Système urogénital

Des souris ont l'abdomen ouvert pour que leur prostate soit exposée à une torche à plasma froid ou à un simple jet d'hélium, puis vivent sept jours avant d'être tuées pour l'analyse du tissu traité. 96 souris transgéniques, privées du gène suppresseur de tumeur PTEN et atteintes d'un cancer de la prostate, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour préparer l'emploi de la torche lors des ablations de la prostate chez des patients. Le porteur attend des effets indésirables "plutôt mineures", et écrit aussi que ce traitement "reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir". Les souris sont hébergées en cage individuelle, ce que le résumé range sous un "enrichissement renforcé".

Objectifs

Le projet est basé sur l’intérêt de l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale (ablation de la prostate) chez des patients présentant un cancer localisé. Il existe aujourd’hui plusieurs appareillages pour le traitement focalisé d’une tumeur mais sans prostatectomie (Ultrasons, lasers, radiothérapie etc.). En revanche, l’utilisation de module spécifique pour le traitement des marges chirurgicales au cours de la prostatectomie est très limitée et encore exploratoire. De plus, la très large majorité des prostatectomies sont aujourd’hui réalisées par assistance robotisée sous coelioscopie. Cette technologie connaît un essor exponentiel et constitue une aire de développement technologique de premier plan dans la chirurgie de la prostate. L’opportunité de traiter avec une source plasma constitue donc une approche nouvelle qui nécessite d’être évaluer in vivo avant tout transfert technologique vers la clinique. La torche à plasma froid est constitué́ de deux électrodes entourant un tube de quartz dans lequel est injecté de l'hélium. Des pics de tension sont appliqués, transformant l'hélium et l'air environnant en plasma (mélange d'ions, de radicaux et d'électrons). Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par plasma sur un modèle de cancer de la prostate induit chez des souris transgéniques. Une étude pilote sur un modèle de souris ayant subi une greffe de cellules tumorales dans la prostate nous a permis d'identifier les paramètres de fonctionnement de la torche à plasma in vivo. Ainsi, deux paramètres seront étudiés, i) l’effet spécifique du plasma comparé à de l’hélium non excité et ii) l'impact du milieu d’imprégnation du tissu pendant son exposition au plasma. Les zones de traitement seront analysées par des approches histologiques et moléculaires. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude pilote sera conduite permettant de vérifier la pertinence du traitement par plasma froid.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser in vivo l'effet d'une exposition d'un tissu tumoral à une source de plasma froid. Nous souhaitons ainsi obtenir, sur ce modèle préclinique, des informations sur le type de lésions engendré: apoptose? nécrose? inflammation? et la profondeur tissulaire atteinte. Ces résultats ont une valeur importante et capitale pour envisager un transfert vers la clinique humaine. Un projet vient d'être accepté dont l'exploration fonctionnelle sur ce modèle vivo fait parti. Par ailleurs, nous avons montré, ex vivo, que le milieu d'imprégnation des cellules tumorales est un paramètre important. Nous allons donc testé 2 milieux caractéritique pour tester l'efficacité de la torche in vivo : un milieu phosphate buffer saline (PBS 1X) de formulation très simple et un milieu de culture plus complexe adapté à la croissance des cellules tumorales prostatiques (RPMI1640).

Procédures

Les animaux subiront une laparotomie et un traitement par plasma froid de la prostate antérieure ou un traitement control (expostion jet Helium). L'ensemble de la procédure opératoire dure en moyenne 10 minutes +/- 2minutes. Les animaux seront maintenus en hébergement pendant 7 jours avant leur mise à mort et le prélèvement des tissus d'interêt. Les animaux pourront être pris en charge par un traitement anti-inflammatoire AINS le cas échéant par injection intraperitonéale. Cette injection, contention de l'animal comprise, durera environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

