Système immunitaire

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales puis jusqu'à trois injections de virus oncolytiques modifiés, avant un prélèvement de tumeurs et d'organes. Le porteur indique surveiller d'éventuels effets auto-immuns et fixe des points limites détaillés, dont une tumeur pouvant atteindre 1000 mm³. Il décrit disposer de cultures en trois dimensions et de puces microfluidiques, mais affirme que l'étude des effets sur "l'organisme entier" impose le recours à l'animal.

Objectifs

Les virus "oncolytiques" sont de nouveaux agents thérapeutiques capables de détruire spécifiquement les cellules tumorales sans attaquer les cellules saines. Deux virus oncolytiques sont actuellement approuvés comme traitements contre le mélanome métastatique (cancer de la peau) et le glioblastome (cancer du cerveau). Les virus oncolytiques présentent trois modes d’actions principaux, à savoir la capacité à 1) tuer directement les cellules tumorales, 2) induire une réponse immunitaire anti-tumorale et 3) vectoriser des protéines thérapeutiques qui seront produites uniquement dans les tumeurs. Cette dernière propriété fait actuellement l’objet de nombreuses recherches au niveau international mais des questions importantes demeurent quant aux protéines à utiliser et aux conditions dans lesquelles les virus doivent être administrés in vivo. Notre projet vise ainsi à étudier, chez la souris immunocompétente, les effets thérapeutiques de virus oncolytiques codant pour différentes protéines impliquées dans la formation de structures lymphoïdes. Ces structures sont constituées de cellules immunitaires et permettent la mise en place de réponses anti-tumorales. Si les virus oncolytiques donnent des résultats très encourageants in vitro, l’évaluation des différents mécanismes impliqués requiert l'utilisation de modèles animaux vivants qui reproduisent la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires associées avant d'envisager un transfert vers la clinique.

Bénéfices attendus

Les efforts réalisés pour comprendre la biologie des tumeurs ainsi que l’amélioration continuelle des traitements tels que la chimiothérapie, la radiothérapie, et plus récemment l’immunothérapie ont déjà permis d’augmenter la survie des patients atteints de cancers. Cependant, dans de nombreux cas ces traitements présentent une efficacité limitée. De nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement très efficaces nécessitent une vectorisation appropriée pour profiter de leur efficacité tout en limitant les effets secondaires. Il a ainsi été montré qu’une vectorisation des agents anti-cancéreux permettait de diminuer la morbidité associée au traitement mais aussi d’en améliorer l’efficacité et de limiter l’établissement d’une résistance dans les cellules tumorales. Ce type de stratégie thérapeutique est d’autant plus intéressant dans le cas de cancers très agressifs pour lesquels nous ne disposons pas encore d’options thérapeutiques satisfaisantes. L’utilisation de virus oncolytiques pour vectoriser des molécules au sein même des tumeurs est une approche innovante destinée à répondre à ces problématiques. En créant de nouveaux virus oncolytiques immunoactivateurs, nous espérons pouvoir apporter des réponses thérapeutiques à des problèmes actuels en cancérologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales puis à des injections intraveineuses, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales répétées de traitements. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 4 injections (1 challenge + 3 traitements) par animal.

Impact sur les animaux

Nous avons préalablement pu vérifier que l’injection de virus oncolytiques aux doses prévues n’entraîne pas de morbidité particulière ou de douleur chez les animaux. Concernant les protéines thérapeutiques codées par ces virus, il s’agit de cytokines et chimiokines connues. Les données de la littérature suggèrent que des effets secondaires auto-immuns pourraient être observés. Une attention particulière sera apportée au suivi de ces effets éventuels (peau, intestin et foie notamment). Chacune des procédures nécessitera la réalisation d'injections intraveineuse, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales qui peuvent être à l'origine d'une douleur légère et générer un stress modéré et ponctuel chez les animaux. Dans toutes les procédures, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra aussi générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélever des échantillons (tumeurs, rate, ganglions, autres tissus) qui serviront à obtenir des données supplémentaires sur ces expérimentations.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. L'approche sur organisme entier nous permet cependant d’évaluer l’effet thérapeutique des virus et de leurs transgènes mais également les effets toxiques potentiels sur divers tissus tels que le compartiment hématopoïétique par exemple. Une telle complexité n’est malheureusement pas encore reproductible in vitro. Dans la mesure où nous souhaitons étudier le ciblage in vivo des cellules tumorales dans un environnement complexe après administration des virus oncolytiques, ces expériences nécessitent d’être réalisées sur l’animal. Nous avons déjà validé la spécificité de nos virus sur un large panel de lignées cellulaires, en 2D et en 3D. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de la biodistribution réelle et des effets systémiques de nos traitements une fois injectés dans un organisme, en particulier les effets immunitaires.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons (n

