Système immunitaire

10 lapins mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque lapin reçoit deux à quatre injections intraveineuses et jusqu'à quinze prélèvements sanguins sur environ deux mois et demi, avant d'être tué pour analyser la répartition du produit dans ses tissus, dans le but de tester des stratégies limitant la réaction immunitaire aux vecteurs de thérapie génique. Le porteur indique n'attendre aucun effet indésirable notable au-delà d'un possible hématome à l'oreille. Il précise poursuivre des travaux déjà menés sur des primates non humains et des lapins, et écarte les méthodes in vitro comme incapables de reproduire ces conditions biologiques.

Objectifs

Les vecteurs dérivés du virus adéno-associé (AAV) sont actuellement les plus utilisés dans les thérapies par transfert de gènes in vivo pour le traitement des maladies génétiques. Ces vecteurs sont efficaces et bien tolérés. Cependant, leur utilisation en thérapie génique peut être limitée (i) soit en raison d’une immunité pré existante à l’AAV due à l'exposition naturelle de l'homme à certains virus AAV, (ii) soit à une réponse immunitaire déclenchée par l’administration d’un vecteur AAV thérapeutique. En conséquence, un grand nombre de personnes avec une immunité pré existante ne pourront pas bénéficier de la thérapie génique AAV. D’autre part, le traitement est souvent limité à une seule injection de par le déclenchement d’une réponse immunitaire. Dans des études précédentes, chez le primate non humain et chez le lapin, ayant une immunité pré existante pour l’AAV thérapeutique testé, nous avons démontré qu’une enzyme, une endopeptidase, était capable par son action spécifique, de diminuer cette immunité, et donc d’augmenter l’efficacité de l’AAV thérapeutique. Actuellement, l’utilisation d’endopeptidases est le traitement le plus prometteur pour pallier à une réponse immunitaire dans un contexte de thérapie génique. D’autre part, dans une étude récente sur le primate non humain avec une immunité pré existante à l’AAV, nous avons obtenu une première preuve de concept en ce qui concerne une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité : méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’AAV, nommé "AAV à capside vide" ne pouvant donc pas transférer de gène). L'objectif de cette étude est d'évaluer l'efficacité et la sécurité de ces différentes stratégies : (i)Comparaison entre une injection d'endopeptidase et la méthode de déplétion des anticorps (ii)Comparaison de chacun de ces traitements avec la combinaison des deux traitements

Bénéfices attendus

L'objectif de cette étude est d'évaluer l'efficacité et la sécurité de ces différentes stratégies : (i)Comparaison entre une injection d'endopeptidase et la méthode de déplétion des anticorps (ii)Comparaison de chacun de ces traitements avec la combinaison des deux traitements Ce traitement combiné pourrait être intéressant en thérapie génique, en particulier chez les patients avec une pré immunité forte ou lorsqu’une nouvelle administration du vecteur est nécessaire. Ces 2 stratégies permettraient de diminuer, voire d’annuler 1-soit une pré immunité, ainsi un plus grand nombre de patients pourront bénéficier de de la thérapie génique AAV 2-soit une réponse immune suite à l'administration du vecteur AAV thérapeutique, permettant ainsi la possibilité d'une deuxième injection thérapeutique

Procédures

Un total de 10 lapins sera inclus dans l’étude. Les 10 lapins seront répartis en 5 groupes, à raison de 2 lapins par groupe, et seront soumis aux interventions suivantes : (i)Selon leur groupe d’appartenance, les animaux vigiles auront de 2 à 4 maximum injections intraveineuses/animal au cours de l’étude. Durée de l’intervention : 15 minutes/injection (ii) Tout au long de l’étude, les animaux vigiles seront soumis à des prélèvements sanguins dont le nombre variera de 6 à 15/animal selon leur groupe d’appartenance. Durée de l’intervention : 5 minutes /prélèvement (iii)Selon leur groupe d’appartenance, les animaux seront suivis soit pendant 21 jours, soit 79±3 jours, avant mise à mort par injection intraveineuse, sous anesthésie générale après analgésie préalable. Durée de l’intervention : 10 minutes

Impact sur les animaux

Les différents gestes réalisés sur les animaux vigiles en boite de contention, seront des gestes classiquement appliqués chez le lapin et pas ou peu invasifs : injections par voie intraveineuse et prélèvements sanguins par ponction veineuse. Il n’est donc pas attendu d’effet indésirable. Suite à un prélèvement sanguin, réalisé à l’oreille, un hématome pourrait être éventuellement observé. Les différents produits injectés ont déjà été administrés lors d’études antérieures chez l’animal, et aucun effet secondaire ou indésirable particulier n’a été observé. Au cas où un animal montrerait des signes de stress lors des injections, une anesthésie légère de courte durée serait alors réalisée.

