Système immunitaire

516 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une inflammation puis des tumeurs cutanées vers 8 à 10 mois, elles subissent des fibroscopies par voie rectale, une phalangectomie pour le génotypage et des applications répétées d'adhésif sur l'oreille destinées à provoquer une inflammation. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les échanges entre intestin, microbiote, système immunitaire et peau à l'échelle de l'"organisme entier", et conclut que le recours à la souris est "indispensable". Les retombées annoncées, de nouvelles cibles contre les cancers de la peau, restent renvoyées à une étape ultérieure.

Objectifs

Les tumeurs présentent des caractéristiques et capacités particulières qui sont essentielles à leur développement. Parmi celles-ci, on peut retrouver leur capacité à proliférer indéfiniment, leur capacité à muter et à échapper au système immunitaire. De nouvelles études suggèrent que le microbiote, micro-organismes vivants dans notre corps, impacte aussi la croissance tumorale. Dans le cas du mélanome par exemple, un déséquilibre du microbiote intestinal est lié à une meilleure progression de la tumeur, de plus, le remplacement du microbiote « malsain » par un microbiote "sain" chez les patients atteints de mélanome permet d’améliorer l’efficacité des traitements par immunothérapie. De même, les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI telle que la maladie de Crohn), maladie où le microbiote intestinal joue une rôle important, présentent régulièrement des symptômes cutanés tels que des dermatites, de l’acné, une rosacée. Ceci suggère un lien entre microbiote intestinal, efficacité du système immunitaire et développement tumoral cutané ou d’une inflammation cutanée. Le projet proposé ici vise à étudier le lien qui peut exister entre ces trois acteurs. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est nécessaire afin de pouvoir étudier les interactions, échanges et influences du microbiote et système immunitaire sur le développement tumoral à distance.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment notre système immunitaire agit dans nos intestins et sur notre peau. Le but est de découvrir les mécanismes permettant la mise en place d’une inflammation cutanée qui mène au développement de tumeurs ; ainsi que l’impact du microbiote sur ces mécanismes et réponses. Ceci nous permettra ensuite d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des cancers de la peau et de proposer une nouvelle approche pour soulager les problèmes de peau chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI).

Procédures

Une fibroscopie, comparable à une coloscopie chez l’Homme, sera effectuée sur certains animaux afin d’étudier la communication immunitaire entre intestins et peau. Cette fibroscopie ne durera pas plus de 10 min par animal et sera réalisée 1 fois sur les animaux, à l’exception des animaux d’une manipulation où le geste sera répété 3 fois en 20 jours. Avant chaque fibroscopie, une injection d’analgésique sera faite sur les animaux. Celle-ci durera 10 secondes au total par animal. Les animaux seront anesthésiés avant la fibroscopie. Certains animaux seront traités par antibiotiques par voie orale. L'identification et le genotypage des animaux se fera par phalangectomie distale donc en un seul geste avant calcification. Certains animaux auront une application d’adhésif sur l’oreille permettant de mimer l’apparition de lésions cutanées. Cette application sera répétée 3 fois sur une oreille et entrainera une inflammation au site de « l’épilation ».

Impact sur les animaux

Le projet implique l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui développent une inflammation et des tumeurs cutanées. Ces animaux vivent normalement pendant les 6 premiers mois de vie sans aucun symptôme. Ils commencent à développer une inflammation cutanée vers 6 mois de vie et des tumeurs cutanées vers 8/10 mois de vie. Certaines expérimentations impliquent l’insertion d’une fibre optique par voie rectale dans l’animal. Celle-ci ne devrait normalement pas générer de lésions ou de gêne puisque cela s’apparente à l’insertion d’un thermomètre rectal chez l’Homme. Certains animaux auront un endommagement de la barrière cutanée de l’oreille des souris, à l’aide d’un ruban adhésif.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit suite à la fin de la procédure afin de prélever les organes, soit lorsqu’un point limite est atteint et qu’aucun geste ne permet un retour à l’état normal et ce afin d’éviter toute souffrance.

Remplacement

L’étude de la migration des cellules immunitaires entre deux organes ne peut se faire, pour le moment, qu’à l’échelle de l’organisme entier. Aucune technologie actuelle n'est capable de mimer les interactions entre le système digestif, le microbiote, le système immunitaire et la peau. Cette étude ne peut se faire qu'à l'échelle d'un organisme entier. De plus, la complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation imposent que cette étude se fasse dans un système intégré, à l’échelle de l’organisme entier. L’utilisation d’animaux est donc indispensable à l’avancée de ce projet.

Réduction

De précédentes études montrent que 100% des animaux développent une inflammation intestinale/colorectale ainsi qu’une transformation tumorale cutanée. L’effet étant indépendant du sexe de l’animal, tous les animaux générés pourront être utilisés. Cela permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. De plus, lors de la mise à mort des individus, certains organes pourront être collectés afin de servir à un autre projet développé dans le laboratoire, permettant ainsi de ne pas utiliser d’autres souris pour cet autre projet. Également, les animaux des groupes contrôles seront mutualisés, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés ici. Afin de réduire encore plus le nombre d’animaux, une formation au geste de « fibroscopie » a été réalisée en suivant un protocole établi et utilisé en routine par d’autres manipulateurs. Pour le calcul du nombre de souris utilisables par groupe, nous avons réalisé des simulations statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux pour la validation des objectifs.

