Système immunitaire

Dépilés à la crème jusqu'à dix fois, immunisés jusqu'à douze fois, piqués jusqu'à sept fois pour des prises de sang, 1 500 rats et 750 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le but est de produire des anticorps monoclonaux et polyclonaux à partir d'un seul animal, à la demande de partenaires industriels qui commandent les cibles. Les animaux dont la réponse immunitaire reste faible sont tués sans attendre, les autres partent vivants chez le client, qui prélève ensuite le sang, la rate, les ganglions et la moelle osseuse. Aucun calcul statistique n'a fixé les effectifs, le porteur indiquant s'être entendu avec ses partenaires sur trois à dix animaux par cible.

Objectifs

L’objectif de ce projet est la création d’une grande diversité d’anticorps monoclonaux et polyclonaux à partir d’un seul animal. Pour cela, un antigène (sous forme d’ADN ou de peptide/protéine) est administré à des rongeurs, afin que le système immunitaire produise des anticorps multiples. Le sang (contenant les cellules lymphatiques) et les organes (ganglions lymphatiques, la rate et la moelle osseuse) de ces animaux seront collectés pour récupérer ces anticorps. Les antigènes en question seront des récepteurs cellulaires humains ciblés et permettront de développer de nouveaux candidats médicaments. La découverte et le développement de ces anticorps appropriés à l'action très spécifique est donc indispensables dans le traitement de maladies infectieuses et des cancers ainsi que dans le diagnostic de ces maladies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'obtention d'outils thérapeutiques afin de traiter des pathologies telles que les cancers, les maladies inflammatoires et neurologiques notamment. Ils constituent donc des solutions thérapeutiques majeures.

Procédures

Les animaux seront soumis aux dépilations (jusqu'à 10), aux immunisations (jusqu'à 12) et aux prélèvements sanguins (juqu'à 7). Chaque intervention dure environs 3 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la douleur des administrations/injections/prélèvements sanguins, la douleur aux niveaux des sites d'administrations/injections (irritations, légères réactions inflammatoires), et le stress causé au moment de la dépilation (crème dépilatoire), des immunisations, des prélèvements de sang et de la contention aux moments de ces interventions.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort. Si aucune réponse immunitaire significative ne peut être détectée chez un animal, l’immunisation est arrêtée et l’animal est mis à mort. Par contre si la réponse immunitaire est présente, les animaux sont expédiés a notre partenaire pour collecter les Anticorps.

Remplacement

La bibliographie montre que le remplacement des anticorps d’origine animale par des anticorps synthétiques a été initié depuis plusieurs années dans différents domaines mais que, dans l’état actuel de la technologie, il reste des situations dans lesquelles soit les anticorps synthétiques restent inadaptés donc inutilisables (anticorps dirigés contres des protéines dénaturées, anticorps anti-peptides), soit l’évolution vers l’utilisation d’anticorps d’origine non animale en production sera un processus de longue durée et les obstacles techniques subsistent (anticorps à usage thérapeutique ou diagnostic). La production d’anticorps monoclonaux et polyclonaux spécifiques de l'antigène, nécessite l'interaction complexe de toutes les cellules (surtout des cellules B) et d’organes lymphatiques impliqués dans le système immunitaire d'un organisme vivant mammifère. Le développement d’une grande diversité d’anticorps par leurs séquences n'est pas possible en l'état actuel de la recherche, tant par les techniques de culture cellulaire que par l'utilisation d'organes isolés, raison pour laquelle l'immunisation d'organismes entiers (souris et rats) est nécessaire. Les dernières découvertes oncologiques ont montré que des facteurs individuels dans les voies de signalisation cellulaire humaines qui jouent un rôle central dans le développement du cancer (ou d'autres maladies importantes) sont donc appropriés comme "cibles" de nouveaux médicaments pour combattre ces maladies. Les anticorps conviennent particulièrement bien comme "candidats médicaments", car ils se caractérisent généralement par une spécificité d'action très élevée et une action sélective par rapport à la cible (moins d'effets secondaires), contrairement à de nombreux autres candidats médicaments (par ex. par voie chimique) qui ont des effets secondaires importants, car ils agissent de manière très peu spécifique. C'est pourquoi la découverte et le développement d'anticorps appropriés et très spécifiques sont indispensables pour de meilleures mesures thérapeutiques contre des maladies telles que le cancer.

