Système immunitaire

122 000 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage de lignées génétiquement modifiées, 12 000 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'activité déclarée tient en une biopsie d'oreille pour génotypage et en la surveillance des lignées dont la modification génétique altère la santé, par exemple par une susceptibilité accrue aux tumeurs. Environ 107 800 souris seront tuées, 12 200 gardées pour la reproduction et 2 000 réutilisées, le porteur indiquant que les souris au génotype sans intérêt sont mises à mort quand aucun autre projet ne peut les prendre. Sur les 122 000 déclarées, la très grande majorité n'existe donc que pour faire naître les quelques individus porteurs du bon génotype.

Objectifs

Il s'agit de définir et de détecter des lignées de souris pouvant altérer leur bien-être dans un élevage de souris génétiquement modifiées et de produire des souris génétiquement modifiées nécessitant une caractérisation génétique.

Bénéfices attendus

Ceci permet de produire et de maintenir des lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à des projets de recherche en raffinant les techniques d'élevage de ces lignées. Ceci permet à la fois de détecter et de prendre en charge l'apparition de caractères dommageables. Ce projet permet d'anticiper la prise en charge des signes nécessitant des soins et de permettre une réaction immédiate en cas d'apparition de ces signes.

Procédures

Identification et prélèvements pour caractérisation des souris (moins d'une minute). Biopsie pour génotypage qui concerne les souris du projet. Conditions d'élevage spécifique des modèles adaptés en fonction de l'évaluation de l'impact du modèle sur le bien-être animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés au caractère dommageable des lignées entretenues : par exemple, une susceptibilité plus grande à l'apparition de tumeurs... La biopsie pour génotypage qui sera faite à l’oreille.

Devenir

Les animaux d'intérêt sont utilisés dans des procédures expérimentales dans d'autres établissements utilisateurs ou peuvent servir en tant que reproducteur. Les animaux dont le génotype n’a pas d’intérêt pour les projets expérimentaux initiaux sont soit utilisés pour d’autres projets expérimentaux dans d'autres établissements utilisateurs quand c’est possible, soit euthanasiés s’il n’y a pas de possibilité de les utiliser dans d’autres procédures.

Remplacement

Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques).

Réduction

La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire (d'une part pour l'évaluation du phénotype dommageable et d'autre part la production de lots expérimentaux). La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc).

Raffinement

Le raffinement concernant l'évaluation et l'entretien de lignées à phénotype dommageable ou potentiellement dommageable est obtenu en appliquant scrupuleusement les consignes des chercheurs concernant l'apparition des signes attendus ou supposés pour chaque lignée considérée. Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (frisottis, batonnet de coton, maison en carton si besoin, mise à disposition si besoin de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière, etc... adaptation du nombre d'animaux / Cage au phénotype). Les conditions sanitairess sont élevées afin de réduire le risque de caractère dommageable lié au statut sanitaire. La biopsie pour le génotypage se fait à l'oreille.

Choix des espèces

Souris, car on peut facilement créer et produire de nouveaux modèles pour répondre à une question scientifique. Tout âge : animaux jeunes à âgés selon le type de procédures expérimentales dans lesquelles ces animaux sont par la suite utilisés en utilisation continue.

Soumises à des injections répétées sous anesthésie gazeuse, sous la peau tous les deux jours puis dans la veine chaque semaine, 770 souris hémophiles sont toutes tuées pour la collecte de leurs organes lymphoïdes, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 610 d'entre elles et léger pour 160. Leur phénotype hémophile les expose à des hémorragies en cas de blessure, et elles subissent en plus des prélèvements sanguins hebdomadaires pendant trois semaines. Le projet vise à induire une tolérance immunitaire au Facteur VIII par des nanoparticules, pour éviter la réaction immunitaire qui apparaît chez environ trente pour cent des patients hémophiles A traités. Sur le choix de l'espèce, le porteur ne cite comme seule alternative connue qu'un modèle canin hémophile, et retient la souris pour l'homogénéité des génotypes et la disponibilité des outils d'analyse.