Raffinement

Des éléments d’enrichissement seront systématiquement mis dans les hébergements afin de favoriser le bien-être animal. Les animaux qui seront anesthésiés feront l’objet d’une surveillance accrue post-anesthésie. Pendant la période d’anesthésie, un gel hydratant et protecteur sera appliqué sur leurs yeux afin d’éviter toute déshydratation et donc toute gêne pour l’animal. Un analgésique sera également administré aux animaux en prévention de tout geste. Afin d’augmenter le raffinement, l’application d’une pommade anesthésique et d’un lubrifiant au niveau anal sera faite pour tous les animaux qui auront une endoscopie/fibroscopie afin de faciliter la fibroscopie (amélioration du protocole). En plus de la surveillance mise en place pour assurer le bon réveil des animaux, une surveillance supplémentaire 1 heure après le réveil des animaux sera faite afin de détecter de potentiels saignements chez les animaux ayant subi la fibroscopie. Si des saignements sont détectés et durent plus d’une heure, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation font que l’étude ne peut se faire que dans un système intégré et donc à l’échelle de l’organisme entier. L’étude de la transformation tumorale cutanée, sous l’influence du microbiote intestinal, implique que les expérimentations soient menées à l’échelle physiopathologique sur un modèle animal de choix. La souris (mus musculus) correspond à ces critères. Premièrement, les souris présentent un système immunitaire similaire à celui de l’Homme. De plus, le rôle de la molécule d’intérêt est conservé à plus de 97% entre l’Homme et la souris, ce qui permet de transposer facilement les études réalisées sur la souris chez l’Homme et inversement. Également, le microbiote de cette espèce est particulièrement bien caractérisé et peut-être facilement contrôlé et étudié, ce qui est important pour le projet que l’on souhaite mettre en place. Enfin, l’ensemble des outils nécessaires à l’étude, comme les anticorps, protocoles et kits, sont développés sur le modèle murin depuis plus de 20 ans. La souris est donc le modèle le plus adapté pour l’exécution de ce projet. Le but du projet est de comprendre l’impact de la signalisation de la molécule d’intérêt sur la réponse du système immunitaire au microbiote et le lien avec le développement tumoral cutané. Cette transformation peut commencer vers 6 mois de vie mais est complétement visible à 8-10 mois de vie. De plus, la maturité du système immunitaire intestinal est établie après 2 mois et l’intestin de souris est mature après 45 jours de vie. De ce fait, seules des souris adultes seront utilisées. Elles seront utilisées à 2, 6 et 8/10 mois de vie (la sortie des animaux entre 8 et 10 mois de vie dépendra des signes cliniques observés lors de la surveillance quotidienne dont feront l’objet les souris).

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le cytomégalovirus murin puis soumises à une série de tests comportementaux, reconnaissance d'objets, préférence à l'eau sucrée et enfouissement de billes, pour tester l'hypothèse que les cytokines d'une infection induisent un état proche de la dépression. Le porteur indique que les souris génétiquement immunodéficientes contrôlent moins bien l'infection et peuvent perdre du poids et présenter douleur, stress et baisse d'activité. Il présente le travail comme une "étude pilote" et affirme qu'un "système vivant et complet" rend l'usage d'animaux "indispensable", les applications pour les patients dépressifs restant hypothétiques.

Objectifs

Le système immunitaire est requis pour la défense de l’hôte contre les agressions par différents types de pathogène (virus, bactéries, etc..). Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs clef du système immunitaire, en première ligne dans la reconnaissance des microbes. Lorsqu’elles détectent un pathogène, les DC produisent des molécules, dites cytokines, véhiculées dans tout le corps pour orchestrer l’activation de tous les autres acteurs du système immunitaire. Une production de cytokines dérégulée en temps et/ou en quantité peut avoir un rôle délétère, parfois fatal, sur l’individu infecté, comme observé récemment dans la Covid. Au cours des infections virales les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont la principale source de cytokines dites Interférons (IFN), ainsi que de nombreuses autres cytokines inflammatoires. Les IFN sont indispensables pour établir une immunité antivirale efficace. Cependant, lorsque les pDC sont absentes ou incapables à produire des IFN, on n’observe pas chez l’hôte une sensibilité accrue aux infections virales. Etant donné que la capacité des pDC à produire des IFN est retrouvée dans la majorité des vertébrés, il est possible que cette fonction ait été conservée pour d’autres raisons. Notre hypothèse est que les cytokines produites par les pDC promouvraient, au-delà des réponses immunes, un état de prostration et d’isolement. Ceci aurait été initialement sélectionné au cours de l’évolution afin d’éviter la transmission de l’infection aux autres individus de la même espèce et éloigner le malade, affaibli par l’infection, du risque d’attaque de prédateurs. Ce type de comportement ressemble aux états dépressifs. D’ailleurs, des hauts taux de cytokines inflammatoires ont été retrouvé chez les patients dépressifs. L’exemple plus flagrant est représenté par les patients souffrant de tumeur ou d’hépatite C qui, lorsque traités avec des IFN, développent des syndromes dépressifs très sévères. Afin de tester cette hypothèse nous souhaitons effectuer une étude pilote sur souris ayant ou pas des pDC ou incapables de produire des cytokines inflammatoires. Nous utiliserons le modèle d’infection systémique par le cytomégalovirus murin (MCMV), un pathogène naturel de la souris, afin d’induire la production de hauts taux de cytokines inflammatoires, en particulier les IFN. Nous évaluerons l’impact de cette infection sur le comportement des souris par une batterie de tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les interactions entre systèmes immune et nerveux. Si notre hypothèse est correcte, il sera envisageable de cibler la production des cytokines, en particulier par les pDC, pour développer de nouvelles stratégies de thérapie pour les patients dépressifs. Ces nouvelles approches seront d’abord validées dans le modèle infectieux, ensuite elles pourront être étendues à d’autres contextes inflammatoires impliquant une activation de pDC, comme les maladies auto-immunes ou l’obésité.

Procédures

Les tests comportementaux ne représentent aucune source de douleur. Tous les tests sont effectués une seule fois. Les tests de localisation et de reconnaissance d'objets durent 20 minutes. Le test de préférence à l'eau sucrée dure 3 heures. Le test à enfouissement des billes dure 30 minutes. L’infection par MCMV est faite une seule fois en injectant par voie intrapéritonéale. L'infection dure entre 30 et 60 secondes maximum. Aucun prélèvement ou procédure chirurgicale sont prévus.

