Système urogénital

400 brebis vont être utilisées, maintenues en élevage et réutilisées pour d'autres expériences, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit des injections d'une hormone provoquant l'avortement et des prises de sang, l'ensemble répété deux à trois fois par an. Le porteur indique que l'induction de l'avortement peut déclencher des contractions utérines douloureuses, et que l'hormone peut accélérer le rythme cardiaque et respiratoire. Ces avortements répétés servent à mettre au point un gel contraceptif destiné aux femmes, présenté comme une alternative "révolutionnaire" aux méthodes hormonales, la gestation des brebis n'étant pas utile au projet.

Objectifs

L’objet de cette demande est d’obtenir l’autorisation d’utiliser une hormone pour obtenir un avortement précoce en cas de gestation chez la brebis, et ceci de façon répétée. Cette procédure sera utilisée dans un projet dont l'objectif est de développer un gel contraceptif d’origine naturelle (non hormonal) à destination des femmes, comme alternative aux méthodes hormonales existantes. En effet, celles-ci provoquent des effets secondaires et/ou de l'inconfort, tels que prise de poids, diminution de la libido, augmentation du risque de maladies cardiovasculaires et de dépression. Malheureusement, les contraceptifs non hormonaux existants sont souvent peu pratiques. Ce projet propose donc de développer in vitro, puis de tester in vivo chez la brebis, un gel à déposer au niveau du col de l’utérus, qui formerait un bouchon empéchant le passage des spermatozoïdes. Le test de l'efficacité du gel est basé sur l'évaluation du passage ou non des spermatozoïdes dans le col de l’utérus de la brebis, dont une preuve effective est la fécondation. La gestation n’est pas nécessaire au projet, d’où la demande de pouvoir procéder à des avortements précoces.

Bénéfices attendus

Le gel contraceptif développé dans le premier projet est présenté comme une alternative révolutionnaire aux méthodes actuellement existantes : hormonales (avec tous les effets secondaires connus), non hormonales (qui présentent elles aussi des inconvénients), et les méthodes dites non-techniques (qui ont une efficacité relative). Ce gel est en effet très efficace (100% d’efficacité in vitro annoncée), sans hormones, peu invasif et très pratique d’utilisation. Il représente donc une solution de choix pour les millions de femmes qui ne peuvent et ne veulent pas utiliser d’hormones.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection lors du traitement de synchronisation, deux injections de l'hormone abortive par voie intra-musculaire, ainsi que trois prises de sang à la veine jugulaire. Ceci répété 2 à 3 fois. Chaque intervention dure moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes : douleur et hématome possible après les prises de sang, douleur causée par les injections de PMSG (synchronisation), de cloprostenol, par voie intramusculaire, répétées 2 à 3 fois dans l’année. Un stress peut être également occasionné par la contention nécessaire lors des injections et prises de sang. L’induction de l’avortement peut déclencher des contractions utérines douloureuses. Le cloprosténol peut provoquer des effets liés à l'activité de la prostaglandine F2α dans les muscles lisses, tels qu'une augmentation de la fréquence cardiaque et respiratoire et une gêne abdominale. Si malgré toutes nos précautions une rétention placentaire devait arriver, les animaux pourraient souffrir de fièvre, abattement, respiration plus rapide.

Devenir

Tous les animaux resteront dans l'élevage et pourront être réutilisés pour des expérimentations futures.

Remplacement

L’étude de l’efficacité d’un produit destiné à l’usage chez l’Homme doit d’abord se faire sur animaux, lorsque cela est éthiquement admissible. Dans notre cas, l’efficacité du gel a été évaluée in vitro. Elle doit maintenant être confirmée in vivo, avant de pouvoir démarrer une phase d’essai chez la femme. L’étude du passage des spermatozoïdes à travers le col de l’utérus n’est pas permise par des modèles in vitro et requiert des animaux pour l’étudier dans toute sa complexité.

Réduction

Sur la base d’une utilisation de 2 traitements par brebis, l’utilisation de l'hormone permet de diviser par 2 le nombre d’animaux nécessaires. Ainsi, la réalisation de 800 inséminations et donc une information sur 800 fécondations potentielles, pourra être obtenue avec seulement 400 animaux. De plus, le traitement évite de mener des gestations non nécessaires à terme et donc la procréation d’animaux non nécessaires.