Devenir

Les 10 animaux concernés par cette procédure seront suivis pendant environ 2.5 mois après l’injection du vecteur testé puis mis à mort pour prélèvements de tissus post-mortem. La décision d'euthanasier les animaux à des fins d'analyse post-mortem est prise pour obtenir des échantillons de tissus pour des tests spécifiques, tels que des analyses de biodistribution (la répartition du médicament dans le corps) ou des examens histopathologiques (étude des tissus pour détecter d'éventuelles anomalies). Ces études sont cruciales pour évaluer la sécurité et l'efficacité d'une thérapie potentielle avant d'envisager des essais sur des êtres humains.

Remplacement

Dans une précédente étude chez le lapin avec une immunité pré existante au produit thérapeutique testé, nous avions déjà étudié l'activité de l’endopeptidase, enzyme capable par son action spécifique, de diminuer cette immunité pré existante, et donc d’augmenter l’efficacité du produit thérapeutique. Notre étude faisant suite à cette dernière, nos résultats viendront la compléter. Aussi, nous devons poursuivre avec le même modèle animal, et ne pouvons donc pas avoir recours à des méthodes substitutives, telles que les études in vitro. Par ailleurs, ces dernières ne peuvent pas fournir les informations nécessaires pour comprendre pleinement l'efficacité de cette enzyme dans des conditions biologiques plus complexes et plus proches de la réalité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude (n=10) a été déterminé sur la base d’études précédentes en thérapie génique. Ce nombre est réduit à son minimum tout en assurant une exploitation possible des résultats. En effet, la constitution de 5 groupes différents permettra d'évaluer l'efficacité et la sécurité des injections d'IdeS par rapport aux injections de capsides vides d'AAV (méthode de déplétion des anticorps) et de les comparer à la combinaison des deux traitements, en présence de niveaux élevés d'anticorps neutralisants anti-AAV.

Raffinement

L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement (techniciens animaliers et vétérinaire). Les administrations expérimentales ainsi que les prélèvements sanguins se dérouleront sans anesthésie. Ces actes étant peu douloureux, aucun protocole analgésique ne sera mis en place d'emblée pour ces actes. Pour favoriser les échanges sociaux entre animaux et favoriser leur bien-être, les lapins seront hébergés en groupe, en box sur résine avec copeaux, durant toute l'étude.

Choix des espèces

Dans une précédente étude chez le lapin avec une immunité pré existante au produit thérapeutique testé, nous avions déjà étudié l'activité de l’endopeptidase, enzyme capable par son action spécifique, de diminuer cette immunité pré existante, et donc d’augmenter l’efficacité du produit thérapeutique. Notre étude faisant suite à cette dernière, nos résultats viendront compléter ces premiers résultats prometteurs. C’est pourquoi nous utiliserons la même espèce, le lapin. 10 lapins (Lapin blanc de Nouvelle Zélande) mâles (4 mois, 3-4 kg) seront inclus dans l’étude. Il s'agit de jeunes adultes, matures sur le plan immunitaire notamment, stade essentiel à notre étude.

4 910 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour l'élevage de lignées au "phénotype dommageable", surtout des souris immunodéficientes ou issues de croisements transgéniques. Elles subissent une biopsie de l'oreille pour le génotypage et un hébergement stérile strict, une rupture de stérilité pouvant, selon le porteur, les contaminer jusqu'au décès du fait de leur immunodéficience. Les souris dont le génotype n'a pas d'intérêt sont tuées, les autres gardées pour la reproduction ou pour entrer dans d'autres procédures. Le porteur décrit ces lignées transgéniques comme des modèles "unanimement validés" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne recrée la complexité du système immunitaire.