Objectifs

L’hémophilie A est une maladie génétique rare liée au chromosome X et caractérisée par un déficit en Facteur VIII (FVIII) de la coagulation. Afin de corriger le saignement, du FVIII dit ‘thérapeutique’ est administré par voie intraveineuse aux patients. Malheureusement, une réponse immunitaire spécifiquement dirigée contre le FVIII thérapeutique est observée chez trente pour cent des patients. Le développement d’anticorps anti-FVIII chez ces patients mène à une impasse thérapeutique. L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle stratégie thérapeutique permettant d’induire une tolérance du système immunitaire au FVIII afin d’empêcher la production d’anticorps anti-FVIII chez les patients hémophiles A. Cette avancée scientifique majeure permettrait une amélioration conséquente de la qualité de vie des patients et un gain financier pour les systèmes publics de Santé.

Bénéfices attendus

Environ trente pour cent des patients hémophiles A traités avec du FVIII thérapeutique, développent une réponse immunitaire neutralisante. L’apparition de cette réponse immunitaire complique énormément la prise en charge clinique (traitement lourd et couteux) et la qualité de vie du patient. Si nous parvenons à induire une tolérance avec notre stratégie thérapeutique basée sur l’utilisation de peptides immuno-dominants sialylés du FVIII, cela permettrait d’envisager des essais cliniques afin de prévenir la réponse immunitaire anti-FVIII chez les patients hémophiles A.

Procédures

Les animaux utilisés ont un phénotype hémophile A (risque de saignement lors de blessure ou traumatisme). Ils subiront des injections sous-cutanées sous anesthésie gazeuse. La fréquence la plus élevée sera d’une injection tous les 2 jours, puis d'1 injection par semaine pendant 4 semaines. Ces interventions (injection) ne durent que 10 à 20 secondes et se feront sous anesthésie pour limiter le stress et la contention. Ils subiront également 4 à 6 injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse. Ces injections seront réalisées à une fréquence d'une injection par semaine et ne nécessitent que 10 à 20 secondes d'immobilisation de l'animal anesthésié. Dans certaines conditions expérimentales, des prélèvements sanguins sont prévus. Ces prélèvements seront également réalisés sous anesthésie gazeuse et ne nécessitent que 20 secondes d'immobilisation maximum de l'animal anesthésié. La fréquence maximale de prélèvement sera d'un prélèvement par semaine pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé est un modèle préclinique de l'hémophilie A, des risques hémorragiques liés à l'absence du FVIII de la coagulation sont possibles en cas de blessure ou traumatisme et demandent donc une adaptation de certaines procédures. Les injections sous-cutanée, intraveineuse et prélèvement sont réalisés sous anesthésie gazeuse. L'induction d'un stress au moment de la préhension ou d'une détresse respiratoire ou difficulté de mouvement au réveil lors de l'anesthésie gazeuse est possible mais reste limitée. Une douleur induite lors des injections intraveineuse ou une inflammation au niveau des sites d'injection lors des injections sous-cutanée sont possibles

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les organes lymphoïdes seront collectés pour l' évaluation de la réponse immunitaire anti FVIII ou pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Des analyses in sillico de prédiction de peptides ont été réalisées, néanmoins, le projet fera appel à différents modèles expérimentaux chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment l’induction de tolérance au FVIII). Toutefois, toute information obtenue in vivo sera immédiatement transposée à des systèmes in vitro pour analyses ultérieures.

Réduction

Le nombre de répétitions des expériences sera défini de manière rationnelle : si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs avec une puissance appropriée, elle ne sera pas répétée, sinon elle sera répétée une à deux fois maximum. Les organes, sérum et cellules des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés; ainsi, aucune expérience supplémentaire ne doit-elle être faite si des questions nouvelles surviennent. Un total maximum de 770 animaux est prévu pour ce projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées avec le personnel de l’animalerie. Les animaux disposent de nourriture et de l’eau ad libitum. L’environnement est enrichi par ajout de nids végétaux et de tunnels en carton. Les souris seront hébergées avec un maximum de 5 souris par cage. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (ajout de nids végétaux et de tunnels en carton). Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Des points limites ont été définis et les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.