Raffinement

Les brebis resteront dans leur troupeau tout au long du projet, et seront traitées sur le site d’élevage, par des opérateurs expérimentés. Un renforcement positif alimentaire sera mis en place après chaque manipulation. Les animaux seront habituées aux manipulations avant le démarrage de l'expérimentation. Les cous des brebis seront tondus afin que la veine jugulaire soit plus accessible, et éviter les hématomes. Une crème décongestionnante sera appliquée après le prélèvement. Si une infection utérine devait advenir, des antibiotiques et antiinflammatoires seraient administrés (points limites attendus : fièvre, abattement, respiration accélérée). De même, si l’avortement induit devait déclencher des contractions utérines douloureuses, un antiinflammatoire non stéroïdien serait administré (point limites attendus : abattement, voire anorexie en cas de douleur importante).

Choix des espèces

La brebis est un bon modèle pour étudier la viscosité du mucus cervical, et le passage des spermatozoïdes à travers le col utérin. Brebis adultes matures sexuellement, dans un état physiologique permettant une fécondation.

140 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un gavage quotidien sous contention pendant 30 jours, puis une injection rétro-orbitaire d'un fluorochrome et deux heures de mesure de la fonction rénale, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs reins. Le projet teste des médicaments censés stimuler l'activité d'un gène impliqué dans une maladie rénale génétique, la maladie d'Alport, et le porteur affirme viser un traitement pour une maladie aujourd'hui sans traitement pharmacologique. Il décrit un modèle où les souris ne présentent pas de symptômes douloureux et conclut que le recours à la souris est "absolument nécessaire" pour reproduire un processus "difficile, voire impossible" à récapituler in vitro.

Objectifs

Nous étudions un gène qui joue un rôle important dans la morphogenèse du rein ainsi que le maintien des fonctions rénales chez l’adulte. Chez l’homme, des mutations dans ce gène sont responsables de pathologies rénales diverses et graves comprenant des anomalies du développement rénal (dysplasie, hypoplasie) et des atteintes de la différenciation tubulaire plus tardive (kystes). Il s’avère que nous avons constaté que le développement des dysfonctionnements liés à l'apparition d'une maladie rénale, en générale, s’accompagne par une profonde diminution de l'activité de notre gène d'étude. Nous émettons donc l’hypothèse qu’une partie des dysfonctionnements observés dans l'insuffisance rénale chronique puissent être expliqués par la baisse soudaine de l’activité de notre gène. Nous allons tester cette hypothèse en traitant des souris qui soufrent d'insuffisance rénale par des médicaments qui stimulent l'activité de notre gène d'étude.

Bénéfices attendus

Le bénéfice susceptible de découler de ce projet est le développement et la validation d'un nouveau traitement pour une maladie génétique qui n'a pas de traitements pharmacologiques disponibles. Nous attendons pouvoir mesurer l’effet du traitement par ces médicaments sur le degré d’avancement du disfonctionnement rénal. Ces mésures seront effectué par 1) analyse d’image de sections histologiques (quantification de fibrose interstitielle par analyse de coupes histologique coloré au Sirius Red et PAS) 2) par mesure de la fonctione rénale en se basant sur la clearence de la sinistrine. 3) par mesure de l'expression génique liée au dysfonctionnement rénal dans l'ARN rénal.

Procédures

Nous allons traiter 140 souris males. Chaque souris sera soumise à un gavage quotidien pendant 30 jours (en état vigile en contention) d'un médicament (ou du placebo). Chaque procédure de gavage va durer moins de 2 minutes. A la fin des traitements, une injection retrorbitale d'un fluorochrome pendant moins d'une minute. Une mesure de la fonction rénale sera effectuée avec un photodiode pendant la durée de deux heures.

Impact sur les animaux

En dépit de la présence d'une insuffisance rénale progressive liée à un défaut génétique, au stade du developpement de la maladie qu'on étudie dans ce protocole, les souris ne souffrent pas de nuisances évidentes. D’autre part, pour ce qui concerne les médicaments qu'on doit tester, des études récentes ont montré que ces composés, administrés par gavage à ces doses, ne provoquent pas de conséquences visibles sur le bien-être des animaux. Les souris seront exposées au stress lié à un gavage quotidien pendant 30 jours.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce protocole seront mis à mort à la fin de procédure. En effet, le prélèvement des reins nécessite la mise à mort des souris.

Remplacement

Remplacement : La complexité du rein et de la maladie rénale nécessite l’utilisation d’un modèle animal. Mais les molécules à l'étude de ce protocole ont préalablement été testées sur des cultures cellulaires ce qui nous permet d’envisager une gamme d’efficacité sans toxicité pour les animaux.

