corporel sera relevé tous les 3 jours pour les traitements inférieurs à 10 jours et 1 fois par semaine pour ceux supérieurs à 10 jours. Les animaux seront élevés dans des cages enrichies et regroupés en groupe sociaux pour éviter tout isolement. Le personnel qualifié assure un suivi quotidien et tout comportement anormal sera reporté au responsable du projet. L’atteinte d’un point limite établi entrainera une mise à mort anticipée de l’animal et l'arrêt du protocole. Nous aurons recours à de l’imagerie non invasive afin de monitorer les lésions inflammatoires dans le cas d’apparition de vascularites spontanées, et de pouvoir suivre l’évolution de ces modèles de la manière la moins invasive possible. Pour toutes les analyses d'imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie au centre du projet sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste ou fluorescent. Les animaux seront surveillés tout au long de l’expérience afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les manipulations seront arrêtées et les animaux mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle animal nous permet de réaliser des expériences de physiopathologie d’inflammation vasculaire et systémique (induit ou spontané) de mammifère en prenant en compte l’ensemble des paramètres physiologiques existant in vivo. Les analyses in vitro ou in sillico ne sont pas relevantes en ce qui concerne l’inflammation vasculaire et systémique car trop de paramètres physiologiques entrent en jeu. Les pathologies induites décrites précédemment font l’objet de protocoles publiés.
Étude de l’homéostasie et fonctionnement de cellules immunitaire et de leurs rôles dans la réponse immunitaire contre des tumeurs solides
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 428 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur par voie intraveineuse, sous la peau ou directement dans la paroi intestinale lors d'une chirurgie de quinze minutes, d'autres sont infectées par une entérobactérie, et certaines sont maintenues endormies deux à quatre heures pour de l'imagerie après une opération de trente minutes. Le porteur estime que les souris rencontrent peu d'effets indésirables et que la localisation de la tumeur ne semble affecter ni leur mobilité ni leur comportement, tout en fixant comme points limites le poil ébouriffé, la prostration et la diarrhée. Aucune ne peut être réutilisée, replacée ou adoptée, ayant reçu des cellules tumorales ou subi une chirurgie viscérale qu'il décrit comme non opérable.
Objectifs
L’objectif du projet consiste à étudier le développement des cellules lymphoïdes (ILCs), ainsi que leurs fonctions dans l’homéostasie tissulaire et dans l’initiation et le maintien de la réponse immune contre des tumeurs et l’infection bactérienne. D’une part, nous analyserons les mécanismes de développement permettant la génération des différents types d’ILCs. Cette étude consistera à déterminer les signaux activateurs et inhibiteurs permettant la génération, le maintien et la régulation fonctionnelle de ces cellules. D’autre part, nous étudierons leurs rôles et leurs interactions au sein du système immunitaire lors de la réponse anti-tumorale et antibactérienne.
Bénéfices attendus
Nous proposons ici de caractériser au niveau moléculaire et cellulaire le mécanisme de surveillance immunitaire des cellules lymphoïdes innées dans un modèle tumoral et infectieux. Ainsi, nous obtiendrons une compréhension intégrée du système immunitaire dans des conditions normales et pathologiques. Ainsi, la compréhension du mécanisme qui régule les premières phases de l'immunité innée contre la progression tumorale et infectieuse pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir l’infection bactérienne ou améliorer l'espérance de vie après la tumorigenèse.
Procédures
Certains animaux recevront une greffe tumorale qui consistera à une intervention chirurgicale de 15 minutes. Les injections instantanées seront réalisées i.v, i.p, et/ou intra lamina propria intestinale. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30 minutes pour effectuer l’imagerie et seront maintenus endormis pendant 2 à 4h.
Impact sur les animaux
Notre projet propose, d’une part d’étudier les cellules lymphoïdes innées (ILCs) infiltrant une tumeur et nécessite la greffe intraveineuse, sous-cutanée ou intestinale de tumeur aux souris et d’autre part d’étudier l’infiltration des ILCs dans le tissu infecté par une entérobactérie. Notre connaissance suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables causés par la pousse tumorale ou l’infection bactérienne. La localisation de la tumeur ne semble pas impacter leur mobilité, leur alimentation, leur pelage et leur comportement et l’infection aura des effets transitoires sur le poids de la souris. Nos précédentes expériences montrent que l’injection de molécules (anticorps) que nous proposons d’étudier dans ce projet n’aura pas d’effets indésirables dans la période expérimentale. Injection des tumeurs par voie i.v. : effets légers Injection des tumeurs par vous sous-cutanée : effets modères Injection des tumeurs intestinale : effets modères Infection des souris avec des entérobactéries : effets modères
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales ou une chirurgie viscérale non opérable.
Remplacement
Nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action des ILCs car les modèles in vitro actuels ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieues in vivo. Néanmoins, nous ne réaliserons que les tests in vivo les plus nécessaires (emplacement spatiale des ILCs dans les tumeurs/métastases et la croissance des tumeurs/métastases. Par contre, afin de caractériser la fonctionnalité de l'ILC, nous remplacerons les expériences in vivo par des tests in vitro afin de réduire le nombre des animaux dans les expériences.
Réduction
D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. Le nombre de souris nécessaire à l’expérimentation a été déterminée en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’individus tout en garantissant une significativité statistique des résultats. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de tumeur(s) ou infectés par des bactéri es. L'utilisation cytométrie spectrale nous permet de réduire le nombre d'animaux utilisé car cette technologie permet d'acquérir plus de paramètres que la cytométrie classique à partir d’un un même animal. Dans la mesure du possible, les expériences de cytométrie, séquençage, et d’immunohistochimie seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation.
Raffinement
Modèles tumoraux : Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (poil ébouriffé́, prostration, diarrhée) sont établis pour raffiner les procédures. Nous utilisons ces modèles de tumeurs depuis plusieurs années et nous connaissons leur tumorigenèse dans des souris contrôles et immunodéficientes (absence des cellules lymphoïde adaptatives et innées). D’après notre expérience et la littérature, nous estimons que le développement tumoral dans les souris mutantes comprises dans ce projet se situera entre ces deux extrêmes. Cependant, nous prévoyons les mesures suivantes et dans l’ordre dès apparition d’un signe clinique : l’ajout du gel hydrique dans la cage pour faciliter la réhydratation et prise de nourriture, réhydratation sous-cutanée, amélioration de la température (plaque chauffante ou chaufferette) de la cage et si pas amélioration mise à mort. Dans le cadre de la tumorigenèse pulmonaire et intestinale, la tumeur ne pourra pas être mesurée au cours de l’expérimentation mais le volume tumoral sera mesuré après la mise à mort. Le nombre de cellules tumorales injectées est établi depuis plusieurs années afin de contrôler la pousse tumorale et de pouvoir comparer des résultats de diffèrent projets. L’injection se faisant intraveineuse, sous-cutanée ou intra tissulaire (face intestinale externe), l’animal qui n’aura aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Modèle infectieux : Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (perte de poids, poil ébouriffé́, prostration, diarrhée) sont établis pour raffiner les procédures. Nous utilisons le modèle bactérien depuis plusieurs années et nous connaissons son développement dans des souris contrôles et immunodéficientes (absence des cellules lymphoïde adaptatives et innées). D’après notre expérience et la littérature, les souris utilisées dans la procédure auront une infection proche de celle observée dans les souris controles. Cependant, En cas de souffrance observé, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Le développement lymphocytaire et les réactions immunitaires sont des processus complexes. De façon générale, l’immunité nécessite plusieurs types de lymphocytes participants chacun dans une ou plusieurs interaction(s) directe(s) ou indirecte(s) avec un ordre spatio-temporel. De ce fait, les systèmes de culture in vitro actuels ne permettent pas de modéliser cet environnement complexe. De plus, il n’existe, pour le moment, aucune lignée cellulaire murine ou humaine de cellules lymphoïdes étudiées (NK/ILC1, ILC2, ILC3). Par conséquent, l’étude de ces processus nécessite pour l’instant l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, la compréhension du mécanisme de développement cellulaire faite in vivo, nous permettra probablement d’établir de nouveaux modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires afin de réduire la contribution animale. Par conséquent, le modèle murin est essentiel dans notre domaine de recherche. Le nombre de souris est calculé en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’animaux tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement significatifs dans les différentes conditions expérimentales. Cette évaluation est déterminée grâce à nos données préliminaires et/ou antérieurs et à la bibliographie scientifique. Elle tient également compte de la faisabilité de nos expériences. En effet l’analyse post-mortem nécessite un temps de préparation conséquent, ce qui nous contraint à analyser de petits groupes d’animaux et d’augmenter la répétition des expériences pour une analyse statistique satisfaisante. Cependant, nos résultats précédents ont permis d’estimer les variabilités biologiques et expérimentales et ainsi minimiser la répétition expérimentale.