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en cas d’absence de réponse au traitement ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, poil ébouriffé, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces - Taille de tumeur égale ou supérieure à 1000mm3 •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental

Choix des espèces

L’objectif principal étant d’évaluer les effets immunitaires de nos nouveaux virus oncolytiques, l’utilisation de souris immunocompétentes et de modèles tumoraux syngéniques est essentielle. L’implantation sous-cutanée des cellules tumorales se justifie par le suivi facilité de la croissance tumorale et la comparaison avec les données de la littérature qui utilisent des approches similaires. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature.

564 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La maladie de Sjögren leur est induite, puis elles subissent des injections intrapéritonéales cinq jours de suite, des anesthésies générales répétées pour mesurer la production de salive sur un suivi allant jusqu'à dix mois, et un génotypage par poinçon d'oreille. Le porteur indique que l'induction peut provoquer une sécheresse oculaire et des signes de kératite, et prévoit un prélèvement d'organes terminal. Il affirme que les modèles in vitro ne capturent pas la complexité des interactions cellulaires et justifie par là le recours aux animaux.

Objectifs

Le syndrome de Sjögren (SS) est une maladie auto-immune complexe et chronique qui se caractérise par une inflammation des glandes salivaires et lacrymales, conduisant à une sécheresse notable de la bouche et des yeux. Bien que cette affection ne soit généralement pas mortelle, elle peut avoir un impact significatif sur la qualité de vie des patients en raison des symptômes persistants tels que la sensation de sécheresse, les problèmes oculaires, la fatigue et les douleurs articulaires. Les recherches actuelles, à la fois basées sur nos propres données et la littérature existante, soulignent de manière convaincante l'implication du système immunitaire dans la pathogenèse du syndrome de Sjögren. Il semble que des dysfonctionnements du système immunitaire puissent entraîner des attaques contre les glandes salivaires et lacrymales, provoquant des lésions et compromettant ainsi la production de salive et de larmes. Cette perturbation du fonctionnement des glandes exocrines contribue directement aux symptômes caractéristiques du SS. Dans le cadre de nos objectifs de recherche, nous nous efforçons de mieux comprendre le rôle spécifique du système immunitaire dans le déclenchement et le développement du syndrome de Sjögren.

Bénéfices attendus

À court terme, notre objectif principal est d'approfondir notre compréhension des mécanismes immunologiques sous-jacents au syndrome de Sjögren (SS). En analysant de manière approfondie les réponses immunitaires spécifiques liées aux lésions des glandes salivaires et lacrymales, nous cherchons à élucider les détails moléculaires et cellulaires qui déclenchent et perpétuent cette maladie auto-immune. Cette compréhension approfondie à court terme devrait nous permettre d'identifier de manière plus précise les points faibles du système immunitaire impliqués dans le SS. Ces informations sont cruciales pour orienter nos efforts vers le développement de nouvelles cibles thérapeutiques. En ciblant spécifiquement les mécanismes responsables des lésions glandulaires, nous pourrions concevoir des interventions plus précises et efficaces pour moduler la réponse immunitaire et atténuer les symptômes du SS. À moyen et long terme, notre objectif évoluera vers l'amélioration de la prise en charge et du suivi clinique des patients atteints du syndrome de Sjögren. En utilisant les connaissances acquises sur les mécanismes immunologiques, nous chercherons à développer des outils diagnostiques plus précis et des marqueurs biologiques permettant de surveiller l'évolution de la maladie au fil du temps.

