Troubles nerveux

Nées immunodéficientes, 360 souris reçoivent dans le cerveau, dès leurs premiers jours de vie, une greffe de cellules issues de tissus de patients épileptiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent ensuite l'implantation d'électrodes et un enregistrement cérébral prolongé en cage individuelle, avec un risque d'activité épileptique et de rejet maternel. Le projet veut savoir si des astrocytes humains issus de tissus malades peuvent déclencher une hyperexcitabilité une fois greffés dans un cerveau de souris. Toutes sont tuées à l'issue pour récupérer leurs tissus cérébraux.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’approcher les mécanismes à l’origine de l’épilepsie chez l’homme. Notre laboratoire utilise déjà des tissus réséqués chez des patients souffrant de tumeurs cérébrales ou de dysplasies épileptogéniques ou non, pour préparer des tranches aiguës utilisées en électrophysiologie. Malheureusement, la durée de vie de ces prélèvements n’est que de quelques heures. Nous proposons donc d’utiliser une partie de ces tissus pour isoler et mettre en culture des progéniteurs neuraux qui seront différenciés in vitro en astrocytes humains. Ces astrocytes différenciés ou les progéniteurs seront ensuite greffés dans le cerveau de souriceaux immunodéficients (lignée NOD SCID), où ils pourront s’intégrer dans l’environnement cérébral murin. Dans ce contexte, les cellules humaines pourraient induire localement certaines altérations fonctionnelles caractéristiques de l’épilepsie. Ce modèle permettra d’étudier le rôle spécifique des astrocytes humains dérivés de tissus épileptiques dans les mécanismes physiopathologiques de l’épilepsie sur une durée prolongée. Ce projet s’inscrit dans le cadre d’une collaboration avec les neurochirurgiens de l’AP-HP spécialistes de l’épilepsie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et physiopathologiques impliqués dans la dysplasie corticale focale (FCD), une cause majeure d’épilepsie pharmacorésistante chez l’humain. En utilisant des cultures primaires dérivées de tissus humains post-chirurgicaux, ce travail permettra d’étudier de manière unique le comportement des astrocytes humains, dans un contexte épileptique. Les greffes intracérébrales réalisées chez des souriceaux immunodéficients permettront d’évaluer in vivo le potentiel épileptogène des astrocytes humains issus de tissus dysplasiques comparés à ceux issus de tissus non épileptiques. Ces modèles permettront de : déterminer si les astrocytes humains issus de tissus de FCD contribuent à la genèse ou au maintien de l’hyperexcitabilité neuronale ; explorer les mécanismes d’interaction entre astrocytes humains et circuits neuronaux murins ; fournir des données expérimentales inédites susceptibles d’orienter de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment dans les cas d’épilepsie résistante aux traitements médicamenteux ; développer un modèle préclinique pertinent pour tester à terme des approches de modulation cellulaire ou pharmacologique ciblée. Ainsi, les bénéfices scientifiques et médicaux attendus sont considérables, tant sur le plan de la compréhension fondamentale des épilepsies focales que sur le plan de la recherche de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux (360 souris nouveau-nées immunodéficientes) seront soumis aux interventions suivantes : -Injection intracérébrale de cellules humaines chez le souriceau nouveau-né, réalisée sans ouverture du plan cutané. -Chirurgie cérébrale chez l’animal adulte, comprenant l’implantation d’électrodes intracérébrales. -Enregistrements EEG télémétriques réalisés sur une période prolongée, sans contention. -Procédure terminale permettant la récupération des tissus cérébraux nécessaires aux analyses prévues.

Impact sur les animaux

-Greffe intracérébrale néonatale : cette intervention peut entraîner un stress de manipulation et une douleur aiguë très brève au moment de l’injection, ainsi qu’un inconfort transitoire dans les heures qui suivent. Chez les souriceaux manipulés, il existe un risque de rejet maternel ou de difficultés de tétée dans les 12–24 h suivant la greffe, pouvant se traduire par un retard de croissance ou une altération de l’état général. -Phénotype lié à l’immunodéficience (NOD SCID) : le phénotype immunodéficient peut être associé à une fragilité accrue et à une sensibilité augmentée aux infections opportunistes, susceptible d’entraîner une altération progressive de l’état général (amaigrissement, baisse d’activité), de durée variable selon les individus. -Implantation d’électrodes EEG : cette chirurgie peut provoquer des douleurs post-opératoires modérées pendant quelques jours, ainsi qu’un inconfort local transitoire lié à la cicatrisation et au port de l’implant. Une irritation cutanée au niveau des sutures et/ou du site d’implantation peut également survenir, généralement de courte durée. -Hébergement individuel lié au dispositif télémétrique : l’hébergement en cage individuelle sur une période prolongée peut induire un stress lié à l’isolement social, d’intensité faible à modérée, pendant toute la durée concernée. -Effets biologiques potentiels liés à la greffe : dans certains cas, une activité épileptiforme peut apparaître, pouvant s’accompagner de modifications transitoires du comportement et/ou d’une altération de l’état général (baisse d’activité, amaigrissement), d’intensité variable et de durée variable selon les individus.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la récupération des tissus nécessaires aux analyses fonctionnelles et histologiques.

Remplacement

L’étude porte sur les mécanismes cellulaires impliqués dans l’épilepsie humaine, et plus particulièrement sur le rôle des astrocytes dérivés de tissus post-opératoires. Ces phénomènes nécessitent un modèle biologique intégrant un réseau neuronal fonctionnel et un environnement cérébral vivant, ce qui ne peut être entièrement reproduit par des approches in vitro. Les cultures cellulaires humaines sont déjà utilisées pour les étapes préliminaires (isolement, différenciation, caractérisation des astrocytes), ce qui limite le recours aux animaux aux seules expériences indispensables pour étudier les interactions entre cellules humaines et tissu nerveux in vivo. Ainsi, le recours à l’animal est restreint à la validation physiologique du modèle.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé a priori à partir de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir un effectif minimal compatible avec des résultats robustes. Les effectifs par groupe ont été estimés à l’aide du logiciel G*Power, sur la base de : (i) test statistique prévu (comparaisons multiples/ANOVA selon les paramètres analysés), (ii) risque de première espèce α = 0,05, (iii) puissance cible 1−β = 0,90, et (iv) taille d’effet attendue estimée à partir de la littérature et/ou de données antérieures du laboratoire. Ces calculs conduisent à un effectif de 20 animaux par groupe pour les analyses principales. Afin de limiter le nombre total d’animaux, plusieurs mesures de réduction sont mises en place : les mêmes animaux sont utilisés pour collecter plusieurs types de données (EEG in vivo, puis analyses histologiques et/ou fonctionnelles ex vivo selon les cohortes), ce qui évite la duplication d’expériences ; les procédures chirurgicales et les acquisitions sont standardisées entre expérimentateurs pour réduire la variabilité interindividuelle ; enfin, l’organisation en lots expérimentaux est planifiée de manière à maximiser les données obtenues par animal.

