Système immunitaire

Dépilées sur le dos sous anesthésie puis exposées vingt minutes aux ultraviolets, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer une inflammation de la peau du dos, une perte de poids et des modifications de comportement. L'objectif est de caractériser des candidats analgésiques non-opioïdes en suivant l'action des cellules immunitaires de la peau et des neurones sensoriels. Les 30 souris ajoutées aux 270 calculées le sont pour parer à une éventuelle mauvaise qualité des ARN extraits, et les tests de sensibilité mécanique pratiqués sur animaux vigiles ne sont pas nommés.

Objectifs

Les solutions actuelles pour soulager la douleur des patients ont une efficacité limitée (effet de tolérance) et des effets secondaires graves. Actuellement les traitements disponibles pour les douleurs modérées et sévères/persistantes comme les opioïdes présentent de nombreux inconvénients. Ainsi, le développement de nouveaux médicaments pouvant traiter les douleurs aiguës est donc très important et s'avère d'une utilité publique majeure. C’est dans ce contexte que nous développons plusieurs nouveaux composés pharmaceutiques qui combleraient une lacune sur le marché de la douleur. Le rôle de ces composés ont déjà été démontré dans la gestion de la douleur, ainsi que dans la réparation des tissus. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les mécanismes moléculaires mis en jeu par ces composés pour moduler l’action des cellules immunitaires dans la régulation des voies de la douleur. La peau représente la première barrière physique contre les menaces extérieures et son intégrité est orchestrée par des cellules immunitaires résidentes spécialisées réparties dans les différentes couches qui la composent. La peau contient également un réseau dense de neurones sensoriels impliqués dans la perception du touché léger et de la douleur. De récentes études montrent également que le système nerveux sensoriel peut influencer l’activité des cellules immunitaires et ainsi optimiser les défenses contre une agression extérieure. Ainsi, pour répondre a ces questions nous avons choisis le modèle de lésions cutanés induite par une exposition aux ultraviolets (UV). Nous étudierons l’activité des cellules immunitaires de la peau et des neurones du système sensoriel (DRG) dans ces souris après exposition aux UV, traités ou non avec les différents composés pour déterminer l’impact du traitement sur la réponse immunitaire et la sensibilité mécanique.

Bénéfices attendus

La douleur est un problème majeur de santé public. Mieux comprendre comment TAFA4 module le système immunitaire dans les processus de mise en place de la douleur est primordial pour améliorer à terme le confort des patients atteints de douleurs chroniques et approfondir la compréhension de son mécanisme d’action. A terme, cette étude permettra de développer de nouveaux médicaments pour le traitement de la douleur inflammatoire sans effet secondaire. Des études précliniques réglementaires de toxicologie et de sécurité ont déjà été réalisées avec un composé utilisant le même mode d’action sans mettre en évidence d’effets secondaires, ni de phénomène d’accoutumance : problèmes majeurs des analgésiques actuellement sur le marché (opioïdes, paracétamol, etc...).

Procédures

Toutes les souris subiront une anesthésie générale afin de subir une dépilation sur la peau du dos puis une exposition aux UV pendant 20 minutes de la zone dépilée, toujours sous anesthésie. Nous réaliserons également des études de comportement pour tester la sensibilité mécanique induite par l’exposition aux UV sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à subir une irradiation aux UV qui pourraient induire une perte de poids, des modifications de comportement en plus d'une inflammation de la peau du dos. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser la nuisance provoquée. De plus une observation approfondie est effectuée quotidiennement à l’aide de la grille d’observation (Annexe) après la mise en place du modèle inflammatoire afin de prévenir toute complication.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des différents tissus est indispensable pour étudier le recrutement cellulaire de la réponse inflammatoire au niveau des tissus étudiés.

Remplacement

TAFA4 a déjà été testé pour son activité analgésique dans différents modèles de douleurs. Le recours à l’utilisation d’animaux est nécessaire pour appréhender l’effet analgésique sur ce modèle post-ultraviolets dans son contexte physiologique mettant en jeu le système immunitaire et le système nerveux sensoriel. De plus la douleur ne peut être dissociée du système biologique global de l’animal, ainsi l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Pour répondre convenablement aux réponses scientifiques soulevées, nous estimons le nombre minimal de souris nécessaires à 270 animaux, auquel nous ajoutons une marge de 30 animaux au cas où il serait nécessaire d’ajouter des animaux pour compléter l’étude (par exemple, si certains ARNs purifiés à partir des tissus prélevés n’étaient pas d’assez bonne qualité pour pouvoir réaliser l’analyse transcriptionnelle). Un total de 300 animaux est prévu pour cette étude. Ce chiffre a été déterminé après l’utilisation d’outils statistiques (logiciel GraphPad) permettant d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires avec une différence significative (p

