Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Impact du stress in utero sur les réponses immunes inflammatoires et autoimmunes des progénitures
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Toutes tuées pour le prélèvement des organes lymphoïdes, du tube digestif, du cerveau et de la moelle épinière, 2 676 souris vont être utilisées, dont 2 016 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les femelles gestantes sont enfermées dans un tube de contention sous une lumière vive trente minutes, trois fois par jour, du treizième au dix-huitième jour de gestation. Leurs descendants adultes reçoivent une inflammation provoquée du système nerveux central ou du côlon, avec syndrome fébrile et perte de poids, la mise à mort intervenant au bout de trente jours. Le porteur écrit pourtant que "le stress en soi ne cause aucun symptôme chez les génitrices" et que les injections et pesées "ne causent pas d'effets indésirables", dans un projet dont il déclare lui-même les trois quarts des effectifs en souffrance sévère.
Objectifs
La prévalence mondiale des pathologies auto-immunes et inflammatoires est en perpétuelle augmentation dans les pays développés et en voie de développement. Elles représentent un problème majeur de santé publique et les approches thérapeutiques utilisées aujourd’hui ne donnent pas entière satisfaction. Il est donc important de comprendre la physiopathologie de ces maladies au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ceci est basé sur l’utilisation des modèles animaux (lignées pures génétiquement homogènes, environnement "contrôlé") qui reproduisent en majeure partie les caractéristiques cliniques et histopathologiques des maladies humaines. De plus, il est tout à fait possible d’appliquer les résultats obtenus dans les modèles animaux à la pathologie humaine. De nombreux facteurs environnementaux ont été décrits comme participant au développement de ces maladies chroniques. Parmi ces facteurs environnementaux, de nombreuse étude épidémiologique placent le stress comme l'un des facteurs majeurs impliqués dans la régulation de l'immunité. L'objectif de cette demande est de comprendre l'association qui pourrait exister entre le stress en période néonatale et les maladies auto-immunes en utilisant un modèle animal de sclérose en plaques et les maladies inflammatoires intestinales en utilisant un modèle de colite
Bénéfices attendus
La période prénatale est une période délicate au cours de laquelle l’exposition intra-utérine à des facteurs environnementaux peut moduler le cours du développement du système immunitaire et conférer un effet durable sur la progéniture qui, plus tard dans la vie, influence le développement des réponses immunes normales et pathologiques. Cette étude sur l'impact du stress prénatal sur la réponse immunitaire de la progéniture chez la souris offre une approche expérimentale pour explorer les mécanismes sous-jacents à ces interactions complexes avec un focus sur le microbiote. Ceci pourrait identifier des souches bactériennes du microbiote ou des métabolites du microbiote qui pourraient être des cibles thérapeutiques des maladies inflammatoires. . Les résultats pourraient avoir des implications importantes pour la recherche sur la santé maternelle et infantile, ouvrant la voie à de nouvelles avenues de prévention et d'intervention.
Procédures
Les souris gestantes seront stressées du 13ème au 18ème jour de gestation à l'aide d'un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour. Nous allons induire chez les progénitures adultes ( 10 souris par groupe) une inflammatoin du système nerveux central ou une inflammation du colon. Au moment de la mise à mort (30 jours), les organes lympoides, le tractus digestif, le cerveau et la moelle epinière seront prélevés et analysés
Impact sur les animaux
Entre nos mains, le stress en soi ne cause aucun symptôme chez les génitrices et n'a aucun effet sur le nombre de petits par portée et sur les soins portés aux petits. Dans le cas du modèle de l'inflammation du système nerveux central ou de colite, les animaux présentent un syndrome fébrile entrainant une perte de poids. Puisque le stress prénatal réduit l’inflammation, on devrait s'attendre à une réduction de la sévérité de la maladie dans les deux modèles. Les expérimentations sur ces animaux (injections, pesées) ne causent pas d'effets indésirables.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire
Remplacement
Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les méthodes alternatives permettant une évaluation du statut immunitaire de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale car le stress, l'inflammation et l’auto-immunité sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité. Cependant, une veille bibliographique sera effectuée pour déterminer si des méthodes de remplacement ont été mises en place.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans chaque expérience a été calculé à minima à l'aide des outils statistiques en tenant compte de la variance biologique des résultats obtenus. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tous les échantillons prélevés sont stokés à -80°C et dans une banque de données. Ils peuvent être réutilisés ou servir de témoins dans des expériences ultérieures.
Raffinement
Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite (perte de poids superier à 20%, grattage ou léchage anormal, posture voûté ou prostrée, amaigrissement, déshydratation, poils hérissés, salissures, anomalies de la respiration, hypo ou hyperthermie et paralysie). Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement, cachettes et objets à ronger). Une surveillance journalière de l'état générale des animaux par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Comme précisé pour chacune des procédures,les animaux seront anesthésiés + anélgésiés (xylasine) en cas d'injection ou de prélévement.
Choix des espèces
L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés. Aucune autre espèce d'animaux n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Nous utuliserons des souris adultes mâles et femelles pour notre projet.
Rôle et régulation de la thrombopoïèse pulmonaire lors d’une infection virale pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une partie des souris est génétiquement modifiée pour porter le récepteur humain du SARS-CoV-2, ce qui les rend infectables par les variants humains du virus. 5 040 souris vont être utilisées, 4 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 240 opérées sous anesthésie sans réveil. Sept jours après inoculation, le porteur décrit chez ces souris une température corporelle tombée à 25 degrés et une perte de poids supérieure à 20 %, et prévoit par ailleurs des chirurgies pulmonaires de quatre à cinq heures, des interventions sur les os du crâne, jusqu'à cinq prélèvements de sang sous la mâchoire et des injections derrière l'œil. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, rate et moelle osseuse, ce cumul de prélèvements sur un même animal étant présenté comme une mesure de réduction.
Objectifs
Les mégacaryocytes sont des cellules qui se développent dans la moelle osseuse et qui permettent la formation de plaquettes dans le sang, nécessaire notamment à la coagulation sanguine. Récemment, nous avons démontré que cette formation de plaquettes n’est pas restreinte à la moelle osseuse mais qu’elle peut aussi avoir lieu dans les poumons. Des études récentes et nos données préliminaires suggèrent que cette formation de plaquettes dans les poumons pourrait jouer un rôle clef lors d'une infection virale pulmonaire. Chez l’homme au cours des infections à Sars-CoV-2 une augmentation très importante de ces mégacaryocytes pulmonaires a été reportée chez les patients atteints de COVID-19 en comparaison à d’autres patients atteints d’autres causes de détresse respiratoire. Nous pensons que la formation de plaquettes au niveau des poumons augmente au cours des infections pulmonaires, et cette augmentation semble liée à une aggravation de la détresse respiratoire et à une inflammation aigüe. Les mécanismes y conduisant ne sont pas connus et ce sont donc ces mécanismes que nous proposons d’identifier en utilisant des modèles d’infections pulmonaires chez la souris et des techniques de microscopie intravitale. L’identification de ces mécanismes devrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques non seulement pour les infections pulmonaires comme la COVID-19 mais aussi pour d’autres pathologies inflammatoires pulmonaires comme l’asthme ou les fibroses pulmonaires où l'activation des plaquettes contribue au développement de la pathologie
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) déterminer l’implication bénéfique ou délétère de la production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales ; (ii) étudier la cinétique de production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales pulmonaires et de l’inflammation pulmonaire ; (iii) caractériser et identifier de nouveaux mécanismes de la biologie plaquettaire (production, modifications, rôles) ; (iv) identifier potentiellement des nouvelles cibles thérapeutiques dans les pathologies pulmonaires dans lesquelles les plaquettes sont impliquées.
Procédures
Dans ce projet, - Les souris sous anesthésie générale subiront une injection de virus. L’injection ne dépasse pas 1 minute. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront entre un et cinq prélèvement sanguin. Les prélèvements ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques jours plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques heures ou minutes plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une injection de molécules puis une chirugie quelques heures ou quelques minutes plus tard. Les souris anesthésiées subiront une procédure de chirurgie sur les os du crane. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris anesthésiées subiront une injection de virus, puis quelques jours plus tard une injection de cellules, et quelques heures après ils seront mis à mort par anesthésie. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie generale subiront une injection de virus. Puis quelques jours plus tard une injection de cellules sous anesthésie generale et locale. Les injections ne dépassent pas 2 min.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous utiliserons un variant du SARS-CoV-2 adapté pour infecter les souris qui induit des pertes de poids inférieures à 10% sur toute la durée de l’infection ainsi qu’une faible baisse de la température corporelle
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront mises à mort pour des prélevements de tissus et de sang.
Remplacement
Notre projet a pour but de mieux comprendre la production de plaquettes sanguines au cours des infections virales pulmonaires. Afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire suffisamment proche de l’homme. Il est impossible de ne travailler sur des modèles in vitro strictement cellulaires car il n'est pas possible pour l'instant d'obtenir en dehors d'un organisme vivant la production de plaquettes pleinement fonctionnelles. En effet cette production est dépendante du flux sanguin et de nombreuses interactions cellulaires. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation d’un organisme entier, le plus adapté étant la souris.