Les potentiels effets indésirables sont attendus comme plutôt mineures puisque que le traitement est localisé à la prostate antérieure qui ne constitue pas un organe essentiel à la survie de l'animal. Par ailleurs, la procédure de traitement de la prostate par laparotomie est une procédure exécutée en routine par l'équipe et dont les suites post-opératoires sont completement connues et maitrisées. Toutefois, il est possible que le traitement par le plasma conduisent à une réponse inflammatoire du tissus prostatique. Grâce au suivi renforcé, nous surveillerons les points limites en terme de mal être ou de souffrance qui conduiraient à l'utilisation d'un traitement anti-inflamatoire si cela s'avérait nécessaire.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés et prélevés pour analyse du tissu prostatique traité.

Remplacement

La caractérisation des effets du plasma sur les tissus tumoraux sera complétée par des expositions sur des organoïdes et des tumoroïdes permettant ainsi de ne pas recourir à l'expérimentation animale. Ces experiences conduites in vitro permettent de calibrer des paramètres critiques (tension, débit helium, temps d'exposition...) du jet plasma sur des modèles intermédiaire entre culture 2D et modèle vivo. Cette approche permet dans une certaine mesure d'anticiper la réponse in vivo. Pour autant, l'utilisation sur le modèle souris est indispensable pour valider cette technologie sur organisme mammifère entier et envisager un transfert vers la clinique humaine.

Réduction

Ce projet d'exposition au plasma froid fait suite, d'une part, à des travaux réalisés en culture cellulaire qui ont permis de caractériser les paramètres d'utilisation de la torche à plasma froid, et d'autre part, à une expérimentation pilote sur un modèle de greffes orthotopiques intra-prostatiques. Ainsi, toute une partie du projet a été réalisé sur des modèles cellulaires en remplacement du modèle vivo et permet de limiter l'utilsation de l'animal à des conditions expérimentales que nous avons définies au préalable ex vivo. Concernant le nombre d'animaux utilisés pour l'étude, il est justifié pour assurer une puissance statistique suffisante pour l'exploitation des résultats et paramètres biologiques.

Raffinement

Le traitement par plasma froid d'un tissu vivant reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir. Ainsi l'emergence potentielle de mal être ou souffrance de l'animal sera étudiée grâce à un suivi renforcer (visites 2x par jour). Si nécessaire les animaux pourront recevoir un traitement anti-inflammatoire. Enfin, les cages seront soumis à un enrichissement renforcé : cage individuelle avec tube carton et pad-fibre.

Choix des espèces

Modèle de souris transgénique invalidé pour l'oncosuppresseur PTEN. pas d'équivalent dans d'autres espèces adaptées à l'étude. Nous utiliserons de souris agées au moins de 6 mois qui permettront de traiter un carcinome de prostate installé. (Cinétique de carcinogenèse très largement décrite dans la littérature et maitrisée par l'équipe de recherche).

1 404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent du tamoxifène par la nourriture et par injections pour supprimer un récepteur dans la prostate, une partie développant des lésions pré-cancéreuses puis des adénocarcinomes. Le porteur indique qu'elles sont tuées selon un calendrier échelonné, jusqu'à quinze mois après induction, pour prélever la prostate, et qu'une euthanasie intervient en cas de perte de plus de 20 % du poids. Il affirme que son projet "nécessite" un modèle in vivo, aucun modèle in vitro ne reproduisant la complexité des communications cellulaires de la prostate.

Objectifs

Le récepteur des androgènes et le récepteur des glucocorticoïdes jouent un rôle très important dans la prostate saine et le cancer de la prostate. Des données suggèrent que ces deux récepteurs ont un mode de fonctionnement similaires, c’est pourquoi nous souhaitons comprendre si la perte de l’un de ces récepteurs peut être compensée par l’autre. Afin de répondre à cette question, nous avons établi des souris génétiquement modifiées où l’expression du récepteur des androgènes ou du récepteur des glucocorticoïdes peut être spécifiquement délété dans la prostate saine ou dans un modèle de cancer de la prostate. Ainsi, avec ces souris nous pourrons étudier l’impact de la perte du récepteur des androgènes ou du récepteur des glucocorticoïdes dans la prostate saine ou dans un modèle de cancer de la prostate. Une meilleure compréhension du mode d’action de ces deux récepteurs est importante afin de pouvoir développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le cancer de la prostate, qui représente aujourd’hui la deuxième cause de mortalité par cancer.