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements complexes pour leur permettre de se comporter normalement. Les animaux sont élevés en présence d’objets permettant le raffinement de l’environnement dans des cages standards à toit ouvert (couvercle à filtre) avec de la sciure de bois utilisée comme litière et un accès ad libitum à un bidon d’eau et à un régime alimentaire standard. Nous utilisons alternativement des carrés de ouates pour que les animaux puissent faire un nid, des dômes en cellulose ou des tunnels en carton, qui sont changés chaque semaine. Les élevages sont effectués au sein d’un établissement agréé où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages et ainsi tous les jours l’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé. De plus, le week-end, la personne en charge du projet sera d’astreinte pour le suivi des animaux. D’autre part, le recours aux analgésiques est prévu dans le cas où l’état sanitaire des animaux le demandera (annexe grille de suivi). Nous avons recours à l’anesthésie/analgésie lors de l’exposition aux UV et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Une planification fine des procédures expérimentale sera effectuée (disponibilité des locaux d’expérimentation, du matériel, période d’acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation et dans l’animalerie) permettant de diminuer le stress des animaux et favoriser la validité des expériences. Notamment lors du test de la sensibilité mécanique, les animaux seront acclimatés à l’enceinte 30 minutes avant d’effectuer les mesures afin de diminuer leur niveau de stress. Enfin l’établissement des points limites selon la grille en annexe avec un suivi quotidien consistera en une vérification du poids, de la vivacité et de l’état du pelage des animaux avant de continuer l’expérience ou non en fonction des signes vitaux des animaux. Une souris ayant perdu 20% de son poids initial sera systématiquement euthanasiée. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.

Choix des espèces

Le niveau de similarité entre la souris et l’homme justifie son utilisation. L’état des connaissances actuelles, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaires et nerveux. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la souris et l’Homme. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires et une maturité développementale du système nerveux. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie pendant au moins une semaine

Capturés au piège dans leur milieu, 150 mulots sylvestres et mulots à collier sauvages sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés. Chacun subit sous anesthésie gazeuse une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire, geste que le porteur chiffre à trois minutes entre la sortie du piège et la fin du prélèvement. Le projet poursuit deux objectifs déclarés, former des étudiants de master aux métiers de la conservation et suivre les pathogènes des rongeurs sauvages. Le porteur admet un taux de mortalité de l'ordre de 3 % lié au piégeage, par arrêt cardiaque, rupture des cervicales ou refroidissement, et justifie le choix de ces deux espèces par leur abondance et leur "facilité de capture".

Objectifs

Le présent projet s’inscrit dans des objectifs de formation pédagogique et scientifique des étudiants de niveau Master ayant pour projet professionnel de travailler dans les métiers de l’environnement appliqués à la conservation d’animaux sauvages. Les objectifs sont i) de fournir un niveau de connaissance adapté à l’utilisation d’animaux de la faune sauvage à travers une approche éthique (présentation des comités d’étiques en expérimentation animale, règle des 3R,…) ; ii) initier les étudiants à la capture de Micromammifères (essentiellement le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus), le Mulot à collier (Apodemus flavicollis) et le Campagnol roussâtre (Myodes glareolus), potentiellement d’autres espèces sauvages moins abondantes ; le présent projet portera cependant uniquement sur les 2 espèces de Mulots, les autres espèces seront relâchées immédiatement, cf ci-dessous) ; iii) présenter les risques liés à la contention et les bonnes pratiques de terrain ; et iv) intégrer le bien-être animal en condition de captivité. Les échantillons récoltés avec les étudiants permettront ensuite de réaliser un suivi à long terme de l’état de santé des populations de rongeurs à l’échelle régionale et de maintenir une surveillance des pathogènes présents chez les rongeurs.

Bénéfices attendus

L’apport de connaissances nouvelles à des étudiants pouvant être amenés à manipuler des animaux sauvages dans leur cursus professionnel, et l’obtention de données nouvelles, remplissent un objectif à la fois pédagogique et scientifique à travers une approche non-létale. La formation à l’éthique et au bien-être animal répond ainsi aux enjeux sociétaux et de perfectionnement personnel d’une pratique encadrée par un context légal et qui s’inscrit directement dans les plans de carrière de certains étudiants. De plus, la formation à une démarche non létale sur des mesures hématologiques, immunologiques et hormonales est innovante et offrira un panel de compétences attractives auprès de leurs futurs employeurs. Sur le plan scientifique, le suivi de l’état de santé de rongeurs sauvages sur les sites d’études permettrait une meilleure compréhension des enjeux sociétaux actuels, mais aussi de définir des risques épidémioloques pour la présence de zoonoses dans l’environnement.

Procédures

Les animaux subiront une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie. Cette procédure sera réalisée par un personnel formé et expérimenté. Le temps estimé d’une prise de sang (avec identification spécifique, sexage et mesures morphométriques) est de l’ordre de 3 minutes de la sortie du piège à la fin du prélèvement.

Impact sur les animaux

Au cours de la manipulation, les animaux peuvent ressentir un stress lié à la capture, la contention, et la manipulation. Les parties potentiellement douloureuses ou particulièrement stressantes (prise de sang notamment) se font cependant sous anesthéise gazeuse. L’anesthésie gazeuse évite une injection (intrapéritonéale), l’induction de l’anesthésie est rapide (de l’ordre de 30 secondes) et l’anesthésie elle-même est brève (de l’ordre de 3 min, permettant l’identification spécifique, le sexage, les mesures morphométriques et la prise de sang), évitant une hypothermie. A l’issue de la prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, un lubrifiant oculaire et un anesthéisant local seront appliqués sur l’œil des individus. Par la suite, les animaux seront placés dans des boîtes dortoirs pour être remis en liberté après un temps de repos (minimum 1 heure) et la vérification préalable de leur bon état de santé (œil en bon état, comportement normal, cf § relatif aux points-limites ci-dessous). Cette méthode de prise de sang n’est pas substituable à un prélèvement dans la queue qui donne un volume trop faible ou dans le sillon mandibulaire . De précédents tests de prise de sang dans le sinus mandibulaire ont été effectués par des personnes qualifiées à ce type de prélèvement sur souris de laboratoire mais n’ont pas permis de réaliser des prises de sang. L’absence de ce sinus chez les Mulots est suspectée.