Procédures

Les interventions possibles incluent des injections intraperitoneales de molecules pendant 5 jours consécutifs, réalisées sous anesthésie locale, avec une durée de moins de 5 minutes par animal. Le suivi à long terme de la maladie s'étend jusqu'à 10 mois, avec une évaluation à court terme (12 semaines) et moyen terme (24 - 30 semaines) de l'homéostasie immunitaire dans les glandes salivaires, impliquant des souris sous anesthésie générale par voie gazeuse, sans réveil et de la production de salive (une fois/mois – pour 15 minutes) sous anesthésie générale par voie gazeuse et par voie intrapéritonéale. Une partie des souris sera genotypée par poinçon d'oreille vers 3 semaines d'age.

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'un anesthésique local. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. L'induction de l'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée. L'induction de la maladie pourrait aboutir à de la sécheresse oculaire et signes de kératite comme observé chez l'homme. Le suivi attentif des réponses comportementales et physiologiques permettra de s'assurer que les souris récupèrent de manière optimale après chaque procédure, contribuant ainsi à leur confort global. Les souris genotypées par poinçon d'oreille peuvent avoir une douleur légère de courte durée.

Devenir

Euthanasies pour prélèvement d'organes à l'issue de la procédure pour des études de biologie moléculaire

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux dans l’étude du Syndrome de Sjögren est nécessaire pour reproduire au mieux ce syndrome. Cette maladie implique une dysfonction des glandes salivaires et lacrymales, qui ne peut être pleinement appréciée qu'en observant les interactions complexes entre différents types de cellules dans leur environnement tissulaire. Des resultats in vitro ont montrés que les cellules epitheliales des glandes salivaires jouent un rôle cles dans la maladie. Cependant, les modèles in vitro ne capturent pas la complexité et la dynamique de ces interactions cellulaires dans un environnement physiologiquement pertinent.

Réduction

Le nombre maximal d'animaux pour ce projet a été déterminé en prenant en considération la distribution théorique présente dans les données bibliographiques et les test statistiques. Ce nombre limité est crucial pour parvenir à des conclusions quant à l'efficacité d'un traitement. L'évaluation de l'effet du traitement sera effectuée à chaque étape à l'aide de tests statistiques. Avant chaque phase, un calcul de l'effectif sera réalisé pour ajuster et réduire le nombre d'animaux nécessaires dans la mesure du possible. De plus, lorsque les procédures le permettront, des évaluations non invasives seront privilégiées tout au long du projet pour améliorer le bien-être des animaux et éviter toute euthanasie inutile. Ainsi, Le calcul du nombre (n) d'animaux prévoit l’utilisation de 7 animaux par groupe.

Raffinement

Les conditions d'hébergement seront appropriés pour réduire la douleur, le stress, l'angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux : hébergés dans une pièce respectant le cycle nycthéméral et une température maintenue à 22°C, dans des cages adaptées à l'animal et à sa taille enrichies avec des copeaux de bois, des tunnels en carton, des bâtons de bois à ronger et des cotons pour nidifier, et avec un accès à la nourriture et à l'eau libre Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et par les personnes en charge de l'étude. Les points limites et les critères d’arrêt précoces de souffrance qui ont été définis seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques, anatomiques et métaboliques largement documentées dans la littérature scientifique. Cette connaissance approfondie facilite davantage l'extrapolation des effets sur la glande salivaire à l'homme. De plus, les modèles expérimentaux de cette pathologie, largement utilisés et décrits dans la littérature spécialisée, sont basés sur ces espèces. Les souris ont été choisies pour ce projet en raison de leurs particularités anatomiques et physiologiques, visant à accroître les chances de réussite du projet. Les souris incluses dans l'étude seront âgées de 3 à 6 mois ou de 8 à 10 semaines, conformément aux publications de référence qui soustendent les modèles et qui définissent le moment de l'induction de la maladie chez ces animaux.

