Troubles nerveux
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- Diagnostic des maladies
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- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Étude du rôle du système lymphatique dans la régulation du sommeil chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six heures de chirurgie crânienne pour implanter le matériel d'enregistrement, après une première opération d'une heure et demie trois semaines plus tôt: 24 souris subissent ces deux interventions, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées ensuite pour prélever leurs tissus. À partir de la seconde opération, chacune vit seule pendant dix-sept jours au plus, isolement dont le porteur reconnaît qu'il génère du stress chez un animal social. La question posée est de savoir si les vaisseaux lymphatiques des méninges interviennent dans la structure du sommeil, et le RNT présente l'ensemble comme des données préliminaires à un projet ultérieur plus ambitieux. La souris est retenue parce que les techniques chirurgicales y sont maîtrisées et que la croissance de la boîte crânienne est achevée à six semaines, ce qui facilite la pose des implants.
Objectifs
Des vaisseaux lymphatiques ont récemment été identifiés dans la dure-mère, l’enveloppe la plus externe du cerveau. Ils contribuent au drainage du liquide céphalorachidien (LCR), un liquide clair qui entoure le cerveau et la moelle épinière, transporte les nutriments et aide à éliminer certains déchets produits par les cellules cérébrales. Ce processus de circulation du LCR, appelé système glymphatique, est particulièrement actif pendant le sommeil, lorsque le cerveau échange davantage de substances entre le LCR et les tissus cérébraux. En revanche, le rôle exact du drainage lymphatique de la dure-mère dans certaines phases du sommeil et dans la circulation et l’élimination des déchets cérébraux reste mal compris. L’objectif de ce projet est d’étudier l’implication des vaisseaux lymphatiques méningés dans la structure du sommeil. Pour cela, une approche expérimentale sera mise en œuvre chez la souris : – une modulation de l’activité des vaisseaux lymphatiques sera réalisée par injection de substances dans le LCR qui soit amplifieront soit feront disparaitre les vaisseaux lymphatiques. – la structure du sommeil et l’activité cérébrale et vasculaire seront ensuite évaluées par enregistrements via des ultrasons captant le flux sanguin et des électrodes captant l’activité électrique des neurones. Les données obtenues permettront de mieux caractériser comment les vaisseaux lymphatiques sont impliqués dans les fonctions réparatrices du sommeil et la circulation du LCR dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des liens entre sommeil, circulation du liquide cérébral (lymphatique et glymphatique) et élimination des déchets du cerveau. Plusieurs maladies neurodégénératives montrent des troubles précoces du sommeil ainsi que des dysfonctionnements des systèmes lymphatique et glymphatique comme la maladie de Parkinson ou d’Alzheimer représentant plus de 60 millions de personnes dans le monde. En modulant l’activité des vaisseaux lymphatiques et en étudiant leurs effets sur le sommeil et l’activité cérébrale, ce projet pourrait permettre d’identifier des mécanismes clés de ces interactions. Les résultats fourniront des données préliminaires pour un futur projet plus ambitieux, visant à approfondir ces mécanismes et à étudier leur pertinence chez l’humain.
Procédures
Chaque souris subira deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale et analgésie adaptée : la première consistant en une injection dans le liquide entourant le cerveau (1,5h maximum), puis, 21 jours plus tard, la deuxième permettant l’implantation du matériel nécessaires aux enregistrements (6h maximum). Après la deuxième chirurgie, les animaux bénéficient de 7 jours de repos, 2 à 5 jours d’habituation au matériel, puis 3 heures continues d’enregistrements quotidiens sur 5 jours consécutifs. A partir de la deuxième chirurgie les animaux devront être hébergés seuls (17 jours maximum).
Impact sur les animaux
Certaines interventions chirurgicales prévues dans ce projet peuvent entraîner un inconfort ou des douleurs temporaires, surtout dans les deux jours suivant les opérations. Des signes comportementaux inhabituels, comme agitation, prostration ou mobilité réduite, peuvent également être observés. L’anesthésie générale nécessaire pour les chirurgies comporte des risques tels que baisse de la température corporelle, une sécheresse oculaire ou des difficultés cardio-respiratoires. Après la chirurgie de mise en place du matériel pour les enregistrements, les animaux sont hébergés seuls pour protéger les implants et les animaux de blessures potentielles, s’agissant d’animaux sociaux cela génèrera un stress. Le matériel implanté sera associé à un inconfort pour l’animal et un risque rare de fragilisation voire perte du matériel et un risque d’infection. Le matériel d’enregistrement peut entraîner une petite gêne temporaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus d’intérêt pour nos analyses pour répondre à notre objectif scientifique.
Remplacement
L’étude des mécanismes physiopathologiques, en particulier les interactions biologiques entre le système neurovasculaire, le drainage des fluides cérébraux, et le sommeil nécessite un modèle vivant pour reproduire de manière réaliste ces processus complexes. La circulation active des fluides cérébraux, ainsi que les dynamiques fonctionnelles du système neurovasculaire, sont des éléments essentiels qui ne peuvent être correctement modélisés par des organoïdes ou des systèmes in vitro. Les organoïdes, bien qu’utiles dans certains contextes, ne permettent ni la reproduction des mécanismes de régulation dynamique du flux veino-lymphatique, ni l’étude des réponses physiologiques du sommeil. Par conséquent, le recours à des modèles animaux est indispensable pour analyser les réactions physiologiques complexes, comprendre les mécanismes sous-jacents à l’atteinte de certaines fonctions, et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Il n'existe actuellement aucune méthode alternative aux modèles animaux permettant d'atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
L’étude nécessitera 24 souris, avec 6 animaux par groupe expérimental (3 groupes) et un risque de pertes évalué à 6 animaux (30 pourcent). Ce nombre a été déterminé par des calculs statistiques. Cette taille permettra d’assurer la puissance statistique nécessaire pour l’analyse des données obtenues.
Raffinement
Les procédures mises en œuvre dans ce projet sont conçues pour réduire au maximum le stress, la douleur et l’inconfort des animaux. À leur arrivée, les souris bénéficient d’une période d’acclimatation d’une semaine dans une animalerie agréée, avec un hébergement en groupe, un environnement enrichi (nids, objets à ronger) et un accès libre à l’eau et à la nourriture. Tous les animaux sont observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci est transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe afin d’assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, avec l’administration systématique d’antalgiques avant et après l’opération. Pendant la chirurgie, la température corporelle est maintenue, les yeux sont protégés et l’hydratation assurée. Après chaque intervention, les animaux font l’objet d’une surveillance rapprochée, permettant d’adapter les soins si nécessaire. Après la chirurgie d’implantation destinée aux enregistrements du sommeil, les animaux sont hébergés individuellement afin de protéger à la fois l’implant et la souris, en évitant toute blessure liée aux interactions avec les congénères. Une période de récupération d’une semaine est respectée, suivie d’une phase d’habituation de 2 à 5 jours, durant laquelle les animaux s’adaptent progressivement au port de l’implant et aux conditions d’enregistrement. Tout au long de cette période, un enrichissement adapté est maintenu afin de préserver le bien-être des animaux.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les systèmes veineux et lymphatiques participent à l’élimination naturelle de certains composés du cerveau. Ces mécanismes reposent sur des interactions complexes entre la circulation des fluides cérébraux, l’activité neuronale et le sommeil, qui ne peuvent pas être étudiées de manière intégrée chez l’être humain ni à l’aide de modèles in vitro, tels que les organoïdes cérébraux, qui ne reproduisent ni la vascularisation ni la circulation des fluides du cerveau intact.La souris a été choisie comme modèle expérimental car elle est particulièrement adaptée à ce type de recherche : les techniques chirurgicales permettant de manipuler le système vasculaire cérébral sont maîtrisées chez cette espèce, tout comme les implantations chirurgicales permettant des enregistrements de l’activité électrophysiologique. L’utilisation combinée de modèles chirurgicaux permettra d’analyser de manière complémentaire le rôle de ces systèmes dans le fonctionnement cérébral. Les procédures seront réalisées chez des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. À cet âge, la croissance de la boîte crânienne est achevée, ce qui permet une meilleure précision chirurgicale et réduit les risques liés aux implants. Cette tranche d’âge correspond également à une période où les systèmes impliqués dans la circulation des fluides cérébraux sont pleinement fonctionnels.