Réduction

Réduction : nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. En effet, nos résultats antérieurs ont montré que le nombre d'animaux qu'on a choisi pour effectuer nos expériences nous garantit que par rapport à l’effet biologique attendu, la variabilité expérimentale qui inévitablement va accompagner nos mesures, va nous permettre d’atteindre une puissance statistique suffisante pour pouvoir tirer une conclusion scientifiquement acceptable. Le test statistique adopté sera le ANOVA.

Raffinement

Comme chez l’homme, les maladies rénales restent longtemps silencieuses et le modèle murin qu'on va adopter ne comporte pas de souffrance spécifiquement liée à la déficience rénale. En tout cas, les animaux seront mis à mort avant l’apparition de symptômes douloureux. Une surveillance quotidienne sera effectuée auprès des animaux afin de s’assurer de leur bien-être constant en se référant à une grille de points limites. Pour compléter cette surveillance les souris seront pesée chaque jour pendant le traitement. Si les souris dépassent un niveau de score 1 pour l'évaluation de leur apparence physique ou de leur comportement, on mettra en place l’administration d’un antalgique. En cas d'atteinte d'un point limite, on choisira la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le développement de l'insuffisance rénale dans les modèles murins représente un excellent modèle experimental qui se rapproche de celui de l'homme. En effet, en néprologie experimentale, la souris représente l' animal le plus adapté pour ce qui concerne l'études des organismes génétiquement modifiés. La complexité du système étudié (la fonction rénale) est très importante. L'utilisation d’un modèle animal est absolument nécessaire car il nous permettra de démontrer l’efficacité de certains médicaments pendant le développement des lésions rénales, un processus hautement complexe qu’il est difficile, voire impossible, de récapituler in vitro. De plus, le développement des lésions rénales chez la souris Alport est un excellent modèle expérimental qui se rapproche de celui de l'homme. Le traitement des souris sera effectué à partir du 30eme jour après la naissance, à un stade de developpement de la maladie assez précoce où les lésions rénales sont à peine visibles. Normalement, ce modèle génétique va developper des lésions rénales plus sévères 1 mois après le début du traitement pharmacologique. En fin de traitement (au 60eme jour après leur naissance), la fonction rénale sera mesurée et par la suite les mâles seront mis à mort par dislocation cervicale et les reins prélevés pour analyse histologique (par une coloration des coupes histologiques en PAS et SyrusRed) et d’expression génique. Le traitement des souris sera effectué à partir du 30eme jour après la naissance, à un stade de developpement de la maladie assez précoce où les lésions rénales sont à peine visibles. Normalement, ce modèle génétique va developper des lésions rénales plus sévères 1 mois après le début du traitement pharmacologique. En fin de traitement (au 60eme jour après leur naissance), la fonction rénale sera mesurée et par la suite les mâles seront mis à mort par dislocation cervicale et les reins prélevés pour analyse histologique (par une coloration des coupes histologiques en PAS et SyrusRed) et d’expression génique.

440 génisses vont être utilisées, toutes gardées en vie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Quarante donneuses subissent environ cinq sessions de ponctions ovocytaires sous anesthésie épidurale après traitement hormonal de superovulation, et quatre cents receveuses reçoivent un transfert d'embryon, dont deux cents avec prélèvement sanguin. À l'issue, les donneuses sont recyclées vers d'autres projets ou vendues en élevage commercial et les receveuses restent dans leur exploitation. Le porteur décrit un objectif d'amélioration des taux de gestation au service de la sélection génétique bovine, et affirme qu'aucune autre espèce ne peut être choisie.

