Système urogénital

40 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Trente-trois subissent une autogreffe de l'utérus puis une seconde opération sans réveil quatre jours plus tard, les sept autres servant de témoins avec la même chirurgie. Le porteur décrit les risques de cette chirurgie longue, hypothermie, douleurs et hémorragie interne, et un hébergement seul de quatre jours en post-opératoire. Le projet cherche des marqueurs sanguins de rejet du greffon utérin, le porteur qualifiant le modèle ovin de "meilleur modèle animal" et le recours à l'animal d'"indispensable".

Objectifs

Deux études préliminaires ont permis de démontrer la faisabilité, puis la maitrise de la greffe utérine chez la brebis. La mise en évidence de marqueurs sanguins reflétant un défaut de fonctionnalité de l’utérus, et en particulier un état inflammatoire important, permettrait de modifier les modalités de surveillance et de mettre en place une stratégie préventive et thérapeutique pendant la chirurgie et en post opératoire afin d’optimiser la réussite de la transplantation. A ce jour, la surveillance repose sur les biopsies répétées du col de l’utérus sources d’inconfort, d’hémorragie et d’infections. L’identification de marqueurs sanguins permettrait de remplacer cette méthode invasive. De plus, cette approche pourrait permettre de mettre en évidence des marqueurs ayant un intérêt similaire dans des situations de greffe d’autres organes. Nous nous proposons de comparer l'impact de deux solutés de préservation d’organe sur la survie du greffon à court terme dans un modèle d'auto-transplantation chez la brebis. Cet objectif sera évalué au travers de 4 paramètres: 1) Évaluation de l'expression de marqueurs de l'inflammation et d’absence de circulation sanguine dans la muqueuse de l’utérus à J4 de la transplantation, par l'analyse de l'expression de 90 gènes connus impliqués dans l'inflammation, 2) Comparaison de l'expression des protéines exprimées dans la muqueuse utérine à J4 de la transplantation entre les deux solutés testés 3) Par une approche immunologiques utilisant des anticorps, analyse de la localisation de protéines dans la muqueuse utérine du groupe contrôle et des deux groupes expérimentaux, 4) Évaluation de la corrélation entre les paramètres précédents, l'analyse histologique et l'état clinique du greffon en fonction du soluté de préservation d'organe utilisé.

Bénéfices attendus

Le succès des premières greffes utérines chez l'l’humain suggère une demande potentiellement croissante pour une telle intervention. On estime globalement que 4000 à 5000 femmes en France pourraient être candidates à une greffe utérine dans l'avenir. L'équipe de recherche collabore dans ce travail avec l'équipe de l'hôpital travaillant sur un essai pilote évaluant la faisabilité, l'efficacité et la sécurité de la greffe utérine à partir de donneurs vivants apparentés pour 10 patientes avec une malformation congénitale caractérisée par l’absence d’utérus et d’une partie du vagin (syndrome de Rokistanski). La première greffe utérine en France a été réalisée en Mars 2019 et a abouti à une naissance vivante par césarienne en février 2021. En transplantation utérine humaine, le diagnostic de rejet du greffon est réalisé sur des analyses de tissus à partir de prélèvements répétés du col de l’utérus qui contribuent à générer des microtraumatismes tissulaires. Identifier des marqueurs non invasifs indiquant la bonne circulation du sang et l’absence d’inflammation pendant et après transplantation de l'utérus permettrait de limiter les interventions traumatisantes et de mettre en place une stratégie thérapeutique pour assurer la réussite de la transplantation.

Procédures

33 brebis subiront une procédure chirurgicale d'autogreffe et seront réopérées sans réveil 4 jours plus tard. 7 brebis témoins subiront une procédure chirurgiale similaire mais sans greffe pour servir de témoins et seront réopérées sans réveil 4 jours plus tard.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés à une chirurgie longue : risques d'hypothermie, douleurs, difficultés à se lever et se déplacer, diminution du transit digestif et de l'appétit. Les effets indésirables comprennent aussi les risques inhérents à toute chirurgie abdominale : risque d’infection, risque de plaie digestive, risque de plaie vasculaire ou de rupture des sutures vasculaires avec hémorragie interne. En postopératoire, les brebis sont hébergées seules dans un box dédié et sous surveillance humaine. Cet hébergement, de 4 jours, est nécessaire pour le suivi d’ingestion alimentaire et le suivi de la reprise du transit digestif. Mais aussi pour éviter l’arrachage du cathéter et une blessure au niveau de la suture par une congénère.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par injection de pentobarbital en IV sous anesthésie générale. L’utérus sera prélevé afin d'évaluer l'expression de marqueurs de l'inflammation et corréler ceux-ci aux analyses histologiques du greffon en fonction du soluté de préservation d'organe utilisé.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer de manière non invasive des marqueurs inflammatoires et de mauvaise circulation sanguine lors d'une greffe utérine. L'utilisation d'un modèle animal est indispensable car il n'existe aucun modèle alternatif permettant de reproduire les réactions complexes d'inflammation suite à une greffe d’organe entier.