Réduction

Nous réalisons ce protocole à la demande de nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre leurs objectifs scientifique. Aucune approche statistique n'a été réalisée. Le nombre d'animaux utilisés par projet d'immunisation varie entre 3 et 10 animaux par immunogène ; le nombre d'animaux utilisés dépend de l'antigène et de l'espèce animale à immuniser. Afin d'obtenir une diversité suffisamment élevée des anticorps à développer, 3 à 10 animaux sont immunisés par groupe et par cible, en fonction de la cible et de l'espèce. Une fois l'immunisation effectuée, les cellules lymphatiques (provenant des organes cibles pertinents pour les cellules immunitaires comme la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse) sont prélevées sur les animaux immunisés. Il n'y a pas de groupe d'animaux de contrôle par essai/antigène cible. Les sérums pré-immunitaires des mêmes animaux immunisés servent de contrôle dans les essais. De plus, pour une bonne campagne d'immunisation pour le criblage des cellules B, il est important de prélever les organes des animaux le plus frais possible et de les traiter directement après le prélèvement. Une cryoconservation des organes lymphatiques ou de leurs cellules après le prélèvement serait réalisable, mais serait également responsable d’une très grande perte de matériel cellulaire, en raison de la mort des cellules due au processus de congélation et de décongélation, ce qui nécessiterait l’utilisation de plus d’animaux immunisés pour avoir la quantité d’anticorps voulu. C’est pour cette raison, que les animaux immunisés sont transportés vivants jusque chez notre client, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour une campagne d'immunisation.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant de l'enrichissement (bâtons de bois et matériel de nidification) et une surveillance est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation. Les contentions, épilations, immunisations et prélèvements sanguins sont réalisés par un personnel formé et expérimenté. En cas d'inflammation (au niveau des sites d'administrations/injections), une injection sous-cutanée d'analgésie sera réalisée, elle pourra etre répétée 24 h après si nécessaire.

Choix des espèces

Les animaux à immuniser doivent être des mammifères possédant une réponse immunitaire humorale (anticorps sécrétés par les cellules lymphocytaires B). Pour qu'une immunisation avec un antigène cible humain s'accompagne d'une réponse immunitaire significative de l'espèce immunisée, il est nécessaire que l'homologie de l'antigène cible entre l'animal et l'homme soit suffisamment différente pour que l'antigène cible soit reconnu comme "étranger" chez l'animal et que celui-ci produise des anticorps spécifiques à l'antigène cible. C'est le cas chez le rat et la souris qui produise des anticorps de bonne qualité. Les animaux seront tous utilisés au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Les animaux utilisés auront au minimum 6 semaines d’âge et maximum 20 semaines (au démarrage du protocole). A cet intervalle d'âge, les animaux présentent une réponse immunitaire particulièrement bien développée et réagissent avec une diversité aussi grande que possible de différents anticorps contre un antigène. Une grande diversité de séquences d'anticorps différentes est importante pour le développement d'anticorps candidats, car l'objectif est de reconnaître le plus grand nombre possible d'épitopes et de liaisons à l'antigène avec différentes affinités. A partir de l'âge d'environ 20-25 semaines, la réactivité et la diversité peuvent diminuer.

Greffées de cellules leucémiques prélevées chez des enfants, par voie intraveineuse ou directement dans le fémur sous anesthésie générale, 3 842 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à douze prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse, une irradiation sub-létale de sept minutes et un gavage quotidien pendant quatre semaines. Les souris développent une leucémie qui provoque perte de poids et affaiblissement général, et toutes sont tuées, pour analyse post-mortem ou parce qu'elles sont transgéniques. Le projet se donne pour objectif d'identifier des approches alternatives à l'utilisation d'animaux non-humains pour l'étude des leucémies pédiatriques, tout en prévoyant 3 842 souris sur sa durée.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de cellules souches hématopoiétiques (CSH) est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies l’enfant à mauvais pronostic. Pour tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, il est essentiel de pouvoir travailler sur les cellules tumorales les plus proches possibles de celles présentes chez les patients afin de prendre en compte la complexité génétique des tumeurs. La xénogreffe dérivée du patient développée après transplantation de la tumeur primaire humaine directement dans divers modèles murins immunodéprimés a été utilisée largement pour modéliser différents types de cancer. En effet, ces tumeurs conservent les caractéristiques histologiques des tumeurs parentales, reflètent mieux l'hétérogénéité de l'échantillon du patient et constituent une plate-forme pour évaluer les médicaments anticancéreux (molécules pharmacologiques et immunothérapies, dans des conditions physiologiques. Le projet a également pour objectif d'identifier des approches alternatives à l’utilisation de modèles animaux pour l’étude des leucémies pédiatriques. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cellules pluripotentes induites humaines cultivées in vitro pour caractériser les propriétés tumorales des cellules exprimant les oncogènes des leucémies issues des cellules souches en comparant les cellules obtenues in vitro et in vivo à celles provenant des patients. A terme, l'utilisation de cellues souches pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux pour réaliser certaines approches exclusivement in vitro. Nous utilisons des outils statistiques permettant de définir le nombre minimal d'animaux à utiliser pour obtenir des conclusions significatives pour chaque approche.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer les modèles utilisés afin d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette : -D'amplifier des cellules leucémiques de patients afin de réaliser leur analyse moléculaire et définir l'efficacité de réponse à plusieurs molécules pharmacologiques qui seront identifiées par les analyses moléculaires. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -De définir si des cellules souches pluripotentes induites pourraient, à l'avenir, être utilisées à la place des cellules humaines primaires et dans les approches in vitro pour réduire l'utilisation de souris. -De caractériser l'efficacité anti-tumorale d'approches précliniques, incluant certaines immunothérapies . -D'améliorer les modèles développés dans le but de réduire le nombre de souris utilisées et de définir les prérequis pour le replacement de certains modèles murins in vivo par des approches in vitro.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection intra-veineuse sous anesthésie locale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-veineuse de molécules sous anesthésie locale: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-fémorale sous anesthésie générale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal) et chaque injection prend 3 à 5 minutes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être journalier sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang sous anesthésie locale: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle sous anesthésie générale : jusqu'à 3 prélèvements par souris avec une fréquence d'au moins 15 jours. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes. Irradiations sub-léthale, une seule fois, durée 7 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général. Les interventions répétées de type injection ou prélèvements de sang peuvent éventuellement occasionner rarement des hématomes ou des lésions locales. Les injections intrafémorales ou les prélèvements de moelle dans le fémur peuvent rarement occasionner des douleurs persitantes et des boîteries. Les irradiations sub-léthales n'ont aucun effet indésirables au-delà des manipulations légères pour les pratiquer.