Objectifs

Actuellement, les biotechnologies de la reproduction et de l’embryon sont utilisées par les entreprises de sélection bovines afin d’accroitre le progrès génétique par la réduction de l’intervalle entre générations et l’augmentation de l’intensité de sélection. Cependant, les taux de gestation obtenus depuis le développement de ces techniques n’ont pas progressé. Pire, des taux de gestation atteignant seulement 35 à 40% sont obtenus dès lors que l’embryon utilisé a été produit in vitro, biopsié et congelé, conduisant à d’importantes pertes économiques et génétiques. Ces échecs peuvent en partie être attribués à une mauvaise évaluation de la qualité des embryons transférés qui ne sont, à ce jour, évalués que d’un point de vue morphologique selon les critères de l’International Embryo Technologies Society qui restent relativement subjectifs et donc variable d’un opérateur à l’autre. Le développement de marqueurs embryonnaires prédictifs de la réussite au transfert permettrait d’améliorer l’efficience de ces techniques par un tri plus sévère et objectif des embryons à transférer. Ce type d’indicateurs n’existe pas à ce jour mais des résultats préliminaires intéressants ont été obtenus par l’utilisation de systèmes de time-lapse permettant de suivre en continu les 1ères étapes du développement embryonnaire. Des embryons de qualité morphologique similaire, atteignant le même stade au même moment, affichent parfois une cinétique de développement totalement différente. Au cours d’un projet antérieur, des taux de gestation contrastés ont été obtenus après transfert d’embryons possédant un profil de développement différent (de 38 à 65% de gestation selon les classes d’embryons transférés). Ces premiers résultats, obtenus sur des effectifs trop faibles, nécessitent d’être confirmés à plus large échelle pour confirmer l’intérêt de ces approches de plus en plus utilisées en médecine humaine. Le projet présenté dans ce document vise donc à déterminer si la classification établie sur ces paramètres (4 classes d’embryons selon leur profil morphocinétique) conduit à des différences significatives de réussite au transfert. De plus, le projet vise également à étudier l'autre facteur de réussite indispensable à l'établissement d'une gestation qui est la réceptivité de la femelle receveuse d'embryons. De la même façon, des biomarqueurs sanguins intéressants ont été identifiés dans un projet antérieur et il convient aujourd'hui de les valider sur un effectif plus large.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider ou d’infirmer un nouvel indicateur non invasif de qualité embryonnaire chez les bovins. Ce projet permettra également de progresser dans les connaissances sur la réceptivité des femelles receveuses d'embryons et de valider ou d'infirmer les biomarqueurs sanguins candidats. In fine, l'amélioration des taux de gestation via ces deux approches conduira à une meilleure efficacité des schémas de sélection, notamment par la diminution du nombre d'animaux donneurs et receveurs nécessaires à la procréation des futurs taureaux d'insémination (gains économique, réduction de l'impact environnemental, impact social positif sur les acteurs du schéma).

Procédures

Les 40 génisses donneuses hébergées en conditions expérimentales seront soumises à environ 5 sessions de ponctions ovocytaires après anesthésie épidurale et traitement hormonal de synchronisation et de superovulation (durée de 30 minutes). Les 400 génisses receveuses hébergées en fermes commerciales seront soumises à 1 transfert embryonnaire après anesthésie épidurale et traitement hormonal de synchronisation des chaleurs (durée de 5 minutes). Pour 200 d'entre elles, elles subiront un prélèvement sanguin (durée de 1 à 2 minutes) à la veine caudale juste avant la réalisation du transfert embryonnaire.

Impact sur les animaux

Peu de nuisances sont attendues sur les animaux de ce projet. Les procédures expérimentales mises en oeuvre sont des pratiques couramment utilisées par les professionnels chez les bovins depuis de nombreuses années et ne semblent pas impacter la santé et le bien-être des animaux. En effet, la ponction ovarienne sous contrôle échographique et le transfert d'embryons sont deux techniques de reproduction couramment utilisées par les entreprises de sélection dans le cadre des schémas d'amélioration génétique et sont réalisées sous anesthésie épidurale. De ce fait, le projet présenté n'est susceptible d'engendrer qu'une douleur légère et très ponctuelle chez les animaux. De plus, les prélèvements sanguins, même si ils peuvent générer du stress de façon transitoire, ne devraient pas conduirent à des nuisances importantes (hématome de façon exceptionnelle) pour les animaux puisque ceux-ci sont peu nombreux et de faible volume.

Devenir

Les interventions réalisées sur les animaux étant des procédures d'élevage classiques qui n'induiront, à priori, que peu de nuisances, toutes les génisses seront normalement gardées en vie à la fin de ce projet sauf avis contraire du responsable scientifique, du vétérinaire sanitaire et des éleveurs impliqués. Les génisses donneuses seront éventuellement recyclées pour un autre projet de recherche ou de formation mais pourront également être mises à la reproduction hors expérimentation et vendues en élevage commerciaux pour poursuivre leur carrière. Les génisses receveuses, quel que soit l'issue du transfert seront conservées dans leur exploitation d'origine.

Remplacement

Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo.