Réduction

Les chirurgies de greffe utérine sont réalisées en autotransplantation, ce qui évite de recourir à un animal donneur. Le nombre d'animaux nécessaire est donc divisé par deux.

Raffinement

Pour limiter le risque d’hypothermie, les brebis seront installées sur un tapis chauffant pendant toute la chirurgie. La température corporelle, la fréquence cardiaque et la saturation pulsée en oxygène (SpO2) de la brebis seront également monitorées durant la chirurgie. Un cathéter sera posé pour administrer en continu une solution physiologique pour maintenir une bonne hydratation de l’animal. Cette voie, permettra également l’injection régulière d’analgésiques pendant l’opération. Ce cathéter sera conservé pendant les 4 jours post opératoire pour éviter de piquer l'animal plusieurs fois lors de prélèvements sanguins ou de l'administration d'analgésiques. En début de post opératoire, la température corporelle de la brebis sera contrôlée et maintenue grâce à des lampes chauffantes. Durant les 4 jours de post opératoire, les brebis seront sous surveillance permanente. La gestion de la douleur sera suivie par scoring des mimiques faciales basé sur des critères décrits dans la littérature. Si le score de la douleur est supérieur à cinq, cela justifie la mise en place d’une analgésie adaptée Le suivi des constantes physiologiques sera réalisé plusieurs fois par jour (température corporelle, fréquences cardiaque et respiratoire, glycémie),. Une analyse sanguine quotidienne (hématologie, biochimie et gaz du sang) permettra d’adapter les traitements. Le confort des cages de post opératoire sera renforcé par l’ajout de tapis, qui permettent de maintenir l’animal dans un environnement sain et facilitent les premières levées de l’animal et ses déplacements. Après la première phase de post opératoire, deux cages seront jumelées afin de permettre à l’animal d’avoir plus d’espace d’exercice. De plus, des enrichissements lui seront proposés (brosse, ballon, râtelier à foin, ambiance musicale). Afin de favoriser la reprise de l’appétit de l’animal, une alimentation variée lui sera proposée régulièrement (eau, foin, granulés, herbe, salade) en fonction de ses goûts et sera contrôlée par des pesées systématiques des quantités distribuées et consommées. Si le niveau d'inconfort/de douleurs ainsi que l'altération de l'état général de l'animal est constaté malgré les traitements analgésiques, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

L'avantage de la brebis dans la recherche sur la transplantation, comparativement aux autres espèces qui ont été testées, est que le bassin est plus large et que l'anatomie de la vascularisation ressemble aux vaisseaux pelviens humains. Le modèle ovin a été défini dans la littérature internationale comme le meilleur modèle animal pour la recherche sur la greffe utérine. Utilisation d'adultes à maturité sexuelle, ayant mis bas deux fois. Ce modèle permet d'avoir un utérus qui a deja fait preuve de sa fonctionnalité et des vaisseaux de calibre optimal, car une brebis ayant eu plus de deux gestations ) pourrait présenter des veines de trop gros calibres (varices).

17 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées. Chacune subit une ovariectomie et la pose d'un implant d'estradiol sous anesthésie, la pose répétée de cathéters dans la veine jugulaire et jusqu'à 24 prélèvements de sang sur dix heures, répétés six fois, pour tester des analogues de kisspeptine destinés à maîtriser la reproduction des animaux d'élevage. Le porteur présente ce projet comme une piste pour supprimer les traitements hormonaux qu'il juge éthiquement contestables. Il affirme que la reproduction ne peut s'étudier que sur organisme entier et que le passage à l'animal reste incontournable.

