Système immunitaire

Pour savoir si un additif alimentaire nanoparticulaire déclenche l'allergie à l'œuf, 360 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. Chacune subit quatre prises de sang et quatre prélèvements de selles, et 240 d'entre elles reçoivent trois injections intrapéritonéales de sensibilisation avant un gavage destiné à déclencher la réaction allergique. Le porteur indique que des symptômes d'anaphylaxie peuvent apparaître dans la demi-heure suivant le gavage et persister une trentaine de minutes, avec chute de la température corporelle mesurée par voie rectale. Il compare la forme en aiguilles des particules de phosphate tricalcique aux fibres d'amiante dans les poumons, tout en rappelant que cet additif entre dans les préparations infantiles.

Objectifs

L’augmentation de la prévalence des allergies alimentaires observée depuis une vingtaine d’année coïncide avec l’augmentation de la consommation d’aliments ultra-transformés. Parmi les aliments ultra-transformés, on trouve ceux contenant des additifs alimentaires, dont le risque de déclencher des réactions allergiques commence à être évoqué pour ceux contenant des nanoparticules. L’un de ces additifs, le phosphate de calcium, contient 100% de nanoparticules et se présente sous la forme d’hydroxyapatite. Il a servi pendant plusieurs années de support à des vaccins comme adjuvant pour amplifier la réponse immune et est actuellement employé dans les préparations infantiles pour augmenter l’apport en calcium. Le projet vise à identifier comment cet additif alimentaire, reconnu comme un nanomatériau et incorporé dans les formulations alimentaires pour équilibrer l’apport en phosphate et calcium, peut conduire à des désordres immunitaires via sa capacité à stimuler le système immunitaire et/ou son affinité pour des protéines identifiées comme allergène (ici le lysozyme).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme d’action d’un additif alimentaire, le phosphate tricalcique dans l’allergie à l’œuf (via le lysozyme). Par la comparaison des différents paramètres mesurés, le protocole répondra aux hypothèses mécanistiques formulées suivant la bibliographie, à savoir : 1) Le phosphate tricalcique (E341) participe à la sensibilisation et au déclenchement de l’allergie alimentaire en favorisant l’exposition des épitopes et/ou limitant la dégradabilité des protéines dans le tractus gastro-intestinal. Ce mécanisme est basé sur les grandes capacités d’adsorption du phosphate tricalcique pour les protéines dont les allergènes. 2) Les particules de phosphate tricalcique (E341), de par leur forme en aiguilles pointues, irritent mécaniquement la barrière intestinale (à la manière des fibres d’amiante dans les poumons), la rendant perméable et facilitant le passage d’allergènes dans l’organisme, auquel le système immunitaire réagit en produisant des anticorps.

Procédures

Lors de ce protocole, toutes les souris subiront 4 prélèvements de selles et 4 prises de sang espacées d’une semaine au minimum, une juste après l’acclimatation, une avant la sensibilisation 1 = S1, une avant la sensibilisation 2 =S2 et une avant la sensibilisation 3 =S3. Les groupes sensibilisés soit 120 souris par sexe subiront 3 Injections intrapéritonéales à 1 semaine d’intervalle (S1, S2, S3), puis toutes les souris, soit 360, subiront 1 gavage oral.

Impact sur les animaux

La sensibilisation par voie intrapéritonéale et la phase de déclenchement de l’allergie alimentaire peuvent contribuer à des nuisances. Lors de l’injection intrapéritonéale une légère douleur passagère peut être ressentie au point d'injection. Une baisse de la température corporelle des animaux est également observée quand l’animal déclenche une réaction allergique. Les souris pourraient ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration de l’allergène par gavage. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris. Aussi, des symptômes caractéristiques de l’anaphylaxie peuvent être observés. Généralement, les effets surviennent entre 0 et 30 minutes après le gavage pour déclencher la réaction allergique et peuvent persister pendant une trentaine de minutes. Lors de la prise de sang à la queue une irritation passagère à la queue peut être ressentie.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et de la fonction gastro-intestinale.

Remplacement

Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les phénomènes intervenant à la fois sur le système immunitaire et la physiologie. Pour étudier le mécanisme de la réponse allergique, le modèle in vivo est donc actuellement le seul adapté.