Bénéfices attendus

Actuellement, le traitement de référence du cancer de la prostate métastatique consiste à bloquer toute activation de la voie de signalisation du récepteur des androgènes. Cependant, après 12 à 18 mois, la plupart des patients rechutent et développent une résistance à cette thérapie. De plus, des glucocorticoïdes sont administrés aux patients ayant un cancer de la prostate afin d’améliorer leur qualité de vie (contrôle de la douleur / diminution des effets secondaires). Toutefois, de plus en plus de données suggèrent que l’administration de glucocorticoïdes pourrait stimuler la croissance tumorale. Ainsi, il s’avère important de mieux comprendre le mode d’action du récepteur des androgènes et du récepteur des glucocorticoïdes et leur interconnexion dans la prostate sous des conditions physiologiques et dans le cancer de la prostate. Cette étude est importante afin de pouvoir développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le cancer de la prostate, qui est aujourd’hui la deuxième cause de mortalité par cancer.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront nourries avec de la nourriture tamoxifène. De plus, la première semaine une injection de tamoxifène en intrapéritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale) par jour pendant 5 jours sera réalisée. Il s’agit de la seule intervention réalisée chez ces souris avant leur euthanasie après 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois, 9 mois et 15 mois (temps de cinétique pouvant varier en fonction de l’étude pilote).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous souhaitons étudier l’impact de la perte du récepteur des androgènes et des glucocorticoïdes dans la prostate saine et le cancer de la prostate. Nous disposons donc au laboratoire de souris génétiquement modifiées où l’expression de ces deux récepteurs peut être spécifiquement délétés dans la prostate à l’aide d’une molécule appelée tamoxifène. Les souris seront nourries avec de la nourriture contenant du tamoxifène et injectées en intrapéritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale) avec du tamoxifène pendant 5 jours. Le site d’injection du tamoxifène sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. De plus, les souris seront pesées afin de vérifier une absence de perte de poids suite au nourrissage avec la nourriture contenant du tamoxifène. Cependant, au laboratoire, nous réalisons souvent ce type de traitement et n’attendons pas d’effet indésirables notables à ce stade. Concernant l’étude du rôle du récepteur des androgènes et des glucocorticoïdes dans la prostate sous des conditions physiologiques, nos connaissances actuelles sur la fonction de ces deux récepteurs nous mènent à penser qu’aucun effet indésirable n’est attendu chez ces souris. Concernant l’étude du rôle du récepteur des androgènes et du récepteurs des glucocorticoïdes dans le cancer de la prostate, nous nous attendons à ce que les souris développent des lésions pré-cancéreuses 2 mois après l'injection au tamoxifène, dont certaines pourraient évoluer en adénocarcinomes 8 – 10 mois après injection de tamoxifène. Toutefois, nos connaissances actuelles concernant le rôle du récepteur des androgènes et du récepteur des glucocorticoïdes dans le cancer de la prostate suggèrent que l’apparition d’adénocarcinomes pourrait être retardée suite à la délétion de ces récepteurs, comparé à notre modèle de cancer de la prostate chez la souris. Pour cette partie, les souris seront euthanasiées au plus tard 15 mois après induction au tamoxifène.

Devenir

Après traitement au tamoxifène (nourrissage + injection en intrapéritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale)), l’ensemble des souris seront euthanasiées selon une cinétique définie à l’issue de l’étude pilote réalisée sur un petit nombre de souris. La prostate sera alors collectée pour y effectuer l’ensemble des analyses nécessaires à la bonne mise en œuvre du projet de recherche.