Objectifs

Actuellement, la maîtrise de la reproduction des animaux d'élevage repose principalement sur la stimulation de l'ovulation par des hormones. Des systèmes considérés plus « naturels », tel l'effet mâle, sont aussi utilisés mais leur efficacité est moindre. Pour différentes raisons, ces deux approches ne répondent pas de façon satisfaisante aux attentes sociétales (absence de contaminant dans les produits consommés et de pollution de l'environnement) et à celles des producteurs (efficacité et rentabilité). Nous avons, dans un projet précédent, développé des analogues à partir d’un neurotransmetteur endogène, la kisspeptine (Kp) comme piste originale pour réduire voire éliminer l’utilisation d’hormones. Ce neurotransmetteur joue un rôle clé dans la stimulation de la reproduction, mais son instabilité métabolique, et par conséquent sa durée d'action trop courte, empêche son utilisation sur le terrain. Nous avons donc conçu et synthétisé des analogues avec une durée d'action plus importante que la molécule naturelle. Le présent projet vise à étudier l'effet de différentes formes de Kp humaine sur la fonction de reproduction des brebis, pour développer l'analogue le plus efficace possible.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont 1) comprendre la différence d'effet de différentes isoformes de Kp entre deux organismes, 2) mettre en place une forme de Kp optimale pour stimuler la reproduction de la brebis et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction des animaux d'élevage (notamment ici, la brebis). De façon plus globale, ce projet vise à élaborer une stratégie d’élevage des animaux de rente avec une meilleur prise en compte du bien-être animal et des attentes sociétales en supprimant les traitements hormonaux et en trouvant des alternatives aux traitements actuellement mis en place et éthiquement contestables.

Procédures

- Ovariectomie et pose d’implant d’estradiol sous anesthésie générale sur 17 brebis (environ 2 heures) - Retrait d’implants d’estradiol sous anesthésie générale sur 17 brebis - Pose et dépose de cathéters dans la veine jugulaire sur animal vigile : 2 fois chez 17 brebis - Prélèvements de sang sur animaux vigiles par ponction de la veine jugulaire via un cathéter : 24 prélèvements sur 10h pour 17 brebis, répété 6 fois.

Impact sur les animaux

La kisspeptine est une molécule employée à de nombreuses reprises dans notre laboratoire dans le cadre de projets antérieurs. De plus, le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les ovins. D'après notre expérience, suite à une injection aigüe de kisspeptine aucune nuisance ou effet indésirable n'est observé. En termes de manipulation des animaux, les chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets peuvent être observés, notamment suite à l'ovariectomie ou la pose des cathéters, des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'analgésiques au moment des procédures.

Devenir

Les animaux auront été ovariectomisés, soumis à l'implantation d'un cathéter dans la jugulaire et injectées avec des isoformes de kisspeptine avec une durée de vie courte (de l'ordre de quelques minutes/heures), les animaux pourrons alors aisément être réutilisés ou replacés.

Remplacement

La reproduction est un mécanisme physiologique intégré extrêmement complexe qui ne peut être étudié que par une approche in vivo. Il en est de même pour toutes les études visant à la contrôler. Notre niveau de connaissances actuelle est largement insuffisant pour espérer mettre en place par exemple une approche de modélisation informatique afin de prédire comment le système répond à un stimulus donné ou pour une quelconque approche de substitution, comme des cultures cellulaires, capable de reproduire les phénomènes complexes d’intégration qui ont lieu au niveau de l’organisme entier. Cependant, l'activité des molécules à tester in vivo dans ce projet a déjà été caractérisée in vitro. Le passage à l'animal reste incontournable en l'état actuel de nos connaissances.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement. Dans le souci de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés ainsi que le nombre d'injections et de prise de sang réalisées sur chaque animal, nous prévoyons de tester plusieures molécules par animal à minimum 3 jours d'intervalle. Cet intervalle de temps permettra de laisser le temps aux molécules injectées de ne plus être détectable dans le sang et de pouvoir tester la molécule suivante sans crainte d'avoir une interaction avec la molécule précédente. Chaque groupe test d'une forme de Kp (composé de 7 animaux) sera comparé avec un groupe contrôle (composé de 17 animaux répartis sur chaque série de tests) pour assurer la validité scientifique et la puissance statistique nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et seront également en groupe lors des procédures afin de minimiser au maximum le stress lié à la contention dans des cages individuelles qui sont souvent employées pour ce genre de procédures. Les méthodologies utilisées dans le cadre de ce projet ne dépasseront pas une douleur de classe modérée et nous mettrons en œuvre tout notre possible afin de garantir le bien-être de l’animal en lui apportant les soins adéquats en fonction des besoins. Dans cet optique, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement (notamment isolement) et l'apparence des brebis (notamment au niveau des plaies chirurgicales et implantation du cathéter) sera suivi avec attention et les animaux seront pesés (en prêtant attention au pourcentage de perte et qu'il ne dépasse pas le seuil critique de 20%) pendant 3 jours après l'ovariectomie. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites (soulagement de la douleur en cas de dégradation d’un critère de comportement et d’apparence, euthanasie en cas d’atteinte du seuil critique des 20% de perte de poids et/ou dégradation de plus de deux critères de comportement et d’apparence). En cas de douleur les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux (baisse d'appétit, prostration, décubitus prolongé). Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés (par exemple prostration, décubitus prolongé, anorexie...) les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux. En cas d’hémorragie post-opératoire (muqueuses pâles), l’animal serait réanesthésié et nous rechercherions le site hémorragique pour procéder à la suture vasculaire.