Réduction
Des expériences préliminaires ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les analyses statistiques seront réalisées sur un logiciel d’analyse en combinant les résultats de n=4 expériences indépendantes avec 5 souris par lot (soit 20 animaux par groupe). En fonction des résultats obtenus lors de certaines étapes clés de notre projet, nous poursuivrons ou arrêterons certaines expériences. Après mise à mort de l’animal, des prélèvements seront réalisés, afin d’obtenir le plus d’informations possibles sans avoir à utiliser d’autres animaux. Nous prélèverons par exemple à la fois le sang, les poumons, la rate et la moelle osseuse, ce qui nous permettra de réaliser plusieurs tests à partir d'un seul animal.
Raffinement
Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux. Les injections sont réalisées sous anesthésie générale. Pour la chirurgie qui est une procédure sans réveil nous utilisons aussi une anesthésie générale, combinés à des anesthésiques locaux et un analgésiant. La température corporelle et l’hydratation des animaux sont maintenues tout au long de la procédure grâce à une caisse chauffante et des injections régulières de solution saline. Un gel est appliqué sur les yeux afin de prévenir leur assèchement. Les souris infectées seront surveillées quotidiennement jusqu’à l’arrêt des procédures. La température, le poids, l’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Pour notre projet visant à explorer la biologie des plaquettes sanguines dans les infections par des virus, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques ii) de l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà présentes dans l’équipe permettant de suivre les plaquettes et les mégacaryocytes, et iii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité et de la biologie plaquettaire chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, notre projet est basé sur l’étude de la dynamique de production de plaquettes par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez la souris. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes majoritairement âgées entre 8 et 12 semaines, mais également certaines de plus de 40 semaines afin d’étudier notre modèle à différents âges chez la souris. A ces stades de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
Immunothérapies antitumorales renforcées par un complexe organométallique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Le volume de la tumeur greffée sur le flanc est plafonné, au-delà l'animal est tué. 325 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tumeurs et leurs ganglions, 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 25 un niveau léger. Chacune reçoit une injection de cellules cancéreuses sous la peau du flanc, puis des injections tous les trois jours pendant vingt et un jours, avec mesure de la tumeur au pied à coulisse quatre fois par semaine. Ce travail s'inscrit dans un projet de maturation financé par un service de valorisation, l'enjeu étant de positionner un composé organométallique comme renfort d'immunothérapies anticancéreuses.
Objectifs
Le nombre de nouveaux cas de cancer a augmenté ces dernières années en France métropolitaine avec plus de 430.000 (en 2023) tous cancers confondus. Malgré les progrès dans leur diagnostic et leur traitement, certains ont encore un pronostic défavorable. Le système immunitaire joue un rôle primordial pour éliminer les cellules cancéreuses. Cependant, l’environnement au sein de la tumeur permet aux cellules cancéreuses d’échapper aux cellules du système immunitaire. L’essor de nouvelles thérapies ciblant le système immunitaire a montré des résultats prometteurs. Toutefois, seulement 20-30% des patients répondent efficacement à ces traitements. C’est pourquoi de nouvelles stratégies sont en cours de développement, pour améliorer la prise en charge des patients non répondeurs. Dans ce contexte, nos travaux actuels portent sur l'étude d'un nouveau composé pouvant altérer les cellules cancéreuses et favoriser la réponse immunitaire. C'est pourquoi, l’objectif de ce projet est de développer des nouvelles associations de traitements couplant les propriétés de notre composé à l’utilisation d’immunothérapies afin de développer nouvelles stratégies thérapeutiques dans le domaine de la cancérologie.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un projet maturation soutenu et financé par le service de valorisation afin de pouvoir positionner un nouveau composé comme agent thérapeutique pouvant potentialiser l’efficacité de traitements anticancéreux par immunothérapie afin d'améliorer la réponse immunitaire antitumorale.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection unique de cellules cancéreuses au niveau du flanc pour développer le modèle (durée < 5 minutes par souris). Une fois que les tumeurs auront commencées à se développer, les souris recevront des injections tous les 3 jours pour administrer les traitements d’intérêt (notre composé et/ou immunothérapies), sur une durée de 21 jours à compter de l'injection de cellules cancéreuses. Au cours des expériences, la croissance de la tumeur sera suivie 4 fois par semaine. Le temps de chaque intervention, injection des cellules cancéreuses, injections des traitements et mesure de la taille des tumeurs se fera en moins de 5 minutes par souris et par manipulation.
Impact sur les animaux
Les injections, ainsi que la contention des souris nécessaire pour réaliser ces injections, nécessaire pour l’ensemble de la procédure peuvent entrainer un état de stress chez ces dernières. C’est pourquoi nous avons choisi d’effectuer ces gestes sur souris anesthésiées. Un suivi quotidien des animaux (évaluation du comportement, alimentation, hydratation) et l’évaluation 4 fois par semaine de la courbe de poids ainsi que de la croissance tumorale (à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile) provoquera peu de nuisance/stress et permettra la surveillance d’apparition des points limites définis Le développement de la tumeur sur le flanc (qui sera limité à un volume maximal) pourrait provoquer une gêne légère de la souris – c’est pourquoi déplacements et activité seront particulièrement observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et les ganglions lymphatiques Application de la règle des «trois R»
Remplacement
Ce projet est basé sur des études préliminaires réalisées sur cellules en culture montrant un effet fort du composé testé à la fois sur les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires. Toutefois, ces études sur cellules ne permettent pas de prendre en considération les échanges qu’il peut y avoir entre elles, ni l’impact des tissus autour de la tumeur sur la réponse au traitement anticancéreux. A ce jour, seules les expériences in vivo permettent de prendre en considération l’ensemble de ces paramètres.
Réduction
L'effectif du nombre d'animaux requis par groupe expérimental a été calculé statistiquement en nous basant sur des études similaires menées au sein de notre laboratoire.
Raffinement
Les expérimentations débuteront après une période d’acclimatation de 7 jours aux conditions de l’animalerie. Les souris femelles seront hébergées par 5 en cages filtrées, à une température de 22±2°C et une humidité relative de 50±20%. Les souris seront soumises à un cycle lumière-obscurité inversé de 12h. Elles auront accès à volonté à eau et nourriture et disposeront d’un enrichissement (frisures de papier graft pour faire des nids, bûchettes de peuplier à ronger, tunnel ou dôme, pour se cacher et grimper). Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés. Des critères d'arrêt anticipé de l'expérimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifiés.
Choix des espèces
Les deux modèles de souris sélectionnés possèdent un système immunitaire efficace et sont les modèles animaux le plus appropriés pour pouvoir induire un développement d’une tumeur et étudier l'impact de traitement anticancéreux. souris adultes, dont le système immunitaire est mature.