Réduction

Sur la base d’une étude menée récemment au laboratoire, le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement exploitables sur les immunoglobines IgG conduit à utiliser des groupes de 30 souris chacun.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi des signes généraux et le suivi des points limites sont effectués au quotidien afin de minimiser l’inconfort et la douleur. L’eau et la nourriture seront mises à volonté dans les cages.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris mâles et femelles. Le modèle murin est reconnu dans le cadre des études du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette espèce. De plus, nos modèles d’allergie ont été établis sur cette espèce. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de ces souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les souris utilisées auront 3 semaines de vie à réception, 5 semaines de vie au début du protocole d’exposition, puis 7 semaines à la première sensibilisation, 10 semaines au moment du gavage oral et de la mise à mort.

Pour tester des nanoparticules poreuses censées porter des gaz et des médicaments jusqu'aux tumeurs, 1 692 souris et 504 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous mis à mort pour prélever leurs organes. Une partie reçoit une implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis trois séances d'irradiation de 4 Gy et des injections intraveineuses trois jours de suite. Le porteur s'attend à une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux porteurs d'une tumeur cérébrale, ainsi qu'à une dégradation de l'état général jusqu'à une semaine après l'irradiation du crâne, avec pelades sur la tête et sécrétions au museau. Il justifie le projet par le "besoin d'améliorer" des thérapies dont il constate le manque d'efficacité, et présente le nombre annoncé comme un maximum susceptible d'être réduit si les seuils statistiques sont atteints plus tôt.

Objectifs

Ce projet a pour but de caractériser l’intérêt de nanoparticules (NPs) poreuses comme vecteur de thérapies (gazeuses et médicamenteuses) pour les tumeurs hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels. En effet, un meilleur ciblage de la tumeur par ces NPs permettrait d’améliorer l’efficacité des traitements actuels tels que la radiothérapie (RT), les chimiothérapies (CT) ou encore les immunothérapies (IT). Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, les thérapies actuelles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles en utilisant comme vecteur des NPs qui ont montré, par nos études précédentes, leur capacité à s’accumuler dans la tumeur tout en préservant le tissu sain environnant .

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal. - Injection intraveineuse de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des NPs (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des CT ou IT (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de buprénorphine (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux et 3 fois pour les animaux avec des tumeurs cérébrales qui auront deux injections supplémentaires en péri-opératoire ; 2 minutes maximum par animal.

Impact sur les animaux

Parmi les procédures expérimentales, les injections intraveineuses (cellules tumorales, NP, CT ou IT) ou les injections sous-cutanées effectuées sur un animal vigile peuvent causer un stress à l'animal lors de l'intervention, ce qui peut être considéré comme une nuisance légère. De plus, au regard de l’expérience du laboratoire concernant les différentes procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir des effets indésirable modérés avec une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur cérébrale. Également, sur ces modèles de tumeur cérébrale, nous nous attendons à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et à la réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures NPs (taille, aspect de toxicité, oxygénation) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive et des modèles de tumeur sous-cutanés se conforment à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Toutefois, dans tous les protocoles d’imagerie, d’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, non sans risque pour l’animal. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants, et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculés est un nombre maximal. En effet, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage et 3 à 2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation de 7 jours minimum avant toutes expérimentations et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Pour les animaux immunodéprimé, la procédure est identique à l’exception de l’hébergement. En effet, les animaux sont placés dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques, ces deniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiée à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie.

Choix des espèces

La souris et le rat immunodéprimés sont des espèces de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Notre expertise des différents modèles de tumeurs cérébrales, nous a permis d’établir que suivant le type cellulaire, nous obtenons des tumeurs plus ou moins hypoxiques et plus ou moins vascularisés (Corroyer-Dulmont et al., Biol Chem. 2013). Ces deux composantes, influençant la croissance tumorale et l’efficacité des traitements actuels, il est nécessaire de travailler avec ces différents modèles in vivo, afin de se rapprocher de la situation clinique. Lorsque les cellules tumorales (cérébrales et pulmonaires) sont d’origine murine (issues de souris C57Bl/6) alors nous pouvons utiliser des animaux immuno-compétents de même souche (souris C57Bl/6) dans ce projet afin de prendre en compte l’ensemble du système immunitaire et le contexte inflammatoire du micro-environnement étudié et connus pour participer à la réponse aux traitements. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, mâles et femelles, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.

Greffées avec des cellules de lymphome par voie intraveineuse ou sous-cutanée, 1100 souris seront toutes tuées pour prélever leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les cellules injectées forment des tumeurs dans plusieurs organes, ce qu'il décrit comme une source de souffrance pour l'animal. L'objectif est de comprendre l'activation et l'épuisement des cellules Natural Killer face à une tumeur. Les retombées pour la santé humaine restent au conditionnel, des résultats qui "pourraient à terme" mener à des développements.