Devenir

Tous les animaux du projet sont transgéniques et seront donc euthanasiés. De plus, beaucoup développeront des maladies de type leucémie et seront euthanasiés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération/maturation terminale des lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches pluripotentes induites), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

De nouvelles lignées de souris immunodéficientes sont développées régulièrement par d'autres laboratoires et certaines sont rapportées comme ayant un taux de greffe des cellules hématopoïétiques humaines supérieur et donc permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces approches. Nous comparerons l'efficacité de ces modèles à celui du modèle de référence pour la prise de greffe de nos échantillons leucémiques afin de sélectionner le modèle qui permettra de réduire le nombre de souris utilisées pour les greffes primaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaire et suffisant et pour analyser les résultats. Au cours des années passées, nous avons identifié un modèle plus réceptif aux greffes de cellules hématopoïétiques primaires ou issues de cellules souches pluripotentes induites. Nous utilisons donc maintenant régulièrement cette souche qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Nous poursuivrons la comparaison avec de nouvelles souches de souris immunodéficientes qui deviendraient disponibles au cours du projet. Dans le cas où elles montreraient une efficacité, nous serons donc amenés à utiliser de nouvelles lignées et à diminuer le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Afin de réduire l’invasivité des prélèvements, nous introduisons des rapporteurs luminescents dans les cellules humaines utilisées pour les approches précliniques afin de pouvoir suivre la prise de greffe et l’efficacité des traitements par des approches d’imagerie corps entier sans prélèvements (ex: sang ou moelle) permettant une meilleure quantification de l'efficacité globale du traitement.