132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur vingt semaines, chaque animal reçoit des injections, six prélèvements sanguins et vingt prélèvements d'urine sous contention, les trois quarts subissant en plus vingt-quatre instillations nasales et une chirurgie terminale, pour reproduire une maladie rénale auto-immune liée aux particules fines. Le porteur indique que les contentions répétées provoquent stress et douleurs, avec des risques de saignement, d'infection et de chute de tension. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne confirme in vivo l'effet de la pollution, les retombées de santé publique restant à envisager.

Objectifs

Notre projet vise à étudier l’impact des particules fines contenues dans la pollution atmosphérique dans la physiopathologie de la glomérulonéphrite extra-membraneuse.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait une meilleure compréhension de l’impact de la pollution sur le système immunitaire et le développement des maladies auto-immunes, notamment de la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Cela pourrait déboucher sur la mise en place de politiques de santé publique et d’une prise en charge spécifique visant à bloquer la suractivation des voies de signalisation inflammatoires.

Procédures

Par animal sur tous les animaux du projet (20 semaines) : - 4 injections sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 6 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 20 Prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 procédure chirurgicale terminale sous anesthésie/analgésie Par animal, sur 75% des animaux du projet : - 24 instillations intranasales (8 semaines de traitement X 3 instillations par semaine). 15 secondes par instillations.

Impact sur les animaux

Les nuisances et complications eventuelles de la procdure incluents : - Stress et angoisse, voire des douleurs, liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les actions d’injections, de prélèvements d’urine et de sang et les instillations nasales. - Des complications éventuelles peuvent survenir au cours de la procédure d’immunisation ou du prélèvement sanguin, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement ou une chute de la tension artérielle voire une hypovolémie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement et analyse histologique et biochimique des organes d’intérêts (reins).

Remplacement

Nos résultats préliminaires in vitro sur cellules immunitaires périphériques et ex vivo suggèrent que la pollution atmosphérique induit une réponse immunitaire pro-inflammatoire favorisant le développement de maladies auto-immunes comme la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour confirmer l’impact des particules fines dans le développement de la glomérulonéphrite extra-membraneuse.

Réduction

Le nombre d’animaux a été établi grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les groupes.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limite précoces et adaptés appuyés sur des fiches de suivi individuels des animaux tout au long du projet.

Choix des espèces

Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. De plus, il existe des études publiées montrant l'efficacité du modèle d’immunisation active de souris avec la protéine d'intérêt pour reproduire exactement la pathologie etudiée, la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).

180 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après six semaines d'une alimentation enrichie ou non en levures, 90 poissons reçoivent sous anesthésie une injection simulant une infection bactérienne et 90 une injection saline, avant d'être tués huit heures plus tard pour prélever sang, foie, intestin et rate. Le projet cherche à renforcer l'immunité innée des truites d'élevage pour une aquaculture présentée comme "nécessaire" face à la demande. Le porteur indique qu'une étape d'alimentation empêche de mener l'étude en culture cellulaire.