Objectifs

Les cellules Natural Killer (NK) sont des cellules immunitaires spécialisées dans la lutte anti-tumorales. Lors du développement d'un cancer, après une phase d’activation au cours de laquelle les cellules NK éliminent les cellules tumorales, la persistance de la tumeur épuise les cellules NK et les rend inefficaces. Cet état d'épuisement conduit à une perte du contrôle sur la tumeur et à une reprise de la pousse tumorale. De nombreuses questions non-résolues subsistent sur le mode de régulation précis de ces deux phases (activation et épuisement). L'objectif de ce projet est de mieux comprendre cette régulation au cours de la réponse anti-tumorale. Pour cela, nous utiliserons un modèle tumoral chez la souris. Ce modèle est basé sur 2 lignées de lymphomes. Ces 2 lignées tumorales seront greffées à des souris normales ou déficientes dans les cellules NK uniquement pour les protéines que nous souhaitons étudier. Nous évaluerons l'impact de la déficience en chacune de ces protéines sur 1) la survie des souris suite à la greffe des cellules tumorales et 2) sur l’activation et l’épuisement des cellules NK.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir la régulation de l’activité anti-tumorale des cellules Natural Killer. Etant donné le rôle de ces cellules dans la réponse anti-tumorale, ces résultats pourraient à terme conduire à des développements en santé humaine.

Procédures

Les animaux seront greffés avec les cellules tumorales par injection intraveineuse dans la veine de la queue (1 injection par souris, 2 minutes) ou par injection sous-cutanée dans le flanc (1 injection par souris, 2 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle est bien caractérisé, ce qui nous permet de prédire les jours auxquels nous obtiendrons des cellules activées ou épuisées tout en limitant la souffrance des animaux. Lors d'une injection intraveineuse, les cellules injectées forment des tumeurs dans plusieurs organes, ce qui est source de souffrance pour l'animal. En ce qui concerne la voie d’injection sous-cutanée, la pousse de la masse tumorale sur le flanc est source d’inconfort pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue d'effectuer des prélèvements d'organe (rate) post-mortem afin d'effectuer des analyses phénotypiques et fonctionnelles des cellules Natural Killer.

Remplacement

Des expériences préliminaires en culture sur des cellules NK rendues déficientes pour les différents gènes testés dans ce projet ont été effectuées. Elles ont mis en évidence l'implication claire de ces gènes au cours de l’activation en culture. Ces modèles expérimentaux sont cependant limités, ne reproduisant qu’imparfaitement les conditions rencontrées dans un organisme, notamment la survenue de l’épuisement. Il nous est donc maintenant nécessaire de mettre en place un modèle animal.

Réduction

L'âge des souris utilisées étant assez étendu et leur sexe indifférent, tous les animaux produits dans notre établissement seront utilisés, évitant ainsi la mise à mort d'animaux inutiles. Nous utiliserons des méthodes d'analyses de pointe permettant de réaliser de multiples analyses et cela sur les cellules d’un même animal. Cela permettra ainsi d'optimiser l'utilisation des animaux. Lorsque cela est possible, la comparaison au sein d’une seule expérience des différentes lignées de souris testées permettra de réduire 1) le nombre de souris utilisées et 2) la variation expérimentale inhérente à la réalisation d’expériences indépendantes.

Raffinement

Le modèle est bien caractérisé, ce qui nous permet de prédire les jours auxquels nous obtiendrons des cellules Natural Killer activées ou épuisées tout en limitant la souffrance des animaux. D'autre part, nous nous baserons sur l'apparition d'une gêne des fonctions locomotrices postérieures due à la pousse tumorale dans la moelle osseuse. Ce signe précoce précède la dégradation de l'état général de l'animal. En cas d'apparition de ce signe sur un animal avant le jour prévu de mise à mort, tout le groupe sera mis à mort. Les groupes étant très homogènes, un tel mode opératoire nous permet d'obtenir des données interprétables et donc de réduire la variation intra-expérience. Enfin, afin de parer à toute éventualité, les expérimentateurs se tiendront prêts à réaliser l'expérience les jours précédant la mise à mort. Des visites seront effectuées tous les trois jours après la première semaine puis une surveillance accrue, visite matin et soir, sera réalisée les 3 jours précédents les dernières dates de mise à mort des animaux dans le but d'anticiper le moindre signe de souffrance. Enfin, des croquettes humidifiées seront placées dans la cage afin de faciliter l'accès des animaux à la nourriture. Des points limites prédictifs de la pousse tumorales ont été établis. Si une souris présente un des ces points limites, l’ensemble du groupe sera mis à mort pour analyse.