Remplacement

Notre projet de recherche vise à comprendre le rôle du récepteur des androgènes et du récepteurs des glucocorticoïdes dans la prostate saine et le cancer de la prostate. Au sein d’une prostate saine, les communications entre les cellules épithéliales et cellules stromales sont importantes au bon fonctionnement de la prostate. De plus, les communications entre le microenvironnement tumoral et les cellules cancéreuses prostatiques jouent un rôle crucial dans le développement et la progression du cancer de la prostate. A ce jour, aucun modèle ne permet d’étudier une telle complexité in vitro. C’est pourquoi, notre projet nécessite d’utiliser un modèle in vivo afin que l’ensemble de ces facteurs soient pris en compte. Toutefois, des études in vitro seront réalisées dans la mesure du possible (i.e. interaction protéine-ADN pourront être validée in vitro, génération d’organoïdes et utilisation de lignées cancéreuses de la prostate pour certaines analyses moléculaires).

Réduction

Le nombre de souris nécessaires pour nos expériences a été déterminé de façon à obtenir des résultats publiables et significatifs à l’aide de tests statistiques adaptés en fonction des expériences réalisées. Il n’est pas rare d’observer une forte hétérogénéité entre des souris du même groupe. En effet, il peut s’avérer nécessaire d’éliminer un échantillon de l’analyse car il possède une réponse différente des autres souris. Afin de réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous commencerons notre étude par une cinétique pilote avec un petit nombre de souris (5 souris par génotype). Cette cinétique nous permettra de raffiner notre étude mais également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le cas où le point limite serait atteint plus tôt que prévu. Par ailleurs, cette cinétique nous permettra de déterminer les temps les plus intéressants à utiliser pour les analyses plus approfondies et ainsi éviter d’utiliser des souris inutilement sur des temps d’étude qui n'aboutirait pas à un résultat convaincant. Notre expertise en expérimentation animale nous a permis de définir au mieux le nombre d’animaux qui sera utilisé pour cette étude. De plus, de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, lorsque cela sera possible, une même prostate sera utilisée pour plusieurs expériences (par exemple, recherche de différents marqueurs biologiques sur une même prostate).

Raffinement

Dans un souci de raffinement, une cinétique pilote sera réalisée avec un petit nombre de souris afin d’éviter toute souffrance inutile des animaux. Cette cinétique nous permettra d’évaluer la vitesse d’évolution des lésions pré-cancéreuses dans nos nouvelles lignées de souris, et donc de supprimer des temps trop tardifs qui pourraient altérer le bien être de l’animal. Durant toute l’étude, tous les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés tous les jours par le personnel de l’animalerie. De plus, l’état de chaque souris sera référencé deux fois par semaine dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement euthanasié par dislocation cervicale. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, une euthanasie par dislocation cérébrale sera réalisée.

Choix des espèces

A ce jour, la souris représente un modèle de choix pour notre étude en raison de : -Temps de gestation court, nous permettant d’avoir de larges cohortes contribuant à l’obtention de résultats significatifs. -L’Histologie de la prostate murine et humaine est similaire (présence de glandes et canaux constitués d’un épithélium composé de cellules luminales, basales et neuroendocrines). -Notre modèle de cancer de la prostate chez la souris présente la même cinétique de développement tumoral que celle observée chez l’homme (lésions pré-cancéreuses évoluant en adénocarcinomes). -Le système immunitaire chez la souris est proche du système immunitaire chez l’homme avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude. -Les voies de signalisation et gènes exprimés dans la prostate sont similaires chez l’homme et chez la souris. Les animaux utilisés seront adultes. Ils seront traités au tamoxifène à 8 semaines et sacrifié comme indiqué après 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois, 9 mois et 15 mois. Cette cinétique pourra être ajustée en fonction de l’étude pilote réalisée dans un premier temps sur un petit nombre de souris. Cette cinétique est importante pour étudier le rôle de AR et GR dans le développement et la progression du cancer de la prostate.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée par injection de cellules cancéreuses, 80 d’entre elles recevant en plus un médicament, la tumeur pouvant atteindre deux centimètres cubes et gêner leurs déplacements avant leur mise à mort pour prélèvement, afin de valider le rôle d’un ARN non codant dans le carcinome rénal. Le porteur indique que des métastases pulmonaires peuvent se former et provoquer une perte de poids et d’appétit. Il affirme que les cultures in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la formation tumorale et compte ouvrir une collaboration avec l’industrie pharmaceutique.