Réduction

L’étude est mise en place dans les installations de la station de phénotypage ELIANCE sur un total de 40 génisses donneuses pour la production des embryons et sur 400 femelles receveuses en fermes commerciales. Afin de comparer les taux de gestation et les taux de vêlages entre les différentes catégories d’embryons, une régression logistique (PROC GLIMMIX sous SAS) sera effectuée. A priori, elle inclura l’effet fixe du groupe morphocinétique (A, B, C, D) ainsi qu’un effet aléatoire de l’élevage. D’autres effets pourront être intégrés au modèle après analyse des différents facteurs de variation de la base de données. Les effectifs prévus dans l’étude permettront, en considérant un risque alpha de 5% et une puissance de test de 80%, de mettre en évidence de façon significative une différence minimale de 20% entre les groupes. Des modèles de régressions linéaires pourront également être effectués pour étudier d’autres variables quantitatives (intervalle de temps entre le transfert d’embryons et les échecs de gestation…). Selon les résultats obtenus, d’autres approches statistiques de type random forest pourront aussi être menées (prédiction des taux de gestation à partir des paramètres morphocinétiques bruts) afin d’optimiser l’arbre de classification morphocinétique des embryons. L'analyse des paramètres sanguins des 200 femelles receveuses sera également effectuée par des approches multivariées (ACP, PLS-DA, régressions linéaires intégrant les effets fixes de la gestation et de la classe d'embryons) intégrant les mêmes niveaux de risques statistiques mais également des analyses de type randon forest pour la prédiction de gestation à partir des différents marqueurs mesurés.

Raffinement

Les génisses donneuses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, rumination) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales...). En dehors de l'enrichissement du milieux, le raffinement des procédures sera également recherché par la réalisation d'une anesthésie épidurale préalablement à chaque ponction ovocytaire. Compte-tenu de ces précautions, le projet présenté n'est susceptible d'engendrer qu'une douleur légère et très ponctuelle chez les génisses. En cas d’atteinte du point limite (posture de compensation, station prolongée debout ou couché, difficulté pour manger et boire, chute importante de rumination ou de l'activité, modification comportementale induite par stimulation de la zone douloureuse, lésions, modifications neurovégétatives ou physiologiques), les procédures expérimentales seront stoppées et les solutions thérapeutiques à apporter seront définies par le vétérinaire sanitaire de l'élevage. Dans un objectif de renforcement positif, une récompense alimentaire (concentrés, seau de mélasse à lécher,....) sera donnée aux femelles après chaque passage dans la cage de contention. Les femelles receveuses seront conduites selon les pratiques en place dans les élevages concernés. Une anesthésie épidurale sera également réalisée avant chaque transfert embryonnaire. Une attention particulière sera apportée juste après le retrait de l'aiguille en réalisant un point de compression suffisamment long pour réduire au maximum le risque d'hématome et préserver l'intégrité des tissus entre chaque prise de sang.

Choix des espèces

Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon. Les animaux donneurs utilisés dans ce projet seront des génisses, toutes pubères. Le modèle génisse a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….). Sur le terrain, les transferts sont également majoritairement réalisés sur des génisses car les taux de réussite sont supérieurs à ceux obtenus sur vaches.

700 bars européens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés pendant deux mois au triphényl phosphate, un plastifiant suspecté d'agir comme perturbateur endocrinien, à concentration environnementale, puis maintenus neuf mois avant d'être tués pour prélèvement d'organes et de tissus. Le porteur décrit un suivi par grille de score, un individu à la nage désordonnée étant mis à mort au point limite, et ne prévoit pas d'intervention sur animal vigile ou anesthésié en dehors de cette fin. Il affirme que les approches in vitro ou in silico ne permettent pas d'évaluer l'impact du produit sur un "organisme entier", ce qui justifierait selon lui le passage par le poisson vivant.

Objectifs

L'immunité est une fonction majeure impliquée dans les défenses contre les agents pathogènes. Chez les vertébrés à mâchoire, les lymphocytes T ont la particularité de se développer dans le thymus lui-même sujet à des variations de taille suivant l'âge ou les taux plasmatiques des hormones sexuelles. Ces variations ont été associée à une altération de l'abondance des sous-types de lymphocytes T périphériques, une diminution de la réponse immunitaire adaptative, une augmentation de l'incidence des maladies infectieuses et une augmentation de la tolérance immunitaire (grossesse). Nous avons montré que les effets des estrogènes sur le thymus et les lymphocytes T étaient conservés entre le bar et les mammifères et que l’exposition à de l’estradiol (E2) modulait chez le bar la plasticité thymique et augmentait sa tolérance immunitaire. Chez le poisson, le thymus subit une involution hivernale puis une reformation en été qui semble avoir lieu chez des juvéniles de l'année mais également des individus matures avec chez ces derniers une involution plus marquée ainsi qu'un dimorphisme sexuel. En plus des hormones sexuelles, celles du métabolisme semblent également être des éléments de premier ordre dans ce phénomène. Ces dernières ont un rôle dans la gestion des réserves énergétiques ou le métabolisme en général, mais également dans la régulation de la reproduction. Ainsi, les fonctions de reproduction, d’immunité et de métabolisme sont étroitement liée. Au sein de ce projet, nous testerons dans un premier temps (1) l’hypothèse selon laquelle l'involution thymique serait influencée par les hormones stéroïdes résultant d’un compromis énergétique (trade-off) entre immunité et reproduction. L’action des perturbateurs endocriniens à activité estrogénique (PEE) sur les téléostéens est bien documentée (reproduction, croissance, immunité…) mais rares sont les études analysant les impacts sur plusieurs fonctions physiologiques à la fois. Le triphényl phosphate (TPP), détecté dans les eaux de surface de nombreux pays, est un plastifiant suspecté PEE, connu pour affecter la reproduction, l’immunité et le métabolisme. Ainsi, dans un second temps, (2) nous évaluerons l’impact du TPP sur ce trade-off établi entre ces trois grandes fonctions.