Raffinement

Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale appropriée et associées à une analgésie systématique. Pour les chirurgies d’implantation d’électrodes EEG, l’anesthésie est réalisée par injection intrapéritonéale de kétamine (95 mg/kg)/xylazine (12 mg/kg), et une analgésie pré-opératoire est administrée par buprénorphine (0,1 mg/kg, S.C.). Une anesthésie locale (pommade EMLA / lidocaïne) est appliquée sur la zone d’incision. La température corporelle est maintenue à 37 °C pendant l’intervention et au réveil à l’aide d’un tapis/couveuse chauffant(e), et les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Après chirurgie, les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne pendant 7 jours permettant de détecter précocement tout signe de douleur, de détresse ou d’altération de l’état général. Les critères d’arrêt (points limites) incluent notamment : perte de poids significative ou retard de croissance, prostration ou baisse marquée d’activité, troubles moteurs persistants, automutilation/grattage au niveau de l’implant ou plaies, signes de déshydratation, ou tout comportement anormal durable. En cas d’atteinte d’un point limite, l’animal est retiré du protocole et euthanasié sans délai conformément aux modalités décrites dans l’item relatif à la mise à mort. Le raffinement de l’environnement repose sur un hébergement adapté avec enrichissement (matériel de nidification) et accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Lorsque l’implantation EEG impose une protection du dispositif et la qualité des enregistrements, un hébergement individuel temporaire est mis en place ; il est limité au strict nécessaire et s’accompagne d’un enrichissement maintenu. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, en limitant la durée de contention et le nombre d’interventions, afin de réduire le stress et l’impact sur le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus appropriée pour ce projet car elle permet d’utiliser des lignées immunodéficientes compatibles avec la greffe de cellules humaines. Les souris NOD SCID présentent un phénotype immunodéficient caractérisé par l’absence de lymphocytes T et B fonctionnels, sans phénotype dommageable spontané sur le plan moteur ou comportemental dans les conditions d’élevage et d’expérimentation prévues. L’absence de cellules immunitaires limite le risque de rejet des cellules humaines greffées et permet un suivi stable de leur intégration dans un cerveau vivant. Des travaux pionniers utilisant ce type de matériel cérébral humain ont été réalisés par des équipes internationales de recherche, validant ainsi ce choix. Les greffes seront réalisées chez des souriceaux âgés de 1 à 2 jours (P1–P2), car cette fenêtre développementale favorise la survie et l’intégration des cellules greffées dans le tissu cérébral, tout en permettant un suivi prolongé de leur maturation et de leurs effets fonctionnels au cours du développement postnatal.

300 souris subissent une chirurgie unique sous anesthésie provoquant un accident vasculaire cérébral, ischémique ou hémorragique selon le groupe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite observées six ou vingt-quatre heures, avec deux prélèvements de sang et deux évaluations neurologiques, puis tuées pour doser des biomarqueurs et mesurer le volume de la lésion cérébrale. Le porteur reconnaît que certaines présentent après l'opération une fatigue, une perte de mobilité ou des difficultés à se nourrir pouvant durer jusqu'à la fin de la période d'observation. Il écrit que, malgré plus de vingt ans de recherches et de nombreuses études humaines, aucune donnée disponible n'explique l'évolution de ces marqueurs, et conclut que le recours à la souris est "indispensable".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une urgence médicale majeure et constitue l’une des principales causes de décès et de handicap dans le monde. Parmi les AVC, ceux causés par un caillot qui bloque une grosse artère dans le cerveau (appelés AVC ischémiques) peuvent bénéficier de traitements efficaces. Cependant, même avec une prise en charge rapide, plus d’un patient sur deux reste dépendant trois mois après l’AVC. Le facteur le plus important pour améliorer les chances de récupération est le temps : chaque demi-heure de retard augmente considérablement le risque de décès ou de séquelles. Or, avant d’initier un traitement, les médecins doivent réaliser une imagerie (scanner ou IRM) pour vérifier s’il s’agit d’un AVC ischémique (avec occlusion d’une artère) ou hémorragique (avec saignement d’une artère), car les traitements sont opposés selon le type. Ce délai d’attente est donc un obstacle majeur. Des travaux récents ont identifié des molécules présentes dans le sang (biomarqueurs) qui pourraient permettre de reconnaître rapidement le type d’AVC. Mais ces biomarqueurs n’ont pas encore été testés dans des conditions permettant leur utilisation fiable en pratique. En particulier, on ne connaît pas leur évolution dans le temps ni leur réponse spécifique selon le type d’AVC. Ce projet a pour objectif d’étudier, chez la souris, l’évolution de ces biomarqueurs dans des modèles expérimentaux d’AVC ischémique et hémorragique. Grâce à un environnement contrôlé, il sera possible de mieux comprendre leur comportement dans le temps et d’identifier ceux qui permettent de différencier rapidement les types d’AVC. À terme, ces résultats pourraient contribuer au développement d’un test sanguin rapide chez l’humain, utilisable dès les premiers instants, pour orienter plus vite les patients vers le bon traitement, et ainsi diminuer la mortalité et le risque de séquelles neurologiques sévères après un AVC.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet cherche à repérer des marqueurs biologiques dans le sang qui réagissent très tôt après un accident vasculaire cérébral (AVC). L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans le corps dès les premières heures, et de voir si certains marqueurs sanguins permettent de faire rapidement la différence entre les deux grands types d’AVC : l’AVC ischémique (lié à un caillot) et l’AVC hémorragique (lié à une rupture de vaisseau). Cette phase permettra de faire progresser les connaissances sur les mécanismes de l’AVC et d’identifier des éléments utiles pour améliorer le diagnostic dans les services d’urgence. À long terme, ces découvertes permettront de créer un outil de diagnostic simple et rapide, basé sur un test biologique réalisable dès la première prise en charge du patient. Cet outil pourra : •Accélérer la mise en route du bon traitement, ce qui est essentiel car chaque minute compte. Un gain d’une heure pourrait réduire d’environ 20 % les risques de décès ou de handicap. •Orienter le patient directement vers le service le plus adapté à sa situation (urgences classiques, service spécialisé, salle d’imagerie interventionnelle), en évitant les pertes de temps liées à des transferts inutiles. À plus long terme, ce système pourrait aussi être intégré dans les études cliniques testant de nouveaux traitements, pour pouvoir les administrer plus tôt et de façon plus ciblée. En résumé, ce projet a pour but d’améliorer la rapidité et la précision du diagnostic des AVC, ce qui bénéficiera directement aux patients en augmentant leurs chances de survie et de récupération. Il contribuera aussi à une meilleure organisation des soins d’urgence et à une avancée importante dans le domaine des maladies neurologiques.