Evaluation de l’efficacité de composés antiépileptiques sur un modèle rongeur d’épilepsie EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pesées tous les jours pendant dix semaines, injectées environ dix-huit fois, opérées une première fois pour déclencher un état de mal épileptique puis une seconde pendant deux heures pour implanter des électrodes crâniennes, 165 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur activité cérébrale est enregistrée en continu, jour et nuit, pendant qu'elles font trois à quatre crises par jour et vivent seules en cage. Vient ensuite un transport de huit heures en camion entre les deux établissements, puis une anesthésie gazeuse de cinq minutes. Toutes sont tuées pour découper leur cerveau en tranches et y mesurer l'effet de molécules antiépileptiques.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mesurer l’efficacité de molécules antiépileptiques dans un modèle d’épilepsie chez la souris. Ce projet sera réalisé dans deux établissement utilisateurs différents pour la création du modèle (EU1/2) et la collection de datas (EU1/2) et (EU2/2). Des données récentes de la littérature scientifique indiquent que certains récepteurs neuronaux de l’hippocampe sont impliqués dans les mécanismes d’épilepsie temporale. L’hypothèse est que ces molécules anti-épileptiques que nous testerons vont alors cibler ces récepteurs afin de diminuer la fréquence et la sévérité des crises.
Bénéfices attendus
Notre projet permet de caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments antiépileptiques dans ce modèle. Nos techniques mise en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation des effets pharmacologiques sur le système nerveux central et sur ces explants de tissus vivants constitue une bonne approche car elle permet : - Dans un modèle de la pathologie une analyse des crises focales partielles ; - D’obtenir des enregistrements sur animal vigile lors des crises et du repos, des crises épileptiques ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons); Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement des composés testés avant de lancer les premières étapes précliniques.
Procédures
Les animaux sont manipulés tous les jours pendant 10 semaines pour les pesées. (EU1/2) Ils sont injectés tous les quatre jours en SC soit environs 18 injections sur 10 semaines (EU1/2) et (EU2/2) Ils subissent deux chirurgies : *Induction d’épilepsies de 15 à 20 min et une heure post opératoire (EU1/2) *Implantation des électrodes d’enregistrement environ deux heures (EU1/2) Une période d’enregistrement de l’activité électrique cérébrale (sans fil) synchronisée à un enregistrement vidéo 24h/24, 7j/7. (EU1/2) Un transport entre les deux sites (camion spécialisé, 8h de trajet en une seule journée) Et enfin une anesthésie gazeuse durant 5 min maximum. (EU2/2)
Impact sur les animaux
Nous avons des procédures qui peuvent amener à des effets indésirables : La procédure peut par : *-l’hébergement individuel des animaux génère du stress ; *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress ; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables de types inflammation induration au site d’injection, *- des conséquences des chirurgies avec des déshydrations, des infections possibles ; *- L’implantation des électrodes peut provoquer de l’inconfort*- l’état épileptique provoques des crises épileptiques à une fréquence de 3 à 4 par jour, de courte durée inférieure à 2 minutes en temps cumulé et par jour.
Devenir
Ce projet nécessitant une analyse fine de l'efficacité des antiépileptiques sur tranche de cerveau, nous devons mettre à mort tous les animaux de ce modèle..
Remplacement
Nos évaluations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons donc utiliser des animaux vivants pour cela. En effet, nos tests, permettent d’évaluer des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car les modèles informatiques actuels ne nous permettent pas d’appréhender la complexité de ces connexions anormales observées lors des crises épileptiques.
Réduction
Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 165 animaux pour la réalisation de ce protocole. Pour la partie ex vivo, nous réalisons des enregistrements multiples sur tranches de cerveau après mise à mort des animaux. Le même tissu étant utilisé pour plusieurs expériences d'électrophysiologie sur tranche, cela réduit le nombre d'animaux total nécessaire.
Raffinement
Les animaux utilisés au cours de la Procédure seront habitués, dès le départ aux contentions à réaliser pour limiter le plus possible les stress futurs liés à ces gestes techniques. Les sites d’injection seront légèrement modifiés pour éviter tout problème d’inflammation lors des traitements répétés. Les points limites sont aussi adaptés aux effets possibles dus à ces doubles chirurgies. Des traitements analgésiques permettant une gestion de la douleur post-opératoire seront appliqués. Le système d’enregistrement de l’activité cérébrale utilise un dispositif sans fil permettant à l’animal de se déplacer librement.
Choix des espèces
Le développement de ce modèle inductible d’épilepsie et la grande quantité d’informations scientifiques disponibles sur le fonctionnement du cerveau des souris, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de techniques d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour la préparation de tissu nerveux et l’évaluation pharmacologique de molécules. Pour ces raisons, nous n’utilisons que ces rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés de notre partenaire.
ROLE DU MICROBIOTE INTESTINAL SUR LA SENSIBILISATION CENTRALE A LA DOULEUR DANS LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Aucun antalgique ni analgésique systématique n'est administré, parce qu'il fausserait la mesure de la douleur étudiée. 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, par groupes de vingt. Elles reçoivent le microbiote intestinal de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, subissent une arthrite induite avec gonflements et rougeurs des pattes, puis des tests de sensibilité au toucher et au froid et des tests d'anxiété et de dépression, avant que leur cerveau et leur intestin soient prélevés. Le porteur écrit vouloir "éviter toute douleur inutile" et annonce qu'il n'interviendra pas tant que les niveaux de douleur observés resteront dans les seuils attendus.
Objectifs
Chez les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde, 20 à 30 % continuent d’avoir des douleurs même si leur maladie est bien traitée. Leur corps réagit plus facilement à la douleur que celui de personnes non malades, et elles ont aussi souvent plus d’anxiété et de dépression. La flore intestinale, c'est-à-dire les bactéries présentes dans nos intestins, joue un rôle dans la maladie, et on sait qu'un lien important existe entre l’intestin et le cerveau. Nous pensons donc que les modifications de la flore intestinale des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde favorisent la douleur chronique et la dépression, notamment chez les patients qui ont des symptômes qui persistent après traitement. Pour mieux comprendre comment tout cela fonctionne, nous allons étudier l’impact de leur flore intestinale en la transférant à des souris. Ensuite, nous observerons ces souris avec différents tests permettant d’évaluer leur sensibilité au toucher ou au froid, mais aussi des tests qui permettent d’évaluer l’anxiété ou la dépression. Nous testerons l’effet des microbiotes dans deux situations : chez des souris saines pour évaluer les effets déclencheurs des microbiotes, et en conditions pathologiques, c’est à dire chez des souris avec de l’arthrite pour évaluer cette fois les effets aggravateurs des microbiotes. Une fois prouvé le rôle du microbiote, nous identifierons quels éléments issus du microbiote intestinal sont responsables pour pouvoir les cibler et tenter de bloquer les mécanismes qui déclenchent ou aggravent la maladie. L’objectif final est d’identifier des composés du microbiote pouvant réduire la douleur ou les troubles anxio dépressifs, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.
Bénéfices attendus
La douleur chronique et de la dépression restent difficiles à traiter chez certains patients, ce qui impacte fortement leur qualité de vie. Il est donc essentiel de comprendre l'origine de l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression pour permettre le mieux les soigner. Une fois prouvé rôle de la flore intestinale, nous analyserons et comparerons les différents microbiotes pour identifier quelles sont les bactéries ou quelles sont les molécules produites pourraient expliquer l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression. Ceci nous permettra ainsi de tester leur rôle protecteur chez les souris avant de les tester en clinique chez les patients. Ce projet permettra donc une véritable recherche translationnelle, du laboratoire au patient, avec pour objectif d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de douleurs chroniques ou de dépression.
Procédures
Nous réalisons des greffes de microbiote intestinal en donnant aux souris par voie orale des préparations de microbiote de patients une fois par semaine pendant 4 semaines. Suite à la greffe de microbiote, les souris seront suivies chaque semaine grâce à des tests comportementaux pour mesurer les seuils de sensibilité (réaction au toucher par filaments de Nylon ou réaction à la température) et caractériser les comportements anxieux ou dépressifs. Chaque test dure entre 5 et 20 min. Dans certains cas, nous examinons aussi si le microbiote modifie la perméabilité de l’intestin ou le passage de substances vers le cerveau, en administrant des traceurs fluorescents par voie orale ou par injection. Ces expériences sont menées chez des souris saines mais aussi dans différents modèles d’inflammation (polyarthrite aiguë ou chronique, inflammation locale de la patte). Les inflammations sont induites par l’injection de molécules inflammatoires, toujours sous anesthésie légère par inhalation. Enfin, lorsque des molécules produites par le microbiote auront été identifiées (comme des dérivés du tryptophane, de la sérotonine, des métabolites de fibres ou des acides biliaires), nous les ajouterons dans l’eau de boisson des souris pour tester leur effet bénéfique dans les modèles les plus pertinents.