Choix des espèces

La seule alternative connue est l’utilisation d’un modèle canin hémophile. Néanmoins, la souris est la seule espèce qui permettent d’avoir un nombre d’individus de même âge suffisant, et de génotype homogène, qui permette l’obtention de résultats statistiquement fiables, et pour lequel les outils nécessaires à l’étude de la réponse immunitaire sont disponibles sans restriction. L’élevage des souris hémophiles A est homozygote. Des souris adultes, âgées de 7-12 semaines en début d’expérimentation (système immunitaire mature) seront utilisées.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 190 d'entre elles et modéré pour 80. Le porteur leur induit trois maladies, une arthrite par injection d'anticorps anti-collagène puis de LPS, un lupus par injection de pristane suivie de recueils d'urine chaque semaine à partir de la vingtième semaine, et un choc anaphylactique après implantation sous la peau d'une sonde de température. Il décrit une inflammation aiguë des articulations avec gonflement, rougeur et "probablement douleur", une chute de la température corporelle et une atteinte rénale, tout en écrivant que "le phénotype de l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet est non dommageable". Chaque souris subit aussi l'amputation de trois millimètres de queue pour son identification.

Objectifs

Les récepteurs d'immunoglobuline sont des acteurs clés dans un certain nombre de maladies inflammatoires, telles que les arthrites (inflammation invalidante des articulations qui devient rouges, gonflent et sont douleureuses) ou les allergies. Ces maladies représentent un problème majeur de santé publique, et dans chacune d'entre elles, l'inflammation est une étape clé initiée par les récepteurs aux immunoglobulines. Le but de notre projet est d'identifier les molécules responsables de l'inflammation exacerbée dans ces maladies, ce qui pourrait conduire au développement d'approches thérapeutiques plus spécifiques et moins coûteuses pour ajuster les traitements actuels et améliorer la prise en charge des patients souffrant de ces maladies. Plus précisément, grâce à des expériences de laboratoire n'utilisant pas de modèles animaux, nous avons identifié deux protéines qui sont de nouveaux acteurs impliqués dans la réponse inflammatoire déclenchée par les récepteurs aux immunoglobulines. Nos expériences sur des lignées cellulaires dans lesquelles nous avons inactivé ces protéines montrent qu'elles sont en effet d'excellents candidats pour moduler la réponse inflammatoire. Nous étudions actuellement la pertinence de ces deux protéines dans des maladies inflammatoires telles que l'arthrite (inflammation des articulations), le lupus (inflammation de la peau et des organes tels que les reins) et le choc anaphylactique (la forme la plus grave des allergies). En raison de la complexité des maladies que nous étudions, il n'y a pas d'autre solution que d'utiliser des modèles animaux qui développent eux-mêmes ces maladies. Nous induirons un modèle d'arthrite qui récapitule la maladie humaine en injectant des anticorps anti-collagène (un composant majeur des articulations), et un modèle de lupus en injectant une molécule qui induit l'inflammation. Le choc anaphylactique sera induit en deux étapes : une première injection d'anticorps de lapin chez la souris, qui induira des anticorps anti-lapin chez la souris. Ensuite, une seconde injection d'anticorps de lapin déclenche le choc anaphylactique qui est la plus grave forme d'allergie connue.

Bénéfices attendus

Nous avons identifié deux nouvelles protéines qui, selon nos données in vitro, semblent contrôler la réponse inflammatoire déclenchée par les récepteurs aux immunoglobulines. Sachant que la réponse inflammatoire déclenchée par les récepteurs aux immunoglobulines est à la base de la physiopathologie de maladies graves telles que l'arthrite (inflammation invalidante des articulations), le lupus (inflammation de la peau et de plusieurs organes, en principal le rein) et les allergies (dont la forme très sévère est le choc anaphylactique), la compréhension des facteurs qui contrôlent cette réponse inflammatoire est un véritable défi pour la science fondamentale et la médecine. Nous disposons de résultats obtenus in vitro, sur des lignées cellulaires, qui démontrent que ces deux nouvelles protéines sont impliquées dans ces réactions inflammatoires, mais le seul moyen d'étudier leur rôle dans le contexte complexe de la maladie est d'utiliser un modèle animal. Suite aux expériences in vivo proposées dans ce projet, sur trois modèles de maladies inflammatoires, nous aurons des preuves solides de l'implication de ces molécules dans la pathologie, et pourrons à l'avenir développer des projets visant à utiliser ces molécules comme cibles thérapeutiques dans ces maladies.