Procédures

Le projet sera mené sur 300 souris, réparties en quatre groupes correspondant à différents modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). Chaque souris sera observée et suivie selon une organisation identique comprenant une période d’acclimatation à l’animalerie de 7 jours, un examen de base avant l’intervention durant 5 minutes et une prise de sang de très faible volume. Chaque souris sera utilisée pour une unique intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie durant moins de 20 minutes. Ensuite elle sera observée pour une durée de 6h ou de 24h où elle subira deux prélèvements veineux durant moins de 10 secondes et deux évaluations cliniques durant moins de 5 minutes sans aucune contention prolongée.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, certaines interventions peuvent entraîner un inconfort ou des effets secondaires chez les souris, mais toutes les procédures sont encadrées et réalisées dans le respect du bien-être animal. Les tests neurologiques réalisés après l’intervention peuvent provoquer un léger stress, mais celui-ci est de très courte durée. Les prélèvements de sang effectués sur des animaux éveillés peuvent entraîner un bref inconfort, comparable à une piqûre, mais ils sont très courts et les volumes prélevés sont minimes. De même, les injections (sous la peau ou dans l’abdomen) peuvent provoquer un léger inconfort au moment de l’acte, mais la douleur est passagère. Concernant les chirurgies pratiquées dans ce projet, une douleur modérée et transitoire est possible au niveau de la zone opérée. Après la chirurgie, certains animaux peuvent présenter une gêne neurologique : fatigue, perte de mobilité ou difficultés à se nourrir. Ces effets sont surveillés et pris en charge, mais peuvent durer jusqu’à la fin de la période d’observation. Dans tous les cas, des traitements antidouleur adaptés sont administrés, et des critères précis sont mis en place pour limiter toute souffrance inutile. Les animaux sont étroitement surveillés tout au long de l’étude, et toute détresse conduit à une intervention immédiate.

Devenir

A l’issue de chaque procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort à un temps défini dans le cadre d’un recueil d’organes et de tissus (sang, cerveau) nécessaires aux objectifs scientifiques du projet. La mise à mort est indispensable pour l’analyse biologique (dosage de biomarqueurs), histologique (analyse du volume lésionnel) et immuno-histochimique (étude de l’expression et de la localisation tissulaire des protéines d’intérêt).

Remplacement

À ce jour, il n’existe aucune méthode alternative permettant de répondre à la question scientifique posée sans recourir à l’expérimentation animale. Malgré plus de 20 ans de recherches et de nombreuses études humaines, aucune donnée disponible ne permet d’expliquer de manière précise et fiable comment évoluent certains marqueurs biologiques après un accident vasculaire cérébral (AVC). Les modèles développés en laboratoire (sur cellules, dits "in vitro") ne permettent pas non plus de reproduire l’ensemble des mécanismes complexes qui se déclenchent lors d’un AVC, comme les réactions inflammatoires, la coagulation, les atteintes des vaisseaux sanguins ou encore la souffrance neuronale. Les modèles animaux, en particulier chez la souris, sont aujourd’hui les seuls à permettre une reproduction fidèle de ce qui se passe dans le corps humain lors d’un AVC, que ce soit par obstruction d’un vaisseau ou hémorragique (saignement cérébral). Ces modèles sont déjà largement utilisés pour comprendre la maladie et tester de nouvelles approches thérapeutiques. En l’absence d’alternative fiable chez l’humain ou en laboratoire, l’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour répondre à la question posée dans ce projet de recherche, dans le but de mieux comprendre la maladie et d’améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, plusieurs stratégies ont été mises en place. Les marqueurs étudiés ont été directement sélectionnés à partir de données humaines déjà disponibles, issues de grandes bases cliniques, d’analyses de la littérature scientifique et de tests réalisés sur du sang de patients. Ensuite, chaque souris incluse dans le protocole permettra d’obtenir plusieurs prélèvements de sang à différents moments, ce qui évite d’utiliser un animal par point de mesure. Grâce aux progrès des techniques de laboratoire, de très faibles volumes de sang (quelques microlitres) suffisent désormais pour analyser les marqueurs recherchés. Ces prélèvements sont réalisés selon les recommandations internationales, sans dépasser les seuils autorisés. Enfin, un calcul précis du nombre de souris nécessaires a été réalisé avant le début du projet grâce à une évaluation statistique, pour s’assurer que chaque animal utilisé est indispensable. Grâce à l’organisation choisie, ce protocole permet de réduire d’environ deux à trois fois le nombre de souris qui aurait été nécessaire avec une approche classique. L’ensemble de ces mesures permet de respecter les principes éthiques de la recherche animale et de limiter son impact tout en garantissant des résultats fiables.

Raffinement

Avant toute procédure susceptible d’induire une douleur modérée, une analgésie préventive sera administrée. Une crème ou un spray anesthésique local sera également appliqué afin d’engourdir la zone traitée et de limiter l’inconfort au réveil. Les souris seront ensuite installées dans une chambre chauffée pour favoriser un réveil confortable. Les animaux auront un accès permanent à l’eau et à une alimentation adaptée, notamment sous forme gélifiée après l’intervention pour favoriser leur récupération. L’état de santé sera surveillé de manière rigoureuse grâce à des grilles d’évaluation précises, permettant de détecter toute douleur ou signe de détresse. Ces évaluations porteront à la fois sur le comportement de l’animal et sur ses capacités motrices. En cas de douleur mal soulagée ou de signes de souffrance importants, l’application de points limites stricts et spécifiques au projet sera réalisée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés.