Bénéfices attendus

- Chez les poissons téléostéens, les connaissances concernant la régulation endocrinienne et environnementale (incluant la contamination environnementale) de la reproduction et de l’immunité par les hormones du métabolisme sont quasiment inexistantes. Or il s’avère que la compréhension de ces mécanismes est à la base de cette demande. Les mécanismes étant très conservés chez les vertébrés, les résultats permettront par ailleurs de mieux comprendre le lien existant entre certaines pathologies humaines métaboliques, l’immunité et la reproduction. - L’étude de l’action du TPP sur un équilibre affectant plusieurs fonctions physiologiques permet une vision plus intégrative et de mieux appréhender les risques environnementaux et sanitaires associés à la présence de ce contaminant largement utilisé dans les produits de la vie quotidienne. Nous pourrons faire une évaluation intégrative de la santé des individus de poissons mais aussi plus largement des populations. - Ce travail aidera, par extrapolation, à élucider l’impact du TPP dans certaines pathologies humaines métaboliques, mais aussi sur l’immunité et la reproduction qui, chez les sujets obèses, sont moins performantes.

Procédures

Les animaux seront exposés à un contaminant à concentration environnementale pendant 2 mois, puis maintenus en condition non contaminée pendant 9 mois (température, luminosité, pH contrôlés). Aucune intervention sur animal vigile ou endormi. Chaque individu sera euthanasié pour prélévement d'organes et tissus.

Impact sur les animaux

Le projet est divisé en deux périodes. Durant la première, les poissons seront maintenus en conditions contrôlées mimant une évolution naturelle des saisons. Durant la seconde, les individus seront exposés à un contaminant à concentration environnementale pendant 2 mois, puis maintenus en condition non contaminée pendant 9 mois (identique à la première période). Un période d'acclimatation de 7 jours sera respectée afin de permettre leur habituation et une meilleure gestion du stress. Des contrôles quotidiens seront effectués afin de s'assurer du bien-être des poissons et du respect des conditions d'hébergement (température, pH, luminosité...). Dans le but de réduire au maximum la douleur, l’angoisse et la souffrance des animaux nous utiliserons durant toute l’expérimentation la grille de score de la Fraunhofer institute. Un animal qui présenterait une nage sur le dos avec des mouvements non coordonnés, nage erratique serait immédiatement euthanasié (point limite) après anesthésie (MS222).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement d'organes et tissus.

Remplacement

Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de ce PEE sur un organisme entier. Afin de comprendre l’impact de ce TPP sur la physiologie du poisson, nous devons obligatoirement passer par un modèle vivant. Cependant, toutes les études préalables de définition de concentrations utiles ont été réalisées par une approche in vitro.

Réduction

- Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux, nous avons calculé l’effectif nécessaire pour pouvoir détecter un effet significatif s’il existe réellement. Pour cela, il est nécessaire de décrire plusieurs paramètres : la puissance statistique souhaitée (habituellement 90%), delta (différence de moyenne attendue), sd (écart-type attendu des données), le risque alpha (habituellement 5%). Les paramètres delta et sd ont été obtenus à partir d’expérimentations précédentes sur des bars matures mâles et femelles. Résultat : - Les concentrations utilisées sont en cours de détermination grâce à des tests in vitro. Ces derniers permettront de cibler les concentrations intéressantes afin de limiter le nombre de conditions et donc d’organismes utilisés. - Plusieurs mesures biologiques et chimiques sur chaque individu

Raffinement

Dans le but de réduire au maximum la douleur, l’angoisse et la souffrance des animaux nous utiliserons durant toute l’expérimentation la grille de score de la Fraunhofer institute qui est un bon guide pour la prise de décision quant à la souffrance animale. Un animal qui présenterait une nage sur le dos avec des mouvements non coordonnés, nage erratique serait immédiatement euthanasié (point limite). Nous souhaitons qu’à la base de cette grille de score nous restions avec des animaux qui sont en code couleur vert.