Impact sur les animaux
La sensibilité tactile et thermale et les comportements anxio-dépressifs étant les paramètres étudiés dans nos procédures, aucune médication antalgique ou analgésique systématique ne peuvent être appliquées car ils fausseraient nos résultats. Les principaux désagréments pour les animaux seront liés aux modèles inflammatoires utilisés pour induire l’arthrite ou l’inflammation locale. Ces inflammations provoqueront des douleurs articulaires, des gonflements et des rougeurs au niveau des pattes. L’arthrite aiguë sera de courte durée (maximum 2 semaines), avec retour à un état normal. L’arthrite chronique durera plus longtemps, mais la durée de suivi sera limitée à 5 semaines après l’apparition des premiers symptômes d’arthrite pour éviter des souffrances prolongées. Les animaux subiront également des piqures d’aiguilles, un stress léger passager lié aux manipulations. Toutes les injections seront pratiquées sous anesthésie légère par inhalation, d’une durée d’environ 5 minutes, afin de réduire au maximum la douleur et l’inconfort.
Devenir
La douleur étant étudiée, et donc induite, chez certains animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement l’euthanasie afin de ne pas générer de douleur inutile. De plus, L’euthanasie permet également de réaliser les analyses post mortem nécessaires, notamment sur le cerveau et l’intestin, afin de compléter les données comportementales et d’approfondir la compréhension des mécanismes reliant microbiote, douleur et comportements anxio dépressifs.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre comment le microbiote intestinal influence la douleur et les comportements associés dans la polyarthrite rhumatoïde. A ce jour, il n'existe pas de modèle de substitution permettant d'étudier les interactions complexes entre microbiote, système immunitaire, système nerveux et comportement. Par ailleurs, la perception de douleur, ainsi que les réponses anxieuses ou dépressives, sont des phénomènes appréhendés par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Tout sera mis en œuvre pour réduire la variabilité interindividuelle dans nos groupes et assurer qu’un nombre minimal de souris sera utilisé pour démontrer un effet (animaux du même âge, mâles et femelles, période d’habituation à l’environnement et à l’expérimentateur). Un grand soin est apporté aux animaux afin de limiter au maximum le stress qui pourrait entraîner des biais importants dans la détermination du seuil de sensibilité tactile. Le nombre de de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations précédentes réalisées, ce qui nous a permis de déterminer qu’un nombre de 20 souris par groupe (10 males et 10 femelles) est nécéssaire pour observer une différence statistique et biologique. Ainsi nous utiliserons le minimum d’animaux requis pour observer des différences statistiques entre les groupes, afin que les tests effectués soient pertinents mais sans sur-utilisation d’animaux.
Raffinement
Notre objectif étant d’étudier l’hypersensibilité à la douleur, nous n’interviendrons pas tant que les niveaux de douleur observés restent dans les seuils attendus pour les modèles utilisés. En revanche, toutes les procédures sont conçues dans le respect de l’animal et avec pour objectif constant de réduire au maximum le stress et l’anxiété, afin de limiter l’inconfort à ce qui est strictement nécessaire au protocole et d’assurer le bien être des animaux. Cela passe par une étape d’habitation progressives des animaux (1 semaine à l’arrivée pour les locaux, puis 1 semaine pour les pièces d’expérimentation) et une manipulation douce par du personnel formé, avec là aussi une période d’habituation quotidienne des animaux aux expérimentateurs. L’enrichissement fourni comprend les matériaux réglementaires de nidification, auxquels est ajouté un igloo rouge, contribuant à améliorer leur confort et leur sentiment de sécurité. Tout au long du projet, l’objectif reste de limiter l’angoisse et la souffrance. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi clinique régulier, plusieurs fois par semaine (et chaque jour en période inflammatoire), pour identifier rapidement toute douleur excessive, perte de poids, difficulté locomotrice ou comportement anormal. Une grille d’évaluation clinique, accompagnée des actions à mettre en œuvre, permettra une prise en charge immédiate et adaptée, afin d’éviter toute douleur inutile. De plus, la durée des expériences est volontairement limitée pour réduire l’exposition aux modèles inflammatoires et minimiser la souffrance.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de greffe de microbiote chez l’animal. Elle permet d’évaluer les effets d’un microbiote donné sur le comportement, la douleur, l’inflammation et les interactions neuro immunes de manière intégrée, ce qui n’est pas possible chez des espèces plus simples. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 8 et 21 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement.
PROTOCOLE D’IMMUNISATION CHEZ LA SOURIS AFIN DE GENERER DES ANTICORPS MONOCLONAUX THERAPEUTIQUES
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
Des injections répétées d'antigène associé à un adjuvant, suivies de prélèvements sanguins répétés, provoquent chez les souris des rougeurs et des irritations locales au point d'injection. 1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées pour que soient prélevés leurs organes du système immunitaire, dont 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce 150 études sur la durée du projet et des points limites "stricts et spécifiques" sans indiquer lesquels, ni combien d'animaux par étude. L'objet réel est de fournir à un laboratoire pharmaceutique dix à cinquante anticorps monoclonaux candidats, le porteur revendiquant par ailleurs une réduction de moitié du nombre d'animaux par rapport au projet précédent.
Objectifs
Au sein de notre département de recherche, l'utilisation des technologies de laboratoire sans animaux (plateformes in vitro) s'est largement développée ces dernières années, s'inscrivant dans une démarche de réduction de l'expérimentation animale. Le but de ce projet est de générer des anticorps monoclonaux chez la souris dirigée contre un antigène cible spécifique impliqué dans des maladies humaines. Ces anticorps, une fois produits, seront testés dans des modèles de laboratoire sans animaux pour valider leur potentiel thérapeutique. Les anticorps développés dans le cadre de ce projet sont destinés à des approches d'immunothérapie pour traiter des patients atteints de cancers (tumeurs solides et cancers du sang) et de maladies auto-immunes et inflammatoires (polyarthrite rhumatoïde, lupus, maladies inflammatoires de l'intestin) Ce projet vise à générer environ 10 à 50 anticorps monoclonaux candidats les plus prometteurs. Nous anticipons 150 études sur la durée totale du projet. Les anticorps générés constitueront des outils biologiques précieux pour mieux comprendre les mécanismes des maladies ciblées, développer de nouveaux traitements plus efficaces et mieux tolérés et offrir des alternatives thérapeutiques aux patients en échec avec les traitements actuels. Cette approche s'inscrit dans la mission de notre laboratoire : développer des médicaments innovants pour améliorer la vie des patients atteints de maladies graves pour lesquelles les options thérapeutiques restent limitées.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme (1-2 ans) Le bénéfice immédiat de ce projet est la découverte et la caractérisation d'anticorps monoclonaux hautement spécifiques dirigés contre un antigène d'intérêt thérapeutique. Ces anticorps constitueront des candidats médicaments prometteurs pour les phases de développement ultérieures. Bénéfices à long terme pour les patients (5-10 ans) À plus long terme, ce projet vise à mettre à disposition de nouveaux traitements thérapeutiques sous forme d'anticorps pour des patients souffrant de maladies graves. En oncologie, cancers du poumon résistants aux chimiothérapies conventionnelles, cancers du sein triple-négatifs, particulièrement agressifs… En maladies auto-immunes et inflammatoires, polyarthrite rhumatoïde résistante aux traitements de fond, lupus érythémateux systémique, maladie chronique aux options thérapeutiques limitées… En maladies du système nerveux central, maladie d'Alzheimer, sclérose en plaques progressive, maladie de Parkinson, maladies neuro-inflammatoires rares sans solution thérapeutique… Ces nouveaux anticorps thérapeutiques offriront aux patients de nouveaux espoirs de guérison pour des maladies actuellement incurables, des traitements mieux tolérés avec moins d'effets secondaires que les thérapies conventionnelles et une amélioration de la qualité de vie grâce à un contrôle plus efficace de leur maladie. Au-delà des bénéfices directs pour les patients, ce projet contribuera à l'avancement des connaissances sur les mécanismes des maladies ciblées, le développement de nouvelles approches thérapeutiques en immunothérapie et la validation de nouvelles cibles pour le développement de futurs médicaments.