Procédures

Les souris auront un seul prélèvement de 3 mm du bout de la queue pour les identifier. En ce qui concerne l’arthrite, les souris auront le jour 1, une injection intraveineuse d’anticorps anti-Collagène dans la veine de la queue et le jour 4 une injection intrapéritonéale d’une substance inflammatoire (LPS). Aucun prélèvement sera effectué sur l’animal vivant dans l’étude de l’arthrite. En ce qui concerne le lupus, les souris auront une injection intrapéritonéale d’une substance inflammatoire (pristane) et un prélèvement des urines sera réalisé à partir de la semaine 20 tous les semaines. Pour l’étude de l’allergie grave nommée choc anaphylactique, les souris auront : le jour 1, une injection intrapéritonéale des anticorps anti-lapin ; le jour 6, un placement dans la peau d’une sonde de mesure de la température (sous anesthésie isoflurane) et le jour 7, une injection intraveineuse dans la veine de la queue des anticorps anti-lapin.

Impact sur les animaux

Le modèle d'arthrite peut provoquer une inflammation aiguë des articulations, avec gonflement, rougeur et probablement douleur. Le modèle de choc anaphylactique provoque une baisse de la température corporelle, tandis que le modèle de lupus provoque une atteinte rénale.

Devenir

La totalité des animaux seront euthanasiés. Il n'est pas possible de les réutiliser car nous avons besoin d'analyser leurs organes post-mortem (articulations, reins, organes lymphoides, sang et plasma).

Remplacement

Nous avons développé des lignées cellulaires qui sur-expriment les différentes molécules que nous allons étudier dans le cadre de l’activation des cellules par les anticorps. Ces lignées vont permettre d'étudier le rôle de ces molécules dans la régulation de l'inflammation lors de ces maladies. Cependant, pour étudier le rôle de ces molécules dans l’induction de l’inflammation dans un contexte physiologique, nous aurons besoin d'un modèle animal puisqu’aucun autre modèle (cellulaire) ne permet aujourd’hui d'évaluer le niveau de la destruction de l’articulation lors de l’arthrite ou des insuffisances rénales lors du lupus (maladie inflammatoire), ou encore, le risque vital lors d’une réaction anaphylactique (la forme la plus grave de l'allergie).

Réduction

Les études déjà réalisées au sein de notre laboratoire nous ont permis d’optimiser le nombre d’animaux minimum permettant l’exploitation de résultats statistiquement valables. Les modèle que nous allons utiliser sont : le modèle d’arthrite, le modèle de lupus (maladie inflammatoire) et le modèle d’anaphylaxie (allergie grave). Selon la littérature, le taux de mortalité dans ces modèles chez la souris est nul et le phénotype de l’ensemble des animaux utilisés dans ce projet est non dommageable.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des portoirs ventilés, 5 individus par cage. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec 1 tube, des cotons et du kraft. Une anesthésie sera effectuée lors du placement en sous-cutanée de la sonde de température pour le modèle d'allergie nommé anaphylaxie et l'utilisation d'antalgiques sera systématique si l'animal présente des signes de douleur (articulations rouges, très gonflés, diminution des deéplacements) au cours de l'expérimentation dans le modèle d’arthrite. Les souris seront surveillées chaque jour. Les signes extérieurs de souffrance (perte de poids par rapport au groupe contrôle, prostration, poil hérissé) seront les critères de point limites à partir desquels nous procéderons à l'euthanasie de l'animal. Les souris sont suivies chaque jour.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent pour étudier et comprendre l'évolution des maladies auto-immunes et inflammatoires chez l'homme. Pour permettre le développement et l'étude des maladies médiées par les anticorps chez la souris, nous injecterons des anticorps spécifiques dans les modèles d'arthrite et d'anaphylaxie (forme grave d'allergie). Pour le modèle de lupus (maladie inflammatoire grave) nous utilisons l'injection d'une substance pro-inflammatoire. Ces méthodes, bien établies, nous permettent d'étudier le rôle des molécules que nous avons découvert sans avoir à croiser des souris déficientes pour ces molécules avec des souris qui développent spontanément les maladies étudiées. Ce point nous semble très important pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Les trois types de maladies que nous étudions se développent chez l’homme à l’âge adulte. En conséquence, les souris seront utilisées entre 2 et 4 mois, un âge qui est équivalent à l’âge adulte chez l’humain.