Objectifs

Le carcinome rénal à cellules claires (CRCC) est un cancer agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que l'expression d'un ARN long non codant in vivo altère la formation de carcinome des cellules rénales et la progression de métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant être testés dans des essais précliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation d'une cible pour le traitement du carcinome rénal à cellules claires. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant faire l'objet d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le carcinome rénal à cellules claires chez l'homme.

Procédures

Toutes les souris seront injectées avec des cellules tumorales (104). L'injection se fait sous anesthésie gazeuse et dure une dizaine de secondes. Les souris de l'étude expérimentale (80) subiront en plus l'administration de médicament 3 fois à 3 jours d'intervalle. Ce traitement supplémentaire est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et potentiellement la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Cette tumeur primaire devrait apparataitre à partir de 5 jours suivant injection et croitre assez rapidement. La temps d'atteinte du point limite du volume de 2cm3 est estimé à moins de 3 semaines. Les métastases ne seront pas visibiles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Lors des expériences précédentes d'injection de cellules tumorales dans le laboratoire, les souris ont du être sacrifiées du fait de la taille de la tumeur primaire et non d'effets dus aux métastases.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance d'un ARN non codant dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

L'étude se fera en deux étapes : * la première procédure constitut l'étude-pilote de la tumorigénicité des modèles cellulaires utilisés (12 souris par lignée cellulaire, donc 24 souris). * Si l'étude pilote est concluante (les lignées injectées vont entraîner une croissance tumorale), elle sera suivie de la seconde procédure : l'étude expériementale visant à étudier l'effet du médicament sur la croissance tumorale : 80 souris injectées avec les lignées modifiées pour la surexpression de l'ARN non codant et traitées ensuite soit avec le véhicule, soit avec le médicament. Ce nombre représente le nombre minimal de souris pour obtenir un résultat significatif d’un point de vue statistique en tenant compte de l’éventualité de mort précoce. Le nombre total de souris expérimentales sera de 104. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides).

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale, ce qui confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance évidente, les souris seront sacrifiées.

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. L'utilisation du modèle de xénogreffe chez la souris ne peut être remplacée par d'autres méthodes expérimentales, il est fiable et facile à manipuler et déjà largement utilisé. De plus, les données que nous produirons à partir de nos tumeurs (cinétique tumorale, séquençage d'ARN, quantifications de protéines) seront comparées à celles collectées par notre laboratoire et nos collaborateurs dans des modèles similaires pour d'autres études. Pour cette expérience d’injection de lignées cellulaires murines sur des souris immunocompétentes, nous ferons correspondre la souche d'origine des lignées cellulaires avec celle des souris réceptrices. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 6 semaines. Le médicament à tester étant un inhibiteur des points de contrôle immunitaires, il convient que sa cible, la population de lymphocytes T, soit à son meilleur stade de développement. A 6 semaines, les souris présentent un système immunitaire développé et fonctionnel, que ne présentent pas des souris plus jeunes. Après cet âge, certaines sous-populations de cellules immunitaires ainsi que la fonction immunitaire globale commence à décliner : la diminution des lymphocytes T naïfs, l'augmentation des lymphocytes T à mémoire dont la fonctionnalité est réduite et la diminution de la diversité de la reconnaissance des antigènes par les lymphocytes T entraînent l'immunosénescence.