Evaluation thérapeutique de l’électrostimulation du nerf splénique sur des modèles inflammatoires expérimentaux de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 480 reçoivent une endotoxine bactérienne quatre jours de suite pour déclencher une neuroinflammation et détruire une partie de leurs neurones dopaminergiques, 288 se font implanter une électrode sur le nerf de la rate avec des connecteurs fixés au crâne, et 384 traversent une piste les pattes encrées pour mesurer leur longueur de foulée. Reliée trente-six jours par un fil à un stimulateur électrique, chaque souris opérée est séparée de ses congénères, et le bénéfice annoncé pour les personnes atteintes de Parkinson reste une piste thérapeutique à explorer. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'un tel travail ne peut être mené que sur des "organismes entiers" préservant les interactions entre système nerveux et système immunitaire.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer sur des modèles murins l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique de la maladie de Parkinson. Ce modèle de Parkinson est caractérisé par une réponse pathogénique neuroinflammatoire médiée par le système immunitaire. Il a pour finalité éventuelle d'appliquer ce traitement par électrostimulation en clinique. La maladie de Parkinson est une maladie du cerveau qui entraîne de la neuroinflammation, des problèmes moteurs, des troubles de la santé mentale et du sommeil, ainsi que des douleurs et d’autres problèmes de santé. L'efficacité des traitements actuels est malheureusement inconstante, et épuisable obligeant à changer souvent de molécule. Il n’y a pas de traitements curatifs. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante et pourrait apporter une nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels. Nous avons ainsi récemment démontré que la stimulation du nerf de la rate (splénique) réduisait significativement la neuroinflammation dans un modèle murin de la sclérose en plaque. On sait que la stimulation de certains nerfs périphériques agit également directement sur les cellules du système immunitaire en inhibant leur activité inflammatoire. Toutefois, l’impact d’une stimulation chronique du nerf splénique sur l’évolution de la maladie de Parkinson n’a jamais été évalué. Le projet consiste à : 1- implanter chez une souris une électrode de stimulation au niveau du nerf de la rate (nerf splénique); 2- puis induire la maladie de Parkinson (modèle par injection intra-péritonéale d’une endotoxine bactérienne ; 3- puis réaliser ou non des sessions d'électrostimulation du nerf de la rate. La comparaison des scores cliniques entre les animaux ayant subi une électrostimulation du nerf splénique et ceux n'ayant pas subit cette électrostimulation nous permettra de déterminer l'effet de l'électrostimulation sur le développement de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante, présentant une toxicité potentielle moindre comparée aux molécules de type stéroïdien par exemple. Déterminer si l’électrostimulation inhibe les principales cellules immunitaires pathogéniques impliquées dans la sclérose en plaque pourrait conforter l’utilisation de cette nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
Induction de la maladie de Parkinson : 480 animaux Les animaux subiront une anesthésie générale gazeuse et recevront une injection d'endotoxine bactérienne tous les jours pendant 4 jours consécutifs afin d’activer le système immunitaire (durée de l'intervention: 10 minutes). Implantation électrode : 288 animaux. Les animaux recevront un analgésique 20 minutes avant l’opération puis subiront une anesthésie générale pendant 20 minutes. Une électrode sera implantée au niveau du nerf splénique et les connecteurs seront fixés au niveau du crâne. La durée prévue de l’opération est de 20 minutes. Le lendemain de l'opération, les animaux opérés recevront un traitement anti-inflammatoire maintenu pendant les 3 jours suivants. Mesure de la longueur de foulé : 384 animaux. Les longueurs de foulée sont mesurées sur une piste plein champ contenant une bande de papier et disposée pour déboucher sur de la nourriture. Les pattes antérieures et postérieures de la souris sont humidifiées au préalable avec de l'encre avant d'être relâchées pour traverser la piste éclairée. Pas de prélèvement sur animaux vigiles, pas de prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
1- Nuisances associés à l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'endotoxine bactérienne : Dans ce modèle, la maladie de Parkinson est induite par injections d'une endotoxine bactérienne. Ces injections provoquent chez l’animal une réaction immunitaire induisant de la neuroinflammation et à terme la perte partielle de neurones dopaminergiques dès le 5ième jour. A partir du 19ème jour après la première injection , un déficit moteur modéré apparaît qui se traduit par une diminution maximale de la longueur de foulé de l’ordre de 8%. Le pic de la pathologie est atteint aux alentours du jour 19 post induction puis les symptômes associés à la maladie vont décroitre progressivement jusqu’à la fin de l’expérimentation (jours 36). 2- Nuisances associées à l’électrostimulation : Il n’y a pas de douleurs associées à l’électrostimulation du nerf splénique car ce nerf n’est pas constitué de fibres nerveuses sensitives. La procédure d'implantation d'une électrode sur le nerf de la rate et l'électrostimulation chronique de ce nerf est réalisée de manière récurrente au sein de notre équipe. Une douleur d’une durée estimée à 48 heures est par contre engendrée par la procédure chirurgicale permettant l’implantation de l’électrode de stimulation sur le nerf splenique du fait de l’incision de la peau et du péritoine. Lors de l'électrostimulation les animaux seront séparés les uns des autres car la stimulation électrique requiert une connexion à un stimulateur électrique externe par un fil incompatible avec une stabulation en groupe pendant 36 jours (risques de rognage de fils).
Devenir
Afin de limiter au maximum les souffrances potentielles associées à l'évolution de la pathologie, l'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure
Remplacement
Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique.
Réduction
Les estimations du nombre d'animaux par condition expérimentale a été determiné par une approche statistique afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulé de l’expérimentation et donc de limiter le nombre d’animaux
Raffinement
Des mesures de raffinements seront mises en place afin de limiter au maximum les contraintes imposées aux animaux dans le contexte de cette étude : les interventions chirurgicales seront menées suivant un protocole d’anesthésie et d’analgésie en prenant soin de maintenir la température corporelle des animaux en les plaçant sur une couverture chauffante. Le suivi postopératoire inclura un traitement antalgique et une grille d’observation préétablie prévoyant des mesures correctives et la mise en oeuvre le cas échéant de points limites précoces et adaptés.
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi car c’est l’espèce animale de référence en Immunologie chez laquelle l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'une endotoxine bactérienne a été bien caractérisée. Le projet portera sur des souris mâles C57Bl/6 âgées de 12 semaines permettant une chirurgie aisée (poids entre 20 et 25 gr).
Etude de la dynamique de la reconstitution hematopoïétique post-stress induite par chimiothérapie ou immunomodulateur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 216 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses après leur mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux chimiothérapies ou un immunostimulant dans l'abdomen, puis subissent de trois à neuf prélèvements de sang dans l'orbite de l'œil, sans anesthésie. Le porteur décrit des effets de la chimiothérapie qui peuvent durer plusieurs mois, diminution du poids, altérations du comportement et du pelage, et cherche à comprendre comment ces traitements dérèglent la moelle osseuse avant l'apparition d'une leucémie secondaire. Il écrit aussi que "les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux".
Objectifs
La chimiothérapie permet de guérir un grand nombre de cancers. Actuellement une grande partie de ces traitements ne sont toujours pas « ciblés » sur la tumeur. Ils empêchent la multiplication des cellules du cancer ce qui est l’objectif désiré, mais empêchent aussi la multiplication de certaines cellules saines notamment dans la moelle osseuse. La moelle osseuse est le lieu de fabrication des cellules du sang à partir des cellules souches. La chimiothérapie fait baisser transitoirement les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes (désignés sous le terme de lignées sanguines). Malheureusement, dans un certain nombre de cas rares, les traitements anti-cancéreux sont eux-mêmes à l’origine du développement de maladies cancéreuses de la moelle osseuse comme les leucémies aigues et les myélodysplasies dites secondaires des années après la guérison du premier cancer. Ce projet vise à comprendre comment la chimiothérapie affecte les cellules de la moelle et la production des lignées sanguines avant l’apparition d’une maladie leucémique secondaire. Pour mener à bien notre projet, nous allons étudier la production des trois lignées sanguines issues de la moelle osseuse, suivre les dérèglements induits au cours du temps par la chimiothérapie et la comparer à un autre facteur perturbant la production des lignées sanguines temporairement et qui n’induit pas de maladies leucémiques secondaires. Nous souhaitons étudier la quantité des cellules souches de la moelle, avant et après traitement par chimiothérapie et par l’agent perturbateur. Les cellules souches sont une population rare, capable de fabriquer toutes les autres lignées, mais aussi de se maintenir tout au long de la vie. Notre hypothèse est que la chimiothérapie diminue le nombre de cellules souches et que cette diminution favorise à son tour le développement précoce de la leucémie en favorisant des cellules qui prolifèrent plus. Notre projet a pour objectif d’étudier, chez la souris, les phases précoces du développement leucémique favorisé par la chimiothérapie. Une meilleure compréhension de ces phases précoces permettra de surveiller les patients porteurs de cancers traités par chimiothérapie et ainsi de prévenir la survenue d’un second cancer, souvent fatal, chez des patients souvent guéris d’une première maladie grave. De plus, la capacité de la moelle osseuse à se réparer après chimiothérapie est un domaine encore peu étudié.
Bénéfices attendus
La capacité de la moelle osseuse à se réparer après chimiothérapie est un domaine encore peu étudié. Nous pensons que notre projet à son terme apportera des avancées significatives dans ce domaine et participera ainsi à l’amélioration du traitement du cancer et notamment des leucémies . Il permettra de mieux connaître ce qui induit l’apparition de leucémie secondaire et comment le prévenir.
Procédures
Dans ce projet, les souris vigiles recevront 2 traitements par voie intra-péritonéale. Le 1er traitement sera administré à raison d’une injection par jour pendant 3 jours (durée du geste inférieure à 10 sec) puis 4 mois après ce 1er traitement les souris recevront un 2ème traitement. En fonction de la molécule, ce 2nd traitement sera administré à raison d’une injection par semaine pendant 6 semaines ou d’une injection à jour 1 et jour 3 ou d’une injection unique (durée de chaque injection inférieure à 10 sec) . Entre 3 et 9 prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire, sans anesthésie, seront aussi effectués. Un prélèvement sanguin après le premier traitement et entre 2-6 prélèvements une fois par mois maximum après le deuxième traitement. Chaque prélèvement sanguin se fera en moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous administrerons aux souris deux chimiothérapies et un immuno-stimulateur par voie intra-péritonéale. La douleur sera une nuisance directe associée à cet acte. Les effets possibles de la chimiothérapie comprennent une diminution du poids, des altérations du comportement et du pelage qui peuvent durer sur plusieurs mois. Pour l’utilisation de l’immunomodulateur, une inflammation systémique est généralement observée pendant 3 jours après traitement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Pour étudier la production des cellules hématopoïétiques (cellules sanguines) matures perturbée par la chimiothérapie, un animal ayant un système hématopoïétique proche du nôtre est nécessaire : la souris reste le modèle de référence. De plus, l’hématopoïèse se développent durant des mois ou des années et il n’est pas encore possible de les reproduire in-vitro. C’est chez elle que des premiers résultats précliniques ont été obtenus pour modéliser les leucémies secondaires. Il n’existe donc pas de méthode alternative à l’expérimentation animale. En revanche, notre schéma expérimental et nos hypothèses reposent sur de nombreuses observations cliniques chez des patients ayant reçu de la chimiothérapie pour le traitement de leur cancer.
Réduction
Le choix des traitements et leurs doses dans ce projet provient des résultats positifs de notre précédente étude. Nous effectuerons des suivis longitudinaux des souris, minimisant leur utilisation. L’évaluation du nombre d’animaux nécessaire est aussi le fruit d’analyses statistiques basés sur le résultat de précédentes expériences effectuées dans notre laboratoire ou dans la littérature. Ainsi nous avons identifié que 8 animaux étaient suffisants pour avoir assez de pouvoir statistiques.