Objectifs

L’objectif du projet est d’élever des animaux au sein d’une plateforme animalière agrée, en particulier des souris, avec des phénotypes dommageables. Ces animaux sont, pour la majorité, des souris immunodéficientes qui sont utilisées dans nos projets de recherche. Ces souris sont dépourvues totalement ou partiellement de système immunitaire adaptatif. Ces animaux ayant un phénotype dommageable peuvent être aussi des souris issues du croisement de deux souches de Souris transgéniques. La surveillance du bien-être des lignées au cours de l’élevage exigera des contrôles quotidiens et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Ces animaux issus du croisement de deux souches de souris transgéniques seront utilisés dans des modèles communs : les modèles d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, d’arthrite, de maladies chroniques de l’intestin, d’inflammation cutanée et pulmonaire. Enfin, les modèles expérimentaux de cancérogénèse sont des modèles de greffe de tumeurs murines ou humaines comme les leucémies, différentes lignées de cancer du côlon ou du pancréas. Ces différents modèles permettent d’adresser un mécanisme d’action, ou des approches thérapeutiques avec des produits biologiques humains. Aujourd’hui, il n’y a pas de données scientifiques publiées sur ces croisements. Les données obtenues avec des nouvelles lignées permettront d’enrichir les données scientifiques dans les modèles étudiés. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable au cours de la génération de ces lignées transgéniques dans nos conditions d’hébergement. Ce n’est que lors de nos expérimentations suite à l’injection de tamoxifène qu’un caractère dommageable sera observable ou non. Si un phénotype dommageable apparait, nous définirons des points limites et une intention particulière sera porté au bien-être animal.

Bénéfices attendus

L’elevage de ces animaux au sein de notre animalerie est bénéfiques pour les animaux et donc nos expérimentations. Les animaux, lorsqu’ils seront utilisés dans nos expériences, seront déjà habitués aux conditions environnementales de l’animalerie, ainsi qu’aux soigneurs et aux expérimentateurs Ce qui pourra limiter très fortement le stress de ceux-ci.

Procédures

L’animal présentant un phénotype dommageable suite au croisement des 2 souches de souris transgéniques pourra ressentir, du fait de son statut génétique, une douleur, une souffrance, une angoisse ou un risque d’infection . La surveillance du bien-être de chaque animal au cours de l'expérience exigera des contrôles quotidiens de routine et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Des conditions d’hébergement pour ces élevages seront strictes dans des portoirs ventilés avec de la litière autoclavée ainsi que des poches d’eau stérile. Tout ceci est mis en place afin de maintenir les animaux en bonne santé et de veiller au bien-être des animaux. Hormis le change des animaux, l’autre intervention sur ces animaux sera une biopsie d’oreille servant à vérifier le génotype des animaux et servant également à l’identification des animaux pour un bon suivi de l’élevage.

Impact sur les animaux

Concernant les animaux immunodéficients, les conditions d’hébergement strictes permettent de maintenir les animaux en bonne santé. Dans le cas où une rupture de la stérilité aurait lieu, les animaux pourraient être contaminés par des micro-organismes opportunistes qui seraient pathogènes pour ces animaux. Du fait de leur immunodéficience, ces animaux subiraient de graves effets indésirables qui se manifesteraient par une inactivité, une perte de poids pouvant aller jusqu’au décès. Pour les modèles CreLox inductible, les phénotypes dommageables des souris obtenus sont difficile à prévoir à l’avance Le bien-être animal sera évalué selon les principes suivants : Des données seront recueillies durant au moins 2 cycles de reproduction après la génération considérant la lignée stable (après 2 générations) avec un nombre d’animaux scientifiquement et statistiquement justifiés (jamais moins de 14 animaux issus d’au moins 2 portées/pontes différentes) en prenant en compte le sexe sur le phénotype : à défaut 7 mâles et 7 femelles. Les observations seront faites à un âge représentatif et un génotype pertinent. Les animaux contrôles seront de même fond génétique que les lignées générées.

Devenir

Les animaux dont le génotypage n’est pas d’intérêt, seront euthanasiés. A l’inverse, les animaux ayant un génotypage d’intérêt seront conservés, soit pour continuer les élevages, soit pour rentrer dans une procédure d’expérimentation.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes lors de greffes ou de thérapies anti-cancéreuses. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées à l’aide de modèles de culture cellulaire, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste. L’élevage des animaux est réalisé à la demande des expérimentateurs. En fonction de la procédure concernée, le nombre d’animaux par groupe est défini de façon à obtenir une différence statistique (Tests paramétriques et non-paramétriques) en fin d’expérience en ayant pris en compte les animaux nécessaires (couples parents et portées non utilisées) et la toxicité associée à chaque modèle. A cause des variabilités inter‐animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et donc la nécessité de répéter inutilement l’expérience. Si un phénotype dommageable est observé avec ces souches, le nombre d’animaux utilisé dans nos expériences sera adapté en conséquence (dimunition du nombre d’animaux par groupe).