Choix des espèces

Les souris représentent une espèce relativement facile à élever qui permet l’obtention de résultats rapides du fait de leur temps de génération réduit. Elles possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l’homme. Pour cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, car ces souris permettent une prise de greffe efficace de cellules humaines, avec un risque de rmaladie du greffon contre l'hôte réduit et peuvent être utilisées pour les approches précliniques. Par le passé, nous avons contribué à des approches précliniques pour un composé qui ont conduit à des phases cliniques. Ces modèles sont également utiles pour le test d'immunothérapies. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, des article récents montrent l’importance d'utiliser des souris receveuses nouveau-nés. Ainsi, nous pourrons transplanter les cellules soit dans des receveurs nouveau-nés ou adultes pour comprendre l'importance de l'âge de l'organisme lors du dévéloppement des leucémies retrouvées chez l'enfant.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un nématode intestinal par gavage et par un Plasmodium responsable du paludisme murin, puis saignées deux fois par semaine par incision de la queue, la croûte de cicatrisation étant retirée à chaque nouveau prélèvement. L'infection détruit leurs globules rouges et provoque une anémie qui culmine autour du quatorzième jour. Le porteur affirme que les interactions entre l'hôte, le ver et le parasite ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier le rôle d’effecteurs immunitaires spécifiques dans la dynamique de l’infection par un nématode intestinal et un Plasmodium murin lorsqu’ils coïnfectent leur hôte. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection entraine des dynamiques différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela peut également avoir des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, lorsque le deuxième parasite infecte un hôte préalablement infecté par l’autre espèce (indépendamment de l’ordre avec lequel les deux parasites infectent l’hôte) on constate un rebond de la dynamique de l’infection. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle que joue la réponse immunitaire de l’hôte dans ce rebond.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier le rôle de la réponse immunitaire dans la dynamique de l’infection quand les hôtes sont coïnfectés par un nématode intestinal et Plasmodium. Ces parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Dans le cas de coïnfection la dynamique des deux parasites est altérée avec des rebonds qui peuvent affecter la santé de l’hôte. Notre projet vise donc à contribuer à élucider le rôle que la réponse immunitaire de l’hôte joue dans ces rebonds et par extension dans le risque encouru par les populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes (tous les animaux ne sont soumis à toutes ces interventions, cela dépendant des différents groupes expérimentaux): gavage (une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Le nématode intestinal produit des infections asymptomatiques dans le sens qu’aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté. Dans des très rares cas, l’émergence des vers adultes dans la lumière intestinale peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale et un passage de LPS dans le sang. La souche de Plasmodium yoelii que nous allons utiliser s’appelle 17X NL où l’acronyme NL signifie « non létal ». Cependant, l’infection par Plasmodium produit une lyse des globules rouges entrainant une anémie. Cette anémie est transitoire (culminant entre les jours 14 et 16 post-infection) et après jour 24 les valeurs de concentration de globules rouges par microlitre de sang reviennent à la normale. Le gavage ne comporte de nuisances particulières si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal. Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animale vigile et sont réalisées en quelques secondes (volume injecté = 100 µl), la nuisance étant donc limitée à cette phase de contention. Les injections intraveineuses sont réalisées à la veine caudale sur animal vigile à l’aide d’un appareil de contention. La nuisance est attendue est donc également liée au stress engendre par la contention. Cependant, la contention et l’injection durent moins d’une minute. Les prélèvements de sang à l'extrémité de la queue sont réalisés en pratiquant une petite incision à la pointe de la queue pour le premier prélèvement et en ôtant la croute de cicatrisation pour les prélèvements successifs, ce qui ne devrait pas engendre des nuisances particulières. Les collectes de fèces sont effectuées en isolant les souris. L’isolement peut provoquer du stress, cependant les souris ne sont isolées que pendant 1 heure, étant pour le reste hébergées en groupe (5 souris par cage). Etant donné que deux prélèvements sont effectués par semaine, le temps passé en isolement ne constitue que 1% du budget temps hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever les organes en vue d’analyses ultérieures.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’évaluer le rôle de la réponse immunitaire dans la dynamique de la coïnfection mettant en jeu un nématode intestinal et un Plasmodium murin. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le Plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans ce projet a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 10 souris par groupe expérimental. Une analyse de puissance montre qu’avec les différences que nous avons observé dans la dynamique de la coïnfection lors d’expériences précédentes, un effectif de 10 souris par groupe confère une puissance de 90% au seuil de significativité de 0.01.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui a été démontré réduire le stress des animaux. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général. Si une dégradation de l’état de santé est constatée, nous utiliserons une grille quantitative de notation qui permet de définir des points limites suffisamment prédictifs.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

Une anesthésie tous les deux jours pendant deux semaines, chacune précédée d'une injection intrapéritonéale: 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes. Elles reçoivent des cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, développent des tumeurs pulmonaires ou péritonéales, et certaines déclarent une réaction du greffon contre l'hôte avec perte de poids et perte de poils. L'objet est de tester deux modifications génétiques de cellules immunitaires humaines, censées mieux attaquer les tumeurs solides. Le porteur décrit les cocultures en deux et trois dimensions déjà menées au laboratoire, puis conclut que le modèle animal reste "indispensable" avant toute application clinique.