Impact sur les animaux

L'infection par le MCMV est généralement bien tolerée par les souris immunocompetentes. Les souris pDC-less tolèrent également bien l'infection par le MCMV, alors que les souris Myd88KO, étant immunodéficientes, contrôlent moins bien l'infection et peuvent avoir une morbidité accrue par rapport aux paramètres suivants: perte de poids, douleur, stress, inactivité, mobilité et posture.

Devenir

Mis à mort de tous les animaux car ils ne peuvent pas être utilisés pour d'autres expériences

Remplacement

Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire et comportementale au cours d’une infection virale in vivo. Ainsi, l’intégration d’un système vivant et complet est indispensable, donc l'utilisation des animaux vivants est nécessaire. Nous effectuerons nos études avec des souris car nous pouvons disposer de modèles mutants pour les cellules et/ou molécules en étude.

Réduction

Nous utiliserons 30 souris pour mener à bien cette étude pilote. Tous ces animaux seront sous fond génétique homogène pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités interindividuelles des animaux sous fonds génétiques mixtes. Nous avons une expérience de très longue durée dans le protocole d'infection, ce qui nous permet d'obtenir des résultats statistiquement significatifs avec 5 souris/génotype/traitement. Les résultats obtenus seront analysés à l'aide de tests statistiques.

Raffinement

Les souris sont élevées dans des services de zootechnie exempts d'organisme pathogène spécifique (EOPS). EOPS). Pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental, les souris seront hébergées en groupe de 2 à 5 individus dans des cages d’une superficie adequate, en conditions d'humidité, temperature et luminosité adaptées à leur physiologie. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois toutes les 2 semaines. Les animaux ont 1 semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Une surveillance journalière de routine de l'état des souris (toilettage, mobilité, poids, respiration) par les zootechniciens et l’expérimentateur permettra de détecter toute souffrance des animaux. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Pour les animaux affaiblis, l’accès à la nourriture et à l’eau sera favorisé. Les points limites ont été définis dans la procédure . Les animaux atteignant les points limites définis seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire et nerveux des 2 espèces. Nous avons maintenant formellement établi ce point en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Nous utiliserons des souris adultes à un age de 8-14 semaines car le système immunitaire rejoint sa maturité entre 2 et 3 mois d'âge.

1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur colorectale en sous-cutané, qui peut réduire leur mobilité et provoquer des nécroses cutanées, puis huit injections de traitement, avant d'être tuées pour prélever tumeurs, rates et ganglions. Le porteur cherche à valider le rôle antitumoral d'une molécule produite par les cellules NK, en s'appuyant sur un modèle transgénique. Il affirme que la complexité du cancer ne peut s'appréhender que dans un organisme vivant.

Objectifs

Ces dix dernières années, l’immunothérapie s’est développée et permet la mise en place d’une réponse puissante et durable chez un nombre limité de patients. Dans le but d’améliorer l’efficacité de l’immunothérapie, de nombreux essais cliniques visent à l’utiliser en combinaison thérapeutique avec d’autres traitements tel que les anti-angiogéniques. L’angiogenèse permet la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants et permet d’apporter de l’oxygène et des nutriments aux tumeurs en expansion. Cibler l’angiogenèse permet d’une part de normaliser les vaisseaux sanguins et d’améliorer l’infiltration en cellules immunitaires des tumeurs, puis également de limiter la croissance tumorale en privant les cellules tumorales de nutriments et d’oxygène. Dans une étude précédente, nous avons montré que cette combinaison thérapeutique ralentit la croissance tumorale dans des modèles de cancer colorectaux chez la souris. Les mécanismes mis en place nous suggèrent que les cellules tueuses naturelles (NK) jouent un rôle anti-tumorale clé en produisant du GM-CSF. Le GM-CSF est une molécule qui a un rôle anti-tumoral et qui stimule le système immunitaire. Afin de valider nos hypothèses, nous souhaitons utiliser un modèle de souris transgénique dans lequel les NK des souris ne produisent pas de GM-CSF. Le but de ce travail est donc de valider nos observations qui sont les suivantes : les NK produisent du GM-CSF qui a un effet anti-tumoral en induisant la maturation et le recrutement d’autres cellules immunitaires.

Bénéfices attendus

Le cancer est aujourd’hui un problème de santé publique majeur et est la seconde cause de mortalité dans le monde. A titre d’exemple, en 2020, 20 millions de personnes ont été diagnostiquées et 10 millions de personnes sont décédées. Au laboratoire, nous travaillons sur le cancer colorectal où les solutions thérapeutiques sont malheureusement insuffisantes. Nous espérons apporter des pistes d’améliorations pour augmenter l’efficacité de l’immunothérapie. De manière plus globale, les connaissances et résultats obtenus permettrons de mieux comprendre le rôle du GM-CSF produit par les NK dans une réponse anti-tumorale induite par un traitement anti-cancéreux. A l’heure actuelle, aucune étude n’a montré ce rôle dans le cancer.

Procédures

Sous anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront 1 injection sous cutanée de 1 minute, 7 jours plus tard, 8 injection Intrapéritonéale (IP) de 10 secondes, réparties sur une semaine et espacées de deux jours.

Impact sur les animaux

L’injection des tumeurs en sous-cutanée pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. Une perte de poids pourrait être observé. En réalisant des injections sous-cutanées, il est possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Aucun effet indésirable n’est attendu pour les traitements.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Nous utiliserons toutes les souris disponibles issue des croissements : mâles et femelles. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être importantes, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront élevées dans un milieu enrichi. Chaque animal sera examiné 3 fois par semaine, tout le long de l’expérimentation. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ce geste n’est donc attendue. Les injections de traitements seront réalisées sur des souris vigiles. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Si nous constatons un problème tel que la perte de poids excessive, une nécrose tumorale, une déshydratation, les souris seront mises à mort.