Devenir

Les animaux seront relâchés à l’issue de chaque procèdure en considérant qu’aucun traitement pouvant moduler leur réponse immunitaire ou affecter leur comportement ou fonction écologique ne pourrait affecter le devenir de ces animaux en condition naturelle. Cette remise à l’état sauvage prend en compte l’expérience des responsables du projet et le travail de la SBEA ayant statué à l’unhanimité sur la possibilité de réaliser un prélèvement sanguin comme indiqué dans chaque procédure suivi du relâcher des animaux.

Remplacement

Le double objectif du projet est (i) de former des étudiants aux méthodes éthiques et réglementaires d’utilisation d’animaux de la faune sauvage à des fins scientifiques et (ii) d’acquérir des données de long terme sur l’état de santé et les pathogènes de micromammifères sauvages. L’utilisation d’animaux est requise car, à notre connaissance, aucune approche de modélisation ne permettrait d’obtenir de telles données. Des études comparatives sur le système immunitaire de rongeurs ayant montré que la réponse immunitaire d’individus sauvages et d’animaux de laboratoire différait significativement (Abolins et al., 2017; Viney and Riley, 2017),l’utilisation d’animaux sauvages est également requise. L’étude pathogènes potentiellement zoonotiques ne peut par ailleurs se faire que sur animaux capturés dans l’environnement et non sur animaux-modèles de laboratoire.

Réduction

La variabilité inter-individuelle des réponses immunitaires est très forte en conditions naturelles et la reproduction de ces mêmes conditions n’est pas possible en laboratoire. De nombreuses études scientifiques commencent à intégrer les conditions environnementales comme effets modulateurs de la réponse immunitaire face aux infections (Flies and wild comparative immunology consortium, 2020). Parmi les agents infectieux susceptibles d’étre identifié, Borrelia burgdorferi, l’agent responsable de la maladie de Lyme présente des prévalences parfois très faibles au sein de populations de Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et de Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Sur la base de ces informations, les effectifs prévus pour les procédures 1 and 2 ne peuvent être inférieurs à 30 rongeurs (Procédure 1) et 30 rongeurs (Procédure 2) par site d’étude et par an pour garantir une puissance statistique suffisante et la valorisation scientifique des résultats.

Raffinement

En ce qui concerne les captures, les pièges sont relevés au moins une fois par jour. Cependant, la littérature ainsi que l’expérience des personnels impliqués dans ce programme laissent envisager un taux de mortalité de l’ordre de 3%. Les causes de décès peuvent être un stress conduisant à un arrêt cardiaque, une rupture des cervicales ou un refroidissement en période froide (peu probable au printemps) et/ou pluvieuse dans les pièges). En dehors de l’arrêt des captures en cas de conditions météorologiques défavorables, ces mortalités indésirables sont difficilement totalement évitables. Les conditions de captivité des animaux seront conformes aux conditions des Rongeurs de laboratoires (Cages normalisées, nourriture et eau fournis ad libitum), sauf en ce qui concerne la captivité individuelle, mais avec un enrichissement aussi élaboré que possible (Dortoir et coton permettant la confection d’un nid, structures de carton, roue et balle pour le jeu). Les animaux seront hébergés sous tente avec un contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie) et les anesthésies, mesures et prélèvements seront effectués dans le véhicule agréé pour expérimentation animale, donc en des lieux séparés. Les mesures et prélèvements seront effectués sous anesthésie par du personnel qualifié.

Choix des espèces

Les espèces choisies sont le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et le Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Le Mulot sylvestre et le Mulot à collier sont des Micromammifères abondants, ubiquistes, opportunistes avec un régime alimentaire varié. Leur positionnement trophique intermédiaire les place comme une source de nourriture de premier choix pour un grand nombre de prédateurs (Rapaces et Mammifères) incluant des espèces patrimoniales (Milan royal par exemple). Leur utilisation dans des travaux scientifiques en écologie, écotoxicologie, ou écoépidemiologie est fréquente, permettant une relation des résultats obtenus ici avec la littérature internationale, tant par les étudiants concernés que par l’équipe de recherche (Chrono-environnement). Leur facilité de capture et leur capacité à être maintenus en captivité en font un modèle biologique idéal par rapport aux objectifs scientifiques de cette étude. Seuls les Rongeurs d’âge adulte et les femelles non gestantes seront utilisés pour cette étude.

Un lapin par groupe sera tué pour analyse des tissus, soit 8 sur 32, le porteur écrivant qu'il tentera de replacer les 24 autres dans la mesure du possible. Les 32 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit jusqu'à quatre anesthésies générales de deux heures et huit prélèvements sanguins de 3 à 5 ml, effectués sur animal vigile dans une cage de contention, pour tester si des comprimés d'ARN messager placés sous la langue déclenchent une réponse en anticorps. Le porteur affirme avoir mené les tests possibles sur cellules avant d'en venir aux lapins, mais conclut qu'un essai sur "organisme entier" reste "nécessaire" puisque des cellules ne produisent pas de réponse immunitaire.