Infection de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) par Flavobacterium psychrophilum : identification des facteurs de virulence et bases génétiques de la résistance de l’hôte.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour identifier les facteurs de virulence de la bactérie de la flavobactériose et les bases génétiques de la résistance de l'hôte, 13 680 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger pour les témoins et sévère pour les poissons infectés, chez qui l'infection peut conduire à la mort. 8 040 alevins de un à dix grammes reçoivent une injection de la bactérie sous anesthésie, 180 subissent des prises de sang espacées de trois jours pendant un mois, et le protocole retenu pour la dose létale 50 mobilise six doses et dix poissons par condition. Le porteur note qu'aucun élément concret d'appréciation de la souffrance ressentie pendant la maladie ne figure dans la littérature, et annonce chercher des paramètres précoces utilisables à la place de la mortalité, les poissons atteignant le point limite étant sortis du protocole et tués.
Objectifs
L’étude porte sur la bactérie responsable de la flavobactériose d’eau froide qui provoque chez les salmonidés une infection pouvant conduire à des mortalités considérables dans les piscicultures. Cet agent pathogène est l'une des causes les plus courantes de maladie bactérienne en production aquacole de truite arc-en-ciel en eau douce. Aucun vaccin commercialisé n'est actuellement disponible et le traitement repose uniquement sur l’antibiothérapie. Les facteurs intervenant dans la survenue des épisodes infectieux sont encore peu compris. Le projet vise à comprendre les mécanismes de pathogénicité de ces bactéries, les caractères de résistance/sensibilité de la truite arc-en-ciel et les interactions hôte-bactérie, et à contribuer au développement de stratégies de contrôle de la maladie. Pour cela, nous utiliserons des modèles d’infection développés précédemment chez la truite arc en ciel et permettant d’étudier la pathogenèse et l’efficacité de méthodes de contrôle. Ces modèles ont été standardisés et peuvent être de ce fait employés avec des effectifs minimisés. Le projet comprend une analyse conjointe de l’impact des paramètres génétiques de l’hôte et de la bactérie sur le développement de la maladie. Les infections expérimentales permettront de caractériser les gènes impliqués dans le pouvoir pathogène des bactéries (facteurs de virulence) grâce à l’obtention de critères d’appréciation quantitative de la pathogenèse (signes cliniques, cinétique de colonisation et de survie de l’hôte) pour des souches bactériennes génétiquement différentes. Nous rechercherons des paramètres précoces pouvant être utilisés en alternative à la mortalité pour l’analyse de la pathogenèse et des paramètres prédictifs du caractère de résistance de l’hôte. Enfin, les infections expérimentales permettront d’évaluer rigoureusement l’effet de différents paramètres sur la résistance des animaux à l’infection, qu’ils soient génétiques ou environnementaux (régime alimentaire, vaccination, immunostimulants, conditions physico-chimiques d’élevage).
Bénéfices attendus
Le programme de recherche apportera des connaissances fondamentales sur la pathogenèse, permettra de caractériser les déterminants génétiques de la virulence et de la résistance de l’hôte ainsi que leurs interactions. Les résultats obtenus doivent contribuer au développement de méthodes alternatives de contrôle de la maladie (vaccins vivants atténués, marqueurs génétiques de sélection de la résistance) avec à terme une réduction des épisodes infectieux de flavobactériose dans les élevages de truite arc-en-ciel, une réduction de l’usage des antibiotiques et une amélioration du bien-être animal.
Procédures
Les infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie et une seule injection par poisson en moins de 15 secondes sur 8040 poissons. Les prélèvements sanguins se déroule au moins d'une minute sur un même individu sont espacés d’au moins 3 jours sur une période n’excédant pas 1 mois. Ces prélèvements seront réalisés sur 180 poissons.
Impact sur les animaux
Les manipulations (tri, pesée, transfert, injection, imagerie) ainsi que la mise à jeun 24 ou 48 heures avant l’infection engendrent un stress chez les animaux. Aucun élément d’appréciation très concret de la souffrance éprouvée lors de l’évolution de la maladie n’est disponible dans la littérature. Cependant, le niveau de douleur sera considéré comme nul chez les contrôles non infectés en bonne santé, et sévère chez les animaux infectés chez qui l’infection peut conduire à la mort. L’infection peut également conduire certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection et une nage erratique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires permettant d’étudier les facteurs de virulence de l’agent pathogène responsable de la flavobactériose. La quantification de la virulence, la caractérisation de la résistance de l’hôte, la compréhension des interactions hôte-bactérie et l’évaluation de l’efficacité de stratégie de contrôle nécessitent de reproduire la maladie chez l’animal. Ainsi, le projet que nous menons chez la truite arc-en-ciel ne peut être réalisé avec des méthodes alternatives. D’autre part, seul un animal ayant un système immunitaire adaptatif permet d’évaluer l’efficacité d’un vaccin lors d’une épreuve d’infection expérimentale en quantifiant la protection apportée.
Réduction
La dose létale 50 (DL50), c’est-à-dire la dose conduisant à 50% de mortalité, est un protocole de référence en expérimentation animale nécessitant 6 doses avec 10 poissons par condition. Les infections par balnéation ou par injection permettent de comparer la cinétique de survie entre plusieurs conditions (différents génotypes de truite, différentes souches, vaccination ou non, etc). Une même dose infectieuse est utilisée pour tous les groupes testés. La mise en évidence de différences significatives de survie entre les conditions nécessite un effectif total de 90 poissons par condition (60 pour le suivi de mortalité et 30 pour les prélèvements d’échantillons biologiques après euthanasie ou l’imagerie). Afin de limiter le nombre d’individus, les conditions sont testées par 4 ce qui permet de mutualiser le groupe contrôle correspondant à des animaux non infectés.
Raffinement
Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères et les biomasses maximales sont rigoureusement respectées. La qualité de l’eau est optimale et surveillée en permanence. Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés. Une anesthésie par bain est réalisée avant de procéder à l’injection, avant prélèvement de sang ou imagerie. Plusieurs paramètres alternatifs à la mortalité seront évalués dans le cadre du projet : la bactériémie, la charge bactérienne dans les organes cibles et le suivi par imagerie in vivo.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est le modèle classique de la pisciculture continentale européenne : c’est la principale espèce d'élevage en France et c'est l'hôte naturel de la bactérie étudiée dans ce projet. Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants afin de pouvoir quantifier la virulence de l’agent pathogène et la résistance de l’hôte afin de permettre in fine une compréhension de la pathogenèse et une évaluation efficace des stratégies de contrôle de la maladie. Les animaux sont utilisés au stade alevin, soit à des stades relativement précoces (1 à 10 g) où la susceptibilité à l’infection est maximale. C’est à ce stade que les animaux sont le plus sensible dans les élevages à cette pathologie. Néanmoins, dans quelques cas particuliers (évaluation de la durée de protection conférée par la vaccination, quantités d’échantillons biologiques prélevables non suffisantes au stade alevin pour réaliser les analyses), les infections pourront être réalisées sur des individus adultes.
Évaluation de l’effet thérapeutique du transfert adoptif de lymphocytes T humains optimisés dans le traitement de tumeurs solides humaines dans un modèle de souris immunodéficientes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
400 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de cellules cancéreuses humaines dans le flanc puis, pendant trois semaines, une injection intraveineuse hebdomadaire de lymphocytes T modifiés. Une tumeur pousse dans leur flanc. Toutes sont tuées par dislocation cervicale après anesthésie, dès qu'un signe clinique sévère ou trois signes notables apparaissent, pour des analyses effectuées sur des prélèvements post mortem. Le porteur cherche des preuves de concept susceptibles de justifier ces immunothérapies chez l'humain, alors que les essais cliniques déjà menés avec ces cellules ont montré une efficacité anticancéreuse qu'il qualifie lui-même de trop limitée.