Sur 410 souris, 130 ne servent qu'à entraîner les expérimentateurs aux techniques d'injection intramusculaire, intrathécale et intraveineuse. Les 280 autres reçoivent un vecteur viral, 80 d'entre elles deux jours après leur naissance, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à huit semaines pour l'histologie des tissus. Entre sept et huit semaines, chaque souris passe dix tests : agrippement, suspension, tapis roulant, barre crantée, immersion de la queue en bain-marie, sensibilité au froid, plaque froide, réactivité cutanée, enregistrement de l'activité pendant 22 heures et électromyographie sous anesthésie. Le porteur écrit qu'aucun analgésique ne sera administré pendant cette phase parce qu'il fausserait les mesures de sensibilité, et qu'une souris montrant des signes persistants de souffrance sera tuée plutôt que soignée.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester une approche de modulation génique prometteuse pour la maladie rare de Charcot- Marie-Tooth (CMT), une neuropathie périphérique entraînant des troubles moteurs et sensitifs. Cette pathologie provoque une perte progressive de force et de coordination, et aucune thérapie curative n’existe actuellement. Nous utilisons des souris reproduisant fidèlement la maladie humaine pour évaluer si la réduction du gène d’intérêt permet d’améliorer la fonction musculaire et nerveuse. Cette stratégie sera testée soit par croisement génétique, soit par thérapie génique utilisant des vecteurs viraux (AAV). Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des mécanismes de la maladie et la validation d’une approche thérapeutique innovante, transposable ultérieurement à l’Homme. Tous les tests sont conçus pour limiter au maximum la douleur et le stress des animaux. Les critères de bien-être sont surveillés quotidiennement et toute souffrance incompatible avec le maintien dans le protocole entraîne l’arrêt immédiat et l’euthanasie de l’animal.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques à l’origine de la maladie, causant des défauts à la fois dans le tissu musculaire et dans le tissu nerveux. Ce projet pourrait également conduire à une preuve de concept thérapeutique pour une maladie aujourd’hui incurable

Procédures

Une partie des animaux (130) sera utilisée pour un entrainement aux différentes techniques d’injection (intramusculaire, intrathécale, intraveineux). Les autres animaux (280) seront répartis comme suivant : 200 animaux seront injectés durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno- associés ; 80 animaux seront injectés au 2ème et jour après la naissance et 120 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 8 semaines, les animaux seront soumis à une série de 10 tests comportementaux : test d’aggrippement (durée 3x20s) - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x30s max en tout), -test sensibilité au froid (3 mesures par patte, 30s max par patte) -mesure de réactivité sur plaque froide (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité des souris par des capteurs (durée de 22h) ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le phénotype général des souris a été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 semaines après caractérisation comportementale. Une étude histologique des tissus affectés sera ensuite effectuée.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Dans cette étude, nous utiliserons des souris mâles et femelles issues des croisements pour maximiser les informations obtenues tout en réduisant le nombre total d’animaux. Chaque souris sera suivie longitudinalement, c’est-à-dire qu’elle sera étudiée à plusieurs moments au cours de sa vie, afin de mesurer l’évolution des symptômes musculaires et nerveux. Grâce à cette approche, nous pourrons obtenir des résultats fiables tout en appliquant le principe de réduction : utiliser le moins d’animaux possible pour répondre aux questions scientifiques.

Raffinement

Les nouveau-nés seront avec leurs parents jusqu’au sevrage. Après cette période, les animaux seront hébergés par groupes de 2 à 5 par cage, dans un environnement ventilé. La température sera maintenue constante et un cycle lumineux de 12 heures jour/nuit sera respecté. Chaque cage sera équipée de nids et les animaux auront un accès illimité à l’eau et la nourriture. Un tube par cage sera également disposé. Les souris CMT présentent des difficultés au temps de suspension, de la nourriture en gel ainsi que des pellets seront donc directement placés dans la cage afin de soulager l’animal dans son accès à la nourriture. À partir du moment où les animaux seront au phénotypage (semaine 7 et 8), ils seront contrôlés du lundi au vendredi lors des tests afin de pouvoir détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance ou de stress comme un pelage ébouriffé ou terne, un dos voûté, de l’apathie, des comportements répétitifs (léchage excessif, tourner en rond), une maigreur visible (pesée lundi semaine 7 et semaine 8), ou encore une agressivité envers les congénères. Si un de ces signes se présente de manière sévère ou persistante, l’animal sera euthanasié et retiré de l’étude afin de lui éviter toute souffrance, cette décision est justifiée par le fait que l’administration d’analgésiques pourrait altérer les paramètres comportementaux ou sensoriels étudiés (baisse de la sensibilité), compromettant ainsi la validité scientifique des données. Cependant, un antalgique sera administré en sous-cutanée au niveau de la nuque avant l'injection d'AAV afin de ne pas induire de douleur. La zone d’injection sera régulièrement inspectée pour détecter tout gonflement ou changement de couleur pouvant indiquer une infection.

Choix des espèces

La souris est utilisée comme modèle pour étudier la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT), car son système musculaire et nerveux est suffisamment proche de celui de l’humain pour reproduire les principaux aspects de la pathologie. Les autres espèces présentent des différences trop importantes, et les modèles cellulaires ne permettent pas d’observer les effets à l’échelle de l’organisme, notamment sur la fonction musculaire et la conduction nerveuse. Les animaux sont étudiés à l’âge de 7 à 8 semaines, correspondant à un stade où le phénotype de la maladie est pleinement exprimé. Cela permet d’évaluer de manière pertinente les effets de la pathologie ainsi que l’efficacité de la thérapie.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un composé par voie orale six jours sur sept pendant huit semaines, puis passent le rotarod, où elles sont forcées de marcher cinq minutes sur une roue en rotation, le test du gait, et le test de von Frey, qui applique des forces croissantes sur la patte au moyen d'un filament. La lignée utilisée porte une mutation de Mfn2 qui reproduit une dénervation musculaire et des défauts locomoteurs apparaissant après six mois. Le porteur indique que les composés ont déjà montré un effet bénéfique sur un modèle in vitro dérivé de cellules humaines de patients, et qualifie néanmoins le passage chez la souris d'étape "indispensable".