Choix des espèces

La brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Nous avons choisi d’utiliser la race Ile de France pour les brebis parce que c’est le modèle sur lequel nous avons obtenu nos résultats précédents et parce que c’est une race d’élevage d’intérêt économique important. Adulte pour étudier un animal sexuellement développé avec un axe gonadotrope actif.

6 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendues à l'élevage. Chacune subit une ovariectomie d'environ une heure sous anesthésie, l'ablation des ovaires les empêchant d'être gestantes tout en conservant un comportement d'oestrus. Le porteur décrit ces brebis comme des femelles "boute-en-train" destinées à stimuler les béliers pour la collecte de semence, une fois toutes les trois semaines. Il affirme qu'il n'est pas possible de collecter les béliers sans recourir à des femelles.

Objectifs

L'objectif est de réaliser une ovariectomie chez la brebis pour permettre la collecte de semence de bélier. Les brebis ovariectomisées ne présentent plus de risque de gestation non désirée et peuvent exprimer un comportement d'oestrus lorsque la collecte de semence est souhaitée.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de disposer de brebis ovariectomisées permettant la collecte de la semence de béliers, sans risques de gestation indésirable, et sans utilisation de traitements hormonaux pour synchroniser les brebis.

Procédures

Les animaux seront soumis une fois à une procédure chirurgicale : ovariectomie. La durée totale de l'intervention, anesthésie comprise, est d'environ une heure. Si des injections post opératoires s'avèrent nécessaires, les animaux seraient contentionnés à peine 2 ou 3 minutes, injection comprise.

Impact sur les animaux

Le statut ovariectomisé n'entraine pas d'effet indésirable au cours de la vie de l'animal. Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations, de la phase pré opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible, ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthésie, une irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation) peut apparaître, mais c'est rare.

Devenir

Les animaux retournent en élevage.

Remplacement

La collecte de la semence de bélier requiert l'utilisation de femelle boute en train. Il n'est pas possible chez les ovins de collecter les mâles sans une autre méthode.

Réduction

Le nombre d'animaux a été choisi pour réduire au maximum l'utilisation des femelles pour les collectes , soit une fois toutes les 3 semaines pour chaque brebis.

Raffinement

Afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité et des locaux calmes. La douleur est traitée préventivement avant l’acte chirurgical dès l’anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu’à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l’état normal est estimé à 3 jours postopératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. Un animal anorexique, prostré, recevra l’administration de morphinique. Sans réponse physiologique satisfaisante, il sera procédé à l’euthanasie suivi du prélèvement du site lésionnel pour analyse. Tout animal qui ne se nourrit pas pendant 4 jours ou avec perte de poids par rapport au poids initial malgré le traitement sera mis à mort. Une fiche de suivi individuel est mise en place, renseignée tous les jours. Les animaux seront surveillés quotidiennement sur 6 paramètres. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante : en ce cas ces animaux recevront des injections sous cutanées de morphine - Fièvre, abattement, en cas d’infection post opératoire : en ce cas, les animaux recevront des antibiotiques et des anti inflammatoires non stéroïdien en fonction de la gravité des symptomes.

Choix des espèces

La collecte de béliers est possible uniquement par l'utilisation de brebis pour stimuler le comportement reproducteur. Brebis adultes et matures sexuellement, de façon à pouvoir répondre au traitement hormonal appliqué après l'ovariectomie.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une maladie rénale chronique leur est induite par un régime à l'adénine pendant quatre semaines, suivie de prélèvements sanguins répétés sur animal vigile et de tests de tolérance au glucose et à l'insuline, pour comparer des régimes carencés en acides aminés. Le porteur indique que le dosage final des toxines urémiques exige un millilitre de sang, soit la quasi-totalité du volume sanguin, ce qui justifie la mise à mort de toutes les souris. Il affirme qu'une étude in vivo est "nécessaire", un éventuel essai chez les patients restant conditionnel.