Pour savoir si une protéine visée par des traitements anticancéreux modifie la migration des cellules immunitaires, 496 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. 400 d'entre elles subissent un prélèvement de la queue sous anesthésie pour le génotypage, 96 reçoivent une peinture fluorescente à l'aine et 96 une injection dans le coussinet plantaire avant la mise à mort et le prélèvement des ganglions. Le porteur précise que les animaux maintenus en élevage échappent à cette mise à mort, les autres étant tués à la fin des trois procédures. Il indique n'attendre aucun effet indésirable de la délétion génétique, reconnaît que manipulations et pesées sont des sources d'angoisse, et qualifie le modèle murin d'"incontournable".

Objectifs

Ce projet vise à déterminer le rôle d’une protéine cible des cellules cancéreuse, PTK7 chez les cellules immunitaires en utilisant un modèle de souris in vivo. Cette protéine a largement été étudiée chez l’homme dans les tissus normaux et cancéreux. Elle est importante pour le développement embryonnaire ainsi que pour le maintien de l’homéostasie des adultes. Sa présence, augmentée dans les cancers est de mauvais pronostic, ce qui fait de PTK7 une cible thérapeutique dans plusieurs essais cliniques. Récemment, PTK7 a été observé dans certaines cellules du système immunitaire : les cellules dendritiques. Cependant, le rôle de cette protéine dans ces cellules et l’impact que pourrait générer les thérapies visant PTK7 dans les cancers reste inconnu. Afin d'étudier ce rôle et dans l’impossibilité d’accéder à des échantillons issus de prélèvements invasifs chez l'homme, l’utilisation d’un modèle animal est cruciale pour répondre à nos questions scientifiques. Nous allons développer un modèle unique de souris dans lequel la protéine PTK7 est éliminée des cellules dendritiques. Nous allons plus spécifiquement étudier l’impact de la perte de PTK7 dans la migration de ces cellules, la migration étant essentielle pour déclencher une réponse immunitaire anti-cancéreuse.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra d'établir pour la première fois si la perte de la protéine PTK7 à la surface des cellules dendritiques altère leurs capacités migratoires in vivo et ainsi de mieux comprendre la biologie de ces cellules et l’impact que les thérapies ciblant PTK7 pourrait avoir dans la réponse anti-cancéreuse. Elle pourrait permettre d’anticiper d’éventuels effets secondaires des thérapies ciblant PTK7 dans le cancer.

Procédures

Les animaux en élevage seront soumis, sous anesthésie gazeuse, au prélèvement d’une biopsie caudale afin de réaliser le génotypage, cela concernera 400 animaux. Dans les expériences de migration des cellules dendritiques, une solution de peinture fluorescente sera appliquée au niveau de l’aine des souris sous anesthésie gazeuse, elles seront ensuite surveillées quotidiennement jusqu’aux prélèvements des ganglions et de la peau après mise à mort par les procédures règlementaires, cela concernera 96 animaux issus de l’élevage. Dans les expériences de migration par compétition, un mélange de cellules dendritiques dans un volume faible sera injecté dans le coussinet plantaire d’une seule patte arrière des souris sous anesthésie gazeuse suivie d’une analgésie préventive, elles seront ensuite surveillées 2 et 4 heures après l'injection jusqu’aux prélèvements des ganglions après mise à mort par les procédures règlementaires 14 heures après. Cela concernera 96 animaux. Les différentes interventions ne sont pas invasives et dureront chacune 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les souris qui vont être utilisées dans ce projet portent une délétion du gène PTK7 restreinte à une sous population de cellules immunitaires. Nous n’attendons pas de phénotype avec des effets indésirables chez les animaux issus de ces croisements. L'anesthésie, le prélèvement pour génotypage et les administrations de réactifs constitueront une nuisance pour les animaux. De même, les manipulations et pesées seront des sources d'angoisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des 3 procédures pour prélèvement à l’exception des animaux en élevage.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer l’impact de la protéine PTK7 dans la migration de cellules immunitaires in vivo, ce qui n’est pas faisable chez l’Homme. Les techniques de migration in vitro existent mais elles ne remplacent pas le contexte physiologique c’est-à-dire la migration des cellules immunitaires à travers les vaisseaux lymphatiques. Par sa similarité avec le système immunitaire humain et sa manipulation génétique, l’utilisation du modèle murin reste incontournable.