Objectifs

La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique (SNP). Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, des déformations squelettiques des extrémités, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Une des formes les plus fréquente de CMT est la forme CMT2A. Au niveau cellulaire, nos travaux précédents ont montré que la Mfn2 mutée entraine des défauts d'organelles dans les neurones conduisant à l’activation d’un stress cellulaire . Ce projet a pour but de tester plusieurs composés pharmacologiques, dont l’effet a d’abord été validé dans des modèles cellulaires, permettant d’améliorer le contact entre ces deux organelles et de réduire le stress cellulaire, dans un modèle murin modélisant de la maladie CMT2A.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si ces composés pharmacologiques représentent une possibilité thérapeutique pertinente pour la CMT2A. Si un effet bénéfique est obtenu, cela pourrait dans le futur conduire à un essai clinique chez l’homme. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT liées à des défauts de stress du réticulum endoplasmique ou à des défauts d’organelles

Procédures

Les animaux seront soumis à : une administration de traitement par voie orale en prise spontanée 6j/7 pendant 8 semaines (léger; quelques minutes); des tests de comportement permettant la mesure de la locomotion et de la sensibilité des pattes (maximum 15 minutes par animal pour chaque test) . Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais ( 5 minutes) et entre chaque test (au moins deux jours). A la fin de l'expérience, les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les animaux CMT2A présentent un phénotype léger d’apparition tardive (après 6 mois) sans impact sur la qualité de vie et surive des animaux. Dans le cas de l’administration guidée par micropipette, les animaux subiront à l’âge adulte un traitement par voie orale de 6 jours par semaine pendant deux mois. Cela impliquera une légère contention de l'animal une fois par jour au moyen d'une légère pression exercée par la paume de la main de l'expérimentateur. L'administration par micropipette ne créera pas d'inconfort, et les composés ont déjà été testé et sont bien tolérés. Au cours du test rotarod, les souris seront forcées à marcher sur une roue qui tourne pendant 5 min. Pour les souris transgéniques qui présentent des défauts locomoteurs sur ce test, cela pourra conduire à une fatigue musculaire légère. Nous n'anticipons pas de nuisance liée au test du gait. Le test VonFrey, qui a pour but d’analyser la réponse sensitive, entraîne par contre un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Les souris ressentiront ainsi une légère piqûre au niveau de leur paume qui entraine un léger inconfort de quelques secondes.

Devenir

mise à mort et récupération des tissus

Remplacement

l est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique de ces composés sur un modèle in vitro de la CMT2A. Néanmoins le passage in vivo, notamment chez la souris, est une étape indispensable pour établir la preuve de concept et la mise au point de la dose du traitement, sa biodisponibilité, afin d'envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire (= 15 animaux par groupe) pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et des tests statistiques. Au total nous utiliserons 420 animaux répartis de la manière suivante : Deux groupes génétiques : contrôles et mutants - Quatre groupes thérapeutiques : 1 solution véhicule (contrôle) et 4 différents composés pharmacologiques.

Raffinement

Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Afin d’optimiser le bien-être de nos animaux, nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage afin de réduire la douleur et le stress des animaux. Nous avons choisi de privilégier un mode d’administration de notre composé pharmacologique par voie orale via la méthode MDA plutôt que par gavage afin de réduire considérablement le stress des animaux et d’éventuels risques de blessures lors de l’injection.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, la lignée utilisée pour la CMT2A reproduit une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez ces patients telles qu'une dénervation musculaire, et des défauts locomoteurs tardifs. Pour les trois études, les traitements seront réalisés à 4 mois (proche du début ds symptômes moteurs) pendant 8 semaines. L'ensemble des groupes de souris de ces études seront suivis pendant les deux mois de traitement (soit de 4 à 6 mois).

Cinquante-six xénopes arrivent dans ce projet en ayant déjà subi une ou deux laparotomies lors d'un projet précédent. 80 femelles adultes au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 58 tuées à l'issue et 22 transférées vers un projet suivant. Chacune peut être ouverte au ventre jusqu'à six fois, sous anesthésie et à un an d'intervalle, pour prélever ses ovocytes, avec à chaque fois une douleur post-opératoire de vingt-quatre heures, une semaine d'isolement le temps de la cicatrisation et un risque d'infection des sutures. Le porteur affirme que la modélisation informatique rend mal compte de la membrane cellulaire et qu'il est "indispensable" de travailler sur cellules vivantes, tout en reconnaissant utiliser aussi des lignées cellulaires, moins robustes selon lui.

Objectifs

Les neurones, cellules du cerveau, communiquent entre eux par le biais de protéines appelées récepteurs. Ces récepteurs jouent un rôle central dans les processus tels que l’apprentissage et de la mémoire. La dysfonction de ces récepteurs est impliquée dans de nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, retard mental, autisme, schizophrénie). Il est donc important de comprendre comment ces récepteurs changent de forme pour s’activer et se désactiver, et comment ces mouvements sont affectés par des petites molécules appelées modulateurs. La compréhension de ces mécanismes est en effet une étape cruciale pour la conception de médicaments ciblant les maladies neurologiques et psychiatriques avec une meilleure efficacité et moins d’effets secondaires. De telles études requièrent l’utilisation de modèles cellulaires in vitro, permettant la caractérisation des récepteurs en conditions contrôlées, mais dans un environnement proche de leur environnement natif. Le projet consiste à utiliser les ovocytes de Xénope comme modèle cellulaire in vitro pour étudier les propriétés moléculaires et pharmacologiques d’une famille de récepteurs du cerveau. De par leur grand nombre, leur grande taille, leur robustesse et leur grande capacité à synthétiser des protéines membranaires, les ovocytes de Xénope sont en effet un modèle très puissant pour l’étude des récepteurs du cerveau. Ce projet devrait permettre des avancées scientifiques sur le fonctionnement de ces récepteurs, ainsi que sur la mise au point de nouveaux agents d’intérêt thérapeutique en neurologie et psychiatrie.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus qui constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Une grande majorité de ces troubles s’expliquent par un mauvais fonctionnement des récepteurs neuronaux. Actuellement, un grand nombre de molécules développées pour cibler ces récepteurs échouent en phase clinique à cause d’effets indésirables (somnolence, problèmes de mémoire, hallucinations, toxicité). Une meilleure compréhension des mécanismes induisant un mauvais fonctionnement de ces récepteurs, ainsi que de l’influence de l’environnement chimique de ces récepteurs sur leur fonctionnement permettrait d’améliorer l’efficacité des traitements et limiter les effets secondaires. En outre, ce projet permettra le développement de nouvelles molécules à visée thérapeutique ciblant les récepteurs du cerveau.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie abdominale pour prélèvement d’ovocyte sous anesthésie générale d’une durée d’environ 30 minutes. A la suite de cette procédure, les animaux seront hébergés individuellement durant 7 jours afin de contrôler la bonne récupération/cicatrisation. Cet acte pourra être réalisé au maximum 6 fois par animal avec une période de repos d’au moins une année entre deux actes.