Choix des espèces

Le bar Européen constitue une espèce à fort intérêt écologique et économique et, du fait de sa production aquacole importante, son système immunitaire et reproductif font l'objet de nombreux articles scientifiques. De plus, suivant nos recherches, chez le bar, le thymus et les lymphocytes T font l'objet d'une régulation fine par les composés oestrogéniques, ce qui suggère que l'immunocompétence du bar pourrait être impactée par des perturbateurs endocriniens oestrogéniques présents dans son environnement. Cette espèce constitue donc un modèle de choix pour notre étude. Ce poisson est par ailleurs soumis à des restrictions croissantes de pêche en Europe de l’Ouest (850/98/EU ; 2018/120/UE) car les stocks de celui-ci sont actuellement en déclin et cela ne résulte probablement pas uniquement d’une activité de surpêche. Les individus seront pris à un âge où ils sont encore sexuellement immatures mais immunitairement matures (dès 180 dph, cohortes 1b et 2b) et matures à la fois sexuellement et immunitairement (dès 450 dph, cohorte 1a et 2a). Nous sommes intéressés par l’étude des étapes clés correspondant au basculement d’une immunité « entière » à une immunité moins complexe et en fonction de la saison et de la mise en place d’une stratégie de reproduction. Chez les bars, en termes de reproduction, les mâles développent leurs gonades dès 310 dph et les femelles en condition contrôlée dès 240 dph. Pour ce qui attrait à l’immunité, les bars sont matures dès 180 dph.

96 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections quotidiennes sous la peau pendant quinze jours, un test de tolérance au glucose après une période de jeûne, et deux prélèvements sanguins. Elles sont ensuite tuées et autopsiées pour analyser le testicule et d'autres organes. Le projet étudie l'effet de deux molécules régulant le glucose sur la fertilité masculine, le porteur indiquant qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'intégrer les effets sur l'organisme entier.

Objectifs

Dans le monde nous estimons que 2 à 12% des hommes sont infertiles. Des facteurs génétiques mais aussi des changements de mode de vie (peu de sport, alimentation riche) peuvent conduire à une baisse de la fertilité à l'âge adulte. Ainsi, dans le cas d’un apport riche en glucides ou dans le cas de diabète sucré chez l’adulte, la qualité du sperme et de son patrimoine génétique sont altérés. Toutefois, après l'arrêt de la consommation de haute teneur en fructose, le nombre de spermatozoïdes retourne à une valeur normale. Dans cette étude, nous allons essayer de mieux comprendre comment le métabolisme glucidique peut affecter la fertilité masculine en utilisant deux classes de molécules (médicaments) utilisées pour réguler la voie des glucides. Nous utiliserons une molécule qui va favoriser l’entrée des glucides dans la cellule (molécule anti-diabetique) ; et la seconde molécule est une hormone produite par le foie . Cette hormone est actuellement étudié pour le traitement de maladies métaboliques (obésité, diabète), mais nous ne connaissons pas ses effets sur la reproduction. L’objectif du projet est d’identifier les effets de ces modulateurs des glucides sur la fonction testiculaire. Ainsi, au cours de cette étude, nous exposerons 2 groupes de souris mâles adultes (saines ou en surpoids suite à un régime riche en lipides) avec soit 1/ l'hormone et 2/ soit avec une molécule qui agit comme sensibilisateur aux glucides (anti-diabetique).

Bénéfices attendus

L’obésité peut conduire à l’apparition de pathologies telles que les maladies cardiovasculaires, ou l’infertilité. Ainsi, dans le cas d’un apport riche en fructose ou dans le cas de diabète sucré chez l’adulte, la qualité du sperme et de l’ADN des spermatozoïdes est détériorée. Les mécanismes d’actions des glucides sur le testicule ne sont pas clairement connus et posent des questions sur les nouveaux traitements thérapeutiques régulant le métabolisme glucidique et leur innocuité sur la fertilité masculine. Le fait que récemment, il a été mis en évidence des taux plasmatiques d'une hormone négativement corrélés aux taux sériques en testostérone chez les patients atteints d’obésité, suggère qu'elle peut agir directement ou indirectement sur plusieurs cellules du testicule et modifier leurs activités . Est ce que ces molécules agissent sur la fonction testiculaire et quels effets peuvent elles avoir ? Les données permettront de mieux comprendre l'importance 1/ du métabolisme glucidique et de sa dérégulation dans la fonction testiculaire et 2/ d'identifier les effets sur le testicule de ces médicaments.