Objectifs

Qu'ils proviennent de la pêche ou de l’aquaculture, les poissons jouent un rôle important dans l’alimentation humaine. Selon les prévisions, la production aquacole devrait augmenter de 15 % d'ici 2030. Cette croissance est nécessaire pour fournir à une population croissante des aliments sains et nutritifs. Cependant, cette croissance doit s’appuyer sur une production aquacole durable, c’est-à-dire respectueuse de l'environnement mais aussi capable de s’adapter au changement climatique. Il est donc important que les poissons d’élevage soient plus robustes. Une façon de renforcer la robustesse des animaux est d'augmenter leurs défenses immunitaires. Le système immunitaire des animaux comporte deux parties : l'immunité innée et l'immunité adaptative ou acquise. L’immunité innée est une protection naturelle présente dès la naissance. Elle agit rapidement lors d’une infection mais n’est pas spécifique de l’agent pathogène (bactérie, virus…). L’immunité acquise se développe au cours de la vie. Basée sur la production d’anticorps, elle est spécifique d’un agent pathogène et bénéficie d’un effet mémoire c’est-à-dire que l’animal réagira de manière plus rapide et plus efficace lors d’une autre infection par le même pathogène. Cependant, une idée nouvelle en immunologie suggère que l'immunité innée peut également être entraînée pour lui permettre d’être plus réactive face à de futures infections. Pour entrainer l'immunité innée, il suffirait d’exposer les animaux à des molécules capables de déclencher la réponse immunitaire innée. On trouve certaines de ces molécules en abondance dans la paroi des levures, comme la levure de bière ou de boulangerie. L'objectif de ce projet est donc d’ajouter des levures dans l'alimentation de la truite pour stimuler et entrainer son immunité innée et ainsi augmenter ses défenses immunitaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir s’il est possible d’améliorer les défenses immunitaires de la truite arc-en-ciel par le biais de son alimentation. Les levures sont fréquemment utilisées dans l’alimentation des animaux d’élevage pour améliorer la croissance et la santé des animaux. Ainsi cette expérimentation permettra d’évaluer si l'ajout de levure dans l’alimentation de la truite permet d’augmenter les défenses immunitaires de cet animal et le rendre plus robuste face au changement climatique.

Procédures

Dans cette expérimentation, des jeunes truites arc-en-ciel seront nourries pendant 6 semaines avec des aliments contenant ou non des levures. Au bout de ces 6 semaines, 90 poissons recevront sous anesthésie, une piqûre d’un produit simulant une infection bactérienne et 90 autres recevront également sous anesthésie, une piqûre de solution saline (eau salée). Huit heures après l’injection, les poissons seront anesthésiés puis euthanasiés et différents tissus et organes (sang, foie, intestin et rate) seront prélevés sur ces animaux morts. Ce délai de huit heures a été démontré dans des études précédentes, comme nécessaire et suffisant pour induire une réaction inflammatoire.

Impact sur les animaux

Les 6 semaines d’alimentation qui précèdent l'injection du produit destiné à provoquer une réaction immunitaire chez les poissons, ne devraient causer aucune nuisance ni effet indésirable aux poissons car ceux-ci seront élevés de manière traditionnelle et nourris avec des aliments adaptés à leurs besoins. De plus, la levure qui sera introduite dans l’aliment bénéficie d’une autorisation d’utilisation en alimentation des poissons d’élevage. Pour réduire le risque d’infection lié au fait de piquer la peau du poisson avec une aiguille, la seringue et l’aiguille seront stériles et changées entre chaque poisson. L’injection de la solution saline stérile n’a aucun effet sur l’état de santé du poisson et son comportement comme l’ont démontré des études précédentes. L’injection du produit simulant une infection bactérienne devrait déclencher une réaction inflammatoire chez la truite. Des études ont montré que ces injections ne présentent aucun risque pour la vie de l’animal mais entrainent une réaction immunitaire similaire à celle que l’on peut observer après une vaccination.

Devenir

Huit heures après l’injection, la totalité des poissons (180) seront anesthésiés puis euthanasiés afin de procéder à des prélèvements de foie, d’intestin, de rate et de sang.

Remplacement

Le projet requiert une étape prélable d'alimentation des animaux, il ne peut donc pas être réalisé en culture cellulaire.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au strict minimum tout en restant suffisant pour prendre en compte les différences de réaction entre les truites arc-en-ciel lors de l'injection du produit stimulant l'immunité, garantissant ainsi la fiabilité des résultats. Ce nombre de poissons a été établi en utilisant des outils statistiques.