Objectifs
L’immunothérapie, devenue une thérapie de référence pour certains cancers, consiste à améliorer les mécanismes de défenses spécifiques du patient pour éliminer le cancer. Parmi les différentes stratégies, l'immunothérapie par transfert adoptif de cellules immunitaires repose sur l’administration à un patient de ses propres cellules immunitaires reconnaissant et éliminant spécifiquement les cellules cancéreuses, appelées « lymphocytes T cytotoxiques ». Des essais cliniques d’injections de ces cellules immunitaires ont déjà été réalisés chez l’humain et, s’ils ont montré une bonne tolérance, leur efficacité anti-cancéreuse est encore trop limitée. Ce programme de recherche préclinique vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité thérapeutique, dans le traitement du cancer de la peau et du cancer colo-rectal, d’immunothérapie par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés. Afin que cette étude soit la plus représentative possible de la pathologie humaine, des souris immunodéficientes (n’ayant plus de système immunitaire) recevront dans un premier temps une greffe de cellules cancéreuses humaines puis dans un second temps des injections de ces lymphocytes T humains optimisés. Cette optimisation passe par des modifications génétiques qui ont pour but de potentialiser les fonctions anti-cancéreuses de ces lymphocytes T.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de ce programme est d’obtenir, à l’aide de ces modèles "in vivo", des preuves de concept précliniques pouvant justifier la mise en place d’immunothérapies par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés, dans le traitement de cancers. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront aussi permettre de prioriser le ciblage de certaines molécules exprimées par ces lymphocytes T.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection en sous-cutanée de tampon salin (avec ou sans cellules cancéreuses) dans le flanc au premier jour de l’étude dans chaque procédure. La procédure d’injection des cellules cancéreuses dans le flanc sera réalisée sous anesthésie. Dans les procédures 2, 3 et 4, les animaux seront également soumis à des injections hebdomadaires (à partir du 7ème jour de l’étude) en intraveineuse d’un tampon salin (avec ou sans cellules immunitaires optimisées) pendant 3 semaines. Ces injections en elles-mêmes sont de l’ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis aux nuisances ou effets indésirables suivants : - une douleur intrinsèque à l’injection (piqûre) dans le flanc ou en intraveineuse, de cellules dans un volume donné de tampon salin. - un refroidissement des souris lors de l’anesthésie. - le développement d’une grosseur tumorale dans le flanc.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le protocole seront mis à mort, car des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem effectués sur les animaux.
Remplacement
Remplacement : Les paramètres observés dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures "in vitro". L'évaluation chez l'humain du bénéfice thérapeutique de l’administration de cellules immunitaires, dans le cadre de traitements anti-cancéreux, nécessite le développement d'études précliniques permettant de vérifier la faisabilité de ces thérapies et de détecter la survenue de premiers effets secondaires délétères. Concernant ces immunothérapies anti-cancéreuses, il est établi que les cellules cancéreuses se comportent différemment "in vitro" et "in vivo", en terme de croissance, de résistance à la mort cellulaire et de capacité à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Notre étude permet d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration des cellules immunitaires injectées au niveau des cellules cancéreuses), et de définir les modalités optimales d’administration de ces cellules immunitaires. Compte-tenu de la difficulté de mise en place d’essais cliniques et de recrutement de patients éligibles, il paraît clair que les informations obtenues suite à ces travaux précliniques, couplées aux données obtenues "in vitro", auront une importance capitale lors du transfert en clinique.
Réduction
Réduction : Le nombre d'animaux a été réduit à des lots de 5 souris (procédure 1) et de 10 souris (procédures 2, 3 et 4). D'un point de vue éthique, le nombre d'animaux utilisé ici est réduit au minimum tout en permettant d’obtenir des différences statistiquement significatives. En effet, plusieurs études publiées dans notre domaine de recherche, et nos propres études antérieures avec des modèles animaux similaires décrivent l'utilisation de 5 animaux par lot pour le développement de greffes de cellules cancéreuses humaines, et 10 animaux par lot pour l’évaluation du bénéfice thérapeutique de l’administration de différents types de lymphocytes T.
Raffinement
Raffinement : Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées (groupe de 5 souris par cage maximum), avec un enrichissement par frisottis et/ou dôme et un accès libre à l’eau et à la nourriture. De façon à diminuer le stress, les différentes procédures seront réalisées sous anesthésie. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l'étude avec une évaluation des signaux généraux (visite 3 fois par semaine en présence d’un signe clinique notable et visite quotidienne en présence de deux signes cliniques notables. De plus, en présence de trois signes notables ou un signe sévère : les animaux seront mis à mort après une anesthésie, par dislocation cervicale. Les signes cliniques sont basés sur le comportement/mouvement, l’aspect physique extérieur, la manipulation, la consommation de nourriture, l’excrétion, l’évolution du poids, l’évolution de la tumeur, l’aspect de la tumeur).
Choix des espèces
Les souris sont des modèles d'étude pertinents, notamment en immunothérapie pour le traitement des cancers, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de greffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients pour éviter le rejet de greffe, tels que les souris NSG. Ces souris permettent la croissance de nombreuses lignées tumorales humaines et l'utilisation thérapeutique de cellules immunitaires d'origine humaine. Les souris seront utilisées à partir de 9 semaines (période où le poids se stabilise), pour des raisons de maturité du développement squelettique, facilitant non seulement le geste lié aux greffes de cellules cancéreuses et de lymphocytes T, mais renforçant aussi la pertinence des effets thérapeutiques.
Etude de l’effet de la phéromone apaisante du lapin (Rabbit Appeasing Pheromone, RAP) sur le développement du microbiote intestinal du lapereau et implications fonctionnelles sur la physiologie des systèmes digestifs et immunitaires
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Réduire les troubles digestifs du sevrage et l'usage d'antibiotiques dans les élevages de lapins : c'est à cette fin qu'une phéromone de synthèse est testée sur 6 lapines et 48 lapereaux, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque lapereau est immobilisé et piqué à la veine d'une patte arrière à l'état éveillé, jusqu'à six fois à raison d'une par semaine, et trente-deux d'entre eux vivent seuls en cage grillagée pendant trente-cinq jours, vingt-trois heures par jour en semaine et vingt-quatre le week-end. Le porteur reconnaît que cet hébergement individuel peut provoquer des comportements anormaux et une baisse d'activité, et que la collecte hebdomadaire de leurs fèces molles les prive d'un aliment qu'ils consomment normalement. Les 48 lapereaux sont tués au trente-cinquième ou au soixante-dixième jour pour prélever leur intestin, les 6 mères étant gardées vivantes, jeunes et en bonne santé, pour de futures procédures.
Objectifs
Le bien-être des lapins domestiques est une préoccupation croissante en Europe. Qu'ils soient des animaux de compagnie ou d'élevage, ils sont souvent soumis à des situations stressantes comme la manipulation, les changements d'environnement, les rencontres avec d'autres lapins, les déplacements ou les visites chez le vétérinaire. Il est crucial d'améliorer l'élevage des lapins pour les rendre plus résistants et mieux adaptés à leur environnement. Aujourd'hui, l'élevage vise à assurer leur bien-être, à optimiser leur alimentation, à renforcer leur système immunitaire et à réduire l'usage des antibiotiques. Le microbiote (l’ensemble des virus, bactéries, champignons) intestinal des lapins joue un rôle vital dans ces objectifs. Il influence la digestion, le métabolisme, la santé intestinale, l'immunité et même le fonctionnement cérébral. Les premières semaines de vie sont essentielles pour le développement du microbiote car c'est à ce moment-là que l'intestin des lapins est colonisé par des micro-organismes. Ce projet de recherche examine si l'utilisation de phéromones apaisantes maternelles durant les premières semaines de vie des lapereaux, notamment lors de moments tels que la séparation de la mère, le sevrage et le mélange d'animaux, peut réduire le stress et influencer la composition du microbiote intestinal. Des études antérieures suggèrent que les phéromones pourraient influencer le microbiote. Cette recherche vise à approfondir ces connaissances en examinant l'effet des phéromones sur différentes espèces d'élevage, y compris les lapins, qui sont particulièrement sujets à des problèmes intestinaux. Réduire l'usage d'antibiotiques dans l'élevage des lapins nécessite de nouvelles approches pour maintenir leur santé, en particulier pour prévenir les troubles digestifs après le sevrage, liés à des déséquilibres dans le microbiote intestinal et/ou à une immaturité de l'intestin et/ou du système immunitaire. Cette étude vise à déterminer si l'exposition des lapereaux aux phéromones pendant leurs premières semaines de vie peut favoriser le développement d'un microbiote intestinal sain, ainsi que la maturation et le bon fonctionnement de leur système digestif et immunitaire. Pour ce faire, différents aspects seront étudiés, comme la composition du microbiote intestinal, la fonction immunitaire, la structure de l'intestin, la capacité de l'intestin à agir comme barrière protectrice, les capacités digestives, ainsi que le comportement des animaux.
Bénéfices attendus
Le bien-être des lapins de compagnie et d'élevage est de plus en plus important en Europe. Par exemple, dans les élevages de lapins, les maladies intestinales restent une grande menace. Le stress peut affaiblir le système immunitaire, entraînant des réponses immunitaires moins efficaces. Cela peut causer des problèmes digestifs après le sevrage, une période de grands changements pour les lapins. Leur système immunitaire n'est pas encore complètement développé à ce stade. Le microbiote intestinal joue un rôle crucial dans le développement du système immunitaire et digestif. Une idée intéressante pour améliorer la santé des lapins, et prévenir les maladies intestinales, est de favoriser un bon microbiote. Utiliser une phéromone apaisante maternelle de lapin pourrait aider à réduire le stress et à améliorer leur bien-être. Ce projet vise à montrer comment cette phéromone peut aider à développer un microbiote intestinal sain et diversifié, renforçant ainsi les défenses immunitaires et digestives et réduisant les effets du stress. À long terme, cela pourrait réduire l'utilisation d'antibiotiques chez les animaux domestiques, contribuant ainsi à lutter contre l'antibiorésistance et à améliorer les pratiques d'élevage, conformément au concept "Une seule santé".