Objectifs

Le développement des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) a révolutionné l'immunothérapie du cancer pour certains types de cancer. Ce nouveau type de traitement par immunothérapie consiste à prélever les cellules immunitaires du patient, de les modifier génétiquement en laboratoire pour qu’elles expriment le CAR, puis elles sont réinjectées au patient afin qu’elles reconnaissent et combattent les cellules cancéreuses. Cependant, des améliorations des thérapies CAR restent nécessaires afin de cibler d'autres types de tumeurs et d'assurer une fonction antitumorale durable des cellules modifiées. Nous proposons ici deux nouvelles stratégies de modification génique ciblant chacune des cellules immunitaires différentes, les lymphocytes T et les macrophages, dans le but d'amplifier leurs fonctions antitumorales. Ces cellules sont des leucocytes (globules blancs) qui ont pour but de détruire d’autres cellules : les lymphocytes T détruisent les cellules reconnues comme étrangères (immunité cellulaire) ; et les macrophages phagocytes « mangent » les cellules étrangères ou leurs débris et participent à la présentation des antigènes et à la libération de cytokines. Dans la première stratégie, nous augmenterons la fonction antitumorale des cellules CAR issues de lymphocytes T, augmentant leur production d'interféron (cytokine/protéine produite par les cellules immunitaires afin d’activer la réponse immunitaire chez d’autres cellules impliquées dans la réponse inflammatoire) grâce à de nouveaux mécanismes que nous avons récemment découverts. Dans la deuxième stratégie, nous améliorerons la survie des CAR issus de macrophages, en les dotant d'une protection anti-apoptotique (=mécanisme de mort cellulaire). Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous utiliserons des approches expérimentales similaires dans les deux stratégies, pour établir la preuve de concept d'une activité antitumorale accrue in vivo. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie cellulaire par récepteurs antigéniques chimériques (CAR) permet de cibler et de tuer les cellules tumorales. Néanmoins, elle représente deux limites i) elle n’a pas permis de cibler les tumeurs solides, ii) elle rencontre des rechutes et des résistances chez près de 50% des patients répondeurs à deux ans. Nous proposons donc deux stratégies pour contrer ces limites et améliorer les capacités à cibler les cellules tumorales, le tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires. La première stratégie permet l’amélioration de la fonction antitumorale des CAR-T (lymphocytes T modifier génétiquement). Cela est assuré par le contrôle de la production d’interféron par les cellules T. La forte production d’interféron induite par ces manipulations a permis l’augmentation de la capacité de destruction des cellules tumorales. La deuxième stratégie tend à améliorer la persistance et la survie des CAR-MAC (macrophages modifier génétiquement). Ces cellules sont prometteuses pour la thérapie cellulaire contre les tumeurs solides par leur capacité à se diriger vers la tumeur et leur capacité de phagocytose des cellules tumorales. La solution apportée pour améliorer leur survie a permis d’obtenir des effets thérapeutiques plus importants. De plus, elle a l’avantage de reposer sur une ingénierie génétique stable. Les monocytes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer » du système immunitaire (sous-catégorie de lymphocytes, proches des lymphocytes T, qui ont un rôle cytotoxique). Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.

Procédures

Dans les trois procédures, nous visons à évaluer l’effet d’un traitement cellulaire sur la progression tumorale, par différentes étapes : A. Plusieurs lots (un par lignée tumorale) d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de comparer la cinétique de progression des différentes lignées tumorales. B. D’autres lots d’animaux vigiles recevront les cellules thérapeutiques par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer la localisation et la persistance des cellules. C. D’autres lots d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après les animaux vigiles recevront un traitement par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer l’efficacité de notre traitement sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à un stress et à une douleur minimale au moment des injections, mais nous nous efforçons de les maintenir à un niveau aussi bas que possible grâce à une manipulation professionnelle. L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires humaines transplantées attaquent le corps de l'hôte, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux développeront des tumeurs pulmonaires ou dans le péritoine, en fonction de la voie d’injection. Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo.

Remplacement

Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet, avec des lymphocytes T et monocytes modifiés, ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroïdes qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives in vitro auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. Une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré est nécessaire. Cette étape est indispensable pour tester les mécanismes de régulation et d’action, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.

Réduction

En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les lignées cellulaires tumorales qu’on utilisera expriment la luciférase, ce qui permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence qui sera faite deux fois par semaine. Une corrélation entre le niveau de bioluminescence pour chaque lignée cellulaire utilisée et l’état général des souris (évalués à l’aide de la grille de score jointe) sera faite, afin de s’assurer que les tumeurs ne dépassent pas un niveau maximal de bioluminescence et éviter le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score jointe au document. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en recherche de thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La souris est aussi le modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, et de la disponibilité de souches murines parfaitement définies. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 6 et 10 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Pour chaque protocole expérimental on utilisera des groupes d’animaux d’âge identique.

2 816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer de huit à vingt-quatre semaines sous régime gras pour développer obésité et diabète, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont irradiées puis greffées de moelle osseuse, d'autres placées seules en cage sept jours, immobilisées deux à cinq minutes dans un tube pour mesurer leur graisse corporelle, ou laissées une nuit sur une grille pour récupérer leurs fèces. Le porteur reconnaît que les injections intrapéritonéales répétées pourraient provoquer une péritonite et que les gavages peuvent causer des microlésions. Le projet ne teste aucun traitement et vise à comprendre le rôle des macrophages du foie, quand l'atteinte des souris, elle, est acquise dès la mise au régime.