Procédures
Les animaux reçoivent 3 à 6 injections d'une préparation contenant l'antigène et un adjuvant pour stimuler leur système immunitaire. Les injections sont espacées de 15 à 21 jours pour permettre au système immunitaire de répondre de manière optimale. Pour la plupart des injections, l’animal est vigile. Pour d’autres type d’injections plus rare, l’animal anesthésié pour réduire l'inconfort. La durée de l'intervention est de quelques secondes par injection. Un prélèvement sanguin intermédiaire, sur animal vigile et l’intervention dure moins d'une minute.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée des animaux pour les injections ainsi que pour le prélèvement sanguin entraîne un inconfort léger et de courte durée, comparable à celui ressenti lors d'une prise de sang chez l'homme. Les injections répétées de la préparation contenant l’antigène (la substance qui stimule la production d'anticorps) associée à l’adjuvant (produit qui renforce la réponse immunitaire) peuvent occasionnellement entraîner une légère rougeur au point d'injection et/ou une irritation locale temporaire. Ces effets demeurent rares et transitoires, se résorbant spontanément en quelques jours sans nécessiter de traitement particulier.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés pour récupérer les organes du système immunitaire car les cellules productrices d'anticorps se trouvent dans des organes internes qui ne peuvent être prélevés que post-mortem.
Remplacement
Notre laboratoire utilise une approche combinée associant technologies sans animaux (in vitro) où ces méthodes sont particulièrement efficaces pour développer des anticorps contre des cibles conservées (protéines très similaires entre l'homme et la souris) et expérimentation animale (in vivo) car cette approche reste indispensable pour obtenir des anticorps de haute affinité (anticorps qui se fixent très fortement à leur cible), caractéristique essentielle pour l'efficacité thérapeutique. Les nouvelles technologies de laboratoire (bibliothèques d'anticorps de nouvelle génération) sont en développement constant dans notre laboratoire. Ces innovations devraient progressivement permettre de remplacer l'utilisation de souris transgéniques une fois que les limitations techniques actuelles seront surmontées. L’objectif à terme est de réduire encore davantage le recours à l'expérimentation animale grâce aux progrès technologiques, tout en maintenant la qualité des anticorps produits pour les patients. Actuellement, l’animal reste nécessaire car seul le système immunitaire complet de l'animal peut générer des anticorps avec l'affinité très élevée requise pour les traitements, explorer toute la diversité des réponses immunitaires possibles et reproduire les processus naturels de maturation des anticorps.
Réduction
Grâce aux progrès technologiques et aux approches complémentaires développées ces dernières années, nous avons atteint une réduction de 50% du nombre d'animaux par rapport au projet précédent. Pour chaque programme thérapeutique, une sélection rigoureuse du nombre minimal d'animaux est réalisée afin de capturer la diversité des anticorps recherchés tout en limitant au maximum le nombre d'animaux utilisés. Cette réduction s'explique par l’amélioration des techniques (méthodes sont plus efficaces permettant d'obtenir de meilleurs résultats avec moins d'animaux), une meilleure récupération des cellules immunes et l’utilisation d’approche combinée en créant plusieurs types d'anticorps différents avec un seul animal au lieu d'avoir besoin d'un animal par type d'anticorps. Ces progrès techniques permettent de diviser par deux le nombre d'animaux nécessaires tout en obtenant les mêmes résultats scientifiques.
Raffinement
Nous avons mis en place plusieurs mesures pour améliorer le bien-être des animaux tout au long de l'étude : Qualité des produits administrés : Tous les antigènes administrés sont rigoureusement purifiés et contrôlés avant utilisation, garantissant l'absence de contaminants qui pourraient provoquer des réactions indésirables. Les adjuvants (substances qui renforcent la réponse immunitaire) sont sélectionnés pour leur excellente tolérance, limitant considérablement le risque de réaction au point d'injection. Choix des méthodes d'administration les moins invasives : Les voies d'administration sont choisies selon une stratégie visant à minimiser l'inconfort. La technique de manipulation en coupe (cupping) est utilisée pour la contention des animaux. Cette méthode, moins stressante que la contention par la queue, réduit l'anxiété des animaux et favorise leur habituation aux manipulations. Surveillance continue et environnement enrichi : Les animaux peuvent être hébergés dans des cages spéciales équipées de capteurs qui permettent de surveiller leur activité 24h/24. Cette surveillance continue permet une intervention rapide en cas de problème. En cas de comportements agressifs entre animaux, un enrichissement supplémentaire du milieu est ajouté (matériaux de nidification, objets à ronger, tunnels) afin d'améliorer leur bien-être. Des points limites stricts et spécifiques à ce projet ont été définis et sont appliqués tout au long de la procédure. Ces critères permettent une intervention anticipée dès l'apparition des premiers signes de mal-être.
Choix des espèces
L'animal utilisé dans ce projet est la souris adulte avec un système immunitaire mature (âgée de 6 à 12 semaines). Ce choix repose sur plusieurs raisons scientifiques importantes : Similitude avec le système immunitaire humain: Le système immunitaire de la souris présente une organisation et des mécanismes très similaires au système immunitaire humain. Cette similitude permet de reproduire fidèlement les étapes naturelles de production des anticorps dans l'organisme. Utilisation de souris transgéniques humanisées: Pour ce projet, nous utilisons principalement des souris transgéniques humanisées. Ces souris spéciales ont été génétiquement modifiées pour produire des anticorps possédant des caractéristiques humaines. Cet avantage majeur permet une transposition directe à l'homme des anticorps découverts, facilitant leur développement comme futurs médicaments et réduit considérablement le risque de rejet lorsqu'ils seront administrés aux patients.
Etude de la biodistribution et de la cinétique d’un vecteur AAV chez des souris saines
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Une injection unique de vecteur AAV ou de sérum physiologique, un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis pour une partie d'entre elles un analgésique, un anesthésique profond et une perfusion intracardiaque qui les tue : 168 souris saines suivent ce parcours. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur ramène l'ensemble des nuisances attendues à une douleur légère liée à la piqûre. Toutes sont tuées pour prélever les tissus qui permettront de comparer où se distribue chacun des deux vecteurs de thérapie génique dans le corps.
Objectifs
A ce jour, de nombreuses maladies génétiques ont été identifiées, avec des profils très variés en termes d’âge d’apparition des symptômes, de sévérité et de pronostic vital. La thérapie génique est une approche thérapeutique prometteuse pour ces pathologies, en permettant l'introduction d'une copie fonctionnelle du gène défectueux dans les cellules affectées grâce à des transporteurs. À ce jour, ces transporteurs, les vecteurs adéno-associés (AAV), utilisés en clinique sont majoritairement d’origine naturelle. Bien que les AAV aient démontré leur efficacité dans plusieurs essais cliniques, leur distribution non spécifique, correspondant à la présence du vecteur dans des organes ou tissus non concernés par la thérapie, limite la précision du traitement ce qui réduit leur capacité à atteindre efficacement les tissus concernés par la maladie. Cette faible spécificité nous contraint à l'injection de fortes doses de vecteur, ce qui entraîne un coût très important de production et un plus haut risque d'effets secondaires, notamment des réponses immunitaires ou des toxicités dans le foie, comme cela a été observé dans plusieurs essais cliniques de thérapie génique utilisant des AAV. Il est désormais essentiel, dans le domaine de la thérapie génique, de développer des vecteurs AAV optimisés avec un ciblage précis et restreint, permettant de ne pas cibler des tissus qui ne nécessitent pas d'être traités. Le but de notre projet est de comparer un nouvel AAV optimisé, que l'on appellera AAVx, à un AAV naturel connu pour son ciblage important des muscles et du système nerveux central. Nous comparerons la distribution globale dans l’organisme de ces deux AAVs après une injection intraveineuse administrée à des doses différentes. Nous cherchons à déterminer si notre vecteur d’intérêt présente une efficacité supérieure, une action plus rapide et une spécificité accrue par rapport à un vecteur AAV d’origine naturelle. Si l’AAVx cible efficacement les muscles et le système nerveux central, sans pénétrer dans les organes dont le foie, il serait un très bon candidat dans le cadre du développement d’un traitement de thérapie génique pour des maladies génétiques neuromusculaires.
Bénéfices attendus
Cette étude permettrait d’identifier un vecteur AAV de seconde génération (AAVx) afin de traiter des maladies génétiques affectant les muscles et le système nerveux central en réduisant les effets secondaires observés dans certains essais cliniques. En effet, si l’AAVx se révèle efficace pour atteindre ces tissus, tout en évitant de cibler des organes tels que le foie, cela permettrait de réduire la dose administrée et de limiter le risque de toxicité du foie ainsi que la réponse immunitaire.