Procédures
Tous les lapereaux (48 au maximum) subiront au moins une fois une immobilisation et un prélèvement sanguin réalisé sur animaux éveillés. Cette intervention (immobilisation et prise de sang) devrait être d'une durée inférieure à 10 minutes/lapin. Pour deux tiers des lapereaux (32 au maximum), cette intervention (immobilisation et prise de sang) sera répétée encore 5 fois, à raison d'une fois/semaine, jusqu'à la fin de la procédure au 70ème jour. Deux tiers des lapereaux (32 lapereaux au maximum) seront hébergés individuellement, toutefois sans isolement visuel, olfactif et auditif d'avec les autres lapins, et dans des cages métalliques grillagées spacieuces fournies avec du matériel d'enrichissement, pendant 35 jours, à raison de 23h maximum par jour les jours de semaine, et 24h par jour le week-end. En effet, les lapereaux issus d’une même portée (pour assurer la compatibilité avec les autres lapins) seront sortis de leurs cages et regroupés dans un « parc d’activités » (enclos sur 2 niveaux, avec paille, matériel à ronger, jouets, tunnel, rampe, cabane) pour leur permettre exercice physique et socialisation avec les autres lapins et les habituer à la manipulation, à raison d’1h/jour minimum, tous les jours de semaine.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les nuisances attendues pour les animaux sont représentées par : (i) les conditions d’hébergement puisque dans la phase 2 de l’étude, les animaux seront hébergés individuellement (sans isolement visuel, auditif et olfactif) au-delà de 24h. Cela peut conduire à l’apparition de comportements anormaux chez les animaux, une baisse de leur activité physique et à une altération de leur bien-être ; (ii) par la privation d’une partie de leurs fèces molles lors des prélèvements hebdomadaires de ceux-ci, empêchant leur consommation si celle-ci se met en place avant la fin de l’étude, pouvant possiblement altérer les apports nutritionnels au lapin ; (iii) par la manipulation et la contention des lapereaux lors des pesées et prises de sang dans la phase 2, possiblement sources de stress psychologique; (iv) par l’introduction d’une aiguille dans la veine de la patte arrière sur animal éveillé lors des prises de sang dans la phase 2, qui peut être source de douleur et possiblement créer un hématome sur le site du prélèvement; (v) par la piqûre pour l'anesthésie préalable à l’injection d’euthanasiant lors de la mise à mort des animaux (au 35e et 70e jour) qui peut être source de douleur.
Devenir
Les 6 lapines gestantes puis mères n'auront subi qu'une procédure légère (exposition au traitement pendant 45 jours, et seulement pour la moitié d'entre elles de surcroit, le groupe placebo n'étant pas exposé à la phéromone apaisante), elles seront encore jeunes, attendues en bonne santé, et donc pourront être réutilisées dans de futures procédures. Tous les laperaux (48 individus au maximum) seront mis à mort au cours de la procédure (soit au 35ème jour pour 1/3 d'entre eux, soit au 70ème jour pour 2/3 d'entre eux) car l'étude implique des prélèvements léthaux, qui seront réalisés post-mortem: tissus intestinaux (section et muqueuse de l'iléon) et contenu intestinaux (digesta du caecum et de l'iléon). Ces prélèvements seront utilisés dans des analyses biologiques visant notamment à déterminer la composition du microbiote (proportion et identité des différentes bactéries), la présence de certaines espèces bactériennes favorables, la structure/architecture de la muqueuse intestinale, à mesurer l'expression de certains gènes modulant le système immunitaire et la fonction barrière intestinale.
Remplacement
Il s’agit d’une étude de recherche fondamentale investiguant les effets de la phéromone apaisante de lapin sur le comportement, les paramètres d'élevage, la physiologie des systèmes digestifs et immunitaires, et le microbiote (communauté des micro-organismes) du lapin, le tout formant des systèmes biologiques interdépendants et s’influençant mutuellement. En tant qu'étude de physiologie, elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants, qui représentent des systèmes biologiques intégrés, où de multiples organes/tissus fonctionnent de façon associée et coordonnée. En effet, l’utilisation de traitement phéromonal est une stimulation sensorielle par exposition à des phéromones qui nécessite l’utilisation d’organisme entier pouvant détecter et réagir aux composés testés. La détection de ces composés peut engendrer une cascade de réactions physiologiques pouvant mener à une modification du comportement ou de la physiologie de l’animal. Cela ne peut être obtenu et observé que sur animaux entiers pouvant pleinement exprimer leurs comportements et physiologies naturels. Il n'existe pas actuellement de méthodes de remplacement pouvant simuler ces changements suite à une stimulation sensorielle. Cela nécessite donc l’implication d’êtres vivants, dans ce cas des lapins.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans l'étude est déterminé par des calculs statistiques pour détecter un effet significatif du traitement, basés sur des études précédentes. En fonction des données et des tests, 3 à 12 unités par traitement sont nécessaires pour observer une différence significative entre les groupes (placebo vs. phéromone). Dans la phase 1, les lapereaux sont logés ensemble, donc l'unité est la cage/portée en raison de la collecte des fèces qui ne peut être individualisée. Chaque groupe comprendra au moins 3 lapines gestantes pour garantir une variété génétique et une représentativité des résultats et permettre l’analyse statistique. Cela signifie que 18 à 24 lapereaux naîtront ensuite dans chaque groupe (selon le taux de naissance et de mortalité des lapereaux). A la fin de la phase 1 et avant la phase 2, un tiers des lapereaux sera mis à mort, laissant 12 à 16 lapereaux pour être logés individuellement et collecter leurs fèces de manière individuelle. Tous les paramètres mesurés seront alors rapportés à chaque lapereau qui est ici l’unité. Les analyses statistiques compareront les traitements sur les paramètres biologiques. Des modèles statistiques seront utilisés, avec des analyses multivariées dans la phase 2. Des précautions seront prises pour éviter les biais (randomisation, aveuglement des traitements, etc.).
Raffinement
Les cages, métalliques à barreaux, sont fournies d’une litière, une plateforme/abri, du matériel à ronger (buchettes en bois, boules en osiers, balles de foin, balle en plastique). Dans la phase 1, une boite à nid à rebords hauts avec litière est fournie aux lapines gestantes. Dans chaque salle sont réglés les paramètres nécessaires à l’espèce en termes de température, luminosité, ventilation et humidité. Pour compenser l’hébergement individuel dans la phase 2, les cages seront les unes à côté des autres pour permettre le contact visuel, olfactif et auditif entre les lapins. De plus, lors de cette phase, les lapereaux issus d’une même portée seront sortis de leurs cages et regroupés dans un « parc d’activités » (enclos sur 2 niveaux, avec paille, matériel à ronger, jouets, tunnel, rampe, cabane) pour leur permettre exercice physique et socialisation et les habituer à la manipulation, à raison d’1h/jour minimum, tous les jours de semaine. Afin de limiter la réaction de peur des lapins, l’opérateur frappe 3 fois à la porte pour avertir de son entrée. Aussi, des séances de socialisation (caresser les lapins dans leur cage) seront prévues pour limiter la peur des lapins durant la sortie de la cage et des manipulations. Les prélèvements sanguins respectent les recommandations en termes de volumes et fréquences, et sont effectués par un vétérinaire et/ou un opérateur expérimenté, toujours en binôme avec un autre operateur formé à la contention. Les prises de sang se déroulent dans une salle différente à l’élevage, loin des autres lapins, dans une ambiance calme. Pour éviter la réaction de douleur du lapin à la perforation de la peau, un gel anesthésique local est appliqué avant la ponction sanguine. Une serviette pourra être utilisée pour mieux contenir le lapin et diminuer sa peur. La pesée des lapins provoque peu de stress car les animaux sont introduits dans une boite qui est posée sur la balance, évitant ainsi la contention des animaux. La pesée servira aussi à suivre la croissance des animaux et détecter d’éventuels problèmes de santé. De même, lors du recueil des féces molles au crépuscule des lapins, l’opérateur notera si des comportements anormaux (par exemple, rongement des barreaux) se manifestent à ce moment particulier d’activité plus élevée des lapins.