Objectifs

La maladie rénale chronique correspond à une perte irréversible du fonctionnement des reins. Elle touche 3 millions de personnes en France et est associée à une augmentation de la mortalité en partie liée à l’accumulation de déchets. Actuellement un régime pauvre en protéines est proposé aux patients afin de ralentir la progression de la maladie rénale chronique. Les mécanismes à l'origine de cette protection rénale par les régimes pauvres en protéines restent méconnus. Des études récentes ont démontré qu’une diminution sélective en certains acides aminés (les composants des protéines) pouvait préserver le fonctionnement des reins de façon similaire aux régimes en protéines. Par exemple la réduction sélective des acides aminés aromatiques (phénylalanine, tyrosine et tryptophane) chez la souris ayant une maladie rénale chronique était associée à une amélioration de la fonction rénale similaire à celle observée à la diminution de l'ensemble des protéines. Cependant, ce régime n’a pas été comparé à la réduction sélective d’autres familles d’acides aminés. Ainsi notre projet aura pour but de déterminer de façon formelle quelle(s) réduction(s) de quel(s) groupes d’acides aminés en particulier est responsable de la protection rénale. Nous cherchons à étudier, chez la souris ayant une maladie rénale chronique, l’effet de régimes alimentaires sélectivement carencés en certaines familles d’acides aminés sur la fonction rénale, l’accumulation des déchets, le microbiote intestinale et différents paramètres métaboliques : taux de sucre et de lipides dans le sang, état nutritionnel.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes et notamment quels réduction d'acides aminées en particuliers sous tendent l’effet « protecteur» des régimes pauvres en protéines proposés aux patients atteints de maladie rénale chronique afin de préserver leurs reins. Si les résultats sont positifs, ce projet pourra faire l’objet d’un essai thérapeutique (intervention nutritionnelle) chez les patients atteints de maladie rénale chronique.

Procédures

La maladie rénale chronique sera induite chez les souris de façon pharmaceutique en nourrissant les souris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire contenant 0,25% d’adénine. Au cours de la procédure les animaux auront plusieurs prélèvements réalisés en condition vigile grâce à une micro-incision longitudinale sur la veine de la queue. L'incision sera désinfectée par une solution iodée et le saignement sera arrêté par un coton hémostatique. Un premier prélèvement (15 μL) réalisé avant la mise en place de régimes spécifiques et réitéré 3 semaines après afin permettra d'effectuer un dosage de l'urée plasmatique. A 11 semaines, nous réaliserons un test de tolérance au glucose après 6 heures de jeûne. Le glucose sera injecté en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min (total 6 prélèvements). A 12 semaine, nous réaliserons un test de tolérance à l’insuline après 6 heures de jeûne. L’insuline sera injectée en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min. Au cours de ces tests, une seule incision permettra de recueillir tous les prélèvements en grattant la croûte formée. A 13 semaine, les souris seront placées 2 par 2, pendant 24 h en cage à diurèse pour collecter l’urine. 48 h après les souris seront mises à mort: une ponction intra-cardiaque sera effectuée après anesthésie profonde, pour évaluer l’accumulation des déchets de la maladie rénale.

Impact sur les animaux

Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n’induit qu’un ralentissement de la croissance pondérales liée à une diminution de la prise alimentaire (sans doute lié au goût de l'aliment enrichi en adénine). S’il s’avère que les animaux perdent trop de poids pendant l’induction de la MRC, le régime Adénine pourra être discontinué pendant 2 jours afin de restaurer une croissance pondérale (5 jours de régime adénine – 2 jours de régime standard). Quoiqu’il en soit, les animaux reprennent rapidement du poids à l'issu du régime. L’utilisation de régimes pauvre en protéines ou de modification des apports en AAs ne sont pas responsables d'une perte d'appétit. Ils peuvent cependant induire une agressivité chez les animaux. Au cours des tests de GTT et ITT, les souris auront des prélèvements sanguins réalisés grâce à une incision à l'extrémité de la queue qui peut générer un stress. Préalablement à ces tests métaboliques les souris seront mises à jeun pendant 6 heures. La mise à mort à la fin de l'étude ou en cas d'atteinte d'un point limite sera effectuée sous anesthésie générale.

Devenir

Le dosage des toxines urémiques (les déchets de la maladie rénale) nécessite 200 microlitres de sérum soit 1 ml de sang. Chez une souris, ce volume correspond à une spoliation de la quasi totalité du volume sanguin et justifie donc la mise à mort de toutes les souris à la fin de l'étude soit 140 animaux.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans la production de déchets urémiques et le développement du syndrome urémique sont multifactoriels. La maladie rénale chronique et les déchets urémiques ont un effet délétère sur l’ensemble des tissus de l’organisme comme le rein, la régulation de la glycémie et les paramètres nutritionnels. Ces éléments ne sont pas modélisables sur un modèle cellulaire. Il est donc nécessaire de recourir à une étude in vivo pour étudier l’impact des différent régimes alimentaires sur l’ensemble de ces paramètres étant donné l’impact globale de la maladie rénale chronique. De plus nous voulons étudier en autre les modifications de la structure l’intestin et du rein qui nécessite des examens trop invasifs pour être réalisé chez l’homme. A ce stade de développement, il est impossible de supprimer un ou plusieurs acides aminés dans l’alimentation humaine. Ainsi toute expérimentation dans des modèles cellulaire ou chez l’homme est impossible à ce stade.