Procédures
Tous les animaux subiront une injection unique d’un traitement (un vecteur ou une solution saline servant de contrôle), qui durera maximum 2 minutes par souris. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur animaux vivants anesthésiés, une seule fois et durera maximum 5 minutes par souris. Avant la mise à mort par perfusion intracardiaque terminale d’une partie des animaux, ceux-ci recevront une injection sous-cutanée d’un analgésique, puis une injection intrapéritonéale d’un anesthésique profond. Chaque injection durera maximum 2 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements sanguins peuvent occasionner une douleur légère liée à la piqûre.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir prélever des tissus qui nous permettront de comparer l’efficacité des deux vecteurs transporteurs de thérapie génique.
Remplacement
Notre vecteur AAV d’intérêt a été sélectionné par un test cellulaire en laboratoire grâce à sa capacité à pénétrer dans des cellules de muscles et de neurones, en comparaison avec des vecteurs AAV d’origine naturelle connus pour leur forte affinité pour les muscles et le système nerveux central. Cependant, ces travaux, réalisés sur un système cellulaire simple composé d’un type cellulaire unique n’est pas suffisant. Nous avons également pu déterminer que notre vecteur d’intérêt est capable de pénétrer dans les cellules musculaires après une injection réalisée directement dans le muscle, mais cela ne nous permet pas de déterminer la distribution globale de ce vecteur dans l’organisme après une injection intraveineuse (la disponibilité du vecteur dans chaque tissu), ni s’il est capable de pénétrer dans le système nerveux central. Pour cela, nous avons besoin d’un organisme complexe, tel que la souris.
Réduction
Le nombre minimal d’animaux dont nous aurons besoin dans notre étude, afin d’observer des différences en termes de distribution globale entre les deux vecteurs AAV étudiés, a été défini à l’aide de calculs statistiques.
Raffinement
Afin de raffiner nos études, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress de l’animal lié à l’acte et assurer son immobilité. Pour augmenter le confort des animaux après anesthésie gazeuse, du gel oculaire pourra être appliqué pour éviter le dessèchement des tissus. Une demi-heure avant la perfusion intracardiaque, un analgésique sera injecté en sous-cutané, ce qui permettra de soulager les douleurs intenses éventuelles. Les souris seront ensuite anesthésiées par administration d’un mélange de deux anesthésiques, dont l’un possédant également des propriétés analgésiques. L’animal sera placé sur un support chauffant tout au long de l’anesthésie.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme animaux modèles car elles partagent une grande partie de leur physiologie et de leur génétique avec l’humain, ce qui permet d’obtenir des données transposables et elles possèdent des organes et systèmes similaires (foie, cœur, système nerveux central, muscles), ce qui est essentiel dans ce projet pour évaluer la biodistribution des vecteurs après administration par voie intraveineuse. La biodistribution d’un vecteur AAV correspond à l’étude de sa répartition dans l’organisme après administration, afin d’identifier les organes qui reçoivent le vecteur et d’en quantifier la présence, au-delà de ou des organe(s) cible(s) visé(s) par la thérapie. Cette analyse est indispensable pour vérifier l’absence ou la très faible diffusion vers des organes non concernés par la thérapie, notamment les organes sensibles tels que le foie ou la rate. L’âge des animaux correspond à la phase de jeune adulte. Cet âge garantit la maturité des organes ce qui réduit la variabilité interindividuelle et assure la reproductibilité des résultats. De plus, de nombreuses pathologies génétiques neuromusculaires se manifestent dès la période juvénile, donc le choix d’administration des souris à 4 semaines est pertinent pour une future utilisation du vecteur d’intérêt dans un contexte pathologique.
Etude des effets de nouvelles molécules sur les dyskinésies induites par la L-DOPA chez le rat parkinsonien
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Un rat dont l'état dévie sur trois critères sans correction possible est mis à mort, selon une fiche de bien-être de trente points remplie chaque semaine. 1 040 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie intracérébrale de trente minutes détruit une partie de leurs neurones dopaminergiques, puis un traitement chronique de quatre semaines à la L-DOPA leur provoque les mouvements involontaires et les postures anormales que le projet veut corriger, observés jusqu'à quatre heures d'affilée deux fois par semaine. Le porteur indique un taux d'échec des lésions de 30 %, ce qui l'amène à opérer quatorze animaux par groupe pour en garder dix, et rattache l'ensemble au développement de candidats médicaments avant un éventuel passage chez l'humain.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative progressive avec destruction des neurones dopaminergiques. Les patients ne présentent pas de symptômes jusqu'à ce que 50 à 70% des neurones à dopamine soient détruits. Les principaux symptômes engendrés par cette perte neuronale sont des tremblements, des difficulté dans les mouvements fins, des rigidité des membres. A ce jour le traitement le plus efficace de ces symptômes moteurs est la L-DOPA. Mais un traitement continu à la L-DOPA engendre l'apparition de dyskinésies (mouvements involontaires, positions aberrantes, torsions....) chez approximativement 40% des patients après 4 à 6 ans de traitement et jusqu'à 90% des patients après 10 ans de traitement. Un des objectifs thérapeutiques majeurs dans le cadre la maladie de Parkinson est de maintenir le plus longtemps possible le traitement à la L-DOPA tout en retardant l'apparition des dyskinésies ou en corrigeant les dyskinésies déjà en place. Une des activités de notre centre de recherche est de développer de nouvelles molécules ayant pour cible le système nerveux central. L'objectif du projet sera donc d'évaluer sur un modèle de rat parkinsonien les effets de nos nouveaux composés sur des dyskinésies déjà en place suite à un traitement au préalable à la L-DOPA ou vérifier les effets d'une coadministration de nos composés avec la L-DOPA sur l'apparition des dyskinésies.
Bénéfices attendus
Les procédures mises en oeuvre permettront d’évaluer la capacité de nouvelles entités pharmacologiques à moduler/corriger les dyskinésies induites par la L-DOPA chez des rats parkinsoniens. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques indispensables au processus de développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests cliniques chez l'homme.
Procédures
-Administration intracérébrale d’un composé : procédure chirurgicale sous anesthésie d’une durée maximale de 30 minutes, effectuée une seule fois. -Traitement unique ou chronique d'un traitement de référence de la maladie de Parkinson ou de nouvelles molécules à tester, pendant une durée maximale de 4 semaines. -Les effets des traitements seront évalués par des observations comportementales (locomotion, mouvements, postures) pouvant durer jusqu’à 4 heures, 2 fois par semaines maximum.
Impact sur les animaux
Nuisances liées à la chirurgie : douleur liée à l’incision, stress lié à la contention, à la manipulation avant introduction dans la boite d’induction de l’anesthésie. Stress lié à l’hébergement individuel lors de la phase de réveil post chirurgical. Nuisances liées à la lésion : difficultés à se mouvoir ou à se nourrir, perte de poids transitoire. Nuisances liées à l’administration chronique de composés pouvant entrainer le développement de comportements, de postures aberrentes et d'altérations du contrôle des mouvements. Problèmes de tolérance à ces nouveaux produits, stress lié à la contention lors de l’administration de ces produits, douleurs liées aux injections. Nuisances liées aux tests comportementaux : stress lié aux observations dans des enceintes confinées. Impossibilité d’exprimer un comportement naturel pendant une durée limitée.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. En effet la lésion intracérébrale ne permettra pas une réutilisation des animaux dans d'autres procédures. De plus les traitements pharmacologiques ou les tests comportementaux pourraient interragir avec d'autres expérimentations.
Remplacement
L'objectif du projet est d'évaluer les effets de nouvelles molécules sur un animal présentant des symptômes de la maladie de parkinson. Installer un modèle de parkinson et évaluer des comportements ne peuvent se faire que sur un animal vigile. Il n'existe pas à ce jour de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.