Raffinement

Les mesures de raffinement prévues visent à garantir des conditions idéales pour les poissons, notamment en faisant en sorte qu’il n’y ait pas plus de 9 à 10 kg de poissons par mètre cube d’eau, en renouvelant l'eau en continu pour apporter suffisamment d’oxygène aux poissons, en créant une colonne de bulles pour enrichir l'environnement, en respectant le rythme naturel du jour et de la nuit et en plaçant un nombre suffisant de poissons dans chaque bassin (27 poissons) pour favoriser les interactions sociales. Les bassins seront équipés de couvercles ajourés pour éviter la prédation par des oiseaux et limiter le stress lié aux activités des techniciens. Les poissons seront nourris manuellement deux fois par jour jusqu'à ce qu’ils ne montrent plus de signe de faim, les techniciens surveilleront deux fois par jour, à l’occasion des repas, le comportement et le bien-être des poissons, en complétant une fiche basée sur des critères comportementaux et physiques. Si un point limite est atteint, l'animal sera euthanasié conformément aux réglementations. La manipulation des truites sera effectuée par des personnes expérimentées, les injections seront faites sous anesthésie générale, et tous les prélèvements d’organes et de tissus seront réalisés sur des animaux préalablement euthanasiés.

Choix des espèces

La truite arc en ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale en France. L’expérimentation sera réalisée sur de jeunes truites arc-en-ciel d’environ 150g. Cette taille de poissons permet la collecte d’échantillons de tissus ou d'organes dont les tailles sont compatibles avec la réalisation de plusieurs analyses.

Toutes tuées à l'issue des procédures pour analyser l'effet des molécules testées, 551 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, qui ont reçu des cellules immunitaires humaines, subissent une injection intraveineuse puis des injections intrapéritonéales tous les trois à quatre jours pendant trois semaines, et une partie d'entre elles une prise de sang hebdomadaire sous anesthésie pendant quatre semaines. Les molécules testées sont censées détruire les seuls lymphocytes B producteurs d'auto-anticorps de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur qualifie ces souris d'"indispensables" et de "modèles les plus pertinents", tout en écrivant qu'une douleur "modérée à sévère" peut être attendue lors de la réaction du greffon contre l'hôte.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie autoimmune caractérisée par une inflammation des articulations qui évolue par poussées, espacées par des périodes de rémission, aboutissant en quelques années à une invalidité aux conséquences socio-économiques lourdes. Notre équipe de recherche développe depuis plus de 20 ans des nouvelles approches d’immunothérapie dans la PR pour cibler les cellules pathogènes et particulièrement les lymphocytes B qui sécrètent les auto-anticorps. Le diagnostic de la PR repose sur la présence de ces auto-anticorps dont les cibles de ces auto-anticorps ont été parfaitement identifiées et plus particulièrement certains peptides citrulliné. Nous allons tester de nouvelles molécules thérapeutiques ciblant les cellules exprimant les auto-anticorps. De précédentes études nous ont déjà permis d’évaluer les propriétés de ces nouvelles molécules thérapeutiques. Les résultats obtenus étant très encourageants, nous souhaitons poursuivre le développement de l’utilisation de ces molécules. Ce projet nous permettra de valider le potentiel de ces molécules pour cibler les cellules sécrétant les auto-anticorps dans des modèles expérimentaux plus pertinents et plus proches de la situation en clinique, pour envisager de nouvelles approches thérapeutiques dans la PR.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’une biothérapie innovante basée sur des molécules permettant de détruire les cellules exprimant/sécrétant les autoanticorps. Le bénéfice de notre nouvelle approche thérapeutique est la destruction spécifique des cellules B pathogènes sans détruire les cellules B non pathogènes. Les traitements actuels ciblant toutes les cellules B entrainent une immunosuppréssion globale qui peut entrainer des effets secondaires graves tels que le développement de cancer ou le défaut de réponse immunitaire des patients à des agents pathogènes. En ciblant spécifiquement les lymphocytes B pathogènes, notre stratégie permettra de proposer de nouveaux traitements pour la PR et pourrait être étendue à d’autres maladies auto-immunes dans lesquelles il y a également une production d’auto-anticorps pathogènes.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 injection intra-veineuse (30 secondes) et plusieurs injections intra-péritonéales (

Impact sur les animaux

Douleur légère dûe aux injections intrapéritonéales ou intraveineuses. Une douleur modérée peut être attendue lors de la croissance des cellules cibles exprimant/sécrétant les auto-anticorps. Une douleur modérée à sévère peut être également attendue lors de la réaction du greffon contre l’hôte.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour analyser l’impact des molécules testées sur les cellules exprimant/sécrétant les auto-anticorps.