Choix des espèces
La phéromone apaisante testée est une version artificielle de la phéromone que les mères lapines produisent pour calmer leurs petits après la naissance. Nous avons choisi d'étudier les lapins car ce sont des mammifères herbivores à un seul estomac, souvent utilisés en laboratoire et pour lesquels nous disposons de nombreuses méthodes d'analyse validées. Les résultats de cette recherche pourraient également être appliqués et bénéficier aux lapins de compagnie et d'élevage en améliorant leur santé intestinale et leur bien-être. Nous utilisons des lapines gestantes adultes car elles sont sexuellement matures, et des lapereaux juvéniles, depuis la naissance jusqu'à 10 semaines, avant qu'ils ne soient sexuellement matures. Cette période d'âge jeune est cruciale pour le développement de leur microbiote intestinal, influencé par la génétique, l'alimentation, l'hygiène, l'environnement et le stress. Le sevrage, qui marque le début de l'alimentation solide, peut être stressant pour les lapereaux, perturbant leur flore intestinale et leur santé digestive et immunitaire. Nous couvrons donc tous les moments importants pour comprendre comment le microbiote intestinal se forme et influence le développement des systèmes digestif et immunitaire.
Etude de la physiopathologie hépatique à l’aide de modèles murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 415 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur foie et de leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une injection de virus dans une veine, d'anti-œstrogènes ou d'un agent chimique qui fait apparaître des tumeurs du foie, ce dernier chez des souriceaux de 14 jours, puis en moyenne huit échographies sous anesthésie, des injections d'anticorps tous les trois jours pendant deux mois au plus, une toxine qui provoque une hépatite ou une chirurgie abdominale terminale. Ces tumeurs peuvent conduire, selon le porteur, à une encéphalopathie mortelle sans perte de poids. L'équipe veut comprendre pourquoi une même mutation donne deux types de tumeurs du foie, résistantes à l'immunothérapie, et en tirer des pistes de traitement. Le porteur affirme qu'il est "crucial de travailler sur des modèles murins pertinents", tout en prévoyant de mettre au point des cultures de tumeurs en trois dimensions pour tester de futurs médicaments.
Objectifs
Ce projet s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais une majorité des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie.
Bénéfices attendus
En aidant à la compréhension des mécanismes moléculaires, métaboliques et immunitaires de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.
Procédures
1) En premier geste, les animaux pourront subir soit : a) une injection intraveineuse unique de virus sous anesthésie générale en 30s b) une injection intrapéritonéale unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles sous contention en 30s c) une injection intrapéritonéale unique d'un agent chimique induisant des tumeurs du foie sur animaux vigiles sous contention en 30s 2) En second geste, les animaux pourront subir: a) une échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne) b) une chirurgie abdominale terminale sous anesthésie générale et analgésie pendant 15min c) une injection intrapéritonéale d’anticorps ciblant le système immunitaire sur animaux vigiles sous contention tous les 3 jours en 30s (pendant 2 mois maximum) d) une injection intrapéritonéale unique de toxine induisant une hépatite sur animaux vigiles sous contention en 30s 3) Le dernier geste étant un prélèvement sanguin suite à une injection intrapéritonéale unique d’anesthésique sous contention sur animaux vigiles en 30s.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, la nuisance principale est liée au développement de tumeurs hépatiques pouvant conduire à une encéphalopathie létale sans perte de poids. Les injections intraveineuses de virus adéno-associés et les échographies réalisées sous anesthésie peuvent entraîner un stress thermique et un inconfort au réveil. Les injections intrapéritonéales peuvent entraîner un stress lors de la contention et une douleur de courte durée lors de l‘introduction de l’aiguille.
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet sera euthanasié pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs
Remplacement
Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. C'est pourquoi il est crucial de travailler sur des modèles murins pertinents.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. 585 animaux sur les 1415 nécessaires nécessaires au projet suivront ce protocole. Nous suivrons le développement des tumeurs pour 200 animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Les tests statistiques utilisés seront des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables. Pour les études à court terme, seuls 15 animaux par lot sont nécessaires. De plus, nous souhaitons mettre au point des cultures in vitro de tumeurs murines pertinentes pour les cancers du foie qui nous permettront à terme de tester de nouvelles drogues anti-tumorales et ainsi de ne tester chez l’animal que les molécules préalablement efficaces sur ces cultures. Récemment, nous avons développé un nouveau modèle de cancer basé sur l'édition génique qui permet de générer moins d'animaux.
Raffinement
Nous suivrons le développement des tumeurs en échographies, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite la souffrance due à un développement tumoral important (raffinement). Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée. Les injections stressantes et échographie seront réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum. Dans la fenêtre de temps où le phénotype délétère lié à l'activation de la beta-caténine peut avoir lieu, un suivi accru sera mis en place. Au cours du suivi échographique, si les points limites sont atteints, les animaux seront immédiatement euthanasiés. Au cours de ce suivi, l'euthanasie des animaux ayant atteint le point limite peut conduire à des animaux isolés dans les cages pour lesquels un suivi accru sera mis en place et le milieu enrichi (nids, tunnels, bois à ronger).
Choix des espèces
Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèles murins. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de carcinogenèse chimique nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.
Edition du genome de poisson zebre par CRISPR-Cas9 en vue de creation de lignees
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Le génome de ces poissons est modifié par CRISPR-Cas9 pour livrer des lignées stabilisées à des laboratoires privés ou publics, clients de la prestation, qui réaliseront ensuite leurs propres expériences. 6 500 poissons zèbres sont utilisés dans des procédures déclarées légères et sévères, ceux qui portent le génotype recherché étant gardés comme géniteurs, les autres tués. Chacun subit une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, et le porteur reconnaît que les modifications génétiques apportées peuvent être physiquement dommageables, occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Il décrit une espèce dont les femelles pondent jusqu'à 200 œufs par semaine et qui atteint l'âge adulte en trois mois, l'élevage d'un grand nombre d'individus étant "aisé".
Objectifs
Ce projet a pour but de créer des lignées génétiquement modifiées par la technique CRISPR-Cas9 sur le modèle poisson-zèbre pour des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Les lignées stabilisées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. En 3 mois il atteint l’âge adulte et est capable de se reproduire. Les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Son développement externe permet la micro-injection et donc facilite les procédures d’édition du génome.
Bénéfices attendus
Notre unité d’appui et de recherche a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant les modèles poissons zèbres. Les lignées ainsi produites permettront de mieux comprendre la fonction des gènes invalidés (knock-out) ou modifiés (mutations ponctuelles) ou insérés (knock-in).
Procédures
Biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie, de maximum 3 mm², 1 fois par animal. Temps de la biopsie (anesthésie incluse) : environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques apportées peuvent potentiellement être physiquement dommageables pour le poisson, lui occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Le génotypage, qui s’opère par une biopsie de la nageoire caudale, est réalisé rapidement sous anesthésie en balnéation (pas d’injection traumatisante). Le prélèvement n’impacte que temporairement voire pas du tout l’animal grâce à la régénération totale du membre en quelques jours. Parmi les effets indésirables potentiels nous pouvons donc lister : comportement d'aversion pour l'anesthésique, douleur suite à la biopsie si le geste est mal effectué, comportements de stress (tels que la désorientation) suite au réveil ou à la manipulation à l'épuisette.
Devenir
Les animaux présentant le génotype d’intérêt seront gardés en vie et utilisés comme géniteurs. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt seront euthanasiés.
Remplacement
Notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre pour étudier des phénotypes complexes par exemple des modifications du comportement ou des modifications à l’échelle d’organes entiers, l’espèce animale utilisée ne peut donc être remplacée par des expériences sur cellules ou organoïdes.
Réduction
Une attention particulière sera portée à la gestion du cheptel, notamment via un suivi informatisé, afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaires à la création de lignée. Un bon suivi des lignées permet par exemple d’éviter de produire davantage d’individus alors que des juvéniles sont déjà prêts à être utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Comme le poisson zèbre est une espèce grégaire, il est donc placé en groupe dans les aquariums d'élevage. Pendant le moment où les individus sont isolés (génotypage) les aquariums sont enrichis avec des structures ou objets (algues synthétiques, tuyaux de PVC) permettant aux individus de s’isoler temporairement si nécessaire ou de pallier un manque de compagnie (statut temporaire, généralement durant un séquençage pour identification génétique ou lors d’un isolement dû à une lésion observée sur un animal et qui requiert une convalescence). Deux ou trois congénères au phénotype différent visible (long fin ou nacre) seront également ajoutés à l’aquarium afin de limiter l’isolement pendant la période d’isolement qui n'excède pas deux semaines. Les paramètres de la qualité de l‘eau seront surveillés, ainsi que le bien-être et la santé des poissons. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, modification de la pigmentation. Si des signes de douleur sont observés suite à la biopsie, une administration par balnéation de lidocaïne (analgésique) à 2 mg/L sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Il permet l’obtention non invasive et indolore de plusieurs centaines d'œufs par ponte nécessaires à la mutagénèse. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à 3 mois. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle. Pour le génotypage, les biopsies des nageoires sont effectuées sur des individus entre un mois et trois mois.