Raffinement

L’élevage des animaux au sein de l’animalerie est réalisé dans des conditions strictes de stérilité et de suivi. Les Souris sont hébergées dans des cages en portoirs ventilés, ce qui assure une non contamination par des pathogènes pouvant être présents dans l’air ambiant des pièces d’hébergement. Les cages contenant la litière sont autoclavées préalablement au change. L’eau de boisson est distribuée via des poches d’eau stériles à usage unique. Le change des animaux est réalisé sous hotte de change, le transfert des animaux de la cage sale à la nouvelle est réalisé à l’aide d’une paire de pince trempée dans l’alcool permettant au maximum de limiter les risques de contamination entre les cages. Entre chaque cage le soigneur désinfecte ses gants. Les animaux sont suivis quotidiennement par les soigneurs afin de prendre en charge les animaux pouvant montrer des signes de mal être et ainsi protéger ces congénères. Ce suivi accru limite aussi le risque de propagation potentielle de pathogènes.

Choix des espèces

La Souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’Homme, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques cellulaires. Les modèles transgéniques utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. Tous les animaux produits seront utilisés dans différentes procédures autorisées dans notre établissement. Ces animaux seront utilisés soit à partir de 8 semaines pour renouveler les couples reproducteurs, soit pour être utilisés dans les différentes procédures et cela à partir de 5 semaines. Cinq semaines est l’âge à partir duquel les animaux peuvent subir une greffe de cellules hématopoïétiques humaines ou de tumeurs sans alterer leur croissance et leur bien-être.

880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Jeunes ou âgées, elles reçoivent des injections répétées d'une molécule (une ptéridine), des prélèvements de sang et passent des tests de force et de motricité (grip test, rotarod), pour comprendre le rôle de cette molécule dans le vieillissement du muscle et du système immunitaire. Le porteur signale un stress et une possible inflammation aux points d'injection, ainsi qu'une fatigue transitoire lors des tests. Il décrit l'analyse des muscles comme "indispensable", ce qui rend selon lui la mise à mort de toutes les souris "requise".

Objectifs

Nous assistons à une expansion démographique de la population âgée dont la prise en charge constitue un défi majeur. Le vieillissement s’accompagne d’un syndrome de fragilité, affectant aussi bien le système immunitaire que musculaire qui peut entraîner des fractures de la hanche chez les personnes âgées de plus de 75 ans avec pour conséquences une perte de l’autonomie liée à la non-reprise de la marche, mais surtout une mortalité avoisinant les 30 pour cent dans l’année qui suit l’opération. La fracture de hanche représente un bon modèle de stress aigu, intéressant pour décrire les réponses inflammatoires sur les systèmes immunitaires et musculaires des personnes âgées. Dans ce contexte de stress aigu, le système immunitaire est activé et conduit à la production d’une ptéridine, un marqueur de l’activation immunitaire. Le rôle propre de cette ptéridine n'est pas encore bien décrit dans la littérature. De précédentes études ont montré que cette ptéridine est un biomarqueur prédictif de la mortalité à un an post-fracture et est associée à l'échec de la reprise de la marche. Dans ce projet, le but est de comprendre comment l'inflammation peut avoir un impact sur la capacité de résilience des patients âgés et comprendre les mécanismes d’action de cette ptéridine dont le rôle semble délétère au niveau immunitaire et musculaire. L’impact de cette molécule est regardé in vivo sur des souris jeunes et âgées exposées chroniquement à cette ptéridine. Les niveaux d’inflammation ainsi que les changements phénotypiques et fonctionnels sur les cellules immunitaires et musculaires sont évalués. Le projet vise également à valider que les conséquences délétères potentielles de cette molécule sont réversibles suite au traitement par des anti-inflammatoires, anti-prolifératives et anti-oxydantes.