Procédures

La moitié des males auront pendant 15 jours des injections journalières en sous-cutanée avec soit l’hormone, soit du sérum physiologique, l'autre moitié des males auront une administration dans l'eau de boisson. L'ensemble des males auront un test de tolérance au glucose qui nécessite une période à jeûn de 4 à 6h suivi d'une injection de glucose puis de mesures répétées du glucose dans une goutte de sang sur une période de 2h. Enfin les animaux auront 2 prises de sang au cours de l'expérimentation pour vérifier les effets des traitements sur le métabolisme du glucose et sur des marqueurs de la fonction testiculaire.

Impact sur les animaux

Les molécules utilisées ont déjà été etudiées aux concentrations que nous souhaitons utiliser. Elles sont en cours d'essais chez l'Homme. Elles ont montré avoir un effet benefique sur le métabolisme glucidique en cas d’hyperglycemie. Les tests decrivent une "innocuité et tolérance bonnes, similaires au placebo" . Les autres nuisances potentielles sont les injections sous-cutanée qui peuvent potentiellement conduire à une infection, mais les solutions seront preparées sous hotte stérile ainsi que l'apparition d'hematome lors des prises de sang.

Devenir

A la fin de l'experimentation, l'ensemble des males seront euthanasiés et autopsiés pour analyser les effets des molécules (analyse histologique et analyse fonctionnelle moléculaire du testicule, hypophyse, foie, tissu adipeux).

Remplacement

A l'heure actuelle, il n’y a aucune méthode de remplacement, puisque les essais in vitro ont été réalisés. L'analyse proposée, nécessite d'intégrer les effets sur l’organisme en entier (notamment en prenant en compte le métabolisme glucidique par le foie, le tissu adipeux et les muscles) sur la fonction testiculaire. Les effets des molécules ont déjà été caractérisés in vitro sur 2 lignées de cellules et aucun effet toxique (mortalité cellulaire) n’a été observé.

Réduction

Des conditions sont mises en place afin de réduire le nombre d’animaux utilisés ainsi nous utilisons qu’une seule dose des médicaments qui est la dose efficace en se basant sur les données de la littérature et du developpeur. Nous optimisons également les analyses au niveau moléculaire, afin d'utiliser peu d'echantillon.Toutefois, pour faire face à la variabilité individuelle, nous avons besoin d'un nombre minimal d'animaux par groupe (12) pour avoir une analyse statistique fiable. Les tests statistiques seront menés pour tester les différences entre le groupe contrôle et le groupe traité de 12 animaux.

Raffinement

Afin de reduire au minimum les effets sur le bien-être animal, les animaux seront élevés dans les meilleures conditions d’élevage avec la présence d’un enrichissement (une cabane en carton pour se cacher et des morceaux de cartons "crinklets" pour faire leur nid), une surveillance accrue sera réalisée les jours suivants la prise de sang ou le test de tolerance au glucose. Si toutefois, un animal présentait un des points limites sur l'apparence, poids, ou le comportement, ou une combinaison de signes cliniques inquiétant, le vétérinaire référent ou un responsable bien-être local serait consulté et/ou les animaux euthanasiés. Dans le cadre des procedures, pour limiter la douleur, nous utiliserons un anesthesique pour les prises de sang et et un analgesique pour le test de tolerance au glucose et pour limiter la possibilité d'hematome nous effectuerons un point de compression. Pour limiter le stress, les animaux resteront au maximum dans leur cage d'hebergement habituelle.

Choix des espèces

Les souris sont des petits mammifères qui ont une vitesse de reproduction rapide (il ne faut que 30 jours pour produire un spermatozoïde à partir d’une cellule souche, contre 80 jours chez l’homme), et la durée de gestation est de 21 jours. De plus les marqueurs et paramètres du métabolisme glucidique ont été très bien caractérisés et facilement mesurables. Cette espèce est donc un très bon modèle pour étudier les effets des composés agissant sur le métabolisme sur la fonction testiculaire, chez les mammiferes. A l’heure actuelle, aucune donnée sur la reproduction n’est connue pour ces molécules. à partir de 6 semaines, les souris peuvent être considérées comme jeune adulte (fin de la puberté), et peuvent se reproduire. Nous utiliserons des animaux avec un âge supérieur à 6 semaines (8 semaines ).