Objectifs

Les macrophages sont des cellules du système immunitaire présents dans tous les tissus. Ils participent au maintien de l’organisme en éliminant notamment les cellules mortes ou bien des pathogènes (bactéries, virus). Ces cellules ont toutefois été aussi fortement impliquées dans un grand nombre de maladies dites chroniques, où on leur prête bien souvent un rôle délétère, et notamment dans la maladie du foie gras (NAFLD), l’athérosclérose (maladie des artères à l’origine des infarctus du myocarde) ou bien dans le tissu adipeux chez les individus avec surcharge pondérale (obésité) et diabète. Les macrophages sont des cellules très diverses qui sont fortement influencées par le tissu où elles résident et leur environnement, notamment en conditions pathologiques. Notre projet vise à mieux définir le rôle des macrophages du foie dans le développement des pathologies dites cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras (NAFLD), obésité). Pour reproduire les différents contextes pathologiques, des modèles animaux seront nourris avec différents types de régimes alimentaires qui favoriseront la survenue d'obésité, de la NAFLD ou bien encore de l'hypercholestérolémie (facteur de risque majeur de l’athérosclérose). Certains traitements pourront aussi être conduits sur les animaux pour modéliser un aspect bien précis de l’évolution pathologique de la NAFLD, à savoir la fibrose du foie. En modifiant, la fonction de ces macrophages, leur capacité à survivre ou bien même en éliminant ces cellules du foie de manière momentanée ou durablement, nous essaierons de comprendre leurs rôles et l’importance de leur diversité (origine, activation) dans le contexte de la pathologie et comment ces cellules peuvent influencer le développement des maladies cardio-métaboliques.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies métaboliques, comme l’obésité, a augmenté à un rythme exponentiel au cours des dernières décennies. Il est important de noter qu'en plus d'avoir ses propres comorbidités, l'obésité a un impact considérable sur la santé d'un patient et augmente sa susceptibilité à d'autres conditions, comme le cancer. Les comorbidités reconnues depuis longtemps de l’obésité comprennent la résistance à l’insuline et le diabète de type 2, l’hypertension, la dyslipidémie, les maladies cardiovasculaires et la stéatose hépatique. Il est à noter que la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) soit également un facteur de risque indépendant majeur pour le développement de maladies cardiovasculaires, notamment l’athérosclérose. Il existe de plus en plus de preuves d’une association étroite entre l’obésité et la NAFLD, et une attention considérable de la recherche est désormais portée sur cette association en raison de la prévalence croissante de la NAFLD et de sa capacité à évoluer vers un dysfonctionnement et une insuffisance hépatique. Le fardeau de la NAFLD devrait augmenter et les projections actuelles estiment que, d’ici 2030, plus de 300 millions de personnes développeront la NAFLD en Chine, plus de 100 millions aux États-Unis et 15 à 20 millions dans les principaux pays européens. Les coûts économiques actuels associés à la NAFLD et à ses comorbidités sont extrêmement élevés. Ainsi, de gros efforts sont en cours pour développer des traitements innovants pour lutter contre cette maladie, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement approuvé. Dans ce contexte, ce projet vise à mieux comprendre le rôle et l’importance que jouent les macrophages (origine, quantité tissulaire, activation) dans le développement de ces pathologies dites cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras ou NAFLD, obésité).

Procédures

Les animaux seront nourris avec différents types de régimes riches en graisses de 8 à 24 semaines pour les faire grossir et développer un diabète. Ils pourront également être nourris en alternance avec un régime riche en graisses ou avec un régime normal. Ils pourront être mis à jeun pendant quelques heures, recevoir un gavage ou une injection et subir 1 ou 2 tests de 2 heures avec quelques petites prises de sang sur animal vigile pour évaluer leur diabète. Les animaux pourront être anesthésiés et recevoir une injection en intra-veineux (durée de quelques minutes) une seule fois. Certains animaux pourront avoir deux prises de sang (vigile, une minute de contention) à quelques jours ou quelques semaines d’écart. Certains animaux pourront être placés dans un tube ou dans un compartiment d’une boite avec restriction de mouvements pendant 2 à 5 mins pour mesurer leur graisse corporelle. Certains animaux pourront être placés seuls dans une cage de dimension normale pendant 7 jours (isolement des animaux avec contact visuel et olfactif avec ses congénères) pour évaluer leur état général et leur niveau d’activité. Certains animaux recevront des traitements par injection de molécules (une seule fois ou deux fois par semaine pendant 6 semaines) ou par addition de molécules dans la nourriture pour induire des perturbations hépatiques. Certains animaux pourront être irradiés quelques minutes et subir une greffe de moelle osseuse immédiatement après par injection sous anesthésie (durée quelques minutes) pour étudier les cellules de leur moelle osseuse. Certains animaux pourront être placés sur une grille déposée sur le sol de leur cage pendant une nuit pour récupérer leur fèces. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les prélèvements pour génotypage pourront induire une douleur légère et de courte durée. Les animaux nourris avec les régimes riches en graisses présenteront une prise de poids importante pouvant modifier leur mobilité avec diminution de leur activité quotidienne. La composition de ces régimes riches en graisses les rend plus mous et pourrait favoriser une pousse des dents plus importantes. Les contentions de courtes durées, les administrations par gavage, les injections et les prélèvements sanguins sur animal vigile nécessaires aux différents tests pourront être sources de stress et d’inconfort pour l’animal. Les injections intra-péritonéales répétées pourraient induire un risque de péritonite. De façon rare, les gavages pourront induire des microlésions ou des irritations. Certains tests pourront également induire un stress pour les animaux en raison d’une courte période de mise à jeun. Les mesures de composition corporelle (mouvements limités dans un tube pendant 2 mins) pourront être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Les courtes anesthésies gazeuses pour les injections intra-veineuses pourront engendrer un stress thermique et les injections une douleur temporaire au réveil. Certaines injections ou administration de molécules pourront induire une inflammation temporaire, être source d’inconfort pendant 1 à 2 jours, et s'accompagner parfois d'une perte de poids. L’isolement (une nuit) sur grille pour la récupération des fèces pourront induire un stress. Les animaux irradiés (doses modérées) pourront être stressés au cours de l’irradiation par restriction de leur mouvement (durée 5 mins) dans une petite boîte.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser l'analyse de leurs tissus post-mortem.