Raffinement
Des protocoles d’intervention en cas de début de souffrance seront mis en place (réchauffement, enrichissement de l’alimentation et du milieu), ainsi que des critères stricts d’arrêt de l’expérimentation en suivant une grille de score. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de l’hématologie, les animaux sont suivis trois fois par semaine afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Les effets possibles de la chimiothérapie comprennent une diminution du poids, des altérations du comportement et du pelage. Pour l’utilisation de l’immunomodulateur, une inflammation systémique avec apparition de fièvre est généralement observée mais que nous n’avons jamais observée dans les doses que nous utilisons. La surveillance à l’aide de la grille de score permettra de réduire au minimum la souffrance animale : dès qu’un signe de souffrance débutante sera détecté, l’expérimentation sera interrompue. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point-limite, nous arrêterons les traitements administrés, et si les symptômes persistent, l'animal sera mis à mort dans les 24h heures .
Choix des espèces
Pour étudier la production des cellules hématopoïétiques matures perturbée par la chimiothérapie, un animal ayant un système hématopoïétique proche du nôtre est nécessaire : la souris reste le modèle de référence. De plus, il n’est pas encore possible de reproduire in vitro l’hématopoïèse car elle se développent durant des mois ou des années et dépend du microenvironnement qui ne peut pas encore être reproduit expérimentalement in-vitro. L’hématopoièse dépend du microenvironnement qui ne peut pas encore être reproduit expérimentalement in vitro. De plus, l’induction de code-barres ou du rapporteur de cycle cellulaire se fait in vivo, grâce à deux lignées de souris spécifique excluant la possibilité de modèle in vitro. A noter cependant que notre schéma expérimental et nos hypothèses reposent sur l’étude de nombreuses cohortes cliniques de patients traités pour le cancer et ayant développé ensuite un cancer secondaire. Les animaux seront adultes. Nous souhaitons étudier l’effet de la chimiothérapie sur les cellules souches hématopoïétiques à l’âge adulte car c’est l’âge de survenue des cancers secondaires.
Confirmation de l’implication de la deubiquitinase BRCC3 et de sa cible d’ubiquitination K373 sur la protéine NLRP3 dans les fonctions pro et anti tumorales des lymphocytes Th17
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
80 souris transgéniques vont être utilisées, chacune portant un mélanome injecté sous la peau qui peut atteindre 1 000 mm3, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'injection dure cinq secondes sous anesthésie à l'isoflurane, et toutes sont tuées ensuite pour prélever les tumeurs et les organes lymphoïdes. Le porteur affirme que ces tumeurs ne provoquent ni nécrose, ni métastase, ni gêne à la mobilité, et ramène les nuisances au stress de la manipulation et de la contention. Le bénéfice annoncé tient en une phrase : montrer qu'une protéine détectrice de danger pourrait servir de cible thérapeutique en cancérologie.
Objectifs
Nos résultats précédents ont montré in vitro et in vivo qu’une protéine détectrice de danger donnait des fonctions pro tumorales à certaines cellules immunitaires. Pour mieux comprendre ces observations et, pourquoi pas, à terme développer une stratégie thérapeutique, nous avons mis en place une collaboration avec une équipe ayant développé des souris transgéniques portant des mutations sur cette protéine. Une des mutations induit un profile antitumorale de nos cellules d’intérêt in vitro. Toujours in vitro, notre collaborateur a pu identifier une molécule agissant sur cette mutation. Pour valider que ces observations sont bien associées à un ralentissement de la croissance des tumeurs, nous utiliserons des souris transgéniques et évaluerons la croissance du mélanome dans ces souris. A la fin de l’expérience, les tumeurs et organes lymphoïdes secondaires des souris seront prélevés pour analyse
Bénéfices attendus
Grâce à cette étude nous pensons pouvoir montrer que la protéine détectrice de danger peut servir de cible thérapeutique en cancérologie.
Procédures
Dans le cas des tumeurs sous cutanées les souris recevront une injection de cellules tumorales (durée de l’injection +/- 5 sec). Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie à l’isoflurane.
Impact sur les animaux
Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie. Sur la durée de l’expérience (les plus grosses tumeurs atteignant un volume de 1000mm3), ces modèles de tumeurs ne provoquent pas de nécrose, pas de métastase et pas d’impact sur la mobilité des souris. Les souris subiront le stress de la manipulation et de la contention.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs
Remplacement
Une grande partie de nos démonstrations a été réalisées in vitro. La réponse immunitaire anti-tumorale étant un phénomène complexe faisant intervenir beaucoup de cellules, de molécules et leurs interactions, il est impossible d’en modéliser l’entièreté en dehors d’un organisme vivant.
Réduction
Dans un souci de réduction, les expériences ne seront répétées que deux fois et les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, nous avons fait appel à une méthodologiste afin de déterminer au mieux le nombre minimal de souris requis pour que nos tests statistiques soient suffisamment puissants.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Chaque animal sera examiné quotidiennement tout au long de l’expérimentation. En cas de signes de douleur ou de souffrance les souris seront mises à mort.
Choix des espèces
Les animaux seront utilisés à l’âge adulte à partir de 8 semaines, c’est-à-dire possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour sous forme génétiquement modifiée.
Imagerie in vivo non invasive par échographie et photoacoustique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 200
2 415 souris et 200 rats vont être utilisés, chacun pouvant subir jusqu'à 18 anesthésies, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'imagerie par échographie et photoacoustique dure jusqu'à 40 minutes par séance et peut se répéter chaque semaine pendant 18 mois, avec parfois l'injection intraveineuse d'un produit de contraste sans analgésie. Le projet est une prestation de service qui ouvre cette imagerie à d'autres équipes : 1 831 animaux non-humains seront tués pour prélèvement d'organes, 784 renvoyés au laboratoire demandeur pour y poursuivre son projet. Le porteur juge l'analgésie "non nécessaire" pour un acte qu'il qualifie de non invasif, tout en admettant que la procédure peut aggraver la faiblesse, la perte de poids ou la souffrance des animaux fragiles.
Objectifs
L'objectif de ce projet générique de service est de fournir aux scientifiques un accès à l'imagerie échographique et photoacoustique non invasive et en temps réel de tissus d'animaux vivants anesthésiés. Les principales applications comprennent : 1- Le suivi de molécules photoacoustiques ou fluorescentes dans les tissus (biodistributions) 2- L'observation superficielle (par exemple, la peau) ou en profondeur (par exemple, les organes de la cavité abdominale) pour une caractérisation anatomique (par exemple, épaisseur des parois, diamètres des cavités) 3- Une caractérisation fonctionnelle et hémodynamique des tissus (par exemple, débits vasculaires, perfusion tissulaire, contractilité myocardique) 4- Le suivi non invasif de la progression tumorale 5- La caractérisation de potentielles nouvelles molécules thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le suivi par imagerie ultrasonore à haute résolution associée à la photoacoustique est une approche non invasive qui permet d'obtenir des résultats concernant l'anatomie, la fonction, voire le profil moléculaire des organes où chaque animal est son propre contrôle. Cette méthode offre la possibilité d'orienter plus efficacement la recherche fondamentale et clinique dans des domaines tels que la cardiologie, la neurologie, l'oncologie, etc. Les données générées seront publiées, ce qui les rendra accessibles à la communauté scientifique et médicale.
Procédures
La procédure d'échographie/photoacoustique est réalisée sous anesthésie mais est non invasive. Elle permet d'analyser l'anatomie et la fonction des tissus mous des animaux (cœurs, cerveaux, foie, reins, etc.) avec ou sans pathologie et/ou traitement. Il peut être nécessaire d'injecter un produit de contraste par voie intraveineuse (pendant l'anesthésie de l'animal) pour une meilleure visualisation des tissus. La procédure d'échographie/photoacoustique se déroule sur une durée maximale de 40 minutes (temps médian de 11 minutes), incluant l'anesthésie, la mise en place et la préparation de l'animal, l'acquisition d'images et le réveil. La durée d'acquisition des images est variable en fonction de la complexité de l'organe et/ou des séquences d'images et peut varier de 5 à 30 minutes. L'imagerie proposée pour un suivi longitudinal pourra s'étaler sur une période allant d'une semaine à plusieurs mois (maximum 18 mois), avec une fréquence d'imagerie d'au moins une fois par semaine. Pour les protocoles courts (
Impact sur les animaux
La contention et les phases d'induction et de réveil lors d'une anesthésie peuvent générer du stress. Les injections intraveineuses peuvent entraîner une légère douleur car elles sont effectuées sous anesthésie mais sans analgésie. Pour cette procédure, l'administration d'analgésie est considérée comme non nécessaire, voire susceptible d'ajouter des effets indésirables pour ce type d'intervention non invasive. Cependant, dans le cas d'animaux fragiles présentant un phénotype dommageable, il n’est pas improbable que cette procédure puisse exacerber l'apparition éventuelle d'effets indésirables tels que la faiblesse, la perte de poids ou la souffrance.
Devenir
À la fin du protocole expérimental, les animaux seront soit euthanasiés et les organes cibles prélevés pour des analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, soit nous organiserons un retour sur le site du demandeur pour la poursuite du projet dans le cadre d’une utilisation continue.