Réduction

Afin d'éviter l'utilisation d’un grand nombre de souris, nous avons mis en place un modèle in vitro de culture de cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse. Ce modèle a l'avantage de générer des millions de cellules dendritiques à partir d'une seule souris contrairement au modèle ex vivo où nous en obtenons 100 fois moins. Nous avons confirmé que la protéine PTK7 est bien exprimée par les cellules dendritiques issues de ces cultures, nous pourrons donc les utiliser et ainsi réduire l'utilisation de cellules isolées ex vivo provenant des souris.

Raffinement

Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales d’induction de l’inflammation et d’injection sous-cutanée dans les coussinets seront réalisées sous anesthésie, une analgésie et un suivi seront mis en place. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

La protéine tyrosine kinase PTK7 et son rôle dans le développement embryonnaire et dans les cancers (sein, colon et poumon) ont été largement étudiés chez les cellules normales et cancéreuses. PTK7 a été observé dans les cellules dendritiques présentatrices d’antigènes du système immunitaire mais son rôle reste complétement inconnu. Le modèle de souris déficientes en PTK7 et conditionné aux cellules dendritiques nous permettra d'étudier in vivo l’impact de la perte de PTK7 dans la migration, une des fonctions principales de ces cellules. Le système immunitaire est présent uniquement chez les vertébrés et en particulier, les cellules dendritiques humaines et murines sont équivalentes. La taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique font aussi que la souris est l’espèce la plus appropriée pour notre étude. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux de la naissance à l'âge adulte pour l'évaluation et le maintien de la lignée puis à l’âge adulte (8-12 semaines) car le système immunitaire est mature à cet âge.

Pour étudier l'effet d'une carence en fer sur la réponse immunitaire, 150 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, 75 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 75 d'un niveau modéré. Soixante-quinze reçoivent un régime pauvre en fer pendant 8 à 12 semaines, avec des effets que le porteur rapproche de la dénutrition : arrêt de la croissance, perte de poids, fatigabilité, perte de poils, sensibilité accrue aux infections. Une ponction dans la veine mandibulaire est pratiquée sous anesthésie sur 75 animaux. Le porteur affirme qu'aucun modèle ne remplace l'animal pour obtenir une carence sans anémie comparable à celle observée chez l'humain, et annonce la congélation des organes non utilisés pour des expériences ultérieures.

Objectifs

La carence martiale, aussi appelée carence en fer, est une condition médicale caractérisée par un manque de fer dans le corps. Le fer est un élément essentiel à la production de l'hémoglobine, une protéine présente dans les globules rouges qui transporte l'oxygène dans tout le corps. Lorsqu'il y a une insuffisance de fer, la capacité du sang à transporter l'oxygène est réduite, ce qui peut entraîner une fatigue, une faiblesse et d'autres symptômes liés à un apport insuffisant en oxygène dans les tissus du corps. La carence martiale est très fréquente dans la population générale et notamment en contexte péri-opératoire (40 à 50%). Elle est associée à une morbidité et une mortalité péri-opératoire importantes, indépendamment de la présence d’une anémie associée. Elle pourrait également être associée à un taux d’infections post-opératoires plus important. Cependant, la physiopathologie de l’augmentation du risque infectieux en cas de carence martiale n’a pas encore été mise en évidence. Ce projet de recherche s’intéresse donc à étudier l’impact de la carence martiale sur la réponse immunitaire cellulaire et humorale. Notre objectif est d’explorer la réponse immunitaire dans un modèle de carence martiale sans anémie. Les résultats pourraient permettre de mieux comprendre l’impact du métabolisme du fer et notamment de la carence en fer sur l’immunité cellulaire notamment au niveau des cellules appelées « macrophages ». Deux modalités du modèle de carence martiale sans anémie seront étudiées : une carence « courte » de 8 semaines et une carence « longue » de 12 semaines. L’hypothèse est que l’impact sur le système immunitaire pourrait-être plus important dans le groupe carence « longue ». Ces résultats viendront compléter ceux déjà obtenus par notre équipe avec un modèle murin d’infection chez des souris carencées en fer. S'il y a une différence, il pourra être intéressant de regarder si la supplémentation permet de restaurer les fonctions immunitaires. De plus, si les résultats obtenus sont en faveur d’une altération des fonctions immunitaires de l’organisme chez les individus carencés en fer, cela aboutira à des projets de recherche clinique sur l’homme afin de vérifier que la carence martiale altère également la réponse immunitaire en contexte clinique et d’évaluer l’intérêt de sa correction.