Impact sur les animaux

Nous anticipons les nuisances suivantes sur les xénopes : (i) Hypothermie durant la période d’anesthésie ; (ii) Douleur post-opératoire dans les 24h suivant la laparotomie ; (iii) Inconfort (tiraillements) lié à la cicatrisation de la plaie pour une durée d’environ 7 jours post-chirurgie ; (iv) Dans de très rares cas, éventuelle infection des points de suture ; (v) Léger stress et inconfort lié à la manipulation lors des transferts de l’animal entre les bacs d’hébergement et les bacs d’expérimentation ; (vi) Léger stress lié à l’hébergement individuel post-chirurgie, le temps que la plaie cicatrise.

Devenir

58 animaux seront euthanasiés à l’issue du nombre maximal d’interventions chirurgicales fixé ou avant si leur état de santé ou la taille de leurs sacs ovariens ne permet pas d’atteindre ce nombre. 22 animaux n’auront pas le nombre maximal de chirurgies à la fin du projet et seront donc utilisés dans un projet ultérieur dans le cadre d’une utilisation continue.

Remplacement

Des expériences de modélisation moléculaire in silico seront réalisées pour prédire certaines propriétés moléculaires des récepteurs du cerveau ainsi que les modes de liaisons des composés pharmacologiques s’y liant. Ceci permettra de limiter le nombre d’expériences à réaliser sur les ovocytes de Xénope. Les études in silico ne prennent néanmoins pas en compte la complexité du milieu biologique. En particulier, elles prennent mal en compte la complexité de la membrane cellulaire dans laquelle les récepteurs sont intégrés, et qui joue un rôle fondamental dans le fonctionnement des récepteurs du cerveau. Il est donc indispensable de réaliser des études sur des cellules vivantes pour pouvoir étudier les récepteurs dans un environnement proche de leur environnement natif. Lorsque cela est possible, nous réaliserons aussi des expériences sur lignées de cellules in vitro. Cependant, nous avons constaté au laboratoire que nos récepteurs d’intérêt étaient beaucoup moins toxiques pour les ovocytes de xénopes que pour les lignées cellulaires. Le système ovocyte de Xénope permet donc d’obtenir dans notre cas une meilleure robustesse statistique et une meilleure reproductibilité des résultats scientifiques. En outre, du fait que chaque animal possède un grand nombre d’ovocytes, le modèle xénope implique l’utilisation d’un faible nombre d’animaux pour obtenir la quantité d’ovocytes nécessaires aux expériences.

Réduction

Les sacs ovariens récupérés lors des laparotomies seront divisés en plusieurs lots, conservés à 4 degrés et traités en fonction des besoins pour augmenter la durée de vie des ovocytes. A l’issue du traitement des sacs ovariens, plusieurs centaines d’ovocytes sont récupérés et mutualisés pour les différents projets scientifiques de l’équipe. Ces procédures permettent de limiter la fréquence des interventions. Nous estimons avoir besoin de faire 52 laparotomies par an (1 par semaine), soit 260 laparotomies sur toute la durée du projet. Cette fréquence des laparotomies a été établie sur la base de notre utilisation d’ovocytes au cours des dernières années : nous utilisons les ovocytes de xénopes en continu toute l’année et la durée de survie des ovocytes extraits est d’environ 7 jours. En considérant 56 animaux en utilisation continue depuis un projet précédent ayant subi 1 ou 2 laparotomies et un pourcentage d’animaux dont la procédure s’arrête avant le nombre maximal de laparotomies, nous estimons que le nombre d’animaux utilisés pour ce projet est de 80: 22 animaux resteront en utilisation continue pour un futur projet avec le même projet scientifique et impliquant la même procédure.

Raffinement

Hébergement : Les xénopes sont maintenus en groupes d’individus dans une pièce dont la luminosité et la température sont contrôlées. Les animaux sont hébergés dans un système de recirculation d’eau dont les paramètres de l’eau sont constamment surveillés et ajustés si nécessaire. L’état des animaux (appétit, mobilité, aspect général, état de la peau) est surveillé quotidiennement. Des tubes en plastique servant de cachettes sont mis dans les bacs comme enrichissement de leur milieu de vie. Les animaux sont nourris 3x par semaine avec des granulés pour truite et amphibiens et du cœur de bœuf. Tout animal présentant une altération de son état général est hébergé individuellement dans un bac d’eau saline, hors du système de recirculation pour éviter toute contamination aux autres animaux. Il est traité le cas échéant selon les recommandations du vétérinaire référent, et remis avec ses congénères lorsque son état s’est amélioré. Durant cette période l’état général des animaux hébergés dans le même bac que l’animal malade est surveillé étroitement. Procédure : L’anesthésique utilisé a un effet analgésique, permettant son utilisation unique durant la procédure de chirurgie. D’après nos observations, les xénopes présentent une mobilité normale dès leur réveil sans perte d’appétit ni altération de leur état général dans les jours qui suivent la chirurgie, suggérant une douleur post-opératoire limitée. Un analgésique sera néanmoins appliqué en cas de signes de douleurs post-opératoires. Des mesures non médicamenteuses seront utilisées pour limiter une éventuelle douleur post-opératoire : (i) récupération à l’anesthésie dans un bac avec une faible profondeur d’eau (ne couvrant pas les narines) pour éviter à l’animal de se lever pour respirer; (ii) récupération à l’anesthésie dans une eau saline de concentration proche du milieu interne du xénope, lui permettant de récupérer plus facilement. L’état général du xénope est régulièrement surveillé durant cette période et évalué selon une grille de cotation. Des points limites ont été établis. La taille du groupe de xénopes disponibles dans notre animalerie permet de limiter la fréquence des laparotomies pour chaque animal à une fois par an en moyenne (et maximum 1 fois tous les 6 mois), limitant ainsi les nuisances induites à chaque animal.