Reconstitution de rats immunodeficients par des cellules hématopoïétiques humaines
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Tous tués pour prélever leur sang, leur rate, leurs ganglions, leur moelle osseuse, leur foie, leurs intestins et leur thymus, 150 rats immunodéficients sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. À l'âge de deux à quatre jours, les ratons sont séparés de leur mère et irradiés quatre minutes, avec un risque qu'elle les rejette ensuite, puis reçoivent une injection de cellules humaines directement dans le foie. Trois prélèvements de sang derrière l'œil suivent, à douze, dix-huit et vingt-quatre semaines, en alternant œil droit et œil gauche. Le porteur présente ce rat "humanisé" comme une alternative aux souris humanisées, plus grande et plus proche de l'être humain, pour éprouver des médicaments agissant sur le système immunitaire.
Objectifs
A l'heure actuelle, l'étude de nouveaux médicaments permettant d'agir sur le système immunitaire ne peut pas être effectuer sans réaliser des expériences in vivo. Les résultats in vitro seuls ne peuvent présumés du potentiel réel et efficace d'une molécule. Afin de pouvoir répondre à ce type de problème, l'utilisation de modèle de souris dites "humanisés" (souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre mais on y trouve la présence de cellules humaines) permet de pallier la complexité de la réponse immunitaire. Suite à l'émergence de nouvelles procédures thérapeutiques, la mise à disposition d'un nouveau modèle d'animaux humanisés : le rat humanisé représentera une alternative intéressante aux souris humanisées. Principalement due à la taille du modèle, permettant de réaliser des modèles de greffes vasculaires mais également dû à la différence de pourcentage au niveau des cellules humaines. Ce projet expose donc la procédure utilisée afin de produire des rats dits humanisés à partir de rats immunodéficients (qui sont des animaux ne possédant pas de cellules au niveau du système immunitaire).
Bénéfices attendus
Sur le court terme, ce projet pourra montrer une meilleure compréhension du système immunitaire humain grâce à sa modélisation des rats humanisés immunodéficientes reconstitués avec un système immunitaire humain.
Procédures
Les différentes interventions sur les animaux sont : l'irradiation de ratons mâles et femelles âgés de 2 à 4 jours qui se déroule en seule fois et cela pendant 4 min, une seule injection intrahépatiques de cellules humaines sera effectuées sur des animaux anesthésiés (anesthésie rapide avec une durée de procédure n'éxcédant pas 5 min) ainsi que des prélèvements se déroulant à semaine 12, 18 et 24 post-injection d'une petite quantité de sang lors d'un prélèvement retro-orbitaire (10 min de procédure de l'endormissement au réveil).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendues sont: le stress du à la séparation de la mère pouvant également induire un risque de rejet des petits par celle-ci, de la douleur pouvant être générés par les différentes procédures expérimentales ( l'injection intrahépatique, des prélèvements de sang ou de la contention des animaux ...). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l'étude.
Devenir
A l'issue de cette procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvements (sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus) ainsi qu’une analyse immunologique par cytométrie en flux.
Remplacement
Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'études pré-clinique réalisée chez l'animal. Ce modèle d'étude du mécanisme d'action d'anticorps et/ou médicaments chez le rat ayant un système immunitaire humain permettra de reproduire les mécanismes d'action susceptibles d'être mise en œuvre chez l'homme. Ces expérimentations in vivo sont les seules à pouvoir répondre à nos questions, le modèle des rats humanisées étant le seul à pouvoir juger dans des conditions physiologiques du rôle des molécules X et Y sur l'efficacité de la réponse immunitaire. Des résultats positifs in vitro seraient insuffisants pour être convaincu de la pertinence physiologique des observations et leur transposition à la clinique seraient freinés.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été déterminée de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur le mécanisme d'action sur les T régulateurs.
Raffinement
Nous cherchons à raffiner au maximum nos protocoles pour limiter la souffrance. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et par les responsables des procédures. Au moment des injections du traitement, une application au préalable de Lidocaïne sous forme de gel sera effectuée comme analgésie . Afin de limiter au minimum l’impact de la séparation maternelle, celui-ci est réduit grâce à l'imprégnation des gants de l’expérimentateur et d’une boite de Petri (qui sera mise dans la cage d’irradiation) avec la sciure de la cage maternelle Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (igloo en PVC...). Lors du prélèvement de sang par des sinus rétro orbitaire (effectuée totes les 6 semaines avec alternance œil droit/gauche) sur des rats anesthésiés, l'utilisation de tétracaïne 1% en collyre permettra une anesthésie locale. Nous procédons à l’euthanasie des rats en cas d’atteinte des points de limite préétablis.
Choix des espèces
Le choix du rat repose essentiellement sur le fait que ces animaux présentent de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l'homme que la souris et que les études fonctionnelles seront plus faciles à réaliser. Il est également à prendre en compte que certains modèles de greffes vasculaires ou autres modèles (ex : implantation d'organoïdes humains) seront plus simples à effectuer chez le rat humanisé par rapport aux modèles de souris humanisés Nous utiliserons des ratons âgés de 2 à 4 jours afin de faciliter la reconstitution du système immunitaire par des cellules humaines.
Identification d’une nouvelle cible thérapeutique pour stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées d'une tumeur sous la peau à l'état vigile, 612 souris reçoivent ensuite trois gavages et trois injections dans l'abdomen, certaines une radiothérapie sous anesthésie générale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses après la mort. Le porteur écrit que le développement de ces tumeurs n'entraînera "ni douleur ni gêne pour l'animal", tout en prévoyant une surveillance quotidienne, une grille de score et des points limites dont l'atteinte déclenche la mise à mort. Dix-huit souris par condition, six par expérience répétée trois fois, servent à éprouver in vivo une cible repérée en culture cellulaire.
Objectifs
L‘arsenal des traitements contre le cancer comprend la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie, c’est-à-dire la manipulation du système immunitaire du patient pour combattre la tumeur. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces contre tous les cancers ou seule une partie des patients répondent au traitement. L’efficacité du traitement dépend souvent de l’implication des cellules du système immunitaire. Ces dernières années, le rôle essentiel d’une population particulière de cellules immunitaires, appelées monocytes, a été mis en évidence. Le but de ce projet est de manipuler ces cellules afin de stimuler les réponses immunitaires contre les tumeurs, et de tester une stratégie thérapeutique permettant d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie.
Bénéfices attendus
Nous avons identifié par des expériences in vitro une nouvelle cible thérapeutique potentielle qui pourrait stimuler les réponses immunitaires dans le contexte du cancer. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances essentielles pour évaluer l’intérêt de cette nouvelle cible thérapeutique dans un système physiologique in vivo. Ce projet permettra également de mieux comprendre l’importance des cellules immunitaires appelées monocytes dans les réponses immunitaires anti-tumorales. Ces avancées seront communiquées à la communauté scientifique dès la fin du projet. A plus long terme, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles applications thérapeutiques chez l’homme, en particulier de nouvelles stratégies pour optimiser l'efficacité des traitements anti-tumoraux.
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée à tous les animaux de ce projet (injection sur animaux vigiles1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inf à 10 sec). Puis les animaux seront ensuite divisés en 2 lots pour recevoir des traitements différents. Les animaux vigiles recevront un traitement par gavage à raison d’une administration par jour tous les 2 à 3 jours (3 administrations au total – durée du geste inf à 10 sec). En parallèle, ces animaux recevront un second traitement par voir intrapéritonéale (directement dans l’abdomen). Les injections seront réalisées sur animaux vigiles à raison d’une administration par jour tous les 2 jours (3 injections au total – durée du geste inf à 10 sec)
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs sous-cutanées au niveau du flanc qui seront mesurées régulièrement. Le développement de ces tumeurs n’entrainera pas de douleur ni de gêne pour l’animal Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non irritants par voie intrapéritonéale (directement dans l’abdomen) (gêne de courte durée),celles liées au gavage oral (gêne de courte durée )
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Après des premières étapes d’analyse et de validation dans un modèle de culture in vitro, nous avons formulé l’hypothèse que notre cible d’intérêt pourrait stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. Cette hypothèse ne peut être testée que dans un modèle in vivo, dans un système physiologique représentant un organisme vivant intégré et autonome tel que la souris. Cette étape est indispensable à la compréhension du processus biologique et à l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’approche proposée dans ce projet. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.