Remplacement
L'imagerie ultrasonore joue un rôle essentiel dans la compréhension des grandes fonctions en recherche préclinique, en particulier dans des domaines où les méthodes substitutives ne peuvent pas fournir des informations équivalentes. Le suivi des processus physiologiques tels que le métabolisme, la perfusion tissulaire, la fonction des organes complexes ou la distribution de médicaments dans le corps offre ainsi des informations précieuses sur les grandes fonctions biologiques. Les modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire fidèlement ces fonctions complexes, dynamiques et spatiales présentes dans les systèmes biologiques.
Réduction
Nos procédures sont non invasives, ce qui nous permet de maximiser le nombre d'expériences réalisées tout en minimisant l'utilisation d'animaux. Le suivi longitudinal, où chaque animal est son propre témoin, sera effectué par imagerie non invasive de la fonction des organes afin d'explorer leur évolution dans le temps dès l'apparition des premiers signes de dysfonction. Nous limiterons donc le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Toutes les procédures sont effectuées de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux, notamment par l'utilisation d'anesthésie et d'antalgiques en cas de douleur. Les souris seront surveillées quotidiennement par notre personnel qualifié afin de détecter le moindre signe de souffrance chez l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie
Choix des espèces
L'utilisation de rongeurs tels que les souris et les rats permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives, digestives, le cancer, etc. L'utilisation de souris génétiquement modifiées reproduit des modèles de pathologie, ce qui en fait un choix privilégié dans la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Le panel d'âges sera variable car il dépendra du projet scientifique auquel nous serons confrontés. Techniquement, nous pouvons imager des animaux allant de P15 (15 jours après la naissance) à 24 mois d'âge.
Immunothérapie du cancer chez les souris humanisées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Immunodéficientes puis greffées avec des cellules souches de sang de cordon humain, 480 souris femelles portent un système immunitaire humain reconstitué, ce qui les expose à une maladie du greffon contre l'hôte, à des pertes de poids et à des plaies cutanées. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rasées sur le flanc, elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire humaine sous la peau, deux injections dans l'abdomen par semaine et deux mesures de la tumeur au pied à coulisse, sans anesthésie. Le porteur écarte les analgésiques, susceptibles selon lui d'interférer avec les résultats, et prévoit la mise à mort 35 jours après la greffe, ou plus tôt si un point limite est atteint, pour analyses cellulaires et moléculaires.
Objectifs
Le cancer est la seconde cause de mortalité en France après les maladies cardio-vasculaires. Le cancer du sein est la première cause de décès par cancer chez la femme. Malgré d'importants progrès, il reste encore de nombreux traitements à tester, en particulier dans le champs des immunothérapies. Dans le cadre général de notre projet d'immunothérapie du cancer, nous cherchons à valider des anticorps thérapeutiques dans un modèle de cancer du sein implanté par la voie sous cutanée chez la souris humanisée. Les souris humanisées sont des souris immunodéficientes reconstituées avec un système immunitaire humain après transfert de cellules souches de sang de cordon ombilical. Avec ce protocole, les souris régénerent un système immunitaire humain complet et fonctionnel quelques semaines après la greffe. Les objectifs du projet sont donc d'évaluer l'effet thérapeutique de différents anticorps sur la croissance de la lignée tumorale en l'absence ou en présence d'un système immunitaire humain. Le choix de la lignée de souris utilisée dans chaque expérience dépend de la cible de la thérapie, ces lignées de souris présentant des caractéristiques de reconstitution immunitaire particulières. La comparaison de la croissance des tumeurs avec ou sans traitement dans des souris humanisées ou non va nous renseigner sur l'efficacité des anticorps à aider le système immunitaire à contrôler la croissance de la tumeur. Ces informations pourraient être importantes pour développer de nouveaux traitements pour le cancer du sein.
Bénéfices attendus
La comparaison des croissances tumorales dans différents groupes de souris traitées nous renseignera sur la qualité de la réponse immunitaire contre le cancer du sein dans un modèle proche de la physiologie humaine donc plus pertinent que les études in vitro ou des études dans des modèles purement murin. Nous testerons des combinaisons thérapeutiques originales de médicaments destinés à la clinique humaine, susceptibles d'être transposées chez l'homme. Les bénéfices potentiels du projet sont donc nombreux, justifiant le recours à l'expérimentation animale.
Procédures
Les animaux humanisés vigiles sont prélevés à la veine mandibulaire une semaine après leur arrivée pour mesurer la qualité de la reconstitution en cellules humaines. Ce geste dure deux minutes par souris. Les animaux vigiles sont rasés sur le flanc droit avec une tondeuse dédiée puis greffés avec une lignée tumorale humaine par injection sous cutané avec une aiguille adaptée. Ce geste dure cinq minutes par souris. Les animaux sont traités deux fois par semaine avec les médicaments à tester avec une injection dans le péritoine avec une aiguille adaptée et pesées simultanément, avec contention appropriée. La taille de la tumeur est mesurée deux fois par semaine avec un pied à coulisses, sans anesthésie, avec contention appropriée. Les animaux sont euthanasiés pour analyses complémentaires soit à la fin de l'expérience (35 jours après la greffe de la tumeur), soit si un point limite est atteint.
Impact sur les animaux
Les animaux vigiles sont injectés par la voie sous cutanée. La croissance des tumeurs sous la peau pourrait conduire à une gêne dans les déplacements, des infections des plaies pouvant conduire à des nécroses, ou encore des douleurs. L'immunodéficience des animaux pourraient conduire à leur infection par des agents opportunistes, conduisant à des atteintes oculaires ou pulmonaires. Le prélèvement sanguin pourrait conduire à une hémorragie incontrôlée. Les injections répétées des traitements par la voie intra péritonéale pourraient conduire à des douleurs locales ou à des infections opportunistes. L'humanisation des souris immunodéficientes pourraient induire une maladie du greffon contre l'hôte, entrainant une perte de poids et/ou des plaies cutanées et/ou une diarrhée.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure par une méthode réglementaire pour analyses cellulaires et moléculaires complémentaires, si ils ont atteint un des points limites définis ou si la durée de la croissance de la tumeur dépasse 35 jours.
Remplacement
Ce projet repose sur la mesure chez la souris des croissances tumorales d'une lignée de cancer du sein humain dans différentes conditions expérimentales et en présence d'un système immunitaire humain. Dans ce cas précis de recherches pré cliniques visant à évaluer l'efficacité de traitements expérimentaux, il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale par des expériences in vitro, incapables de reproduire la complexité physiologique de la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur. De plus, seul le modèle des souris humanisées permet de répondre aux questions du projet et d'obtenir des résultats potentiellement transposables à la clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans le projet (480) est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le groupe contrôle recoit les véhicules des deux molécules testées en combinaison. La taille des effectifs a été fixée à 6 animaux / groupe pour détecter une différence de 20 pour cent dans la croissance tumorale avec une puissance de 80 pour cent. Du fait de la variabilité de croissance tumorale entre souris, nous répéterons l’expérience pour chaque condition testée. Les groupes expérimentaux tests et contrôles seront réalisés simultanément, réduisant le nombre d'animaux nécessaires. Chaque souris sera inclus dans un protocole d'analyse complet, allant de la mesure de la croissance tumorale aux analyses cellulaires et moléculaires subséquentes.
Raffinement
L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par les membres de l'équipe et/ou par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Il n'est pas prévu d'utiliser des analgésiques, ceux ci pouvant interférer avec les résultats de l'étude. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du papier et une maison pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité. Des points limites basés sur différents critères extérieurs (poids, comportement, aspect général,...) ont été établis.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes humanisées représentent le seul modèle d'une réponse immunitaire humaine contre une tumeur humaine in vivo. A ce titre, elles représentent le seul modèle vivant dans lequel des drogues à destination d'un usage clinique peuvent être testées. Il devient ainsi possible d'apprécier l'efficacité de telle ou telle drogue sur la réponse immunitaire contre la tumeur. Cette hypothèse est développé depuis de nombreuses années par l'équipe et le modèle nous a permis de proposer une nouvelle stratégie de traitement pour le cancer du sein. Le présent projet vise à utiliser les souris humanisées pour développer 5 nouveaux traitements contre le cancer du sein. Les souris humanisées sont livrées par le fournisseur entre 15 et 18 semaines d'âge. Ce temps est nécessaire pour le développement complet des lymphocytes T humains chez la souris à partir des progéniteurs humains greffés dans les souris à l'âge de 3 semaines environ. Les animaux non humanisés sont livrés à l'âge de 6 à 10 semaines. Seules des souris femelles sont utilisées dans ce projet.
Production d’anticorps polyclonaux anti Dnak chez le lapin
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Quatre à sept injections intradermiques avec un adjuvant qui provoque une forte inflammation aux points de piqûre et des douleurs articulaires, quatre à six prélèvements sanguins sur animal vigile, puis une anesthésie générale de quinze minutes suivie d'une exsanguination de deux minutes: 2 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur sang fournira des anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine bactérienne, destinés à servir d'outil de laboratoire pour étudier la virulence de staphylocoques de la peau. La seconde lapine est immunisée quinze jours après la première, ce décalage permettant selon le porteur de renoncer à l'immuniser si la protéine était mal supportée. Le même document décrit deux plateformes, des blocs de luzerne, des friandises aromatisées deux fois par semaine et une heure quotidienne dans un parc intérieur.