Objectifs

La vaccination génétique par ARN messager administré par voie intramusculaire a récemment fait preuve de son efficacité clinique dans le contexte de l'épidémie de COVID-19. Néanmoins, les formulations actuellement utilisées nécessitent une conservation au froid, à -20°C au mieux, voire -80°C. Nous avons développé une formulation sous forme de comprimés muco-adhésifs stables à température ambiante, ou à 4°C, et destinée à une administration mucosale par voie buccale (sous la langue ou contre les joues). Le projet d'expérimentation animale décrit ici concerne une étude de l'efficacité éventuelle de ces comprimés d'ARN messagers pour induire une réponse immunitaire chez le lapin, par administration buccale. Cela permettra de déterminer si ces comprimés peuvent poursuivre un développement vaccinal pré-clinique, puis clinique plus poussé.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre de la mise au point d'une nouvelle formulation vaccinale par ARNm. Il permettra de déterminer si les formulations étudiées (dont l'activité est démontrée) peuvent être administrés par voie buccale sans toxicité particulière, et permettre l'induction d'une réponse immunitaire de type anticorps. En cas de réponse positive, cela permettrait ultérieurement de poursuivre le développement de ces formulations dans un but vaccinal. Ces formulations seraient particulièrement avantageuses du fait de leur stabilité à température ambiante, permettant un stockage plus facile, et donc un accès à des vaccins pour une population plus large.

Procédures

Les animaux seront soumis à quatre anesthésies générales au maximum de 2h environ, et à 8 prélèvements sanguins de 3 à 5ml sur animaux vigiles placés dans une cage de contention. La durée d'un prélèvement est de l'ordre de deux minutes

Impact sur les animaux

Il s'agit ici d'une administration muscosale par voie buccale (placement sous la langue et contre les joues) de comprimés muco-adhésifs. Les comprimés seront réalisés avec des excipients déjà utilisés en clinique humaine, et n'ayant pas de toxicité particulière connue. Néanmoins, les animaux seront soumis à 4 anesthésies générales au maximum, et au stress induit par cette procédure, ainsi qu'à celui dû aux différentes prises de sang (et à l'utilisation de la cage de contention pendant quelques minutes).

Devenir

Pour analyse de tissus, un animal par groupe sera mis à mort. Nous tenterons de replacer les 24 autres dans la mesure du possible

Remplacement

Avant de recourir à l'expérimentation animale, les tests alternatifs réalisables ont été faits : évaluation de la fonctionnalité des ARN messager comprimés et efficacité d'expression de l'antigène par des tests sur culture cellulaire, tests de toxicité sur culture cellulaire également. Néanmoins, un test sur organisme entier est nécessaire, les tests sur cellules ne pouvant induire une réponse immunitaire.

Réduction

Nous avons décidé de n'étudier qu'une partie des formulations sous forme de comprimés réalisées. Il s'agit ici d'examiner si les formulations étudiées peuvent, ou non, engendrer une réponse immunitaire importante. Nous avons prévu des groupes de 4 animaux par formulation, la variation interindividuelle dans le domaine de la vaccination pouvant être importante. La réponse que nous attendons est de type "tout ou rien", et chaque animal est son propre contrôle. En conséquence, aucune analyse statistique n'est nécessaire dans ce projet. Si les résultats (réponse immunitaire chez un ou plusieurs animaux) permettent d'envisager un développement plus poussé des produits, cela sera l'objet d'un projet ultérieur. Par ailleurs, pour chaque formulation, nous commencerons par immuniser 2 animaux. Si la réponse en anticorps est analysable, nous n'incluerons pas les 2 autres animaux prévus dans le groupe.

Raffinement

Le protocole expérimental n'induit pas de souffrance particulière autre que celle due à des anesthésies générales. Le projet nécessite des prises de sang régulières. La première prise de sang sera effectuée une semaine avant le début des immunisations pour permettre une récupération totale. Les prises de sang seront limitées à quelques millilitres, 5ml au maximum. Par ailleurs, les animaux seront surveillés jusqu'au réveil de leur anesthésie. Ils seront ensuite suivis quodiennement lors d'une veille sanitaire, et suivis par le porteur de projet deux fois par semaine en regard de points limites pré-établis.

Choix des espèces

Le lapin est adapté pour ce type d'expérience car les rongeurs habituellement utilisés (rats, souris) ont une cavité buccale dont les propriétés de perméabilité sont non représentatives de celle de l'humain. Le lapin a, lui, une cavité buccale dont la structure mucosale est très semblable à l'humain, et donc beaucoup plus représentative. Les animaux utilisés devront avoir un système immunitaire fonctionnel : Ce seront des lapins de 2 à 3 mois, âge à partir duquel ils sont habituellement vaccinés (en tant qu'animaux domestiques), et avec lesquels nous avons toujours obtenu de bons résultats.

Fabriquer un réactif de diagnostic sérologique : 3 900 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour récolter les parasites de leur cavité abdominale. Elles reçoivent une inoculation intrapéritonéale de toxoplasmes et une inoculation de cellules tumorales qui déclenche une ascite. L'infection se manifeste par des poils hérissés et un dos courbé, signes que le porteur décrit comme la preuve que l'inoculation a fonctionné. La culture cellulaire est écartée au motif du rendement : il faut environ 80 milliards de parasites par production, quantité que le porteur affirme ne pas pouvoir obtenir in vitro.