Réduction

Nous avons pris les dispositions nécessaires pour éviter le double emploi de notre procédure expérimentale. En effet, à notre connaissance, la question scientifique que nous posons ici n’a encore jamais été adressée. Il s’agit donc d’un projet totalement original et nous avons veillé, lors de l’élaboration de notre procédure, à éviter toute redondance dans les expérimentations. L'analyse statistique sera effectuée par ANOVA ou test non paramétrique de Kruskall-Wallis lorsque justifié. Ces tests seront complétés d'analyses post-hoc. Ainsi, le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Selon nos données précédente, le nombre de sujets par groupe est de 8. Il a donc été décidé de porter le nombre d’animaux à 10 par groupe afin de parer aux aléas expérimentaux : atteinte de points limites, décès liés à la maladie rénale, échec de l'induction de la maladie rénale par le régime. La procédure sera dans un premier temps réalisé que chez 70 souris mâles et nous renouvellerons l'experience dans les mêmes conditions chez des souris femelles pour évaluer l'impact du sexe sur ces régimes au cours de la maladie rénale chronique. Un total de 140 animaux est donc nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés 5 par cage (stabulation sociale) dans un environnement enrichi. Une surveillance appropriée permettra de repérer la survenue de points limites généraux: apathie, prostration, perte de poids, hypoglycémie profonde. La maladie rénale chronique sera induite chez nos souris par méthode pharmaceutique grâce à un régime en Adénine qui est bien toléré par les animaux. Il peut cependant être responsable d'un ralentissement de la prise pondérale à cause d'une diminution de la prise alimentaire (sans doute lié au goût de l'aliment enrichi en adénine). En cas de perte de poids trop importante, le régime sera suspendu pendant 48h ce qui permet habituellement un rapide rattrapage du poids normal. Au cours de l'étude, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront réalisés. Le volume d'injection de glucose et d'insuline a été adapté afin de limiter tout inconfort et la glycémie sera suivie toutes les 15 minutes. La survenue d'une hypoglycémie sévère sera suivie d'une injection de glucose et, en cas de peristance, constituera un point limite spécifique de ces tests. Les prélèvements sanguins réalisés au cours de l'étude seront effectués en condition vigile, grâce à une incision de moins de 1mm à l'extrémité de la queue. A la fin de l'étude, tous les individus seront mis à mort. La mise à mort des souris, indiquée par la fin de l'étude ou la survenue d'un point limite, sera réalisée sous anesthésie générale puis dyslocation cervicale.

Choix des espèces

Le présent protocole sera conduit sur des souris, car le modèle de maladie rénale chronique, est facilement réalisable et permet l'induction d'une maladie rénale chronique de stade modéré. De plus, l'altération de la fonction rénale chez la souris reproduit les modifications systémiques que l'on peut observer chez l'homme (accumulation de toxines urémiques, hyperglycémie, modification du microbiote intestinale). Des souris âgées de 6 semaines ont été choisies correspondant à des jeunes adultes chez lesquels l'induction de la maladie rénale est bien tolérée (pas de signe de souffrance des animaux). Etant donnée que la fonction rénale s'altérè de façon physiologique avec l'âge des souris, nous choissisons des souris juvéniles afin de s'affranchir de ce biais.

150 perches communes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 femelles tuées pour prélever leurs gonades, les autres gardées vivantes après cannulation ou stimulation manuelle de la ponte. Sur dix mois, elles sont anesthésiées pour un sexage par échographie, une puce leur est injectée, et huit prélèvements sont réalisés. Le projet cherche à savoir si la méthylation de l'ADN existe pendant l'ovogenèse de cette espèce, préalable annoncé à de futures études. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" cette expérimentation par des cellules en culture.

Objectifs

La reprogrammation de la méthylation de l’ADN pendant l’ovogenèse permet des réorganisations chromosomiques qui peuvent influencer l’expression des gènes dans la génération suivante. Ces modifications, souvent irréversibles, peuvent induire des modifications physiologiques, morphologiques ou biologiques et potentiellement conférer des avantages aux descendants qui deviennent alors des caractères héréditaires. Il est donc admis que ce mécanisme est un moteur de l’évolution. Chez les poissons, certaines espèces déclenchent cette reprogrammation et d’autres non. Dans ce dernier cas, les mécanismes adaptatifs ne sont pas encore compris mais semblent impliquer d’autres voies qui intégreraient à chaque génération les modifications épigénétiques et leurs conséquences sur l’expression génique. La compréhension des liens entre des modifications environnementales et les mécanismes évolutifs des espèces représente un enjeu important de nos connaissances, particulièrement pour des espèces très sensibles aux variations de leur environnement tels que les poissons. Les résultats obtenus à l’aide de diverses méthodes de biologie moléculaire nous permettront de mieux comprendre les mécanismes qui sont déclenchés dans des ovocytes à chaque étape de l’ovogenèse. Ainsi il nous sera possible de répondre à l’objectif principal de ce projet qui est de déterminer si la reprogrammation de la méthylation de l’ADN existe chez la perche commune et s’il existe un lien avec la dynamique d’expression des gènes pendant l’ovogenèse. Ce travail représente un préalable nécessaire à des études plus précises sur l’effet de variations de certains paramètres environnementaux sur le succès de reproduction chez la perche commune.