Objectifs
Une neurohormone humaine sécrétée par les terminaisons nerveuses dans les parties superficielles de la peau, le CGRP (Calcitonin Gene Related Peptide), a été identifiée par le laboratoire comme facteur induisant une augmentation de la virulence de staphylocoques du microbiote cutané. Nous avons ainsi montré que le CGRP provoque une augmentation de la virulence de Staphylococcus epidermidis, par un mécanisme faisant intervenir la protéine chaperonne DnaK, alors retrouvée au niveau du sécrétome de la bactérie. Le gène dnaK de Staphylococcus epidermidis a été cloné et la protéine recombinante DnaK produite et purifiée à partir d’E. coli. Le projet vise à élucider ce nouveau mécanisme d’activation de la virulence par le CGRP. Pour ce faire, i) nous caractériserons l’interaction entre le CGRP et la protéine DnaK ; ii) nous étudierons le rôle de DnaK dans l’activation de la virulence, c'est-à-dire en tant que protéine effectrice et/ou en tant que protéine activatrice d’un messager secondaire : iii) DnaK étant capable de se lier à une multitude de ligands, en plus du CGRP, d’autres neurohormones de la peau seront testées pour leur capacité à activer la virulence en interagissant avec la protéine DnaK ; iv) enfin, la protéine DnaK étant l’une des protéines les plus conservées chez les procaryotes, nous testerons ce système de communication sur d’autres bactéries du microbiote cutané. L’intervention d’une protéine chaperonne procaryote dans la détection d’un signal eucaryote n’ayant jusqu’à présent jamais été mise en évidence, les résultats de ce projet pourraient ainsi mener à la découverte de nouvelles voies de signalisation hôte–bactéries. A long terme, la caractérisation des mécanismes moléculaires d’activation de la virulence des bactéries de la peau par le CGRP permettra par la suite de proposer de nouvelles molécules à visée thérapeutique pour le traitement de maladies inflammatoires de la peau telles que le psoriasis.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux anti Dnak seront d’abord des outils de lignage et de diagnostic. Ils nous permettront d’étudier le rôle de DnaK dans l’augmentation de la virulence chez les procaryotes, la découverte de nouvelles voies de signalisation hôte–bactéries et la caractérisation des mécanismes moléculaires d’activation de la virulence des bactéries de la peau par le CGRP.
Procédures
Prélèvement sur animaux vigiles et injection transdermiques. Prélévement vigile maximum 6 minimum 4. Injections intradermiques maximum 7 minimum 4. Les temps de prélèvement et d'injection seront de 1 à 2 minutes chacun. En fin de procédure une anesthésie générale de 15 minutes suivie d'une exsanguination de 2 minutes.
Impact sur les animaux
L’utilisation de l’adjuvent de Freund peut induire des douleurs articulaires et provoque une forte inflammation au niveau des points d’injection. La réaction immunitaire peut aussi induire une hausse de la température.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après l'immunisation afin de recueillir le maximum de sang et donc d'anticorps polyclonaux.
Remplacement
Des méthodes de production d'anticorps recombinant existent mais ils ne permettent en aucun cas d'obtenir une polyclonalité aussi élevé que chez l'animal. De plus la qualité des banques de phages est très variable et donc les résultats très aléatoires. La diversité des clones obtenus par sélection sur phage display est extrêmement faible et l’affinité des anticorps obtenus médiocre. Le lapin permet d’obtenir des anticorps de fortes affinités grâce à la longueur de leur partie variable. La finalité de notre projet est d’étudier les produits de dégradation de la protéine Dnak il est donc important de posséder des anticorps qui ciblent l’intégralité des épitopes immunodominants.
Réduction
Nous avons utilisé les données de la littérature pour calculer de façon théorique les capacités moyennes de production d'anticorps pour chaque lapin. Nous avons donc pu déterminer que 2 lapins seraient nécessaires pour obtenir la quantité d'anticorps indispensable à nos études. Les deux lapins seront immunisés avec 15 jours de décalage ceci permettra d’évaluer la toxicité intrinsèque de la protéine Dnak recombinante et de ne pas immuniser le second lapin si la protéine était mal supportée par le premier lapin.
Raffinement
Les injections intra-dermiques comme les ponctions sanguines seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane. Les règles d'asepsies seront respectées afin d'éviter tout risque d'infection aux sites d'injection et de ponction. Afin de diminuer au maximum toute douleur articulaire et toute douleur due à l’inflammation des sites d’injection, les animaux recevront un patch transcutané d'antalgique morphinique adapté à leur poids. Ce patch sera changé toutes les 72 heures. Le suivi sérologique de l’immunisation nous permettra de limiter au strict minimum les rappels d’immunisation et de mettre fin à la procédure au plus vite. L’observation des animaux au quotidien basée sur le score grimace scale permet d’établir un point limite précoce qui mettrait fin immédiatement à la procédure par la mise a mort. Les deux lapines seront hébergées ensemble dans des gages aux normes européennes elles disposeront de nourriture et d’eau ad libitum. Leur cage est équipée de deux plateformes et deux abris fixes. Le milieu est enrichi de briquettes de bois et de bloc de luzerne. 2 fois par semaine elles reçoivent des friandises sous forme de bonbons aromatisés spécialement développé pour les lapins. Elles seront sortie 1h par jour dans un « parc » intérieur agrémenté de jouets.
Choix des espèces
Le lapin est l’espèce de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. Sa taille moyenne permet d’obtenir une bonne quantité de sérum riche en anticorps tout en utilisant peu de protéine pour l’immunisation. La longueur des parties variables des IgG de lapin leur confère une excellente affinité, de plus ces IgG sont facilement purifiable. Les animaux seront des jeunes adultes de 1,5 à 2 kg (30 à 45 jours) car ils possèdent un taux maximum d’anticorps circulant et un système immunitaire mature.
Immunisation de souris au système immunitaire humanisé
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 500 souris au système immunitaire humanisé vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de souffrance légère. Elles reçoivent jusqu'à deux injections hydrodynamiques de plasmides dans la veine, des administrations de composés immunogènes, pathogènes ou thérapeutiques, des prélèvements sanguins répétés à la veine saphène, au sinus rétro-orbital ou à la queue, puis un prélèvement terminal par ponction intracardiaque sous isoflurane. Le porteur décrit pourtant des atteintes qui peuvent se traduire par une perte de poids, une hypoactivité ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer, et justifie la mise à mort par le fait que les animaux "ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général". Sur le remplacement, il envisage des tests in vitro "si ceux-ci sont appropriés", et conclut que la souris humanisée reste "indispensable".
Objectifs
Le système immunitaire joue un rôle central dans la mise en place d’une réponse protectrice efficace et durable contre les agressions extérieures. Pour mieux comprendre ce tissu et s’en servir pour développer des thérapies innovantes, les chercheurs ont besoin de modèles précliniques prédictifs. En greffant des cellules souches à des souris immunodéprimées, nous pouvons reconstituer un système immunitaire fonctionnel exprimant des cellules blanches humaines. Cette caractéristique permet, par exemple, de conduire des tests précliniques plus prédictifs des effets prophylactiques et thérapeutiques qu’aura une vaccination chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir la fonctionnalité d’un candidat médicament dans un modèle se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'Homme.
Procédures
Injection hydrodynamique par voie intraveineuse : 2 fois maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Des composés seront administrés par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire. Les injections dureront quelques secondes. Les prélèvements de sang seront réalisés dans la veine saphène, le sinus rétro-orbital ou à la veine caudale. Un prélèvement terminal sans réveil pourra être réalisé par voie intracardiaque ou par voie rétro-orbitale si l’intracardiaque n’est pas réalisable pour raisons scientifiques. Ce prélèvement sera réalisé sous anesthésie à l’isoflurane à une concentration comprise entre 3.5 % et 4.5 %. Les volumes maximaux d'injections et de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition dépendra du vétérinaire d’établissement et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) hydrodynamique(s) intraveineuse de plasmides, l'administration des composés immunogènes, pathogènes ou thérapeutiques, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvement s sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, lorsqu’il n’est pas possible de recréer, in vitro, une séroconversion et d’évaluer son impact protecteur sur un organisme vivant, la souris au système immunitaire humanisé constitue une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et la mise à disposition des patients de thérapies innovantes.
Réduction
Un total de 1500 souris adultes seront utilisées, couvrant une période 5 ans, permettant de réaliser 50 études précliniques, soit 4 groupes (1 placebo et 3 traitements) de 5 à 10 individus. Le nombre exact d’animaux par étude sera réduit en fonction d’études statistiques adaptées aux effets attendus des agents immunogènes et des éventuels traitements.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Un morceau de bois, permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. À leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Celle-ci sera objectivée par une échelle de score adaptée. Les animaux seront pesés deux à trois fois par semaine, la fréquence pouvant être adaptée au stade de l’étude si nécessaire. Le vétérinaire aura pleine autorité pour envisager un traitement anti-douleur ou euthanasier une souris pour raison éthique, s’il le juge nécessaire. Un anesthésie sera mise en place pour les prélèvements terminaux par voie intracardiaque ou rétro-orbitale.