Choix des espèces

Le système d’expression en ovocytes de xénopes est très largement utilisé en laboratoire du fait de la grande taille et robustesse des ovocytes facilitant ainsi leur manipulation, et permettant la production de quantité importante de protéines. Le grand nombre d’ovocytes produit par chaque femelle et la robustesse des résultats expérimentaux issus de ce système permettent en outre une grande reproductibilité des expériences tout en utilisant un faible nombre d'animaux. Nous utiliserons des xénopes femelles adultes. Il est nécessaire d’utiliser de tels animaux pour prélever les ovocytes au bon stade de maturation.

Pour étudier comment le cerveau perçoit le temps, 512 souris sont entraînées une à trois semaines dans des enceintes expérimentales, motivées par des récompenses alimentaires obtenues au prix d'une réduction contrôlée de leur ration. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Jusqu'à deux chirurgies de deux heures sous anesthésie générale servent à implanter le système d'imagerie que les animaux portent ensuite pendant les tests, encombrement dont le porteur reconnaît l'inconfort. Les souris qui ne peuvent pas être incluses dans les tests comportementaux seront, écrit le porteur, "valorisées" dans une expérience de mise au point d'outils d'analyse.

Objectifs

Dans notre vie quotidienne, nous évaluons constamment le temps : combien de temps avant que le feu passe au vert ? Quand avons-nous voyagé la dernière fois ? Ces processus sont fondamentaux pour notre mémoire, nos prises de décision et nos capacités d’adaptation. En effet, la perception du temps est une fonction cognitive essentielle permettant aux organismes d’interagir efficacement avec leur environnement. Que ce soit pour anticiper un événement imminent ou pour structurer des actions ou des expériences vécues sur des périodes étendues, la capacité à percevoir et encoder le temps joue un rôle clé dans la survie et l’adaptation. Des perturbations de ces processus peuvent altérer les capacités d’adaptation face au stress et contribuer à des troubles psychiatriques tels que la dépression, les troubles anxieux et de stress post-traumatique. La manière dont le cerveau représente et stocke les informations temporelles reste encore mal comprise. La perception et l’encodage du temps reposeraient sur des réseaux cérébraux complexes impliquant des régions comme l’hippocampe et le striatum. Cependant, ces régions n’encodent pas le temps comme un simple chronomètre : leur activité fluctue, se transforme au fil du temps et s’adapte en fonction de l’expérience, de l’apprentissage et de l’âge. Il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes associés, ceux permettant notamment d’estimer la durée de stimuli ou l’horodatage et les caractéristiques temporelles des expériences vécues. Ainsi, ce projet a pour objectif d’étudier les mécanismes cérébraux impliqués dans la perception du temps, à des échelles courtes (dizaines de secondes) et longues (heures à semaines), à travers l’étude du comportement des animaux dans différentes situations expérimentales . En outre, nous testerons dans une dernière expérience, les effets d’un mélange gazeux d'oxygène et de protoxyde d'azote, utilisé pour ses effets analgésiants, qui est actuellement développé comme alternative thérapeutique à action rapide dans certaines pathologies psychiatriques comme la dépression. Il est établi que le mélange gazeux affecte les états de conscience mais ses effets immédiats et différés sur la perception et l’encodage du temps ne sont pas connus alors qu’ils pourraient avoir un rôle important à jouer dans ses effets bénéfiques comportementaux et thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le premier objectif de ce projet est d’apporter des connaissances essentielles sur les mécanismes cérébraux sous-tendant l’encodage du temps à court-terme et dans la mémoire à long terme. Une meilleure compréhension de ces processus fondamentaux est cruciale pour comprendre les bases neuronales de la mémoire et les capacités d’adaptation cognitive. L’approche par imagerie calcique offre une précision inatteignable pour observer en temps réel le fonctionnement des populations neuronales du cerveau lors de la réalisation de tâches liées à la perception du temps et à la mémoire, permettant d’analyser des mécanismes auparavant inaccessibles. Ces découvertes seront d’autant plus précieuses que les zones du cerveau impliquées jouent un rôle central dans de nombreuses autres fonctions cognitives et sont affectés dans troubles comme la dépression, l’anxiété et les troubles de stress post-traumatiques. En outre, ce projet implique également l’évaluation des effets d’un mélange gazeux d’oxygène et protoxyde d’azote actuellement utilisé pour ces propriétés analgésiantes mais en cours de développement et d’évaluation comme alternatives thérapeutiques à action rapide dans la dépression.

Procédures

Les animaux seront soumis à des phases d’entrainement et de tests comportementaux sur des périodes allant de 1 à 3 semaines, selon l’expérience concernée. Ces phases correspondent à des explorations libres ou dirigées quotidiennes, dans différentes enceintes expérimentales (avec des récompenses alimentaires), d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes par session et qui pourront être répétées selon l’expérience. Afin de maintenir la motivation pour la récompense alimentaire, certaines phases expérimentales incluront un contrôle alimentaire léger, consistant en une réduction contrôlée de l’apport alimentaire avant la session expérimentale sur une période de 1 à 3 semaine. La distribution est quotidienne et ajustée individuellement. Dans certaines expériences, les souris seront également soumises au maximum à 2 interventions chirurgicales, chacune d’une durée approximative de deux heures, réalisées sous anesthésie générale. Les animaux pourront être hébergés en cage individuelle de manière ponctuelle, notamment après les interventions chirurgicales (pendant 24 à 72 heures) et lors des périodes nécessitant un contrôle alimentaire individualisé (1 à 3 semaines)

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations/contentions ainsi que l’hébergement isolé en cage, l’isolement lors des tests de comportement et la restriction alimentaire peuvent engendrer du stress pour l’animal. L’intervention chirurgicale peuvent induire des douleurs post-opératoires légères avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal. Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les souris seront encombrées d’un système d’imagerie lors des tests, ce qui peut engendrer de l’inconfort.

Devenir

La totalité des animaux de l’étude seront mis à mort. Pour les besoins de l’étude, nous devons prélever le cerveau pour vérification histologique et investigation de l’expression de protéines d’intérêt.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée : l’étude des bases comportementales et neurales de la perception et l’encodage du temps et de leur mémoire à différentes échelles d’analyse. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale de fonction cognitive complexe comme dans notre étude repose sur l’observation directe du comportement de l’animal et de ses performances mnésiques tout en effectuant l’enregistrement de l’activité neuronale lors de la réalisation de ces tâches comportementales et de mémoires.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques.