Bénéfices attendus

Ces résultats viendront compléter ceux déjà obtenus sur notre modèle murin de sepsis chez des animaux carencés en fer non anémiés précédemment décrit. S'il y a une différence, il pourra être intéressant de regarder si la supplémentation permet de restaurer les fonctions immunitaires. De plus, si les résultats obtenus sont en faveur d’une diminution de la défense immunitaire de l’organisme chez les individus carencés, cette étude pourra se poursuivre sur le modèle de carence « longue » plus pertinent avant d’envisager des projets de recherche clinique étudiant l’impact de la carence martiale chez l’homme et l’intérêt de sa correction.L’ensemble des organes non utilisés en post -mortem immédiat seront congelés, notamment les poumons, pour des expérimentations ultérieures.

Procédures

1) Régime pauvre en fer : 8 à 12 semaines, 75 animaux concernés 2) Ponction mandibulaire : sous anesthésie, durée de 5-10 min, une fois sur 75 animaux

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus pour le régime pauvre en fer seront apparentés à ceux retrouver lors d’un état de dénutrition : diminution de la croissance, absence de prise de poids, perte de poids, fatigabilité plus importante de l’animal qu’un sujet non carencé, perte de poils, susceptibilité aux infections. Les effets indésirables attenus pour la ponction veineux mandibulaire pouvant survenir seront des douleurs post-procédures pour lesquelles une analgésie adéquate pourra être administrée, un défaut de cicatrisation.

Devenir

Les procédures de ponction veineux mandibulaire et de régime carencé ne necessiteront pas la mise à mort de l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies aux normes suivant leur âge et leur poids. Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel . La mise à mort concernera tous les individus à la fin de la procédure expérimentale . Les prélèvements d’organes et sanguins se feront immédiatement après la mise à mort de l'animal.

Remplacement

Nous ne pouvons nous affranchir de l’utilisation d’animaux pour ce projet qui a comme objectif d’évaluer le retentissement de la carence martiale indépendamment de l’anémie sur l’immunité. Il nécessite donc d’obtenir un modèle de carence martiale sans anémie aisément reproductible et comparable à la carence martiale sans anémie observée chez l’homme. Un animal est nécessaire pour obtenir ce modèle et la souris est un bon animal pour obtenir aisément ce modèle qui a déjà été décrit ; et réaliser des prélèvements biologiques. Les procédures expérimentales à réaliser dans notre projet ne peuvent pas être réalisées sans l’utilisation d’animaux vivants puisqu’elles font appel à des prélèvements biologiques et des biopsies d’organes.

Réduction

Devant le bon déroulement de la cytométrie et sa reproductibilité une série de 150 animaux est donc nécessaire pour mener à bien ces analyses et pouvoir en interpréter les résultats. Ce nombre de sujet nécessaire a été calculé selon epiR 1.0.4 basé sur des données préliminaires. Pour une puissance de 80% et un risque de première espèce de 5% dans le cadre d’un test unilatéral.

Raffinement

Les souris auront libre-accès à l’eau et à une alimentation adaptée. Toutes les cages seront munies d’une cachette et leur milieu sera enrichi. Une grille d’évaluation pour la surveillance des points limite a été établie. La ponction mandibulaire sera réalisée sous anesthésie générale. La mise à mort des animaux se fera en dehors des locaux d’hébergement. Les animaux anesthésiéssédatés seront surveillés étroitement à l’aide de leur fréquence respiratoire, de leur mécanique ventilatoire, la température sera monitorée et ils seront réchauffés à l’aide d’un tapis chauffant puis dans une enceinte chauffée pendant une à deux heures, jusqu’à leur récupération totale.

Choix des espèces

La souris, notamment C57BL/6J, est un animal largement étudié et utilisé comme modèle d’étude de pathologies humaines. Elle présente de nombreux avantages tels qu’une courte durée de vie, un coût modeste et de nombreuses similitudes avec l’homme. Par ailleurs, la souris C57BL/6J est un animal déjà utilisé dans des études expérimentales explorant le métabolisme du fer, un modèle de carence martiale sans anémie, ainsi que pour l’utilisation d’un traitement martial. Les souris seront âgées de 16 à 22 semaines (adultes) afin d’éviter les effets liés au changements hormonaux et à la période de croissance. Par ailleurs, le métabolisme du fer a déjà été étudié chez des souris de cet âge.