1 920 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Elles subissent des instillations dans la vessie pour induire une cystite, avec brûlures et envies fréquentes d'uriner, puis un gavage ou une administration intravésicale du produit testé, un séjour de 72 heures en cage métabolique et un test de sensibilité à la douleur viscérale. Le projet cherche des alternatives aux antibiotiques contre la cystite récidivante de la femme. Le porteur affirme que l'étude "ne peut se faire que sur des animaux vivants", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la fonction vésicale.

Objectifs

La cystite est une infection urinaire localisée au niveau de la vessie. Elle est due, dans 90 % des cas, à une bactérie appelée Escherichia coli (E. Coli) mais d’autres bactéries ou micro-organismes peuvent en être la cause. Cette infection urinaire survient quand la bactérie E. Coli, présente naturellement dans le tube digestif (colon, rectum), pénètre dans l’urètre, puis remonte dans la vessie, et commence à se multiplier. La faible longueur de l'urètre chez la femme explique que la cystite soit plus fréquente chez elle que chez l'homme. Une femme sur deux présente au cours de son existence un ou plusieurs épisodes de cystite aiguë. Deux pics de fréquence sont observés : au début de l’activité sexuelle et après la ménopause. L'infection urinaire est plus grave si elle survient en présence d’anomalies de l’appareil urinaire (présence d’un reflux vésico urétéral, calcul rénal…) mais aussi chez un sujet souffrant d’immunodépression, chez une femme enceinte, chez les personnes âgées de plus de 75 ans et en cas de maladie rénale chronique sévère. En France, chaque année, une femme sur dix est touchée par une cystite ; 20% des femmes ayant eu une infection urinaire auront un nouvel épisode et 30% de celles-ci encore un autre épisode. On parle de cystite récidivante, lorsque le nombre annuel des infections dépasse 3 épisodes. Une fois la crise aiguë passée, on peut envisager une stratégie de prévention des récidives. Une antibiothérapie prophylactique prolongée pendant 6 mois, est souvent utilisée. Toutefois cela peut induire l’émergence de souches bactériennes résistantes aux antibiotiques. Il est donc nécessaire de trouver des alternatives aux antibiotiques, qui devraient être utilisés seulement dans les cas les plus graves.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui le médecin généraliste, en cas de cystite, prescrit généralement un traitement antibiotique de courte durée (en une seule dose ou sur trois ou cinq jours). Toutefois en cas d’infection récidivante, des traitements répétés d'antibiotiques sont souvent utilisés, ce qui contribue fortement à générer une résistance à ces traitements. Il est donc urgent de mettre au point de nouveaux traitements, hors antibiotiques, afin de traiter les cystites récidivantes. Le but ultime de notre projet est de mettre en place un modèle de cystite qui sera utilisé pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments ayant un effet anti-inflammatoire, afin de contribuer à réduire l’utilisation d’antibiotiques chez les femmes atteintes de cystite bactérienne.