Objectifs

En France, la surveillance sérologique mensuelle (recherche d’anticorps dans le sang) de la toxoplasmose durant toute la durée de la grossesse chez les femmes enceintes séronégatives pour la toxoplasmose, est nécessaire en vue du dépistage de séroconversion en cours de grossesse pour la mise en place précoce d’un traitement adapté et limiter les complications pour le foetus. Le diagnostic sérologique est également utile pour les immunodéprimés, les patients susceptibles d'être greffés, les donneurs d'organes. L’utilisation d’antigènes est nécessaire pour la recherche d’anticorps. En l'absence d'antigène de toxoplasme seul commercialisé, la fabrication de l'antigènes de toxoplasma est donc une activité nécessaire pour les contrôles sérologiques faits en dehors de tests commerciaux.

Bénéfices attendus

Le projet est d’avoir des tests fiables permettant le diagnostic de la toxoplasmose, pathologie potentiellement grave puisque, elle peut entraîner des malformations congénitales mais aussi le décès de patients immunodéprimés chez l'Homme.

Procédures

Inoculation intrapéritonéale de parasites et de cellules effectuées pour créer une infection parasitaire qui se traduit par l'apparition de signes cliniques, preuve de l’infection.: 1 inoculation/souris, 1 minute. Inoculation intrapéritonéale de cellules TG180 induisant une ascite: 1 injection, 1 minute. Anesthésie flash à l'isoflurane: 1 seule, 1 min

Impact sur les animaux

L’inoculation intrapéritonéale de parasites chez la souris provoque une infection parasitaire. Les souris présentent des symptômes cliniques d'infection (poils hérissées, dos coubés), rentrant dans la grille de score et nous permettant de déterminer les points limites.

Devenir

Pour chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour le recueil des parasites de la cavité abdominale.

Remplacement

L’alternative à l’utilisation d’animaux serait de produire l’antigène par culture cellulaire. Cependant plusieurs problèmes se posent et nous empêchent de basculer sur une technique de culture : - la reproductibilité de la méthode qui n'est pas fiable. En effet, nous savons par expérience que la multiplication des parasites in vitro est incertaine, avec un nombre de parasites variables d’une boîte de culture à l'autre ne permettant pas d'assurer un antigène reproductible entre les différents lots contrairement à la multiplication in vivo. - la qualité de l'antigène est différente entre une production d'antigène in vivo et une production in vitro. Les deux préparations de parasites sont différentes jouant sur la sensibilité de chaque méthode. - la quantité de parasites. Il faut pour la fabrication de cet antigène, la production d'un nombre très élevé de toxoplasmes. Cette énorme quantité de parasites (environ 80 milliards de parasites) ne peut pas être obtenue en culture cellulaire. La production en cultures cellulaires nécessiterait une grande quantité de boîte de culture pour obtenir la même quantité de parasites. A notre connaissance, aucune autre alternative n’a été développée pour obtenir une si grande quantité de parasites. Il y a quelques années, nous avons travaillé (pour la multiplication parasitaire) avec des cellules en suspension qui ne permettaient pas d’avoir un nombre suffisant de parasites. Nous avons donc changé de type cellulaire pour travailler avec des cellules adhérentes. Nous avons ainsi amélioré notre rendement de parasites en le multipliant par 5. Cependant, ce type cellulaire bien que facilitant l’invasion et la multiplication cellulaire n’est pas suffisant pour obtenir la grande quantité de parasites exigée pour la production d’antigène. Les approches in silico ne peuvent pas être envisagées car le diagnostic de la toxoplasmose se fait biologiquement avec les sérums des patients mis au contact de l’antigène.

Réduction

La standardisation de cette technique (concentration de parasites, cellules, réactifs, …) réalisée par notre laboratoire depuis plus de 30 ans permet de prévoir un nombre minimum de souris nécessaire à la fabrication d'antigène. Pour la fabrication de cet antigène, un nombre d'animaux a été estimé : en dessous de ce nombre de souris, le rendement pour l’obtention du nombre de parasites est trop faible pour assurer la fabrication d’un volume d’antigène suffisant. De plus, le protocole de fabrication a été optimisé pour minimiser le nombre de souris au maximum. Ainsi, historiquement la souche de parasite et la lignée cellulaire (nécessaire pour la multiplication des parasites) étaient entretenues sur souris (passages successifs) toute l’année de façon continue consommant un nombre important de souris. Actuellement, les parasites et la lignée cellulaire sont stockés congelés et décongelés en prévision de la production de l’antigène. C’est donc une approche expérimentale validée au cours du temps qui nous a permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaire avec une variabilité du volume obtenu. Nous ne pouvons prévoir la quantité d’antigène que par les volumes antérieurs utilisés annuellement.

Raffinement

Une surveillance accrue des souris (2 fois/ jour) est effectuée dans les 72 heures après leur inoculation par des personnels formés et expérimentés afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. Après l’inoculation parasitaire, une attention particulière est portée sur 5 critères : l’apparence physique de l’animal (aspect du poil), son comportement (réponse aux stimuli externes, mobilité) et la présence de signes cliniques (respiration). L’utilisation d’un analgésique permettra de prévenir toute douleur éventuelle. Il sera administré aux souris (5mg/kg) per os (dans un biberon) après inoculation de la souche parasitaire. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne).