Choix des espèces

Les cellules Natural Killer ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris âgées de 8 à 28 semaines seront utilisées. En effet, c'est à partir de l'âge de 8 semaine que les souris ont un système immunitaire mature. D'autre part, la réponse anti-tumorale ne varie pas sur la tranche d'âge considérée. Nous utiliserons de cette façon tous les animaux produits, évitant ainsi la mise à mort d'animaux inutiles.

198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intradermiques de cellules tumorales au flanc, développent une tumeur locale et d'éventuelles métastases dans les ganglions, une partie recevant ensuite neuf injections intrapéritonéales sur trois semaines. Le projet cherche à préciser le rôle d'un facteur immunitaire dans le carcinome épidermoïde cutané et à repérer des cibles thérapeutiques. Le porteur renvoie les retombées cliniques au conditionnel, un blocage qui "pourrait" améliorer la survie des patients.

Objectifs

Le carcinome épidermoïde cutané est le deuxième cancer cutané le plus fréquent. Ce cancer est facilement traitable lorsqu’il est localisé, mais il a cependant un potentiel agressif et peut être responsable de métastases qui peuvent entrainer le décès. Les principaux facteurs de risque de survenue de ce cancer cutané sont l’âge et l’exposition chronique au soleil. Il est d’ailleurs plus fréquent et agressif en cas d’immunodépression, ce qui souligne le rôle du système immunitaire pour contrôler le développement du cancer. Comme dans de nombreux cancers, les cellules tumorales ont la capacité d’endormir le système immunitaire pour échapper à son contrôle. L’immunothérapie antitumorale fait partie des nouvelles stratégies pour restaurer une réponse immunitaire. Cependant, tous les patients ne répondent pas à ce traitement et une meilleure connaissance des cellules et molécules qui bloquent le système immunitaire et qui favorisent la progression tumorale est nécessaire. Le projet vise donc à déterminer ces facteurs, dans le but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous nous intéressons en particulier à un facteur produit par les cellules de la peau. Ce facteur est connu pour être associé à un mauvais pronostic dans certains cancers, notamment le cancer du pancréas ou le cancer du sein. Nous émettons l’hypothèse que ce facteur pourrait modifier la réponse du système immunitaire dans le carcinome épidermoïde cutané et favoriser sa croissance.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les signaux et cellules impliqués dans la réponse du système immunitaire contre le carcinome épidermoïde. Ceci permettra l’identification de potentielles cibles thérapeutiques, lesquelles seront testées pour déterminer si leur blocage pourrait être un traitement potentiel en clinique pour améliorer la qualité de vie et survie des patients.

Procédures

Lors de la première et deuxième procédure, 126 souris seront anesthésiées et injectées par voie intradermique avec des cellules tumorales (durée : 6 min par souris). Lors de la troisième procédure, 72 souris seront anesthésiées et injectées par voie intradermique avec des cellules tumorales (durée : 6 min par souris). Par la suite, ces 72 souris seront injectées par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines (durée : 10 secondes x 9 injections = 1 minute 30). La durée totale des actes par souris lors de la troisième procédure par souris est de 7 minutes 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux injectés avec des cellules tumorales par voie intradermique au niveau du flanc développeront une tumeur au niveau local et d’éventuelles métastases au niveau des ganglions lymphatiques drainant le flanc. Un suivi rigoureux du comportement, de la vivacité de tous les animaux sera effectué. Ainsi, tout signe de souffrance, de stress ou d’angoisse de l’animal provoquera son exclusion de l’étude. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour analyser la croissance tumorale et la réponse immunitaire au niveau des ganglions lymphatiques et de la tumeur.

Remplacement

L’étude de la réponse immunitaire met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l’utilisation d’expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de progression tumorale.

Réduction

Le protocole sera appliqué à un maximum de 198 souris. Ces souris seront utilisées afin d’étudier le rôle du facteur étudié dans la progression tumorale. Le nombre de souris a été estimé de façon à pouvoir détecter des différences significatives dans la croissance de la tumeur ou dans la réponse cellulaire immunitaire contre la tumeur (nombre de cellules immunitaires au sein de la tumeur).