Remplacement

L’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier les acteurs cellulaires pouvant orienter le développement des pathologies cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras, obésité). Nous avons besoin d’étudier spécifiquement l’influence de l’inactivation de certains gènes dans nos cellules d’intérêt, et d'étudier les conséquences dans le développement de la maladie. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires qui rentrent en jeu et la répercussion de leur activité sur le fonctionnement du tissu.

Réduction

Un total de 2816 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de notre d’expérience utilisant des approches similaires et à l’aide d’un calcul de puissance, nous estimons que 2 lots de 8 animaux par condition seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour certaines expériences mâles et femelles seront étudiés séparément car les réponses tissulaires peuvent différer selon le sexe de l’animal. Toutefois, pour certaines études les mâles seront préférentiellement utilisés. Les femelles générées seront alors utilisées pour d'autres expériences, permettant de réduire le nombre d’animaux. A l'issue des expérimentations, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. Dans la mesure du possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans les conditions standard d'animaleries EOPS (exempte d'organismes pathogènes spécifiques) avec hébergement en portoirs ventilés, avec respect des cycles jour et nuit de 12h, un contrôle de l’hygrométrie et de la température comprise entre 20 et 24 degrés. Les changes litière et de nourriture sont effectués de façon hebdomadaire avec surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie. Les souris disposeront de lanières de papier kraft, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Si des males se battent ou se blessent, ils seront immédiatement pris en charge avec l’avis de la SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) et ou du vétérinaire de l’établissement utilisateur. Une solution la plus adaptée et la moins contraignante pour les animaux sera recherchée (enrichissement supplémentaire si l’isolement est validé, possibilité de rassemblement, etc.). Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Après transfert des animaux des zones d’élevages, les animaux seront acclimatés à l’animalerie pendant 1 à 2 semaines et habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. Pour toutes les procédures, les injections, les administrations de molécules ou les prélèvements sanguins seront réalisées par une personne en charge de l'étude, habilitée à réaliser les expérimentations sur ce modèle, maîtrisant le geste et avec un matériel adapté afin de réduire le stress et la douleur des animaux. Pour les procédures où une douleur est attendue, les animaux seront suivis quotidiennement. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et,ou le vétérinaire pourra être sollicité, le cas échéant. Si des points limites définis en amont sont atteints, les animaux en souffrance seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle des invalidations géniques et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être facilement réalisées. De plus, de nombreuses lignées ont déjà été développées et sont donc disponibles pour les chercheurs. La physiologie murine est proche de celle de l’Homme, justifiant ainsi l’utilisation de cette espèce à des fins de recherche thérapeutique en médecine humaine. L’expression des maladies cardio-métaboliques est par ailleurs assez bien reproduite dans le modèle murin avec un recul expérimental de plusieurs décennies à travers le monde. Les animaux utilisés devront avoir atteint la maturité sexuelle et être de jeunes adultes au début des expérimentation. Ils seront donc utilisés à partir de l’âge de 8 semaines.

Rendues malades d'une colite hémorragique par un produit administré une semaine durant, ou d'un lupus par une injection de pristane dans la membrane entourant l'intestin, 1 080 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le lupus se déclare huit semaines après l'injection, et des prélèvements sanguins sont réalisés chaque mois sous anesthésie, pour évaluer deux molécules mises au point par l'équipe. Le porteur décrit une injection qui "n'induit peu d'inconfort et de douleur", puis annonce que certaines souris développeront des atteintes pulmonaires sévères et seront tuées en détresse. Il conclut que l'essai préclinique sur des souris récapitulant les manifestations humaines est "indispensable" avant tout essai chez les patients.