Choix des espèces

Le modèle souris décrit dans les publications sont des souris (femelles) âgées de 8 semaines (20g) qui présentent un système immunitaire fonctionnel.

980 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, certaines recevant une injection sous la peau chaque jour pendant un mois. Elles subissent une irradiation myéloablative suivie d'une greffe de moelle osseuse injectée dans le sinus rétro-orbitaire, une transplantation de macrophages dans les poumons par voie intratrachéale ou nasale, puis une infection virale ou une chimiothérapie, les prélèvements sanguins étant eux aussi pratiqués derrière l'œil. Le porteur décrit une douleur légère à modérée aux poumons, à l'œsophage ou à l'œil, ainsi qu'une fatigue, un inconfort respiratoire et une perte de poids pendant quinze jours. Les retombées annoncées, améliorer la réponse immunitaire des personnes âgées, restent au conditionnel, et l'effectif justifié dans le texte, 960 souris, ne correspond pas aux 980 déclarées.

Objectifs

L'objectif de notre recherche est d'étudier les mécanismes qui influencent la multiplication et le maintien des macrophages résidant dans les poumons. Ces cellules jouent un rôle essentiel dans la défense immunitaire, en éliminant les toxines et en contribuant à l'immunité et à la régénération pulmonaire. La capacité proliférative des macrophages alvéolaires diminue au cours du vieillissement. Le projet vise à étudier les effets d'une induction de la prolifération des macrophages pulmonaires de souris âgées sur la défense immunitaire et la régénération pulmonaire en réponse à des traitements chimiothérapeutiques ou des infections virales affectant les poumons.

Bénéfices attendus

D'un point de vue recherche fondamentale, le projet permettra une avancée dans la compréhension de la perte de fonction des macrophages alvéolaires lors du vieillissement et notamment lors de réactions inflammatoires dans les poumons induites par certains traitements chimiothérapeutiques ou infections virales. Ces résultats pourraient conduire à des stratégies thérapeutiques visant à améliorer la réponse des personnes âgées lors de ces réactions. Cela pourrait être réalisé en stimulant la prolifération des macrophages alvéolaires ou en effectuant des transplantations de ces cellules prolifératives.

Procédures

Les procédures utilisées sont : injection de molécules permettant l'expression de gènes (injection en sous cutanées quotidiennement pour une durée de 1 mois ou une unique ingestion par gavage), transplantation de macrophages dans les poumons par injection intratrachéale ou intranasale (unique), transplantation de moelle osseuse par unique injection en intraveineuse dans le sinus retro-orbital après traitements myéloablatifs (une unique dose d'irradiation et une unique injection en intrapéritonéale d’une molécule), traitement chimiothérapeutique ou infection virale par injection intratrachéale ou nasale (unique), prélèvement sanguin dans le sinus retro-orbital.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur capture lors des expérimentations. Les procédures sont classées modérées de par la répétition des gestes expérimentaux sur une durée maximale de 1 mois et la douleur que peut ressentir l’animal. Les souris peuvent présenter : -une sensibilité de la peau au niveau des zones d’injection pendant une durée de 1 mois. - une douleur de légère à modérée au niveau des poumons, de l’œsophage ou de l’œil pour une durée de 5 min minimisée par antalgique et anesthésique. - une fatigue, un inconfort respiratoire et perte de poids pendant 15 jours. Le phénotype des lignées génétiquement modifiées n’induit pas de douleur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue d'analyses.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons déterminer si l'induction de la prolifération des AM peut permettre d'améliorer la réponse immunitaire à un traitement chimiothérapeutique ou une infection pulmonaire virale. L’inflammation pulmonaire induite est une réponse immunitaire intégrant des systèmes de communications cellulaires complexes (endothélium, système lymphatique et vasculaire, système neuronal) que l’on ne peut actuellement pas reproduire in silico, ni in vitro, ni ex vivo. Il n’existe pas de méthodes in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) permettant d’étudier une réponse immunitaire globale comme possible sur animal entier. L’induction de la prolifération des macrophages alvéolaire n’est à ce jour possible que par l’utilisation de modification génétique. Des alternatives ex vivo à l’expérimentation à l’utilisation animale ont été réalisées afin de montrer que l’expression des macrophages alvéolaires augmentent leur prolifération avec notre modèle et une première série d’expérience a pu démontrer que ces macrophages sont plus fonctionnels. Cependant, afin d’analyser leurs capacités de régénération à une inflammation pulmonaire, il est nécessaire d’avoir une approche globale. Dans ce sens, le modèle murin est particulièrement bien adapté à ces différentes problématiques. Il n’y a donc pas d’alternative actuellement à l’utilisation des souris pour atteindre l’objectif de ce projet.