Choix des espèces
La procédure expérimentale d’humanisation a été mise au point et est actuellement maîtrisée chez la souris. Les souches NOG et NCG sont particulièrement réceptives à la greffe du système immunitaire ce qui va permettre à cette espèce d’exprimer des lignées lymphocytaires humaines. Cette particularité permet d’étudier les effets prophylactiques d’une vaccination en condition in vivo, et d’extrapoler, avec davantage de sécurité, les effets qu’auront les traitements chez l’utilisateur final : l’homme. D’autres souches de souris, en particulier non-humanisées, pourront être utilisées dans le cadre d’études préliminaires. Les animaux seront intégrés aux études à partir de l’âge de 7-8 semaines pour les animaux non humanisés, et à partir de 18 semaines pour ceux humanisés.
Evaluation de l’efficacité de thérapies cellulaires et/ou géniques pour le traitement des déficits immunitaires dans un modèle murin – Amendement n°1
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Quatre injections dans le péritoine, une injection dans la veine rétro-orbitale, une injection directement dans le foie, cinq anesthésies gazeuses suivies de séances d'imagerie et deux anesthésies générales profondes: 2 138 souris génétiquement immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris reçoivent des cellules souches ou des progéniteurs sanguins humains, corrigés ou non, pour vérifier que ces cellules se développent dans un organisme vivant. Le porteur indique que cette étape est exigée par l'Agence nationale de sécurité du médicament avant toute demande d'essai clinique chez l'être humain. L'effectif de 2 138 animaux n'est adossé à aucun calcul de puissance statistique, il a été dimensionné "en fonction de notre expérience du modèle" et de la variabilité observée lors de projets antérieurs.
Objectifs
Le but de ce projet est de tester in vivo dans un modèle murin l’innocuité et l’efficacité de nouveaux protocoles thérapeutiques pour des déficits immunitaires sévères. Ces déficits sont des pathologies très graves qui touchent les cellules sanguines et immunitaires, indispensables à la lutte contre les agents infectieux. Ils sont dûs, soit à une mutation dans un gène indispensable au développement ou à la fonction des cellules sanguines, soit à des traitements contre le cancer du sang, dans le cas de leucémie par exemple. Pour toutes ces pathologies, la greffe de moelle osseuse provenant d’un donneur sain est une option thérapeutique largement utilisée, mais la survie après greffe est très hétérogène et peut être inférieure à 30%. De nouvelles approches thérapeutiques doivent donc être absolument développées pour augmenter la survie de patients greffés. Notre objectif est d’explorer l’efficacité de trois nouveaux traitements de thérapie cellulaire (injection de progéniteurs des cellules sanguines), et de thérapie génique (injection de progéniteurs des cellules sanguines ou cellules souches, génétiquement modifiés). L’efficacité de ces approches innovantes doit absolument être validée dans un modèle animal car cette étape est exigée par l’Agence Nationale de la Santé et du Médicament avant tout essai clinique chez l’homme. Il existe un modèle de souris génétiquement modifiée pour être atteinte de déficience immunitaire et qui peut recevoir des cellules sanguines humaines pour qu'elles se développent sans effet délétère. Selon l’âge des souris receveuses, les cellules humaines seront injectées en intraveineuse ou en intrahépatique et la reconstitution immunitaire sera suivie par des prélèvements d’organes lymphoïdes après la mise à mort.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place de nouvelles thérapies dans le cas de déficits immunitaires sévères. Plus spécifiquement, les différentes études sur les progéniteurs de cellules sanguines nous permettront de choisir le protocole de production le plus optimisé pour leur capacité à se développer dans le corps. Par ailleurs, les protocoles impliquant la modification génétique des progéniteurs ou cellules souches visent à évaluer l’efficacité de telles stratégies de remplacement de gènes défectueux et notamment en vérifiant la bonne évolution des cellules génétiquement corrigées chez la souris, et ce durant leur développement. A terme, l’ensemble de ce projet permettra la mise au point jusqu’au stade clinique de protocoles thérapeutiques personnalisés avec une survie améliorée pour tous les patients atteints de déficits immunitaires.
Procédures
Les animaux subiront selon leur utilisation, soit 1 ou 2 : Injection intrapéritonéale (4X), 10s par intervention. Injection intraveineuse rétro-orbitale (1X), 30s par intervention. Anesthésie générale profonde (2X), 2min par intervention. Injection intrapéritonéale (1X), 10s par intervention. Injection intrahépatique (1X), 10s par intervention. Anesthésie gazeuse (5X), 10min à 30min. Imagerie optique (5X), 10min à 30min par intervention. Anesthésie générale profonde (1X), 2min par intervention.
Impact sur les animaux
Les altérations génétiques des animaux provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. A la dose utilisée, l'agent de conditionnement n'induit pas d'effet indésirable majeur mais une douleur transitoire durant les heures post-injectio. L’anesthésie légère gazeuse ou profonde générale par injection de produits anesthésiants peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. Les cellules souches et progéniteurs lymphoïdes ne provoquent pas d'effets indésirables et sont très bien tolérés chez les animaux. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée légère et un stress transitoire.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de réaliser plusieurs analyses moléculaires et biochimiques.
Remplacement
La mise en place d’essais précliniques sur modèles animaux, quand ceux-ci existent, est exigée par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés sur les cellules seront testés chez l’animal. Notre protocole de production de progéniteurs de cellules sanguines est déjà une méthode de remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches pour produire et expandre des cellules qui normalement se différencient en plusieurs mois dans la moelle osseuse. Nous utilisons un système de culture cellulaire, en évitant la maturation des cellules humaines chez la souris sur plusieurs stades. De même, la modification génétique des cellules sera faite dans la culture puis validée (efficacité de l’incorporation du gène sain, expression protéique du gène sain…) avant l’injection chez les animaux. En outre, la capacité des progéniteurs ou cellules souches, corrigées ou non, à se développer correctement, notamment en certains sous-type de cellules sanguines, sera également évaluée dans une culture cellulaire grâce à des tests déjà validés dans la littérature. Ils serviront à statuer sur la fonctionnalité potentielle des cellules avant leur injection chez les souris. Les expériences chez l’animal interviendront au terme d’un long développement et d’une caractérisation des produits cellulaires qui seront utilisés afin de ne traiter les animaux qu’avec les cellules dont les résultats sur les cellules seront suffisamment satisfaisants pour poursuivre chez l’animal. Ces expérimentations s’inscrivent dans le cadre d’une validation de la capacité de ces cellules, dans un organisme complet, à se développer. En effet, les expériences sur les cellules ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, la capacité à migrer et la persistance de nos cellules therapeutique.
Réduction
Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé en fonction de notre expérience du modèle en question, en prenant en compte la variabilité observée lors de précédents projets du laboratoire. De par la faible taille de nos groupes, nous nous attendons à ne pas pouvoir valider une distribution gaussienne de nos données et donc à privilégier des tests non paramétriques. Cependant, nous raisonnerons de manière méthodique en testant la possibilité d’une répartition en loi normale de nos jeux de données. Un premier test sera utilisé pour évaluer la répartition gaussienne de chaque groupe, suivi d'un test pour comparer les variances. Pour la comparaison entre deux groupes, si les données suivent une distribution gaussienne, nous aurons recours aux tests paramétriques. En cas de répartition non gaussienne, un test non paramétrique sera utilisé. Pour les comparaisons entre plus de 2 groupes, nous utiliserons soit un test d'analyse de la variance pour les données normales avec comparaisons multiples ou son équivalent non paramétrique en cas de répartition non gaussienne. Par ailleurs, afin de réduire au maximum la production de notre élevage de souris immunodéficientes, nous aurons recours à la synchronisation des trios en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.