Choix des espèces

Disponibilité de modèle génétiquement modifié pertinent dans le projet scientifique : aucune autre espèce animale présente la même modification génétique. Les modèles tumoraux syngéniques existant sont utilisables chez cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

2 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie avec ouverture de la cage thoracique, des injections répétées et un suivi de la tumeur du foie par imagerie, jusqu'à un point limite au-delà duquel elles peuvent maigrir, s'isoler ou devenir agressives. Le porteur situe les retombées cliniques à long terme et au conditionnel. Il affirme que l'utilisation des souris reste "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant le microenvironnement tumoral.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’étudier des cellules du système immunitaire, les populations lymphoïdes, afin d’identifier celles qui sont impliquées dans le contrôle du développement des cancers du foie. Nous souhaitons également dans ce projet étudier le rôle de deux voies de signalisation cellulaire dans la fonction de ces populations cellulaires. Nous espérons ainsi définir clairement les différentes populations lymphoïdes impliquées dans le développement du cancer du foie et mettre en évidence un rôle déterminant des voies de signalisations dans leurs fonctions au sein de la tumeur. Nous espérons à l’aide de ces premiers résultats, qui seront complétés par des expérimentations in vitro, pouvoir améliorer l’efficacité des cellules lymphoïdes à l’encontre des cellules cancéreuses du foie afin de pouvoir proposer une nouvelle approche thérapeutique pour la prise en charge des patients atteints de cancer du foie.

Bénéfices attendus

Premièrement, ce projet permettra d’améliorer notre compréhension du développement du carcinome hépatocellulaire et du rôle joué par les populations lymphoïdes. Ensuite, ce projet nous permettra également de connaître le rôle de deux voies de signalisation cellulaire majeures dans la fonction des cellules lymphoïdes innées à l’encontre des cellules cancéreuses. Enfin, nous espérons démontrer qu’il est possible d’améliorer la fonctionnalité de ces cellules lymphoïdes innées grâce à la modulation de ces voies de signalisation et ainsi proposer une ou des nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge des patients atteints de cancer du foie. Les résultats obtenus grâce à ce projet, pourront permettre d’explorer par la suite cette ou ces approches pour une application en clinique en vue d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Ainsi à long terme, ces expérimentations s’inscrivent dans une recherche visant à améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer du foie.

Procédures

Les souris pourront subir une chirurgie avec ouverture de la cage thoracique sur une hauteur de 2cm environ. Cette procédure chirurgicale aura lieu une seule fois et durera environ 30minutes. Les souris pourront recevoir des injections en intrapéritonéale, cette procédure dure quelques secondes et l’animal est contentionné pendant moins d’une minute. Cette procédure sera répétée au maximum une fois par jour durant toute la durée de l’expérimentation. Les souris pourront recevoir des injections en intraveineuse. Pour cela la souris est contentionnée durant 2-3 minutes et l’injection dure quelques secondes. Cette procédure sera répétée au maximum une fois par semaine durant 7 semaines. Un prélèvement sanguin au niveau sub-mandibulaire pourra être réalisé une seule fois. Cette procédure dure moins d’une minute. Le suivi de la pousse tumorale chez les souris sera réalisé par imagerie. Pour cette procédure, les souris devront être immobilisées durant environ 30min et la procédure sera réalisée au maximum 14 fois durant toute la durée de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

Les animaux ne présentent habituellement aucun signe de souffrance avant que la tumeur atteigne la taille que nous avons fixé comme point limite. Il est alors possible que les animaux commencent à montrer des signes de stress physique et comportementale. D’un point de vue comportemental, les souris peuvent acquérir un comportement asocial, voir agressif ce qui n’est pas le comportement habituel de l’espèce. Nous pouvons observer aussi un arrêt de la toilette et possiblement une dépilation volontaire signe d’une détresse. D’un point de vue physique, nous pouvons observer un amaigrissement, notamment au niveau du bassin de l’animal, signe d’une perte d’appétit de l’animal lié à une détresse causée par une taille de tumeur importante. L’injection intra-veineuse par la veine caudale d'un grand volume de solution peut entrainer une douleur transitoire. Les autres injections par voie intrapéritonéale ou intraveineuse n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront développé une tumeur.

Remplacement

Dans la mesure du possible, les études que nous menons sont réalisées dans des modèles in vitro de cultures cellulaires. Cela nous apporte de nombreux éléments qui nous permettent d’affiner nos hypothèses ou d’en émettre de nouvelles. Cependant, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode suffisamment robuste pour reproduire in vitro la complexité du microenvironnement tumoral afin d’étudier les interactions entre le système immunitaire et la tumeur. Ainsi, afin de pouvoir apporter des réponses précises à nos problématiques de recherche, l’utilisation des souris reste indispensable. Une veille scientifique continue sera également effectuée, afin d’éviter toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire leur nombre autant que possible, tout en permettant d’identifier des effets biologiques suffisamment fiable, évalués par des analyses statistiques valides. Nos calculs ont pris en compte la variabilité interindividuelle ainsi que l’effet attendu. Afin d’améliorer la relevance de ces résultats, nous avons décrit trois modèles permettant d’induire un cancer du foie. Ces modèles ne seront pas réalisés de manière concomitante. Ainsi, bien évidemment, si une hypothèse est invalidée dans le premier modèle étudié, elle ne sera pas testée dans les autres modèles afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de limiter leur stress au cours de la procédure. Une fiche de suivi sera tenue, de manière journalière la semaine suivant l’induction de la tumeur puis de manière tri-hebdomadaires jusqu’à la fin de la procédure afin de vérifier l’état général des animaux et de prévenir toute souffrance évitable. Les animaux bénéficient des conditions normales d’hébergement et de soins de notre animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit, enrichissement des cages, nourriture à volonté). Toutes les souris en expérimentation possèderont du coton dans les cages en tant qu'enrichissement. De plus, dès que les souris commenceront à présenter une perte de poids détectable, de la nourriture en gel ou des crochets humides seront ajoutées dans leur cage. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation contraignante ou invasive sera réalisée sous anesthésie générale par voie gazeuse et la douleur sera prise en charge par administration d’antalgiques. Lors des chirurgies, le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure en évaluant les réflexes et la respiration. Pour prévenir une potentielle baisse en température, les animaux seront placés sur un coussin chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours des procédures. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, une mise à mort anticipée de l’animal sera réalisée.