Bénéfices attendus

Les poissons sont très sensibles aux variations de leur environnement et ces dernières contrôlent plusieurs fonctions biologiques parmi lesquelles la reproduction. Ainsi, l’ovogenèse de la perche est contrôlée par des variations saisonnières de température et photopériode. D’autres paramètres environnementaux peuvent moduler la progression de ce processus. Par conséquent, il existe un lien avéré entre l’environnement et la reproduction ce qui pourrait, théoriquement, modifier les processus moléculaires impliqués dans l’adaptation des espèces aux variations de leur milieu de vie. Parmi ces processus, la méthylation de l’ADN est connue chez les mammifères mais ne semble pas exister chez toutes les espèces de poisson. Il s’agit ici de déterminer si ce processus existe pendant l’ovogenèse de la perche. Cela nous permettra, à l’avenir, d’étudier comment certains paramètres environnementaux ciblés influencent ces processus évolutifs. Cette étude constitue donc un préalable scientifique indispensable pour ouvrir ce nouveau champ d’investigation.

Procédures

Il y aura 5 expérimentations effectuées or de l’eau mises en place dans ce travail. Au début du cycle de reproduction, l’ensemble des 150 animaux seront anesthésiés avant d’être sexés par échographie (procédure 1, 2 et 3) car il n’y a pas de signe distinctif extérieur chez cette espèce (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Puis une puce électronique leur sera injectée pour nous permettre d’avoir un suivi personnalisé (procédures 1, 2 et 3) (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Ils seront alors répartis de manière homogène dans 2 bassins. L’ovogenèse sera induite en contrôlant les variations de température et de photopériode dans chaque bassin. Huit prélèvements réguliers seront effectués pendant les 10 mois d’ovogenèse. Au cours de chaque prélèvements 6 femelles (48 femelles en tout) seront anesthésiées pour effectuer une prise de sang (procédure 1) pour analyser des taux hormonaux (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Elles seront mises à mort pour effectuer une analyse approfondie des gonades par échographie et des prélèvements de gonades pour un suivi histologique classique. Un mois avant le début de la saison de ponte, toutes les femelles restantes (52 femelles) seront anesthésiées avant d’introduire une canule dans l’orifice urogénital (procédure 2) (Durée la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson) pour prélever quelques ovocytes. Ces derniers seront observés pour évaluer leur progression dans les phases finales de maturation. Ceci nous permettra de trier les femelles en fonction de cet avancement. Les femelles au même stade pondront en même temps, nous permettant de réduire le stress des animaux lors de la saison de ponte. Enfin, à cette dernière étape, les femelles prêtes à pondre (reconnaissable par l’observation d’une cloque sur l’orifice uro-génitale) seront stimulées manuellement pour déclencher la ponte (procédure 2) (Durée de l’intervention entre le moment de la capture et le retour dans le bassin de réveil : moins de 5 minutes par poisson). De la même manière, les mâles spermiants seront stimulés par pression abdominale pour collecter le sperme (procédure 3) (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil :

Impact sur les animaux

Trois manipulations (injection d’une puce électronique (procédure 1, 2, et 3), prise de sang (procédure 1) et cannulation (procédure 2)) impliquent l’injection d’une aiguille ou d’une canule chez l’animal. Elles pourraient induire des nuisances comme une douleur ou des infections. Pour y pallier, les animaux seront systématiquement anesthésiés pour éviter la douleur. Concernant les risques d’infection, le matériel utilisé est stérile ou désinfecté et une observation renforcée des animaux sera effectuée pendant la semaine qui suit les expérimentations. Si nécessaire un protocole de traitement sera mis en place.