Bénéfices attendus

Des précédentes études ont montré que cette ptéridine est un biomarqueur prédictif de la mortalité à un an post-fracture et est associée à l'échec de la reprise de la marche. Ce biomarqueur identifie ainsi les patients vulnérables, à plus haut risque de mauvais décours clinique. La compréhension des mécanismes d’action de cette ptéridine dont le rôle semble délétère au niveau immunitaire et musculaire, permettra d’identifier des stratégies thérapeutiques susceptibles d'entrainer une récupération rapide, une meilleure résilience, une qualité de vie optimale et la survie à long terme des personnes âgées confrontées à un événement clinique aigu.

Procédures

Les animaux seront soumis à quatre interventions: 1) L'injection intrapéritonéale de molécules (3 fois par semaine) est une intervention de très courte durée (environ 1 minute) sur des animaux vigiles; 2) Des prélèvements sanguins sont réalisés sur des animaux vigiles (1 fois tous les 15 jours) 3) Des tests fonctionnels pour évaluer la fonction motrice sur des animaux vigiles dont la durée globale est d'environ 15 minutes (1 fois); 4) la mesure de force d’un muscle de la jambe de la souris d’une durée d'environ 15 minutes (1 fois).

Impact sur les animaux

*Dans notre projet, les injections par voie intrapéritonéale réalisées chez la souris peuvent être source de stress physique et de douleur au point d’injection (avec potentiellement un risque d’inflammation). Le prélèvement sanguin peut également être source de stress physique et entraîner une inflammation de courte durée au point de piqûre. Les anesthésies sont susceptibles d’induire un stress thermique. Les grip test et le rotarod peuvent également générer un stress et une fatigue transitoires.*

Devenir

Tous les animaux (n=880) de la procédure sont euthanasiés à la fin de la procédure. L’analyse des muscles est indispensable pour ce projet. L’euthanasie de l’ensemble des animaux est donc requise.

Remplacement

Notre but est d’étudier l’effet d'une ptéridine in vivo sur le système immunitaire et sur la fonction musculaire de la souris au cours du vieillissement. Pour cela, nous utiliserons des souris contrôle C57bl7, jeunes ou âgées. La plupart des analyses concernant l’impact de cette ptéridine sur le système immunitaire ou son effet sur la fonction musculaire ne peuvent pas être reproduites in vitro ni ex vivo, ce qui nécessite l’utilisation des modèles murins. L’analyse du système immunitaire et des muscles de ces souris au cours du vieillissement nous permettra de comprendre l’effet de cette ptéridine. En parallèle, des cultures de cellules musculaires ou prélèvements sanguins seront utilisées pour disséquer les mécanismes sous-jacents. Pour cela d’autres muscles (Gastrocnemius, soleus, etc) ou organes seront prélevés à l’euthanasie pour pouvoir obtenir des cultures primaires murines. Également des prélèvements sanguins seront effectués avant le traitement, deux semaines après et au moment de l'euthanasie.

Réduction

Chaque groupe sera constitué de 15 à 25 animaux pour obtenir des résultats statistiques dans le respect de la règle des 3R. Un maximum de 880 animaux seront utilisés. Afin de comparer les groupes de sujets, nous réaliserons une analyse statistique.

Raffinement

Les animaux auront une période d’au moins 7 jours d’acclimatation avant de commencer l’expérimentation. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons ou tunnel en carton ou carré de coton compacté. Suite au réveil des différentes procédures, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur. Pour les prélèvements sanguins, les souris sont anesthésiées. A la fin de l'acte, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur ou inconfort. Les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la perte de poids, des plaies au site d’injection, une croissance excessive des dents seront évalués régulièrement. Les animaux qui montrent un signe quelconque de détérioration de leur santé seront euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

Le modèle murin C57BL6 sera utilisé de par la grande homologie avec l’Homme permettant une bonne étude des processus biologiques comme le vieillissement. De plus, la durée de vie relativement courte des souris (environ 2 ans) permet également d’étudier rapidement le vieillissement sur une période de temps raisonnable pour la recherche. Le modèle C57BL6 est utilisé car c’est un modèle accessible et couramment employé pour différentes recherches. Les souris C57BL6 âgées de 3 mois (équivalent à 20-26 ans chez l’Homme) sont considérées « jeunes ». Les souris C57BL6 âgées de 16 à 22 mois (équivalent à 60-80 ans chez l’Homme) sont considérées « âgées ».