Choix des espèces

Pour le moment, il n’existe pas de méthode suffisamment robuste pour reproduire in vitro la complexité du microenvironnement adéquat pour étudier les interactions entre le système immunitaire et la tumeur. Ainsi, afin de pouvoir apporter des réponses à notre problématique de recherche, l’utilisation des souris reste indispensable. De plus, l’existence de lignées de souris transgéniques permet des études mécanistiques approfondies qui nous permettront de mieux décrypter les voies de signalisation impliquées dans la fonction des cellules lymphoïdes et ainsi dans le contrôle de la progression du cancer du foie. Par ailleurs, il est à noter que le système immunitaire de la souris est proche de celui de l’Homme, au niveau des composants moléculaires et cellulaires, ce qui nous permet d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans le processus tumoral, et d’envisager par la suite un transfert de technologie chez l’homme. Pour ce projet, les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6 à 12 semaines afin d’être proche de la situation de la pathologie humaine. Les souris présenteront ainsi un système immunitaire pleinement fonctionnel.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées entre un et quatre mois après la greffe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant jusqu'à 17 fois sous anesthésie. Rasées et greffées sous la peau du flanc de cellules de mélanome de souris, elles reçoivent sans anesthésie deux injections d'anticorps qui bloquent leurs lymphocytes T régulateurs, puis sont opérées au douzième jour pour retirer la greffe et la peau qui la recouvre, afin de déclencher une dépigmentation de type vitiligo. Le porteur additionne ces actes en "68 minutes" par souris. Il annonce aussi 640 souris numérotées par amputation de phalanges et génotypées, et écrit que le protocole s'appliquera à "un maximum de 640 souris", pour 400 déclarées.

Objectifs

Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 2 mois, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 4 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.

Procédures

640 souris seront numérotées par phalangesctomie et génotypées. 400 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 6min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 15min). Puis, 2 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée 6x 3min). Entre 1 et 4 mois, le suivi sera uniquement visuel, sans anesthésie. Après 3 mois, selon le développement des taches blanches, des photos seront prises sous anesthésie gazeuse (durée = 4x3min). La durée totale de la procédure par souris est de 68 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, au niveau du point d’injection des cellules. Des résultats préliminaires de notre équipe démontrent que ce type de greffe n’engendre pas de métastases au niveau d’autres sites, ni de gène dans les mouvements des animaux. Nous avons déjà fait des injections intrapéritonéales d’anticorps sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. La résection de la greffe se fera sous anesthésie générale profonde. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.

Remplacement

Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse.

324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous la peau, puis des injections intrapéritonéales deux fois par semaine pendant quatre semaines, pour évaluer l'activité antitumorale d'anticorps polyclonaux. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une douleur si elle nécrose ou s'ulcère, et prévoit des points limites et une mise à mort en cas de signes cliniques. Il affirme que les études sur l'animal restent "indispensables" pour valider l'activité des traitements dans un environnement physiologique, malgré des tests in vitro disponibles.

Objectifs

L’immunothérapie antitumorale utilise les acteurs du système immunitaire pour s’attaquer aux cellules cancéreuses. L’objectif de ce projet est d’évaluer l'activité antitumorale d'anticorps polyclonaux dans des modèles murins de cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de confirmer l’activité antitumorale des anticorps polyclonaux et d’offrir une alternative thérapeutique aux patients dans des pathologies où le besoin médical est important.

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie. Le traitement sera effectué par injection en intrapéritonéal (2 fois par semaine pendant 4 semaines) sur animaux vigiles. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :moins de 5 min par souris. Pour les injections en intrapéritonéal, la manipulation des souris n'excédera pas 1 min.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Ils peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal. Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. L’état clinique et le poids des souris seront suivis 3 fois par semaine. Une contention légère sera faite sur les souris pour l'administration intrapéritonéale par du personnel qualifié afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Cette manipulation ainsi que la piqure ne dureront que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères.

Devenir

Après chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.

Remplacement

Si des tests in vitro sont utilisés pour évaluer l'activité des nouvelles thérapies, les études chez l'animal restent indispensables pour valider leur activité dans un environnement physiologique. Ces études permettent aussi de repérer une éventuelle toxicité des traitements et éclairent sur les modes d'action engagés.

Réduction

Le choix de 12 animaux par groupe est le nombre nécessaire et suffisant pour nous permettre de faire des analyses statistiques robustes.

Raffinement

Les souris seront hébergées selon la règlementation en vigueur avec des enrichissements afin de réduire l’angoisse, éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Des signes cliniques et points limites ont été définis afin de monitorer objectivement la soufrance des animaux. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux ou par injection d’analgésique selon les signes cliniques observés. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des frisottis sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher.

Choix des espèces

Les modèles xénogreffes décrits dans ce projet ont été validés et caractérisés dans des publications. Les animaux utilisés sont des souris immunodéficientes. Ces souris sont très largement utilisées pour la mise en place des modèles xénogreffes. Nous travaillerons avec des souris femelles (le sexe des animaux n'a pas d'impact sur les résultats mais les souris femelles étant plus légères elles permettent d'utiliser moins d'anticorps) jeunes adultes (la prise tumorale est plus homogène dans cette tranche d’âge).

2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une inoculation de bactéries de peau humaine par voie sous-cutanée ou dans une plaie créée au poinçon de 4 mm, avec prélèvements de sang rétro-orbitaires, avant mise à mort par dislocation cervicale au cinquième jour d'infection. Le porteur indique que l'injection peut provoquer des abcès ou une infection systémique "possiblement douloureuses" et surveille la douleur au moyen d'une grille de score. Il affirme qu'un processus impliquant autant de types cellulaires est "impossible à reproduire in vitro" et que l'expérimentation animale est un "élément clé" du projet.