Procédures

La première intervention sur les rats sera par des instillations intravésicales de la combinaison PS+LPS (une fois/jour pendant 4 jours) sous anesthésie à l'isoflurane. La durée de l'intervention sera de 90 minutes par jour. Chaque rat sera posé sur un tapis chauffant à 37°C afin d’assurer la température corporelle physiologique. Avant chaque instillation par l’urètre, un gel lubricant sera appliqué au niveau de la zone du méat urétral. Afin d’éviter l’assèchement de la cornée pendant l’anesthésie, les yeux seront traités avec un gel oculaire (Lubrithal®). La deuxième intervention consiste à administrer à l'animal le produit test (candidat médicament) ou son solvant, par gavage ou par voie intravésicale. La duréé de l'administration par gavage est de 2 minutes et la durée de l'administration par voie intravésicale est de 10 minutes. Si nécessaire, un échantillon de sang sera prélevé 1 fois par jour pendant 4 jours maximum par la veine de la queue afin de collecter des données de pharmacocinétique. La duréé de cette intevention est de 5 minutes. La troisième intervention concerne le séjour en cages métaboliques pendant 72 heures. La quatrième intervention consiste à réaliser le test de sensibilité à la douleur viscérale. La durée de cette intervention est de 60 minutes.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale décrite dans ce projet a pour but d’induire une inflammation vésicale chez le rat qui puisse mimer la cystite bactérienne. Les symptômes d’une infection urinaire sont le besoin constant d’éliminer de très faibles quantités d’urine. Uriner s’accompagne de sensations de brûlure. La cystite peut parfois s’accompagner d’une fièvre légère, moins de 38°C, et d’un sentiment de malaise. Dans la plupart des cas, les cystites n’entraînent pas de complications. Toutefois, dans les cas les plus graves, l’infection peut remonter et atteindre le rein.

Devenir

A l'issue des 3 premières Procédures tous les animaux seront maintenus en vie. A l'issue de la Procédure finale, tous les animaux seront euthanasiés. La mise à mort est justifiée par le fait que les animaux ont subi plusieurs procédures, induisant une pathologie, et ne pourront pas être réutilisés pour d'autres expérimentations.

Remplacement

Le but de notre étude est de quantifier l’effet de molécules ayant des mécanismes d’actions différents sur la fonction vésicale chez le rat éveillé, donc l’étude ne peut se faire que sur des animaux vivants. En effet, il n’y a pas de modèles in vitro prédictifs de la fonctionnalité vésicale dans sa globalité.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera de 12, étant donné la variabilité interindividuelle de réponse au Lipopolysaccharide. Le nombre de lots est déterminé en fonction du nombre de doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Un calcul de puissance statistique basé sur les données de la littérature nous a montré que l'utilisation de 12 rats par groupe nous permettra de détecter une différence de 25% entre les rats traités avec le solvant et les rats traités avec le candidat médicament. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux (entre 4 et 8 groupes expérimentaux, nombre d'animaux par groupe égal à 12) seront comparés entre eux en utilisant un test statistique standardisé.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les animaux seront hébergés 2-4 par cage, en fonction de leur poids corporel, avec des igloos ainsi que des morceaux de bois à grignoter. Les cages sont de type IVC en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront gavés par un technicien expérimenté. Le jour de l'administration intravésicale de Protamine Sulfate et de LPS, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane. L'examen quotidien des animaux permettra d'évaluer plusieurs paramètres de santé et bien-être, notamment changement de couleur et d'aspect des poils (poils hérissés), diminution de la prise de boisson et de nourriture, diminution du grooming et de l'activité exploratoire dans la cage, perte de poids. Si la perte de poids sera supérieure à 20 % du poids initial, l'animal sera euthanasié. Dans le cas où un prélèvement de sang serait nécessaire, les animaux seront anésthésiés à l'isoflurane afin de minimiser le stress et la douleur. Pendant le séjour dans les cages métaboliques pendant 72 heures, les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Les animaux seront en contact visuel et olfactif entre eux mais le matériel d’enrichissement au niveau du sol de la cage ne pourra pas être utilisé car il peut interférer avec la collecte des fèces et des urines.

Choix des espèces

Les rats sont utilisés très fréquemment en recherche préclinique pour l’étude de la fonction vésicale. Les paramètres physiologiques et pathologiques liés à la fonction vésicale sont très bien caractérisés chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats entre différents laboratoires. Les rats seront de souche Wistar ou Sprague-Dawley, car ces souches sont largement utilisées pour les études de la fonction vésicale (nombreuses références bibliographiques). D'autres modèles expérimentaux, notamment chez le chien, le chat et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et d’infrastructures d’hébergement. Les animaux seront utilisés à partir de 9 semaines d'âge (adulte) pour avoir une équivalence chez l'Homme.