Réduction

le nombre minimum de souris nécessaires (n=960) a été évalué afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les expérimentations seront réalisées en veillant à réduire, supprimer ou soulager tout inconfort, douleur ou angoisse subis par les souris afin d'améliorer leur bien-être. Pour cela, les procédures seront effectuées sous anesthésie générale, dans des conditions stériles, et si nécessaire, un analgésique sera administré. L'état de santé des souris sera surveillé quotidiennement à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur, permettant de déterminer les niveaux de douleur afin de prendre les mesures nécessaires pour la limiter. Tout au long de l'étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur. Cela inclut un environnement contrôlé avec une température et une ventilation régulées, une lumière suivant un cycle de 12 heures, et une hygrométrie adaptée. Les souris auront un accès constant à la nourriture et à l'eau. Elles seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. Leur environnement sera enrichi avec des dômes en carton ou du coton.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. De nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiés permettant de poser les questions biologiques qui nous intéressent existent déjà. Nous utiliserons dans ce projet : - des souris adultes jeunes (entre 6 semaines et 3 mois) et âgées (entre 12 et 27 mois) car nous étudions le vieillissement - des souris nouveaux nés (moins de 1 semaine) car leur niche alvéolaire est vide permettant ainsi de faire des transplantations de macrophages alvéolaires.

Pour bloquer la transmission de la dengue, du Zika et de la fièvre jaune en immunisant contre une protéine du moustique, 295 souris C57BL/6J vont être utilisées dans ce second établissement, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est endormie pour recevoir cinq moustiques sur la peau, puis prélevée par ponction dans l'orbite de l'œil à trois, six et neuf jours après les piqûres. Le porteur indique que l'infection virale peut provoquer perte de poids, immobilité, mauvais état corporel et troubles neurologiques. Le vaccin universel contre tous les flavivirus qu'il annonce reste un objectif de long terme, quand l'infection des souris figure au protocole immédiat.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de tester une nouvelle stratégie de lutte contre tous les flavivirus, tel que la dengue, le Zika et la fièvre jaune. L’objectif est de déterminer l’effet d’une immunisation contre un nouveau facteur de transmission chez le moustique et de déterminer le mécanisme. Ces données fourniront la base nécessaire au développement d’une stratégie vaccinale contre tous les flavivirus. Il sera réalisé sur deux établissements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) Identifier une cible vaccinale contre tous les flavivirus, ii) Comprendre l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur la transmission. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin universel contre tous les flavivirus, lesquels infectent un demi-milliard de personnes et en tuent 250000 par an.

Procédures

D'abord, nous optimiserons l’immunisation contre le facteur de transmission. La procédure durera 42 jours. Nous injecterons les souris avec des antigènes et ferons des prélèvements sanguins à 14, 28 et 42 jours par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie volatile. Ensuite, nous testerons l’effet de l’optimisation sur la transmission d’un flavivirus par piqûre de moustique. La procédure durera 52 jours. Les souris seront injectées avec les antigènes, exposées aux moustiques sous anesthésie générale et nous effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqûre des prélèvements par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie. Puis, nous déterminerons si la protection contre la transmission est liée à l’immunité humorale (c.-à-d. les anticorps), en testant l’effet d’une immunisation passive par injection de sérum immune sur la transmission par piqûre. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, collecterons le sang par ponction cardiaque après euthanasie, injecterons le sérum immun dans d’autres souris, exposerons ce second lot de souris aux piqûres de moustiques et effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqure de moustiques des prélèvements sanguin par prélèvement retro-orbitaires sous anesthésie. Enfin, nous décrypterons comment l’immunisation contre le facteur de transmission affecte l’infection de la peau par piqûre du moustique. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, les exposerons aux piqûres de moustiques sous anesthésie et collecterons des biopsies cutanées à l'endroit de piqures de moustiques avec des punch et sous anesthésie. Les animaux seront sacrifiés juste après la réalisation des biopsies.

Impact sur les animaux

- Il est possible qu'une douleur légère soit occasionnée lors d'injection de l'anesthésique ou de l’antisérum. Toutes les autres interventions seront réalisées sous anesthésie. -Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, stress, comportement anormal, troubles neurologiques liés à l’infection par le virus.

Devenir

Les souris dans toutes les procédures seront mises à mort sous anesthésie. Toutes les souris dédiées à la production des sérums seront prélevées par ponction intracardiaque juste après leur mise à mort. Les souris seront mises à mort après la réalisation de biopsies cutanées sous anesthésie et avant leur réveil.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun modèle, à par le modèle animal, ne nous permettra de faire un test d’immunisation. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires, supportant notre hypothèse, sur des modèles in vitro. De plus, nous caractériserons la fonction des gènes régulés identifiés par le scRNAseq (expérience 4) sur des modèles in vitro en utilisant des cellules primaires.

Réduction

-Afin de réduire le nombre de souris, nous allons utiliser une seule dose (la plus élevée) dans les groupes contrôles pour déterminer les meilleures conditions d’immunisation (procédure 1) -Dans les procédures 2, 3 et 4, nous exposerons chaque souris à 5 moustiques pour réduire le nombre d’animaux nécessaire aux tests de survie et à la collecte des biopsies de peau.

Raffinement

-Les souris seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées avant les prélèvements sanguins ou leur exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffants et une lampe chauffante pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et desséchement de la cornée. En dehors des expériences, le suivi des souris s’effectuera chaque jour. - Les souris infectées seront mises à mort après la collecte des biopsies cutanées par dislocation cervicale sous anesthésie. - Nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée. - Les souris seront maintenues par 3 à 5 individus / cage avec de la litière et des enrichissements en alternance. Nous changerons la litière tous les 3 jours.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris C57BL/6J. Contrairement aux autres modèles d’infection pour les flavivirus, ces souris ne sont pas immunodéprimées. Les modèles de transmission des flavivirus utilisent généralement des souris transgéniques avec une immunité innée déficiente. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. De plus, nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter les C57BL/6J par piqûre de moustique. Par ailleurs, les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler. Les constantes physiologiques seront facilement mesurables avec des outils adaptés. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate, une piqûre par plusieurs moustiques simultanément et leur manipulation.