Objectifs

Il existe des maladies génétiques telles que les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton caractérisées par une fragilité de la peau (génodermatoses). Les patients atteints de génodermatoses présentent des plaies qui sont infectées par des bactéries du microbiote cutané s. Les patients atteints des formes les plus sévères d’epidermolyse bulleuse présentent de larges décollements cutanés et développent des plaies infectées chroniques qui peuvent entraîner des cicatrices et une fibrose. Il est probable que la multiplication des bactéries sur la plaie, appelée "colonisation critique" dans la pratique clinique, entrave la cicatrisation et favorise l’inflammation locale et générale. En outre, les infections cutanées répétées favorisent les carcinomes spinocellulaires agressifs sur les sites exposés à des blessures continues. Les protéines (cytokines, chemokines, facteurs de croissance) exprimées au niveau de la plaie par les différentes populations cellulaires de la peau (kératinocytes, fibroblastes, cellules immunitaires) sont essentielles au processus de guérison et sont susceptibles d'être influencées par la colonisation par les bactéries du microbiote cutané. L'impact des différents types de souches bactériennes adaptées à l'hôte sur les signaux pro-inflammatoires et profibrotiques dans le contexte des plaies est mal connu. Les Objectifs scientifiques sont (i) comprendre pourquoi et comment les souches bactériennes issues de la peau humaine parviennent à coloniser de façon chronique la peau des patients atteints de pathologies de la barrière cutanée (ii) identifier les liens entre l'infection cutanée et les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte. Les objectifs cliniques sont (i) tester l’impact de molécules anti-inflammatoires et antibactériennes sur la colonisation bactérienne des plaies et sur les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte(ii) identifier les marqueurs de virulence bactérienne. AMENDEMENT : Les nouvelles souches de souris qui seront utilisées permettront de mieux déterminer les mécanismes pathologiques induits par des infections bactériennes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des infections chroniques de la peau chez les patients atteints d’altération de la barrière cutanée, comme les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton, en exploitant des souches bactériennes issues de la peau humaines. Nous comparerons 2 modes d’infection pour évaluer l’impact local des souches (infection de plaies) et leur capacité à disséminer à partir d’un abcès (infection sous-cutanée). Ceci nous permettra de mieux comprendre le rôle des bactéries dans les lésions localisées et dans les lésions compliquées d’infection disséminée. Il est fondamental de comprendre l'impact des infections. Notre projet vise à identifier des marqueurs de sévérité des infections chroniques de la peau pour une meilleure anticipation et gestion des complications chez les patients. Notre projet prévoit aussi de tester des molécules visant à inhiber l'inflammation et la fibrose de la peau ce qui pourra contribuer à mieux traiter les patients. En outre, notre projet peut aider à fournir une compréhension physiopathologique plus large des mécanismes complexes qui sous-tendent les dermatites chroniques également associées à des infections cutanées, comme la dermatite atopique et les plaies chroniques non cicatrisantes des diabétiques.

Procédures

Au cours de l’ensemble des procédures, les interventions réalisées sur les animaux seront : (i) Procédure 1 : Inoculation bactérienne sous-cutanée (1minute par animal). (ii) Procédure 2 : Lésion artificielle et inoculation bactérienne (15minutes par animal). (iii) : Anesthésie (3 fois au cours de chaque procédure, 5minutes par animal). (iv) Prélèvement sanguin rétro-orbitaire (2 fois au cours de chaque procédure, volume de 30 à 60ul de sang, 3 minutes par animal). (v) mise à mort par dislocation cervicale (quelques secondes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances infligées chez la souris sont (i) inoculation par injection sous – cutané, réalisée sous anesthésie gazeuse peut provoquer une infection profonde pouvant provoquer des abcès ou une infection systémique possiblement douloureuses (ii) la réalisation d’une plaie artificielle de 4mm par punch biopsy sous anesthésie peut entrainer une douleur. (iii) les prélèvements de sang rétro-orbitaire, réalisé sous anesthésie, à J2 et J5 peuvent engendrer une douleur. Pour le respect du principe des 3R la durée et les doses des infections seront réalisées selon les protocoles préétablis pendant une période d’infection de 5 jours ou la perception du stimulus qui causent la douleur sera surveillée par les critères relatifs au bien-être animal, selon une grille de score.

Devenir

Tous mis à mort à J5 de l'infection pour analyse histologique de la peau et quantification du nombre de bactéries.