Réduction
En raison de la variabilité liée aux études comportementales, un effectif de 10 animaux par groupe est nécessaire pour la robustesse des tests statistiques. Il existe un taux d'échec des lésions de l'ordre de 30%. Ainsi afin d'avoir un nombre suffisant d'animaux pour les tests statistiques, 14 animaux par groupe au moment de la chirurgie seront nécessaires. Les tests de plusieurs molécules ou plusieurs doses d'une même molécule pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant qu'un seul groupe recevant une molécule de référence.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie centrale (température et hygrométrie contrôlées) groupés par 2 à 4 par cage. Une période de 5 jours d'acclimatation après livraison est prévue avant toute expérimentation. Tout au long des études les animaux sont hébergés dans des cages adaptées à l'espèce avec la présence d'enrichissement de milieu (tunnel, balle, aspen bricks à ronger, graines de tournesol...) et avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. Avant la chirurgie, pendant la phase d'acclimatation, une phase d'habituation à l'expérimentateur sera réalisée. Une fois par semaine, les rats seront placés dans une enceinte plus grande avec des aménagements types échelles, plateformes, roue d’activité… Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), une fiche de contrôle du bien-être animal comprenant 30 critères est renseignée chaque semaine. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu'aucune action puisse corriger ces déviations alors la mise à mort de l'animal sera envisagée. Les membres de la structure bien-être animal effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse avec administration d'analgésiques en local et en systémique. Dans le suivi postopératoire est prévue une administration d'antidouleur de manière systématique jusqu'à 5 jours suivant la chirurgie. Des croquettes humidifiées seront placées sur le sol de la cage pendant la récupération post-opératoire. Cependant si 3 jours après le réveil, l'animal présente des signes de mal-être (non reprise de poids, poil hérissé, absence de toilettage, prostration, absence de fèces...) alors il sera euthanasié. Si nous constatons une réouverture de la plaie dans les 3 jours qui suivent la fin de la chirurgie, des soins et des sutures pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse. Lors d'une co-administration de plusieurs composés, une injection unique sera privilégiée et les sites d'injection seront alternés afin d'éviter l'apparition de lésions cutanées.
Choix des espèces
Le modèle parkinson après destruction partielle de neurones chez le rat ainsi que le développement de mouvements aberrants suite à l'administration du traitement de référence de la maladie, est largement caractérisé dans la littérature. Le cerveau du rat est suffisamment volumineux pour avoir une neuroanatomie particulièrement bien détaillée et documentée permettant de cibler des zones précises. Les rats ont un système nerveux suffisamment évolué pour extrapoler certains résultats à l'homme. Les rats seront utilisés à l'âge adulte. En effet, la maladie de parkinson ne concerne que des personnes adultes.
Détermination de la pharmacocinétique de molécules thérapeutiques innovantes pour traiter des maladies génétiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Souris porteuses de maladies génétiques par construction et souriceaux nouveau-nés composent les groupes de ce projet, la souche étant choisie selon le modèle pathologique visé. 3 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les injections peuvent être répétées chaque semaine pendant 24 semaines, les chirurgies durent de 30 minutes à une heure, et les prélèvements sanguins peuvent atteindre deux par jour sur 48 heures. Le porteur signale que manipuler les nouveau-nés peut entraîner leur rejet par la mère et que les injections provoquent œdèmes et réactions inflammatoires locales, avant la mise à mort qui permet d'analyser muscles, cœur, cerveau, foie, rein et moelle épinière.
Objectifs
Notre équipe développe des molécules innovantes pour la thérapie génique et la modulation de l’expression des gènes. Nos efforts se concentrent sur des maladies génétiques, notamment neuromusculaires, neurodégénératives et des épilepsies infantiles. Ces maladies sont particulièrement difficiles à traiter, car elles exigent que le médicament atteigne l'ensemble du corps ou atteignent le cerveau et la moelle épinière. Notre objectif est d’identifier les médicaments les plus efficaces et adaptés à chaque type d’organe, afin que ces thérapies puissent, un jour, être utilisées chez les patients.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement des maladies génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules atteignant au maximum les organes ciblés avec le moins d’effets secondaires.
Procédures
Chaque animal est soumis à un seul type d'injections avec une seule et même molécule afin d’évaluer le meilleur transport dans les organes ciblés. Les injections se feront en moins de 1 minute et pourront être répétées chaque semaine pendant 24 semaines maximum. Les chirurgies dureront entre 30 minutes et 1 heure. Les injections chroniques prennent 5 minutes et pourront être répétées toutes les 2 semaines, sur une période maximale de 24 semaines. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins (durée du prélèvement : 1 minute, 2 fois par jour maximum, sur 48h maximum).
Impact sur les animaux
La manipulation des nouveau-nés peut entrainer leur rejet par la mère. Les injections sous la peau induisent un stress et une douleur légère de courte durée aux animaux, quel que soit leur âge, et peuvent entraîner certains effets indésirables, tels que la formation d’œdèmes et des réactions inflammatoires locales. Chez les jeunes souriceaux, selon leur localisation, les injections peuvent induire une douleur modérée sur de courte période. La chirurgie peut entrainer une douleur post opératoire modérée et de courte durée.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’analyser les différents tissus (muscles squelettiques, cœur, cerveau, foie, rein, cerveau, moelle épinière ...).
Remplacement
La recherche en bioinformatique de molécules et les analyses réalisées sur des cellules de malades permettent d’effectuer une première sélection. Cependant, aucun modèle cellulaire ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est donc indispensable de mener ces études dans un modèle animal, la souris, qui permet d’évaluer des paramètres essentiels tels que la distribution du traitement dans les tissus ciblés et sa durée de vie.
Réduction
Dans le cadre de ce projet, notre objectif principal est de déterminer la distribution des molécules, c’est-à-dire de mesurer leur répartition dans différents tissus. Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats représentatifs et fiables. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
La fréquence des injections pourra être réduite si les résultats initiaux indiquent une accumulation suffisante et une demi-vie prolongée de la molécule. De la nourriture en gelée sera mise à disposition dans les cages des individus jeunes, fragiles ou ayant subi une procédure, afin de faciliter leur prise alimentaire. De plus, toutes les interventions douloureuses seront précédées de l'administration d’un antidouleur et se feront sous anéesthésie. Un suivi, accompagné d’une grille d’évaluation, sera assuré tout au long de la procédure et des mesures seront prises afin d'éviter toute souffrance inutile (utilisation de points limites ou critère d’arrêt précoce). Chez les souriceaux, le temps passé hors du nid sera strictement limitée. Des précautions spécifiques seront mises en œuvre pour éviter un rejet maternel.
Choix des espèces
Nous travaillerons sur des souris, car elles présentent une grande similitude génétique avec l’humain (environ 95 % de conservation des gènes). De plus, il existe des modèles pathologiques des maladies que nous ciblons avec nos molécules. Ces modèles permettront ensuite de tester l’efficacité des molécules thérapeutiques. La souche employée sera choisie en fonction du modèle pathologique spécifique, parmi les différentes souches existantes. Nous utiliserons à la fois des souris adultes et des nouveau-nés, afin de tester nos molécules à des stades de développement correspondant à la période précédant ou accompagnant l’apparition des symptômes des maladies sur lesquelles nous travaillons.
Étude de l’impact de la modulation des gènes dans des cellules non neuronales dans un contexte d’ataxie cérébelleuse. EU4/4
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Déplacées à pied entre quatre établissements utilisateurs, dans une cage fermée glissée dans un double emballage opaque, les souris de ce volet passent d'un site à l'autre selon l'étape du protocole. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester la modulation d'un gène de cellules non neuronales dans deux modèles d'ataxie cérébelleuse. Prélèvement de tissu à l'oreille dans les deux premiers établissements, chirurgie d'une heure et injection d'un vecteur dans le cervelet dans le troisième, tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, puis injection d'un fixateur dans le quatrième pour une partie des animaux. 52 femelles rejoignent un projet d'élevage pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres sont tuées pour prélèvement de tissus.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.
Bénéfices attendus
Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).
Impact sur les animaux
Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.
Remplacement
Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.
Raffinement
Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.
Étude de l’impact de la modulation des gènes dans des cellules non neuronales dans un contexte d’ataxie cérébelleuse. EU2/4
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour démontrer le rôle d'un gène exprimé dans des cellules non neuronales du cervelet, deux lignées de souris reproduisant l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l'ataxie de Friedreich sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 360 souris sont concernées par ce volet. Chacune subit un prélèvement de tissu à l'oreille, une chirurgie d'une heure sous anesthésie pour injecter un vecteur dans le cervelet, puis des séries de tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, et une partie d'entre elles une dernière chirurgie d'injection de fixateur. 52 femelles sont réutilisées pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres tuées pour prélèvement de tissus. Les tests comportementaux, que le porteur qualifie d'indolores et sans dommage durable, ne sont jamais nommés.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.
Bénéfices attendus
Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).
Impact sur les animaux
Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.
Remplacement
Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.
Raffinement
Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.