Injectées d'antigènes, prélevées par ponction dans l'orbite de l'œil sous anesthésie à quatorze, vingt-huit et quarante-deux jours, puis exposées à cinq moustiques chacune pendant qu'elles sont endormies : 295 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Neuf jours après les piqûres, de nouveaux prélèvements rétro-orbitaires suivent, puis des biopsies de peau, pour un objectif que le porteur situe à long terme, un vaccin universel contre tous les flavivirus. Une partie des souris fournit le sérum, collecté par ponction dans le cœur juste après leur mise à mort, sérum ensuite injecté à d'autres souris exposées aux mêmes moustiques. Toutes sont tuées, les dernières par dislocation cervicale sous anesthésie après le prélèvement de la peau, avant tout réveil.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de tester une nouvelle stratégie de lutte contre tous les flavivirus, tel que la dengue, le Zika et la fièvre jaune. L’objectif est de déterminer l’effet d’une immunisation contre un nouveau facteur de transmission chez le moustique et de déterminer le mécanisme. Ces données fourniront la base nécessaire au développement d’une stratégie vaccinale contre tous les flavivirus. Il sera réalisé sur deux établissements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) Identifier une cible vaccinale contre tous les flavivirus, ii) Comprendre l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur la transmission. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin universel contre tous les flavivirus, lesquels infectent un demi-milliard de personnes et en tuent 250000 par an.

Procédures

D'abord, nous optimiserons l’immunisation contre le facteur de transmission. La procédure durera 42 jours. Nous injecterons les souris avec des antigènes et ferons des prélèvements sanguins à 14, 28 et 42 jours par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie volatile. Ensuite, nous testerons l’effet de l’optimisation sur la transmission d’un flavivirus par piqûre de moustique. La procédure durera 52 jours. Les souris seront injectées avec les antigènes, exposées aux moustiques sous anesthésie générale et nous effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqûre des prélèvements par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie. Puis, nous déterminerons si la protection contre la transmission est liée à l’immunité humorale (c.-à-d. les anticorps), en testant l’effet d’une immunisation passive par injection de sérum immune sur la transmission par piqûre. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, collecterons le sang par ponction cardiaque après euthanasie, injecterons le sérum immun dans d’autres souris, exposerons ce second lot de souris aux piqûres de moustiques et effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqure de moustiques des prélèvements sanguin par prélèvement retro-orbitaires sous anesthésie. Enfin, nous décrypterons comment l’immunisation contre le facteur de transmission affecte l’infection de la peau par piqûre du moustique. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, les exposerons aux piqûres de moustiques sous anesthésie et collecterons des biopsies cutanées à l'endroit de piqures de moustiques avec des punch et sous anesthésie. Les animaux seront sacrifiés juste après la réalisation des biopsies.

Impact sur les animaux

- Il est possible qu'une douleur légère soit occasionnée lors d'injection de l'anesthésique ou de l’antisérum. Toutes les autres interventions seront réalisées sous anesthésie. -Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, stress, comportement anormal, troubles neurologiques liés à l’infection par le virus.

Devenir

Les souris dans toutes les procédures seront mises à mort sous anesthésie. Toutes les souris dédiées à la production des sérums seront prélevées par ponction intracardiaque juste après leur mise à mort. Les souris seront mises à mort après la réalisation de biopsies cutanées sous anesthésie et avant leur réveil.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun modèle, à par le modèle animal, ne nous permettra de faire un test d’immunisation. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires, supportant notre hypothèse, sur des modèles in vitro. De plus, nous caractériserons la fonction des gènes régulés identifiés par le scRNAseq (expérience 4) sur des modèles in vitro en utilisant des cellules primaires.

Réduction

-Afin de réduire le nombre de souris, nous allons utiliser une seule dose (la plus élevée) dans les groupes contrôles pour déterminer les meilleures conditions d’immunisation (procédure 1) -Dans les procédures 2, 3 et 4, nous exposerons chaque souris à 5 moustiques pour réduire le nombre d’animaux nécessaire aux tests de survie et à la collecte des biopsies de peau.

Raffinement

-Les souris seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées avant les prélèvements sanguins ou leur exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffants et une lampe chauffante pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et desséchement de la cornée. En dehors des expériences, le suivi des souris s’effectuera chaque jour. - Les souris infectées seront mises à mort après la collecte des biopsies cutanées par dislocation cervicale sous anesthésie. - Nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée. - Les souris seront maintenues par 3 à 5 individus / cage avec de la litière et des enrichissements en alternance. Nous changerons la litière tous les 3 jours.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris C57BL/6J. Contrairement aux autres modèles d’infection pour les flavivirus, ces souris ne sont pas immunodéprimées. Les modèles de transmission des flavivirus utilisent généralement des souris transgéniques avec une immunité innée déficiente. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. De plus, nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter les C57BL/6J par piqûre de moustique. Par ailleurs, les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler. Les constantes physiologiques seront facilement mesurables avec des outils adaptés. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate, une piqûre par plusieurs moustiques simultanément et leur manipulation.