Objectifs

La Rectocolite hémorragique (RCH) est une maladie inflammatoire digestive sévère dont les causes sont mal comprises. De plus, cette pathologie peut être caractérisée par une résistance du traitement. Le lupus érythémateux systémique (LES) est une maladie auto-immune pouvant engendrer des atteintes cutanées, rénales, articulaire et vasculaire dont les cause ne sont pas encore bien comprise. De plus, les traitements actuellement disponibles ne permettent que de partiellement contrôler la pathologie. C'est pour ces raisons que le développement de nouveaux outils thérapeutiques tant pour le LES que pour la RCH est nécessaire pour une meilleure prise en charge des patients. De nouveaux mécanismes pathologiques communes à ces deux pathologies ont récemment été décrit et nous avons développé de nouvelles molécules afin de réguler ces mécanismes pathogéniques et de diminuer les atteintes d'organes. Les objectifs de ce travail seront donc d'évaluer le pouvoir thérapeutique des deux molécules développées par notre équipe et de les comparer aux traitements de référence ou en combinaison avec ces derniers pour amplifier leurs effets. Ces thérapeutiques étant nouvelles, et nécessitent une validation préclinique avant le passage éventuel chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les thérapeutiques actuellement disponibles pour les patients atteints de recto-colite hémorragique (RCH) ainsi que celles disponibles pour le lupus érythémateux systémique (LES) sont imparfait. En effet certains patients peuvent être résistant au traitement, de plus ces derniers peuvent aussi engendrer de lourds effets indésirables. En partant de ce constat, notre équipe essaye de développer de nouveaux outils thérapeutiques en rapport avec les derniers avancés sur la compréhension de la physiopathologie de ces deux maladies. Avant tout, essaie sur les patients l'essai pré-clinique sur des modèles murins permettant de récapituler les manifestations cliniques humaines est indispensable. Le bénéfice attendu à long terme est donc la génération de nouvelles molécules thérapeutiques pour traiter la RCH et le LES.

Procédures

Le modèle de colite induit en 1 semaines est utilisé pour cette étude est largement validé et utilisé dans la littérature engendrant de l'irritation et inflammation au niveau intestinal. La sensibilité des animaux a la maladie peut varier selon les individus et la détérioration de l’état général peut être plus rapide chez certains. Le poids et l’état général seront donc surveillés quotidiennement pendant la durée du traitement. Il est admis que si l’animal perd plus de 20% du poids du corps, il doit être euthanasié plus rapidement que prévu. Pour les prélèvements sanguins, les souris seront anesthésiées pendant 2 minutes le temps du prélèvement pour limiter leur inconfort. Le modèle murin de lupus est induit par une injection rapide durant moins de 30 secondes au niveau de la membrane entourant l'intestin, ce type d'injection est classique et n'induit peu d'inconfort et de douleur. La maladie lupique est induite a partir de 8 semaines après l'injection.

Impact sur les animaux

Le modèle de colite utilisé pour cette étude est largement validé et utilisé dans la littérature engendrant de l'irritation et inflammation au niveau intestinal. La sensibilité des animaux a la maladie peut varier selon les individus et la détérioration de l’état général peut être plus rapide chez certains. Le poids et l’état général seront donc surveillés quotidiennement pendant la durée du traitement. Il est admis que si l’animal perd plus de 20 % du poids du corps, il doit être euthanasié plus rapidement que prévu. Le modèle murin de lupus induit par le pristane est un modèle validé, certains animaux peuvent développer dans les premières semaines des atteintes pulmonaires sévères, mais ces souris vont rapidement être reconnu comme étant en détresse et seront rapidement euthanasié afin de limiter le plus possible la durée de leur detresse. Les animaux qui n'auront pas développé d'atteinte pulmonaire vont progressivement avoir une légère détérioration de leur fonction rénale.

Devenir

Tous les animaux utilisé seront euthanasié conformément à l'annexe IV de la directive 2010/63/CE. Cette mise a mort des animaux est neccesaire afin d'évaluer les paramétres immunologiques et l'évolution de la pathologie en fonction des différents traitements.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologie observée chez l’homme peut apporter la preuve de l’intérêt d’un traitement ciblant GPX4 ou le s- CD95L dans la RCH et le LES. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé statistiquement comme étant le nombre minimum d'animaux pour réaliser des tests statistiques robustes et permettant de conclure quant à l'efficacité thérapeuque de nos molécules.

Raffinement

1. Hébergement: les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance, perte de poids trop importante. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: certaines souris auront un prélévement sanguin une fois par mois et afin de limiter leurs stress, incomfort et douleurs ce geste sera fait sous anésthésie générale.

Choix des espèces

Souris C57Bl/6 : nous utiliserons ces souris car elles ont largement été utilisées dans la littérature avec le modèle DSS ou pristane et y sont sensibles.