Raffinement
Les animaux immunodéficients seront hébergés au sein d'un établissement dont le statut sanitaire apporte un niveau de stérilité permettant d’éviter toute souffrance dues à leur phénotype immunodéficient. Les souris seront hébergées à raison de 5 par cage sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson à leur volonté, la nourriture et l’eau sont stériles. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnels de polycarbonate rouge translucide (pour les activités journalières) destiné à diminuer le stress et stimuler leur activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Des gels riches en nutriments pourront être ajoutés dans la cage si le besoin s'en fait sentir (animal chétif ou faible). La souffrance des animaux sera surveillée régulièrement et la décision de leur mise à mort encadrée par une grille de score définissant des points limites spécifiques. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance hebdomadaire par les responsables du projet. Chaque procédure invasive sera précédée d’une anesthésie générale profonde accompagnée d’une analgésie. Lors des anesthésies gazeuses, les animaux seront placés sur un plateau thermostaté permettant de maintenir leur température corporelle. La mise à mort de l'animal sera faite sous anesthésie générale afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
La souris immunodéficiente que nous avons choisie constitue le modèle de référence pour tester l’efficacité de nouvelles approches de thérapie cellulaire et génique des déficits immunitaires. En effet, ces souris immunodéficientes sont capables de soutenir le développement des différentes cellules sanguines humaines à partir de cellules souches. Nous utiliserons soit des souris femelles ou mâles de 4 à 8 semaines soit des souris nouveau-nés (moins de 4 jours). Les souris de 4 à 8 semaines supportent bien le traitement permettant de les “vider” de leur globules blanc les 2 jours précédant la greffe. Ce traitement à la dose choisie est sans toxicité majeure et permet d’une part de mimer la situation clinique de greffe, et d’autre part de « vider » la moelle des animaux afin de faire de la place pour les cellules humaines et faciliter leur différenciation dans toutes les lignées sanguines. La prise de greffe des cellules humaines est bonne chez les animaux âgés de 4 à 8 semaines. Les souris nouveau-nées (
Rôle des macrophages dans l’insuffisance hépatite aiguë chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
3 520 souris vont être utilisées, toutes tuées six heures après une injection qui déclenche une insuffisance hépatique aiguë, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune passe par une biopsie de la queue avant quatorze jours de vie, éveillée, pour le génotypage, puis selon les groupes par une injection intraveineuse sous anesthésie, un régime alimentaire particulier et deux prises de sang à une heure d'intervalle. La destruction massive des cellules du foie doit provoquer une réaction inflammatoire, avec poils hérissés, animal recroquevillé, respiration accélérée et mobilité réduite. Le porteur écrit qu'aucune manifestation de souffrance n'a été rapportée dans ce modèle, dans un projet qu'il classe pourtant entièrement en gravité sévère.
Objectifs
L’insuffisance hépatique aiguë est une pathologie survenant lorsque la mort des hépatocytes excède les capacités de régénération du foie. Elle demeure une affection de mauvais pronostic et une cause importante de greffe hépatique. L’un des principaux facteurs de risque de survenue de l’insuffisance hépatique aiguë est la présence sous-jacente d’une pathologie hépatique chronique. Dans ce contexte, le foie étant fragilisé, la survenue d’un événement inflammatoire peut conduire à une insuffisance hépatique aiguë. Ce projet a pour but d’étudier le rôle des macrophages résidents du foie, les cellules de Kupffer, dans la physiopathologie de l’insuffisance hépatique aiguë, notamment lorsqu’elle survient dans un contexte de pathologie hépatique chronique. Ce projet permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques plus efficaces et ciblées, limitant ainsi le recours à la transplantation hépatique.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’améliorer la connaissance de la physiopathologie de l’insuffisance hépatique aiguë, notamment lorsqu’elle survient dans un contexte de pathologie hépatique chronique. Chez l’Homme, le traitement demeure aujourd’hui encore limité et repose sur l’identification et l’éviction de l’agent causal ainsi que, le cas échéant, le recours à la transplantation hépatique. En déterminant le rôle des cellules de Kupffer (KCs) dans ce processus, nos résultats contribueront à identifier les mécanismes impliqués permettant ainsi le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à une biopsie pour génotypage. Elle sera effectuée sur des animaux vigiles 7 à 14 jours après leur naissance et ne durera pas plus de quelques secondes. Certains de ces animaux seront soumis à une injection intraveineuse, réalisée sous anesthésie générale en 3 minutes. Un délai de récupération d'une semaine sera observé avant les interventions suivantes. Certains animaux seront ensuite nourris ad libitum par un régime spécifique avant d'être soumis à un premier prélèvement sanguin, effectué en vigile et d'une durée moyenne 4 minutes. Ces animaux seront ensuite injectés en vigile par voie intrapéritonéale. Ce geste sera réalisé en quelques secondes puis suivi d'un second prélèvement sanguin une heure après. Ce prélèvement sera également effectué en vigile et d'une durée similaire au premier. D'autres animaux seront directement soumis à deux injections intrapéritonéales successives, sans mise sous régime préalable, réalisées en vigile en quelques secondes et suivies d'un unique prélèvement sanguin une heure après. Ce prélèvement sera effectué dans les mêmes conditions que précédemment décrit. Tous les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire six heures après l’injection intrapéritonéale.
Impact sur les animaux
Avant le début des procédures, une biopsie (moins de 1mm) sera effectuée chez les souriceaux vigiles de moins de 14 jours, permettant l’identification génétique des animaux et qui pourra être génératrice de stress, d’inconfort et d’une douleur de courte durée. Au cours des différentes procédures, certains animaux subiront une anesthésie qui pourra engendrer un stress thermique et, dans des cas rares, une détresse respiratoire. Une fois anesthésiés, ces animaux subiront une injection intra-veineuse pouvant induire une douleur brève à leur réveil. Tous les animaux seront soumis aux mêmes nuisances et effets indésirables décrits ensuite. Ils subiront une contention pouvant occasionner du stress et une injection pouvant induire une brève douleur. Les animaux subiront également un prélèvement de sang au cours de la procédure, occasionnant de la douleur et du stress. L'insuffisance hépatique aiguë induite par la mort massive des hépatocytes se traduit par une réaction inflammatoire aiguë et pourra générer une douleur. Des modifications de l'apparence des animaux (pilo-érection et recroquevillement), des modifications de leurs signes cliniques (augmentation de la fréquence respiratoire) ainsi que de leur comportement (animal peu mobile) sont attendues. Les animaux nourris ad libitum avec différents régimes pourront subir une prise ou une perte de poids pouvant modifier leur mobilité et leur comportement.
Devenir
En vue des différents prélèvements nécessaires et de l'analyse des différents types cellulaires hépatiques, l'euthanasie de l'ensemble des animaux à l'issue des procédures est indispensable.
Remplacement
Notre projet, portant sur l'étude des phénomènes inflammatoires et des communications intercellulaires survenant dans le foie au cours de l'insuffisance hépatique aiguë, justifie l'utilisation impérative d'un modèle intégré comme la souris. Le foie, par la complexité de sa structure et par la diversité de ses types cellulaires, ne pas être reproduit fidèlement en utilisant des cultures de cellules isolées. De plus, l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés déjà existants facilite l'étude de divers gènes candidats.
Réduction
Au total 3520 animaux seront utilisés pour ce projet et répartis en différents groupes expérimentaux (mâles et femelles) de 10 souris a minima. Afin d'obtenir des résultats interprétables et significatifs, les effectifs des groupes ont été établis grâce à un calcul de puissant. Nous comparerons et interpréterons les résultats des différents groupes et conditions expérimentales avec fiabilité grâce à l'utilisation de tests statistiques. Dans la mesure du possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude. D’autre part, en fonction des données obtenues au cours du projet, nous évaluerons la pertinence et la nécessité de réaliser ou non certaines expériences, permettant ainsi de limiter le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés à l’animalerie pendant 2 semaines et habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. Ceux issus des mêmes portées et de même sexe seront regroupés par cage de 5 maximum. Les souris disposeront de lanières de kraft, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Si des mâles se battent ou se blessent, ils seront immédiatement pris en charge avec l’avis de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) et/ou du vétérinaire de l’établissement utilisateur qui validera leur isolement. Chaque animal isolé disposera d'un double enrichissement (lanières de kraft et maisonnette en carton). Certains animaux seront soumis à une injection intra-veineuse. Or, pour limiter le stress et la douleur, ils seront préalablement anesthésiés. Afin de limiter le risque de lésion et de douleur, l’expérimentateur s’assurera de la qualité de l’anesthésie avant l’injection. Les animaux seront placés jusqu’à leur réveil sur une table chauffante pour limiter le risque d’hypothermie. Leur bien-être sera évalué dès leur réveil puis une heure, 24 heures et une semaine après l'injection. Aucune manifestation de souffrance n’a été rapportée dans ce modèle, cependant un gel ophtalmique sera systématiquement appliqué au site d’injection pour améliorer la récupération. Pour les animaux mis sous régime, une pesée hebdomadaire sera effectuée et permettra de s’assurer du bien-être des animaux. Une détérioration de l’état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entraînera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Les injections seront réalisées par un expérimentateur formé, maîtrisant le geste et avec un matériel adapté afin de réduire le stress et la douleur des animaux. Après chaque prélèvement sanguin, une compression de la veine caudale sera réalisée afin de limiter la perte de sang. Leur état général sera évalué toutes les heures afin d’éviter toute souffrance prolongée. Si les points limites sont atteints, les animaux en souffrance seront immédiatement euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce de mammifère chez laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être facilement réalisées. De plus, de nombreuses lignées ont été déjà développés et sont donc disponibles pour les chercheurs. La physiologie murine est proche de celle de l’Homme, justifiant ainsi l’utilisation de cette espèce à des fins de recherche thérapeutique en médecine humaine. Pour notre étude, nous aurons recours à des lignées génétiquement modifiées utilisant un système d'expression constitutive. Ce système permet notamment l'exploration fonctionnelle approfondie et est très largement utilisé. L'utilisation de lignées transgéniques pour ce projet est nécessaire car elles permettent d'étudier spécifiquement l'implication de divers gènes codant pour des protéines impliquées dans l'insuffisance hépatique aiguë. Notre projet se basant sur l'étude d'un foie et d'un système immunitaire mature, il nécessite d'avoir recours à des souris adultes. De plus, des différences de réponses métaboliques et inflammatoires en fonction du sexe ont été démontrées. C'est pourquoi nous utiliserons des animaux mâles et femelles adultes, âgés de 8 à 15 semaines.