Evaluation de traitements antiépileptiques dans le context de crises réfractaires chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Injection d'acide kaïnique directement dans le cerveau, implantation d'électrodes cérébrales pendant deux heures, parfois d'une canule pendant une heure de plus : 574 souris vont être utilisées, dont 568 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les crises focales induites peuvent conduire à un état épileptique permanent, avec hypersalivation, mouvements de la tête et des pattes avant et pertes d'équilibre. Il s'agit de tester des candidats médicaments contre les épilepsies pharmacorésistantes, sur un modèle recommandé par l'Epilepsy Therapy Screening Program. Six souris utilisées pour la mise au point d'une méthode d'anesthésie pourront être réutilisées, les 568 autres sont tuées, une mise à mort que le porteur justifie par la souffrance durable que les procédures elles-mêmes provoquent.
Objectifs
L'objectif du projet est d'évaluer de nouveaux candidats-médicaments pour lutter contre les épilepsies partielles, qui prennent naissance dans une région localisée du cerveau, chez la souris. À l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité de vie et l'espérance de vie des patients. Les crises partielles sont liées à une décharge électrique anormale dans une région cérébrale spécifique. Chez l'homme, elles peuvent inclure des fourmillements, des picotements, des secousses musculaires involontaires, des mouvements anormaux de la tête ou des yeux, ainsi que des symptômes émotionnels tels que la peur ou le rire. Le projet consiste à évaluer l'efficacité de nouvelles substances pharmacologiques en développement, par l'utilisation de tests dans des modèles de crises épileptiques induites par des substances chimiques connues pour leurs propriétés convulsivantes. Le modèle d'induction de crises focales par l'acide kaïnique, reconnu par l'Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP), est utilisé pour son caractère prédictif et sa pertinence dans l'étude des mécanismes physiopathologiques de l'épilepsie ainsi que dans l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le modèle d'épilepsie induit par l'injection d'acide kaïnique administré par voie intracérébrale, reproduisant l'épilepsie temporale médiale (MTLE), est recommandé pour identifier et évaluer l'efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. À l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30 % des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou de l'inefficacité des traitements (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux antiépileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet stoppant ou limitant le développement de crises épileptiques. À ce jour, il n’en existe aucun, alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.
Procédures
Dans la première procédure, les animaux sont soumis à une anesthésie d'une durée maximale de 2 heures, durant laquelle l'expérimentateur évalue la profondeur de l'anesthésie par des tests de réflexe (type pincement de la queue de l'animal). Pour les 3 autres procédures décrites, une phase chirurgicale (sur des animaux anesthésiés) est nécessaire pour l'injection de la substance réactive (2 à 5 minutes, une fois) et l'implantation d'électrodes cérébrales (2 heures, une fois) ou l'implantation d'une canule cérébrale (60 minutes, une fois) et l'implantation d'électrodes cérébrales (2 heures, une fois). L'administration d'un médicament candidat peut également être réalisée pendant la phase chirurgicale (2 à 5 minutes, une fois). Pour la quatrième procédure, une substance réactive est administrée durant une à deux minutes, suivie d'une substance antépileptique chez l'animal vigile, environ une semaine après la chirurgie. Le comportement de l'animal sera évalué pendant 30 minutes à 2 heures. Le médicament candidat pourra être injecté par bolus rapide, une fois par semaine sur plusieurs semaines (1 injection de quelques secondes, une fois par semaine pendant 5 semaines) ou quotidiennement pendant 2 à 3 semaines sur animal vigile. Deux à quatre semaines après la phase chirurgicale, les mesures électroencéphalographiques sont réalisées sur des animaux vigiles et sur plusieurs jours consécutifs, en fonction du design de l'expérience. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés pendant l'étude (maximum une fois par semaine pendant 2 mois) ou en fin d'étude pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques. Les prélèvements d'organe sont réalisés à la fin de l'expérience.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment en raison de la contention. Les crises focales, prenant naissance dans une région localisée du cerveau, peuvent conduire à l'apparition d'un état épileptique permanent et sont caractérisées par une hypersalivation, des mouvements de la tête et des pattes avant, un redressement de l'animal et une perte d'équilibre dans certains cas. Chez les animaux opérés, des problèmes de cicatrisation peuvent être observés, notamment lorsque l'animal se gratte.
Devenir
Les animaux issus de la procédure de développement d’une méthode d’anesthésie pourront être maintenus en vie et réutilisés. Les animaux issus des autres procédures (sévères) seront euthanasiés afin de garantir l’absence d’une souffrance (les procédures concernées entraînant une épilepsie) qui se prolongerait à l’issue de l’étude. De plus, dans un grand nombre de cas, des structures nerveuses (notamment cerveau) seront collectés en fin d’étude, ce qui n’est pas compatible avec un maintien en vie.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives in vitro permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales, afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et ainsi de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux), permettant ainsi l’observation des effets des substances pharmacologiques sur l'activité cérébrale des animaux et le comportement associé, le cas échéant.
Réduction
Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude, en fonction des analyses statistiques effectuées. Un lot d'animaux sera utilisé sur plusieurs semaines et recevra les différents traitements d'une même expérience, limitant ainsi le nombre total d'animaux par expérience. Il est également envisagé de diminuer le lot d'animaux si le nombre d'animaux répondeurs est supérieur à nos attentes.
Raffinement
Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie chimique ou gazeuse, en parallèle d'un protocole d'analgésie avant le début de la chirurgie et pendant les 48 heures suivant l'opération. Une solution anesthésique locale est également appliquée sur le crâne de l'animal pour limiter la douleur. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire, et une couverture chauffante est placée sous l'animal anesthésié pour maintenir sa température corporelle pendant la chirurgie. Les animaux seront pesés une fois par jour pendant 2 jours après la chirurgie pour évaluer leur récupération. Suite à la chirurgie, les animaux sont placés par deux dans leur cage d’hébergement, en présence d'un enrichissement adapté. Des points limites stricts, prédéfinis et spécifiques au projet seront appliqués afin de prévenir toute douleur, souffrance ou détresse non justifiée scientifiquement.
Choix des espèces
Les modèles de crises convulsives induites par l'administration intracérébrale d'une substance chimique sont largement décrits dans la littérature chez la souris et sont recommandés par l'Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Ces modèles présentent un intérêt translationnel notable et permettent d’évaluer des candidats médicaments pour le traitement des crises réfractaires. Chez l’Homme, l’épilepsie est une affection neurologique pouvant survenir à tout âge. Les souris sont testées une fois sevrées. L'âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux articles scientifiques et en fonction de la population ciblée par le traitement.
Effet du fructose sur le microbiote intestinal et comportement : comparaison des fonds génétiques des souris C57BL/6
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Neuf tests comportementaux répartis sur deux semaines, deux gavages de glucose, une injection d'insuline, dix-neuf prélèvements de sang et un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures sont infligés à 96 souris génétiquement modifiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu du cæcum. L'étude cherche à établir si le fond génétique modifie la réponse des souris au fructose, étape que le porteur présente comme préalable à une future étude sur les mécanismes d'action. Les neuf tests censés mesurer l'anxiété, l'humeur dépressive et la mémoire ne sont pas nommés.
Objectifs
La consommation de fructose a fortement augmenté au cours des dernières décennies, notamment par le biais des produits alimentaires ultratransformés et par les boissons sucrées. Plusieurs études ont montré l’impact négatif de cette surconsommation sur la santé (obésité, diabète de type 2, etc.), troubles de l’humeur (anxiété, dépression). On ne sait pas comment le fructose provoque ces effets néfastes. Dans l’intestin grêle, il est peu absorbé par rapport au glucose. Son excès provoque sa présence en quantités anormales dans le gros intestin et y altère la flore bactérienne. Ce phénomène est amplifié chez près de la moitié de la population qui présente des problèmes d’absorption intestinale du fructose, pathologie encore mal diagnostiquée. Des travaux préliminaires sur la souris montrent que les cellules immunitaires du cerveau sont activées par l’excès de fructose indiquant un état inflammatoire néfaste à long terme. De plus, des tests de comportement révèlent un état dépressif de ces animaux. Mais on ne sait pas si le fructose agit directement sur le cerveau ou/et si ses effets sont la conséquence d’un dysfonctionnement intestinal ou sanguin. Cette étude va nous permettre de déterminer si les différences génétiques ont un impact sur les effets du fructose chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’évaluer dans quelle mesure le fond génétique des souris et leurs conditions d’hébergement influencent leur réponse au fructose, tant sur le plan comportemental que physiologique. Ces données sont cruciales pour mettre en place une étude sur les mécanismes d’action du fructose.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à des tests de comportement durant 5 à 20 minutes pour permettre d’analyser des comportements émotionnels et de mémoire : 4 tests différents répartis sur 4 jours une semaine (jour de repos le mercredi) et 5 tests différents répartis sur 5 jours une autre semaine. Trois semaines sépareront les 2 semaines de tests. Au cours du protocole expérimental, les animaux vigiles seront soumis à 2 reprises à un test de tolérance au glucose et une fois à un test de résistance à l’insuline. Ils recevront au total 2 gavages de glucose et 1 injection d’insuline pour un suivi de la glycémie pendant 2 heures (glycémie mesurée à 7 et 5 temps différents par prélèvement d’une goutte de sang d’une durée inférieure à 10 secondes, soit un total de 19 prélèvements). Les gavages et injections ne durent qu’une dizaine de secondes, maximum 20 secondes. Les animaux seront mis à jeun 16 heures maximum une fois, et 6h deux fois, une fois 4h, puis 2h en fin de protocole. Un prélèvement sanguin sera effectué une fois, d’une durée d’environ 20 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages et des prélèvements (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à un stress durant les tests de comportement (10 minutes maximum). Les animaux seront soumis à une légère douleur lors des prélèvements sanguins. Les souris seront soumises à des périodes de jeûne (16 heures, 6 heures et 4 heures) ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever et analyser certains tissus (cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu de caecum).