Devenir

Seule la procédure 1 (prise de sang) sera suivie d’une mise à mort des animaux car les gonades devront être prélevées pour effectuer des analyses moléculaires et histologiques. Concernant les 2 autres procédures, les animaux seront gardés en vie après chaque expérience pour nous permettre de continuer la progression de l’étude

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer cette expérimentation animale qui a pour but de mettre en évidence des régulations moléculaires dans des ovocytes au cours de l’ovogenèse. Ces régulations si elles existent, dépendent certainement des variations de signaux moléculaires et/ou cellulaires (hormones, signaux nerveux etc…) jusqu’ici inconnus. Il n’est donc pas possible d’effectuer ce travail dans des cellules en culture qui ne permettraient pas de reproduire l’ensemble de ces signaux extracellulaires.

Réduction

Nous avons décidé de faire plusieurs expériences indépendantes (étude de la reprogrammation de la méthylation de l’ADN et analyse de la progression de l’ovogenèse par échographie) car ces dernières nécessitent les mêmes contrôles (histologie, taux hormonaux…) mais n’interfèrent pas en termes de prélèvement d’organes. Nous avons donc regroupé 2 expériences pour réduire le nombre d’animaux utilisé. D’autre part, la mise en point récente d’une méthode de sexage des perches par échographie, nous permet maintenant de focaliser nos études avec un nombre de femelles et mâles plus adapté à nos besoins au départ. En effet, par le passé nous devions équilibrer le sexe-ratio pour nous assurer d’avoir le bon nombre de femelles pour toute l’expérience. Grâce au système d’identification par puce et au sexage préalable par échographie, nous pouvons réduire le nombre de mâles utilisés et donc réduire le nombre total d’animaux étudiés. En effet, cette opération permet de réduire le nombre de mâles utilisés de moitié par rapport à nos expérimentations précédentes.

Raffinement

Les étapes de puçage, de sexage, de cannulation ou de prise de sang peuvent engendrer soit un stress du fait d’une manipulation prolongée hors de l’eau (cannulation ou sexage) ou d’une douleur correspondant à l’introduction d’une aiguille (puçage et prise de sang). De ce fait les animaux seront préalablement anesthésiés pour éviter le stress des animaux. Les étapes de prélèvement de sperme ou de stripping (stimulation des pontes ou de la collecte du sperme) sont rapides (inférieur à 2 minutes) et seuls les animaux spermiants ou ayant ovulés seront stimulés. Cette stimulation correspond à une légère pression sur l’abdomen des poissons qui déclenche la ponte ou la libération de sperme. Une fois enclenchés ces processus ne nécessitent pas de pression abdominale prolongée et la récolte se fait rapidement. Si ces étapes risquent de stresser les animaux du fait de la pêche et de la vérification quotidienne des femelles, la rapidité de la procédure nous permet de ne pas les anesthésier. Pour éviter les stress répétés, nous avons décidé de regrouper les femelles en fonction de leur stade de maturation ovocytaire lors d’une évaluation globale un mois avant le début de la saison de ponte. Ceci nous permet de concentrer les pêches de poissons dans un bassin à quelques jours (4-5 j/par bassin) ce qui diminue le stress des poissons dans chaque bassin tout en nous permettant une meilleure efficacité dans notre gestion de la saison de pontes. Les mâles seront également isolés dans un bassin pour éviter qu’ils soient trop stressés. Chaque mâle sera stimulé au maximum 3 jours de suite puis isolés du groupe pour récupérer et éviter le stress répété.

Choix des espèces

La perche commune est une espèce groupe synchrone pour laquelle tous les ovocytes se développent simultanément, il sera plus facile de déterminer si cette synchronicité existe également à l’échelle moléculaire. D’autre part, cette espèce pond ses œufs enrobés dans une gangue. Cette caractéristique présente l’avantage de nous permettre de déterminer si les éventuelles variations des régulations étudiées peuvent être en lien avec la localisation des ovocytes dans l’ovaire jusqu’à la ponte. En d’autres termes nous voulons savoir si le microenvironnement des cellules influence ces régulations dans un ovocyte donné. La ponte d’un ruban d’œufs nous permet en fin de cycle de déterminer la localisation antéro-postérieure des ovules dans la gonade et donc pouvoir suivre cette évolution tout au long du cycle de reproduction. Les animaux utilisés seront des adultes matures et primipares. Nous choisissons de travailler avec des animaux primipares car ils sont plus jeunes et proviennent le plus souvent d’un même groupe d’animaux ayant été élevés en même temps dans les mêmes conditions. Au contraire, des animaux ayant déjà pondus pourraient provenir de lots différents. Nous réduisons ainsi le risque que les animaux aient des histoires différentes ce qui pourrait éventuellement affecter le processus épigénétique étudié et donc augmenter les variations individuelles qui pourraient interférer avec nos résultats. Nous pensons que le travail avec des primipares nous permettra de diminuer cette variabilité individuelle sans pour autant l’éviter complètement.