Réduction
Le nombre de souris par condition est de 18 (6 par expérience, répétée 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, selon la différence que l’on souhaite mettre en évidence. Dans notre expérience préalable, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Dans certaines expériences, plusieurs organes seront prélevés post-mortem pour des analyses, ce qui optimise le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement par l'équipe pour l’état général (7j/7). La radiothérapie sera réalisée sous anesthésie générale et les éventuelles douleurs soulagées par des analgésiques. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte des points-limite les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 5 à 7 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Traitement thérapeutique de tumeurs hépatiques induites par le virus de l’hépatite B grâce à des vecteurs lentiviraux vaccinaux
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées sous la peau avec des cellules tumorales sous anesthésie, vaccinées une à deux fois dans le muscle, parfois traitées par lenvatinib administré par la bouche, 8 532 souris voient leur tumeur mesurée au pied à coulisse tous les trois à quatre jours pendant un mois. Les procédures sont déclarées légères à modérées, avec des ulcérations, des tremblements, de la prostration et l'arrêt du toilettage parmi les effets attendus de la croissance tumorale. Les souris dont la tumeur régresse complètement sont suivies quatre mois puis exposées de nouveau à des cellules tumorales. Aucune ne sort vivante, le porteur écrivant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées, ni replacées, ni adoptées, la stimulation immunitaire provoquée par la greffe biaisant toute autre étude.
Objectifs
Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules. Le système immunitaire joue un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération notamment grâce aux réponses cellulaires impliquant, entre autres, des lymphocytes T aux propriétés lytiques. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique fondée sur des vecteurs lentiviraux, connus pour induire cette catégorie de lymphocytes T, pourrait être particulièrement efficace dans le contrôle de la prolifération tumorale. En revanche, et en prévision d'une expérimentation clinique, ces vecteurs se doivent d’être non-intégratifs (VLNI). Lors du cancer du foie lié au VHB, les cellules tumorales expriment certaines protéines du VHB comme l’enveloppe, la capside ou la protéine HBx. L’objectif de ce projet est d’utiliser des VL exprimant ces protéines ou fragments de protéine du virus de l’hépatite B comme vaccin thérapeutique chez la souris. Suite à la vaccination, nous espérons obtenir une réponse immunitaire qui conduirait à l’éradication des tumeurs exprimant ces mêmes antigènes. Les vaccins candidats avec une activité anti-tumorale seront ensuite évalués en association avec les traitements actuels des patients avec cancer du foie lié au VHB en prévision d’un essai clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le virus de l’hépatite B est la cause avérée de 50% des cancers du foie chez l’homme. Les traitements actuels (chirurgie, irradiation, traitements immunomodulateurs) ne permettent au mieux qu’une légère augmentation du temps de survie. Chez l’homme, le développement de ces tumeurs s’accompagne de réponses immunitaires inefficaces. Grâce aux VLNI nous espérons pouvoir potentialiser ces réponses et détruire les cellules tumorales. Si nous parvenons à une élimination totale des tumeurs, un nouveau projet sera déposé afin d’évaluer notre candidat vaccin dans un modèle orthotopique. Cela permettrait d’envisager son utilisation pour induire un traitement des foyers primaires chez l’homme en parallèle à d’autres traitements immunothérapeutiques.
Procédures
Les procédures comprennent une injection en sous cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (5min), une à deux vaccinations intramusculaires (quelques secondes) et éventuellement une injection intrapéritonéale d’anticorps (quelques secondes) et ou une injection per os de Lenvatinib (quelques secondes) (procédure 8). La surveillance de la croissance tumorale sera suivie pendant 3 à 4 semaines. Certains animaux seront soumis à une injection de vecteur lentiviral en intramusculaire (quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront une légère douleur au moment de l'injection intramusculaire du petit volume de vaccin. L'injection de cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie. Au niveau de la croissance tumorale, les modèles sont largement décrits et les effets adverses de la croissance sont connus et seront monitorés : lésions cutanées, ulcération, capacité au déplacement des animaux, modification du comportement (isolation, tremblement, prostration, absence de toilettage).
Devenir
Le développement des tumeurs étant irréversible, les animaux seront mis à mort dans toutes les expérimentations selon les points limites établis. Si les souris ne présentent plus de tumeur grâce au traitement, elles seront suivies pendant quatre mois, puis seront à nouveau exposées à des cellules tumorales (procédure 6). Si les animaux atteignent une régression totale de la tumeur, les animaux seront mis à mort au bout de 90 jours maximum après la fin du traitement car ils ne peuvent pas être réutilisé pour d’autres expérimentations. La stimulation du système immunitaire induite par l’implantation de la tumeur peut induire des biais importants pour toutes autres études. Par conséquent, tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats vaccins dans le but de les transposer chez l’homme. Ces études impliquent nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité de la réponse vaccinale et anti-tumorale au niveau d’un organisme entier. La souris est un modèle de prédilection pour ce type d’étude par rapport aux autres animaux de par sa facilité d’élevage, de l’existence d’outils permettant une analyse en détail du système immunitaire et des corrélats pouvant être réalisés avec les tumeurs chez l’homme. Cette étape constitue également une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’homme, en complément des études réalisées in vitro. C’est pourquoi aucun système cellulaire isolé ne peut être utilisé pour remplacer la recherche sur les animaux.
Réduction
En s’appuyant sur des résultats antérieurs obtenu par notre groupe, la littérature et une approche statistique, il a été possible d’anticiper le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et répétables sur les différents paramètres de l’étude. Pour calculer la taille des groupes de souris injectées par les vecteurs, nous avons utilisé les moyennes et écart-types d’expériences antérieures. La sélection rapide des meilleurs candidats VLNI dans un premier temps permettra de poursuivre leur caractérisation avec un minimum de groupes et donc d’animaux.
Raffinement
Selon notre expérience antérieure, l’injection de LV n’induit aucun signe clinique chez les souris mais l’implantation de tumeurs peut induire une gêne modérée, qui sera contrôlée au cours des expériences. Le site d’injection (flanc droit) a été choisi pour avoir un impact minimal sur les capacités motrices de l’animal et assurer un suivi visuel simple et régulier (tous les 3-4 jours) du développement de la tumeur (mesure de la taille de la tumeur au pied à coulisse) et une prise de décision rapide en cas d’apparition d’un trouble chez l’animal. Si un point limite est atteint, la souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers mais néanmoins présents (perte de poids inférieur à 10%, poils hérissés, inactivité), plusieurs mesures seront prises : ajout de gel hydrique, réhydratation sous cutanée, chauffage des cages, amélioration de l’enrichissement.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe de nombreux modèles de tumeurs qui peuvent être utilisés chez la souris pour tester nos candidats vaccins. De plus, des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogènes chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Il est admis qu’à partir de l’âge de 6 à 7 semaines, le système immunitaire des petits rongeurs est considéré comme mature et que les réponses immunitaires induites peuvent être considérées comme comparables à celles induites pendant la durée de vie d’adulte.
Cibler les mégacaryocytes et les plaquettes hébergeant le virus du SARS-CoV-2 pour une restauration immunologique efficace
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par le SARS-CoV-2 par instillation nasale sous anesthésie, 1 704 souris subissent ensuite des prélèvements de sang derrière l'œil, jusqu'à un par semaine, et des prélèvements dans la bouche. Les procédures sont déclarées légères et sévères, aucun animal n'est gardé vivant et la durée de conservation après le début des expériences ne dépasse pas deux mois. L'infection fait perdre environ 12 % de leur poids aux souris Balb/c au quatrième jour et peut en tuer 10 %, l'objet du projet étant de chercher des réservoirs du virus dans les plaquettes et les mégacaryocytes. Le porteur écrit qu'au total 1 224 souris seront "nécessaires", pour un projet qui en déclare 1 704, et affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit à ce jour les interactions hôte-virus aboutissant au Covid-19.
Objectifs
La pandémie Covid-19 est devenue une urgence sanitaire et médicale dans la plupart des pays dans le monde. Le SARS-CoV-2 cause des symptômes respiratoires qui peuvent être graves, ainsi que des symptômes à l’origine du COVID long par la persistance de réservoirs cellulaires du virus. Notre objectif est d’identifier et de caractériser ces réservoirs viraux dans le contexte de l’infection par le SARS-CoV-2 et les conséquences de ce phénomène sur la réplication virale et la pathologie Covid-19.