Raffinement

Les chirurgies sont réalisées par du personnel formé et expérimenté, sous anesthésie générale afin de garantir l’absence d’inconfort pendant les gestes réalisés. Des constantes physiologiques sont suivies pendant l’intervention et des précautions sont prises pour maintenir l’animal dans les meilleures conditions. Des mesures sont mises en place avant et après les interventions afin d’assurer un confort et une récupération rapide des animaux. Les animaux font l’objet d’une surveillance régulière pendant plusieurs jours afin de vérifier leur bon état général et leur reprise d’activité normale Les expériences comportementales incluent une phase d’habituation progressive à l’expérimentateur, aux dispositifs et conditions de test afin de réduire le stress. Les manipulations ne nécessitent pas de contentions. Lorsqu’un hébergement individuel est requis, il est limité dans le temps. Des enrichissements supplémentaires sont apportés (matériel de nidification, abris, des tubes et objets à mordiller). Les animaux sont regroupés dès que les conditions le permettent. Les animaux ne pouvant pas être inclus dans les expériences comportementales seront valorisés, en intégrant une expérience permettant la création de nouveaux outils d’analyses sans recourir à des animaux supplémentaires.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des études des bases neurobiologiques de la mémoire, de la formation des souvenirs et de dysfonctions de la mémoire. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes normaux sous-tendant l’association temporelle de souvenirs et sa mise en mémoire dans des conditions normales. Il n’est pas nécessaire d’utiliser des stades plus spécifiques du développement par rapport à l'objectif scientifique de l'étude.

Exposés à de la lumière bleue la nuit dès le sevrage, à trois semaines, 558 rongeurs diurnes reçoivent des injections dans l'œil, subissent des électrorétinographies d'une heure et des chirurgies cérébrales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun vit seul en cage à partir de vingt jours et jusqu'à la fin des procédures. Le porteur range cet isolement parmi les nuisances attendues, puis parmi ses mesures de raffinement, en précisant que les animaux se voient et s'entendent d'une cage à l'autre. Six tests comportementaux qu'il dit validés sont annoncés sans être nommés, et l'espèce n'est jamais précisée, désignée seulement comme un rongeur diurne de laboratoire, avant que tous soient tués pour prélever la rétine et le cerveau.

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 heures de l’environnement synchronise l’horloge biologique du cerveau. La lumière exerce à la fois des effets positifs et négatifs en fonction de ses caractéristiques (moment d’exposition, durée, intensité spectre, etc…). La littérature montre qu’une exposition aberrante à la lumière, c’est-à-dire une exposition la nuit notamment dans la région bleue du spectre, altère les rythmes de l’organisme et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'humain. Un candidat clé pour la médiation des effets de la lumière sont les cellules à mélanopsine localisées dans la rétine. En effet, la lumière pénètre dans l’organisme à travers la rétine et est captée par un type de cellules particulier : les cellules photoréceptrices à mélanopsine. Ces cellules permettent la conversion du signal lumineux en un signal biochimique, transmissible alors à d’autres cellules. Ici, le signal sera transmis jusqu’aux structures du cerveau qui régulent les rythmes biologiques et l’humeur. Les adolescents présentent un risque particulier à l’exposition nocturne à la lumière bleue car l'apparition de la plupart des maladies mentales survient avant l'âge de 25 ans et ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue la nuit de manière chronique, et ce dès l’adolescence, va contribuer au développement de troubles affectifs et visuels sur le long terme. Afin de vérifier cette hypothèse, notre étude sera réalisée sur un modèle de rongeur diurne la rendant plus pertinente que celles menées habituellement sur les modèles de rongeurs nocturnes utilisés en laboratoire tels que les rats ou les souris. Les objectifs sont de déterminer : 1) Impact de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur l'humeur à l'aide de différents tests comportementaux validés. 2) Conséquences de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur la rétine, son fonctionnement et ses projections vers le cerveau. 3) Caractérisations des effets de la lumière bleue dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine, régulant l'humeur. Cette analyse multidimensionnelle, allant de la cellule au comportement de l’animal, aura des résultats déterminants aux niveaux fondamental et clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition aberrante à la lumière bleue de manière chronique et sur le long terme, sur le développement direct de troubles affectifs et visuels chez un rongeur diurne. En effet, les études actuelles se concentrent davantage sur l’étude de la lumière bleue en se basant sur des modèles de rongeur type souris ou rat, en débit de leur physiologie nocturne et donc, éloignée de celle de l’humain. Les données obtenues sur le modèle diurne pourront donc permettre une réflexion translationnelle plus pertinente.

Procédures

Afin de définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte différents types d'interventions. Dans un cas, les animaux seront soumis à 6 tests comportementaux validés permettant d'étudier l'effet de la lumière sur leur humeur. La durée d'un test est variable, mais dure environ 10 minutes pour un animal. Afin d'étudier les effets de l’exposition lumineuse sur les cellules à mélanopsine de la rétine, les animaux seront soumis à des injections oculaires, qui se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’exploration de la fonction visuelle se fera par électrorétinographie (ERG), sous anesthésie. Les ERG durent environ 1h et auront lieu à 3 reprises : avant l’exposition, et à 2 âges post-nataux pertinents pour les cinétiques des autres expériences : P50 et P80. Enfin, afin de vérifier l'implication d'une structure cible du cerveau impliquée dans la régulation de l'humeur, nous allons réaliser une chirurgie sur animaux anesthésiés, La totalité de la procédure dure environ 1h. Une chirurgie terminale sera réalisée sous anesthésie générale afin de prélever les tissus d'intérêts.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances listées ci-dessous : 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien et de l’humeur (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs, hébergés habituellement en groupes. 3) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 4) Les animaux seront soumis à des anesthésies, des injections dans l'oeil, ainsi qu'à des chirurgies cérébrales susceptibles d’induire une douleur modérée, un risque infectieux et/ou inflammatoire, une perte de poids, etc. Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…)

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière à partir de l’adolescence et sur le long terme chez l’adulte, sur l’humeur et la vision. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base de notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L’effet sur la vision sera évalué par une approche longitudinale à différents stades de l’exposition à la lumière. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification, tunnel et bâton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement, état des yeux) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur un modèle de rongeur diurne de laboratoire. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères à long terme d'une exposition aberrante à la lumière bleue commençant dès l’adolescence, afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'humain. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (dès le sevrage, c'est à dire à 3 semaines) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur l’humeur et la fonction visuelle.