Raffinement

La greffe tumorale par le biais d’injection intradermique et la prise de photos nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la progression tumorale (prise de photos, mesure de la taille de la tumeur) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Des points limites, précis et gradés pour chacune des procédures expérimentales ont été définis. Si un animal atteint les points limites établis, il sera retiré de l’étude et euthanasié.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte tumoral met en jeu différents organes comme la peau et les ganglions lymphatiques, rendant nécessaire l’utilisation d’expériences in vivo pour comprendre cette réaction. Le modèle animal choisi pour étudier le CEC est la souris, car son système immunitaire est proche de celui de l’Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. De plus, la peau des souris présente des similitudes avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l’étude du CEC. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d’étudier le système immunitaire à l’âge adulte.

300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles gardées pour l'élevage et les croisements restant en vie, les autres mises à mort pour prélever rate, moelle osseuse et reins. Porteuses d'une mutation reproduisant un lupus humain, elles peuvent développer perte de poids, insuffisance rénale, dermite avec plaies et douleurs articulaires, et subissent des prélèvements sanguins mensuels sous anesthésie à l'isoflurane, dont le porteur reconnaît le caractère aversif. La protéinurie est mesurée chaque semaine pour suivre les points limites. Sur le remplacement, le porteur affirme devoir recourir à un "modèle entier" et à un "organisme entier" pour étudier la production d'auto-anticorps, et juge la souris appropriée.

Objectifs

Ce projet repose sur l'étude d'une mutation décrite chez une patiente atteinte d'un lupus érythémateux systémique. Un modèle murin reproduisant cette mutation a été récemment créé sur fond C57BL/6J, et décrit dans la littérature. Cette souris présente une survie réduite, une autoimmunité avec une augmentation des lymphocytes B et une production d’auto-anticorps (notamment des anticorps anti-nucléaires). Nous souhaitons étudier en détail le phénotype des lymphocytes B à l’origine de la production des autoanticorps pathogènes. Ce projet n'a pas fait l’objet d'une évaluation par d'autres instances mais repose sur une question scientifique non résolue à ce jour et dont les réponses pourraient bénéficier aux patients.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de mieux comprendre comment cette mutation génétique peut conduire à une perte de contrôle de la production d’autoanticorps dans une maladie autoimmune sévère telle que le lupus. Les TLR sont des récepteurs de l’immunité qui ont été impliqués dans la maladie lupique dans la littérature, mais les mécanismes de leur implication sont encore mal connus. Ainsi ces résultats pourraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients, à moyen/long terme.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins mensuels, sous anesthésie. Des prélèvements (rate, moelle osseuse, reins) seront effectués sur les animaux en fin de procédure après mise à mort. La protéinurie sera mesurée sur un prélèvement d'urine toutes les semaines, pour l'évaluation des points limites.

Impact sur les animaux

Les souris étudiées dans ce projet développent une maladie proche du lupus humain, qui peut causer une perte d'appétit et donc une perte de poids, une insuffissance rénale matérialisée par une augmentation de la protéinurie mesurable à l'aide de bandelettes urinaire. De plus, les animaux peuvent développer une adénopathie associée à une dermite, entrainant une dépilation et le développement de plaies. Le lupus peut également se matérialiser par des douleurs articulaires induisant des difficultés de déplacement et une mise à l'écart du/des individus, un dos voussé. Les prélèvements sanguins peuvent potentiellement générer une anémie (paleur des muqueuses), une respiration plus rapide ainsi qu'une plaie éventuelle au site de prélèvement. Les nuisances liées aux anesthésies répétées sont inhérentes à toute anesthésie (l'anesthésie est cependant ici de courte durée pour un prélèvement sanguin). L'utilisation de l'isoflurane pour l'anesthésie présente un aspect aversif pour la souris, cependant l'anesthésie génère un stress moins important que de réaliser le prélèvement sur un animal vigile.

Devenir

Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle entier afin d'étudier les réponses immunes et la production d'autoanticorps qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été décidée. La pertinence des résultats sera évaluée à l'aide de tests statistiques multiparamétriques de type Anova nécessitant l'analyse de groupes de 8 souris minimum pour chaque question posée. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d'optimiser l'utilisation des différentes portées, nous utiliserons les mâles et les femelles de chaque portée générée.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés dans une animalerie à statut sanitaire propre permettant déviter une infection. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, décrite pour chaque procédure, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites spécifiques.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'autoimmunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations auront un âge de 3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et maximum de 8 mois (âge moyen pour lequel les points limites apparaissent).