Bénéfices attendus
Les plaquettes et les mégacaryocytes sont des cachettes virales largement négligées. Nous étudierons leur participation dans des modèles murins de long COVID et COVID sévère. Nous proposons enfin de les cibler afin de restaurer le statut immunocompétent et la qualité de vie des individus présentant des déficits immunitaires persistants d'origine virale. A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire les interactions hôte-virus aboutissant au COVID-19. L'évaluation de la pathogénicité du SARS-CoV-2 pourra aider à développer de nouvelles stratégies de lutte qui nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’est pas possible à ce jour de remplacer par des tests in vitro ou in silico. Il est admis que le modèle murin et l’infection avec une souche du SARS-CoV-2 adaptée à la souris est pertinent pour le suivi de la réplication du virus et pour décrire la physiopathologie associée à l’infection par le SARS-CoV-2.
Procédures
(1) Infection de SARS-CoV-2 par voie nasale. L’instillation nasale du virus sera réalisée sous anesthésie générale obtenue par inhalation d’isoflurane. 1 infection par animal sera réalisée, celle ci dure environ 1 minute, après l'endormissement de l'animal par l'isoflurane. (2) Prélèvement sanguin par voie rétroorbitale. Une analgésie locale sera réalisée par le dépot d'une goutte de collyre à base de tétracaine. Une anesthésie générale sera obtenue par l'inhalation d’isoflurane. Les prélèvements intermédiaires (1 fois par semaine au maximum) durent moins d'une minute. Le prélèvement terminal en fin d'expérience durera plus longtemps afin d'obtenir un maximum de volume sanguin, les animaux seront euthanasiés à la suite de ce prélèvement. (3) Prélèvement de swabs buccaux. Ce prélèvement se fera à la suite du prélèvement sanguin intermédiaire pour éviter une autre anesthésie et contention des animaux. Un bref prélèvement à l'aide d'un swab (taille nourisson) sera effectué dans la bouche de chaque animal, ceux ci dureront moins d'une minute.
Impact sur les animaux
L’infection par le virus mouse-adapted SARS-CoV-2 conduit à une perte de poids d’environ 12% au 4ème jour de l’infection chez les souris Balb/c. A cette dose, 10% des souris Balb/c peuvent mourir, les C57Bl/6J ne meurent pas.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans cette procédure sera euthanasié à terme même ceux qui servent de contrôle. La durée maximale de conservation des animaux après le début des expériences est de deux mois.
Remplacement
Des modèles d'étude in vitro existent (organoides par exemple) cependant ils ne sont pas pertinents pour notre étude. En effet, nous nous intéressons à comprendre les effets physiopathologiques par l'infection au SARS-CoV-2 et seul l'étude sur l'organisme entier (animal) nous permettra de répondre à la problématique scientifique.
Réduction
Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe sera utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Dans cette étude, nous utiliserons un test de comparaison de moyennes t-test. Les expériences seront répétées 2 fois avec un nombre de 6 animaux par groupe expérimental. Au total, 1224 souris seront nécessaires. Cette utilisation maximise les données obtenues à partir de chaque animal, afin de limiter ou d'éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, la réalisation de procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Chaque animal sera observé et scoré (évaluation des signes cliniques) toutes les 24h à partir du jour de l’infection. Les souris sont placées dans des cages contenant entre 2 et 4 animaux pour maintenir leur caractère grégaire. Si des conflits sont observés, les animaux agressifs seront écartés du groupe. Pour tout prélèvement et injection, les animaux seront placés sous anesthésie générale. Une analgésie locale sera réalisée pour les prélèvements sanguins.
Choix des espèces
La souris, exprimant naturellement le récepteur ACE2 du SARS-CoV-2, représente un modèle pertinent pour l’étude des réponses immunes et inflammatoires liées à l’infection par ce virus. Chez la souris, il existe de nombreux outils (anticorps, kit ELISA) permettant une analyse des mécanismes immunologiques impliqués dans un effet physiologique. Les souris mâles et femelles seront infectées à l’âge de 8 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.
Preuve de concept du rôle d’une protéine de la réponse inflammatoire dans la régénération musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Irradiées, puis greffées avec de la moelle osseuse d'un animal déficient, 40 souris reçoivent enfin une toxine injectée dans le muscle de la patte pour y provoquer une lésion. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leurs organes. Le porteur décrit une immunodépression, une fatigue générale, une mobilité réduite pendant quatre jours et une perte de poids allant jusqu'à 15 % après l'irradiation, tout en qualifiant la lésion musculaire d'"inconfort passager" après lequel la mobilité "n'apparaît pas affectée". L'effectif tient à 6 ou 7 individus par point d'analyse, pour une étude que le porteur présente lui-même comme une preuve de concept préalable à des travaux plus complets.
Objectifs
Le muscle adulte a la capacité de régénérer complètement après une lésion, grâce aux cellules souches musculaires et aux cellules de l'immunité qui jouent un rôle important dans ce processus. Une protéine a été identifiée comme un candidat important impliqué dans la fonction des cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire, ce qui a été validé par des expériences réalisées sur des cellules in vitro. La validation du rôle de cette molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire in vivo nécessite l’utilisation d’un modèle de souris présentant une inactivation de cette molécule spécifiquement dans ces cellules. Une approche économe en nombre d'animaux consiste à transplanter les cellules de la moelle osseuse d’un animal déficient pour la molécule dans des souris receveuses normales. De cette manière, seules les cellules immunitaires sont inactivées pour la molécule dans les animaux transplantés. Ensuite, une blessure musculaire est réalisée afin de pouvoir analyser les muscles de ces souris. L’objectif de cette étude est de valider la pertinence de l’inactivation spécifique de la molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire en réalisant des expériences de transplantation de moelle et de lésion musculaire sur un petit nombre d’animaux.
Bénéfices attendus
Cette étude preuve de concept permettra d'identifier si la molécule est nécessaire dans les cellules de l'immunité pour la régénération musculaire. Le cas échéant, des études plus complètes seront mises en place ultérieurement afin d'en analyser le fonctionnement moléculaire. A terme, la compréhension des mécanismes permettant la régulation de l'inflammation au cours de la réparation tissulaire sera bénéfique pour améliorer les conditions de vie des patients atteints d'inflammation persistante en général, et de dystrophies musculaires en particulier
Procédures
- irradiation (1 fois 1 minute) - injection intraveineuse de moelle osseuse (1 fois 10 minutes sous anesthésie) - injection sous-cutanée d'analgésique (1 fois 1 minute) - induction de blessure musculaire : injection d’un agent chimique dans le muscle situé le long du tibia (1 fois 10 minutes sous anesthésie)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues incluent le stress dû à la manipulation des animaux lors des transfert de cage et du transport et lors du déplacement dans la boite d’anesthésie lors des injections intraveineuse et intramusculaire. L'irradiation puis la transplantation provoquent une immunodépression transitoire. Ceci induit une fatigue générale chez les animaux et peut entrainer une réduction de mobilité pendant environ 4 jours, conduisant à une perte jusqu'à 15% de poids de corps 4 jours après l'irradiation, et qui est récupérée à partir du 6ème jour. L'irradiation peut également, dans de très rares cas, induire une pousse des dents. L'induction de la blessure musculaire engendre un inconfort passager chez les animaux, avec une diminution transitoire de l’activité après l’injection de la toxine (24h) bien que la mobilité des animaux n’apparaît pas affectée
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des organes
Remplacement
Les alternatives non animales ont déjà été utilisées dans ce projet. Il s'agit des expériences de co-culture cellulaire in vitro dans des modèles qui miment la régénération musculaire in vitro. Il est désormais nécessaire de valider ces résultats in vivo afin de les intégrer dans l’organisation complexe du tissu musculaire dans l’organisme.
Réduction
Le modèle mis en œuvre dans ce projet a été choisi car c’est celui qui permet de réduire le plus possible le nombre d’animaux nécessaire. Des outils statistiques ont permis de définir que 6 à 7 individus par point d’analyse, en fonction des analyses réalisées, sont suffisants pour réaliser des statistiques robustes.
Raffinement
Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Le raffinement inclut l'anesthésie lors de l'injection de la moelle osseuse, de l'induction de la blessure musculaire et lors de la mise à mort des animaux, ainsi que l'administration d'analgésique lors de la lésion musculaire. Le raffinement inclut le maintien des animaux dans des conditions sanitaires propres et une surveillance quotidienne des animaux après l'irradiation comprenant le dépôt de nourriture hydratée et de gel nourrissant directement dans la cage, une pesée tous les 2 jours, la surveillance d’une pousse des dents en plus de la surveillance de l'état général des individus. Ces mesures de raffinement sont issues de recommandations publiées issues de travaux de la communauté scientifique. Des points limites qui auront pour effet l’arrêt de la procédure ont été définis.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'Homme dans sa structure et son fonctionnement, avec les mêmes séquences de l'inflammation chez la souris et chez l'homme au cours de la régénération musculaire. Le projet s'intéressant aux mécanismes de réparation tissulaire à l'âge adulte, les souris sont utilisées à l'âge adulte, soit entre 8 et 12 semaines.