Remplacement

Les molécules utilisées dans ce projet ont toutes été validées in vitro dans un premier temps afin d’optimiser chacun des paramètres et seules les molécules efficaces in vitro seront évaluées in vivo chez des souris immunodéficientes. Les souris immunodéficientes, injectées avec des cellules immunitaires humaines, permettent d’évaluer l’impact de la molécule à tester sur la réponse immunitaire humaine et vice-versa l’impact de la réponse immunitaire sur la molécule à tester. L’utilisation de souris immunodéficientes est donc indispensable pour évaluer les propriétés des molécules thérapeutiques dans les conditions qui seront utilisées en clinique. Elles constituent aujourd’hui les modèles les plus pertinents pour décrypter les effets des molécules et sont aujourd’hui bien plus adaptées que les souris immunocompétentes ou les modèles expérimentaux ex-vivo. Elles sont indispensables pour définir les propriétés des nouvelles molécules thérapeutiques avant application chez l’Homme.

Réduction

Le suivi longitudinal que nous avons choisi pour ce projet permet d’utiliser les mêmes souris sans avoir à les euthanasier à différents temps pour évaluer l’efficacité des molécules à tester. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment dans des publications utilisant des modèles expérimentaux similaires et avons calculé, avec un logiciel spécialisé, le nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour obtenir des données interprétables au niveau statistique Les souris immunodéficientes sont généralement irradiées avant greffe avec des cellules humaines pour permettre une meilleure prise de greffe mais cette irradiation favorise également la maladie du greffon contre l’hôte, limitant la survie des souris greffées. Afin de limiter le nombre de souris, nous n’envisageons pas, dans ce projet, d’irradier les souris.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance et le stress des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement pour rechercher tout signe de douleur et de stress grâce à une grille de score qui prend en compte de nombreux paramètres comportementaux et la perte de poids des souris sera évaluée 2 fois par semaine. Un enrichissement des cages sera réalisé en utilisant des copeaux de litière et des igloos, mais surtout de la nourriture humidifiée dans la cage en cas d’observation de perte de poids. Les souris seront suivies sur une période de 4 semaines post-injection et euthanasiées. Les animaux immunodéprimés peuvent présenter un phénotype dommageable selon les conditions d’hébergement. Les souris seront réceptionnées à l’âge de 5-6 semaines et seront incluses dans les protocoles expérimentaux après 8 à 10 jours d’acclimatation. Les souris seront hébergées et manipulées dans des conditions préservant leur statut immunologique. Elles seront changées avec du matériel autoclavé et de préference en premier, dans une hotte change cage, de façon à éviter toute contamination. Les souris ne seront pas gardées plus de 1,5 mois en zone d’hébergement et ne devraient pas montrer de phénotype particulier dû à leur déficit immunitaire. Enfin, pour éviter l’apparition de la réaction du greffon contre l’hôte, nous évaluerons également la possibilité d’utiliser d’autres cellules ne provoquant pas ce type de réaction immunitaire.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées sélectionnées pour ce projet ont une caractéristique essentielle de ne pas avoir de cellules immunitaires permettant ainsi l’injection de cellules humaines, qui ne sont pas détruites par la souris. Les souris injectées avec les cellules immunitaires humaines permettent de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Elles permettent d’évaluer l’impact de la molécule à tester sur la réponse immunitaire humaine et vice-versa, l’impact de la réponse immunitaire sur la molécule à tester. Elles constituent aujourd’hui les modèles les plus pertinents pour décrypter les effets des molécules et sont aujourd’hui bien plus adaptées que les souris immunocompétentes ou les modèles expérimentaux ex-vivo. Dans la littérature, ces souris sont injectées avec les cellules humaines à l’âge adulte (6-7 semaines). Elles seront donc réceptionnées à l’âge de 5-6 semaines et seront incluses dans les protocoles expérimentaux après 8 à 10 jours d’acclimatation.