Remplacement

Des expériences in vitro seront réalisées lorsque cela est possible pour démontrer le rôle précis de certains types cellulaires (keratinocytes, neutrophiles). Toutefois, les modèles animaux sont utilisés ici dans le but d’obtenir des modèles d’infection impliquant de nombreux types cellulaires interagissant les uns avec les autres et impossible à reproduire in vitro. En effet, au cours de l’infection les interactions entre les cellules de la peau (keratinocytes et fibroblastes) et les cellules immunitaires (neutrophiles, cellules de Langerhans, lymphocytes..) ont un rôle fondamental dans la capacité de l’hôte à éradiquer les bactéries pathogènes. De plus, l’infection est caractérisée par des symptômes uniquement observables chez l’animal (abcès). Il est donc impossible de reproduire efficacement un processus biologique aussi complexe impliquant le système immunitaire uniquement par des études in vitro. L’expérimentation animale est donc un élément clé de ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous utiliserons des souris femelles adulte s. Le nombre de souris qui sera inclus dans chaque groupe sera le plus faible possible pour pouvoir assurer la reproductibilité des expériences et répondre aux questions scientifiques . Le nombre d'animaux sera de 12 souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs. L’application de tests statistiques efficaces sur le nombre des échantillons collectés réduira l’utilisation des animaux dans les différentes conditions expérimentales. Le nombre d'animaux a été détermié par une approche statistique.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation du décret n°2013-118 et adaptées. Nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement des animaux par la mise à disposition de la nidification, de maisonnette et de bâtonnets en bois à ronger. Les animaux disposent de nourriture, d’eau et de litière. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux et de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance journalière et une durée limitée à 5 jours. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est sensibilisé à la détection des signes de souffrance des animaux et qualifié sur le plan réglementaire, technique en continu. Pendant la période de quarantaine les animaux seront familiarisés par la prise en main et la contention par l’expérimentateur. Pour limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie gazeuse. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée par le test des réflexes à la douleur (pincement du coussinet de la patte), les prélèvements sanguins rétro-orbitaire sont réalisés sur souris anesthésiées à l'isoflurane. La fréquence est de 2 prélèvements à J2 et J5 de l’infection en alternant les prélèvements des yeux. Afin de limiter la souffrance infligée lors des prélèvements sanguins, de l’ocry-gel sera appliqué en préventif sur l’œil prélevé, 5 min avant le prélèvement rétro-orbitaire. Des antalgiques sont prévus en pré-opératoire et en cas de souffrance en post -opératore si le score est égal à 2 (injection sous cutanée de 50ul de buprénophine à 0,05mg/kg). En cas d’atteinte de point limite égal à 3 , nous procèderons immédiatement à la mise à mort par une dislocation cervicale.

Choix des espèces

Au cours des quarante dernières années, la recherche sur les maladies infectieuses a fait de la souris un modèle de choix pour les maladies infectieuses humaines, permettant la mise au point de traitement efficaces et de réponses scientifiques. La pathologie de la peau développée suite à l’injection de bactérie chez la souris est très similaire à celle développée chez l’homme. Un autre facteur important la petite taille de l’animal, la courte gestation et la grande taille des portées rendent les souris facile à élever que tout autre mammifère actuellement utilisé pour la recherche sur les maladies infectieuses. Les souris adultes seront utilisées afin que le système immunitaire soit mature.

3 228 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections répétées, une infection chronique par le parasite Toxoplasma pouvant provoquer "un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à sept jours" et une perte de poids, des chirurgies stéréotaxiques et des tests cognitifs, pour étudier la neuro-inflammation dans la maladie d'Alzheimer. Les organes, dont le cerveau, sont prélevés après mise à mort. Le porteur affirme que les études in vitro "ne permettent pas" d'étudier le comportement et la cognition.

Objectifs

Une inflammation à bas bruit tout au long de la vie contribuerait aux mécanismes du vieillissement et même pourrait fortement peser dans la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer et des démences associées. Au niveau du cerveau, des médiateurs de l’inflammation, les cytokines, qui circulent en grande quantité dans le cerveau au cours des infections ou lors des maladies neurodégénératives pourraient perturber les mécanismes de réponses physiologiques du neurone. Il est donc important de mieux comprendre comment les processus de neuro-inflammation affectent le comportement et la cognition. Ici, il est proposé d'utiliser des modèles de souris dans lesquels il est possible d’induire la suppression de l’expression d’un récepteur à une cytokine à la fois, et cela seulement dans les neurones. Cela permettra d’étudier l’importance de cette cytokine dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, ainsi que dans des processus pathologiques. Ces derniers sont la neuroinflammation chronique ou des infections du système nerveux central. L'étude utilisera un modèle transgénique entrainant les symptômes de la maladie d'Alzheimer, ou une infection par Toxoplasma ou l'expression isolée de médiateurs de l'inflammation. Le recours à un modèle animal est donc irremplaçable pour cette étude, puisqu'elle vise à déterminer les effets de la suppression de la signalisation de cytokines sur la physiologie de neurones, le comportement et la cognition.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle des signaux pro-inflammatoires reçus par les neurones au cours des infections du système nerveux central et la réponse neuro-inflammatoire et la neurodégénérescence, permettra, sur le plan fondamental d'élucider les mécanismes clés mis en jeux dans les neurones et leur importance pour la fonction cognitive. Sur le plan médical, ces recherches pourraient déboucher sur l'identification de nouvelles cibles, pour des stratégies thérapeutiques contre des maladies neurodégénératives dont la maladie d'Alzheimer, pour laquelle aucun remède n'est connu.

Procédures

Les interventions concerneront: i) des injections intrapéritonéales répétées journalièrement pendant 5 jours, sur animaux vigiles (2904 souris, 5 jours, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection intrapéritonéale d'un parasite, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (2796 souris, une injection de quelques secondes); iii) deux types de chirurgies sous anesthésie générale: une de moins de 15 minutes (chirurgie cutanée, 432 animaux), ou/et une de moins de 40 minutes par animal (injection intracrânienne bilaterale, 960 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), la force (une session de 5 minutes au total par animal, à raison deux 3 essais de 5 secondes chacun et 30 secondes au minimum entre chaque groupe de 3 essais) et les processus cognitifs ( toutes les souris (3228), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal), labyrinthe de Barnes ( chaque souris testée une fois pendant 7 jours consécutifs, à raison de 3 essais d'exploration libre sur la table de 3 minutes maximum (selon la performance de l'animal) chacun par jour)), la perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde terminale (sans réveil, 3228 animaux, moins de 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées ne présentent aucun symptômes apparents de maladie et n'ont donc pas de phénotype dommageable, ce que nous avons confirmé lors de leur utilisation dans le cadre du premier protocole APAFIS autorisé pour ces lignées. Dans le cas d'infection par Toxoplasma ou l'infusion chronique de cytokines pro-inflammatoires par implantation de pompes sous cutanées, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies stéréotaxiques peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Du fait que les animaux sont acclimatés à l'environnement des tests comportementaux et sont habitués aux expérimentateurs par manipulations régulières des animaux dans les semaines précédant les tests, aucune nuisance n'est constatée durant les tests comportementaux. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes; où les souris doivent être hébergées individuellement, l'hébergement pourrait devenir anxiogène mais des mesures d'enrichissement du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.

Devenir

Les 3228 animaux seront en fin de procédure euthanasiés. L'euthanasie est nécessaire afin de prélever les organes en post-mortem (dont le cerveau) des animaux pour comprendre ensuite au niveau cellulaire et moléculaire, les causes et mécanismes des changements observés au niveau comportemental, et limiter le double-emploi au maximum. Ces prélèvements post-mortem sont aussi nécessaires afin de confirmer l'efficacité de la procédure.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant la neurodégénérescence. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires (12 pour les groupes contrôles témoins). En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 3 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 4 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont: perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, absence de toilettage. L'utilisation d'implants sous-cutanés permettront de délivrer des molécules de manière chronique ce qui évitera de devoir recourir à des injections journalières répétées. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids). La maitrise des interventions qui pourraient s'avérer douloureuses sera effectuée par l'utilisation d'analgésiques en péri-opératoire. Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux .

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel du parasite Toxoplasma gondii, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques la signalisation de médiateurs de l'inflammation dans les neurones dans le cadre d’une infection naturelle. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés (modèles invalidés pour un gène contribuant à la maladie ou exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux déficients pour la protéine étudiée n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieur à 6 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulations sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.

2 540 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses par voie sous-cutanée ou, sous anesthésie, directement dans le pancréas, puis jusqu'à 24 injections sur huit semaines, la tumeur pouvant induire "un dysfonctionnement léger de la fonction pancréatique". Même les animaux dont la tumeur ne s'est pas développée sont tués. Le porteur indique avoir déjà obtenu et breveté des résultats in vitro, tout en concluant qu'ils "ne permettent pas de récapituler la complexité d'un organisme vivant complet".

Objectifs

Nous avons identifié une stratégie médicamenteuse qui stimule l'activation de l'immunité, tout en diminuant les toxicités classiquement associées. Nous proposons de prouver la validité de cette stratégie thérapeutique en évaluant sa capacité à induire des réponses anti-cancéreuses et en mesurant les toxicités potentielles associées dans des modèles de cancers réfractaires à l'immunothérapie. Dans ce cadre, nous nous concentrerons sur le cancer du pancréas et le cancer de la peau menant à des métastases, cancers au pronostic sombre pour lequel l'immunothérapie représente un fort espoir thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce programme de recherche vise à approfondir la compréhension d’une stimulation de l'immunité innée au cours d’un traitement par immunothérapie. Nous déterminerons notre combinaison médicamenteuse présente un effet supérieur sur la réponse inflammatoire anti-tumorale en comparaison à l'utilisation des médicaments utilisés seuls. Les résultats de ce programme pourraient avoir un impact significatif sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les cancers réfractaires à l'immunothérapie et ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces et mieux tolérées pour les patients.

Procédures

Gestes techniques de cette demande sont les suivants : - injection de cellules cancéreuses en sous-cutanée (10 minutes) - chirurgie/injection de cellules cancéreuses en intra-pancréatique (30 minutes) sous anesthèsie - injection en intrapéritonéal sur animal vigile (20 secondes) = anticorps ou luciférine - injection en péritumoral sous-cutanée sur animal vigile (20 secondes) = anti douleur, anticorps ou traitements pharmacologiques. Au maximum un animal recevra : soit (i) - 1x chirurgie/injection de cellules cancéreuses en intra-pancréatique (20 minutes) sous anesthèsie -2x injection en sous-cutanée sur animal vigile (20 secondes) - 24x injection en intrapéritonéal sur animal vigile (20 secondes) sur une durée de 8 semaines soit (ii)- injection de cellules cancéreuses en sous-cutanée (10 minutes) - 24x injection en péritumoral sous-cutanée sur animal vigile (20 secondes)

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie (injections de cellules en intra-pancréatiques) les animaux pourraient ressentir de la douleur à la zone d'incision et d'injection et avoir un peu de difficulté à accéder à la nourriture. La présence d'une tumeur sur le flanc peut limiter les mouvements de la souris. La présence d'une tumeur en orthotopique (pancréas) peut induire un dysfonctionnement léger de la fonction pancréatique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Les animaux dont la tumeur ne s'est pas développée seront également euthanasiés, en effet ces animaux auront subi des changements dans leur immunité ne permettant pas leur réutilisation.

Remplacement

Dans le cadre du remplacement, visant à réduire l’utilisation de modèles animaux dans les procédures expérimentales, nous avons déjà réalisé des expériences in vitro permettant de mettre en évidence un l'effet synergique entre deux molècules. Ces résultats ont été brevetés par notre équipe. Ces résultats très encourageants obtenus en culture cellulaire ne permettent pas de récapituler la complexité d'un organisme vivant complet.

Réduction

Une étude statistique préalable et un nombre adapté de souris par groupe expérimental nous permettent de réduire le nombre d’animaux utilisé. Ainsi la taille des groupes a été déterminé via lun logiciel statistique et le nombre minimal d’animaux par groupe doit être de 8 à 10 animaux . De plus les études antérieures menées par le groupe, nous permettent également d’estimer d’une moyenne de 10 animaux par groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle ou expérimentale. Les prélèvements d’organes qui se feront après euthanasie des animaux.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne et pesés une fois par semaine. En préchirurgie les animaux recevront une dose d'antalgique et en post-chirurgie de la nourriture et de l'eau gélifiée seront posés à même le sol afin de leur permettre de se nourrir facilement en post-chirurgie. Les animaux seront placés en cage de minimum 4 individus avec maisonnette plus du coton afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux. Enfin des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le présent projet.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle expérimental de référence pour ce type d'expérience de greffes de cellules cancéreuses. Des souris de 7 à 12 semaines seront utilisées en début de manipulations expérimentales afin d’avoir des animaux adultes (d’âge mûr).