Remplacement
L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives ne peut être faite que sur des animaux vivants, tout comme l’étude des effets physiologiques d’un changement de consommation alimentaire. Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant les remplacer. Enfin, les analyses tissulaires doivent être réalisées sur des organes entiers qui tiennent compte de l’anatomie réelle qui existe chez les individus, en particulier le cerveau constitué d’un réseau de voies nerveuses encore impossible à reproduire.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. D’après de précédentes études, 12 animaux par groupe expérimental semblent nécessaires pour obtenir des résultats rigoureux suite aux tests comportementaux.
Raffinement
Pour réduire au maximum le stress des animaux, une semaine avant le début du protocole, ils seront habitués à être pris de leur cage au moyen d’un tunnel en plastique et à être manipulés pour les gestes de contention. Un suivi visuel quotidien des animaux sera opéré et leur poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour limiter au mieux la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le modèle utilisé est la souris, qui est un mammifère comme l’Homme. Les tests de glycémie et de comportement sont bien connus chez ces rongeurs et nous pourrons comparer nos résultats à ceux d’études antérieures. Elles seront étudiées à l’âge adulte (10 semaines) pour reproduire la malabsorption intestinale du fructose observée chez l’Homme lorsque la flore intestinale est mature et évaluer leur santé mentale. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés qui seront nécessaires pour la poursuite de notre projet, où le transporteur au fructose sera invalidé spécifiquement dans le cerveau ou l’intestin afin de déterminer si l’effet du fructose est du à son action directe au niveau du cerveau ou à sa malabsorption au niveau intestinal.
Etude de la délétion d’un complexe de 2 enzymes de modification des ARN de transfert dans le cerveau de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Plus petites, dotées d'un cerveau plus petit, les souris double mutantes de ce projet peinent à se déplacer et à communiquer avec le reste de la portée, et leur mortalité augmente vers trois semaines de vie. 942 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau, à des stades allant de l'embryon à vingt jours de vie. Le porteur écrit pourtant qu'elles "ne subiront aucune procédure expérimentale". Tout animal délaissé par sa mère ou sans poche à lait visible pendant vingt-quatre heures est tué, et les collectes s'arrêtent à vingt jours pour devancer la mortalité.
Objectifs
Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Des mutations dans de nombreux gènes ont été identifiées chez des patients avec des troubles du neurodéveloppement. Notre objectif est de comprendre le rôle de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques associés à ces maladies. Plusieurs patients avec des troubles du neurodéveloppement présentent une mutation dans le gène d’intérêt. La protéine issue de ce gène (gène 1) forme un complexe avec une autre protéine (encodée par le gène 2). Ce complexe est indispensable au décodage de certains gènes. Notre collaboration avec des généticiens et d’autres équipes de recherche a permis de mettre en avant l’importance du gène d’étude dans le développement du cerveau. La technique utilisée lors de ces précedentes études nous a permis de moduler l’expression dans une partie des cellules de cortex (environ 1%) et de visualiser un défaut de migration. Nous souhaitons à présent moduler cette expression dans toutes les cellules du cortex pour comprendre les mécanismes impliqués dans les troubles du neurodeveloppement. Afin d’avoir toute la population de cellules du cortex à analyser (et non 1% comme les expériences précédentes), nous avons étudié des souris cKO (Knock-Out conditionnel, c’est-à-dire que le gène d’intérêt est absent uniquement dans le cortex des souris) soit pour le gène 1 soit pour le gène 2. Ces souris ne présentent aucune anomalie au niveau du cerveau. Nous souhaitons à présent étudier les souris cKO pour les deux gènes du complexe (perte de l’expression des gènes 1 et 2 simultanément), ici encore en limitant l’excision des gènes au cortex cérébral des souris. Cette étude permettra de comprendre par quels mécanismes moléculaires le complexe influe sur le développement du cortex.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de comprendre la fonction du complexe étudié dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels sa déplétion conduit à des troubles du neurodéveloppement, plus précisément au niveau moléculaire.
Procédures
Ils ne subiront aucune procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Les animaux mutants sont plus petits et ont un cerveau plus petit. Ils pourront avoir du mal à se déplacer et à communiquer avec le reste de la portée, notamment dans le cas des études post-natales. Vers 3 semaines après la naissance, les animaux présentent une mortalité qui semble augmentée d’après nos premières données préliminaires. Dans ce projet, nous n’étudions pas les animaux agès de plus de 3 semaines.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet afin de prélever les cerveaux et de réaliser les analyses sur ceux-ci.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral en développement qui ne peut pas totalement être recréé par des approches in vitro. Nous incluons d’ailleurs dans cette étude des méthodes de culture cellulaire, mais qui nécessitent tout de même des embryons « donneurs ». Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.
Réduction
Notre projet est composé de trois études dont la première a pour but de déterminer les stades clés pour les études suivantes, afin de limiter le nombre de stades étudiés en détail et de limiter le nombre d’animaux générés. De plus, nous allons combiner les analyses de protéines et d’ARN sur une même portée (1 hémisphère pour chaque étude au lieu du cerveau entier). Nous utilisons les test statistique adaptés afin d’évaluer différents paramètres chez les animaux portant la mutation par rapport aux contrôles (embryons non porteurs de la mutation de la même portée). Nous avons aussi adapté le nombre de portées à analyser en fonction des expériences à réaliser.
Raffinement
Nous prenons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal, notamment avec l’ajout de nid et de tunnel dans les cages d’hébergement. La mise à mort est faite par du personnel qualifié. Pour les animaux à 3 semaines de vie (21-22 jours après la naissance), bien qu’ils soient plus petits et aient un cerveau plus petit, nous n’avons jusqu’à présent pas détecté de signe de détresse ou de souffrance. Aucun point limite (maigreur, absence de lait maternel dans l’estomac) n’a été constaté dans les premières portées. Nous faisons toutefois nos collectes les plus tardives à 20 jours de vie, avant l’apparition de la mortalité. Nous effectuons le prélèvement pour le génotypage en post-mortem pour éviter une douleur inutile. En post-natal, pour les animaux étudiés le jour de la naissance ou à 6 jours de vie : nous comptons les nouveaux nés à la naissance et nous nous assurons qu’ils sont bien en groupe dans le nid, attestant que la mère s’occupe de tous ses petits. Tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. 3 fois par semaine, nous apportons une attention particulière aux points limites suivants : i) l’absence de prise alimentaire par observation de la poche à lait : tout animal sans poche à lait visible pendant 24h est euthanasié ; ii) cyanose: les animaux étant glabres jusqu’à 6 jours de vie, nous observons la couleur de la peau : tout animal cyanosé est euthanasié. Entre 6 et 20 jours de vie: Nous surveillons l’attitude de la mère et tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. L’apparence du pelage des petits est également un bon indice du soin apporté par la mère. Nous avons noté une taille des nouveaux nés double mutants plus petite (mais de corpulence normale, c’est-à-dire qu’ils ne sont pas anomalement maigres), des cerveaux plus petits et des animaux moins vifs. Le point limite étant une perte anormale de poids, les animaux sont pesés 3 fois par semaine. Si une perte de poids ou un état de maigreur est observé, l’animal est euthanasié. Les animaux ne réagissant pas à une stimulation lors de l’ouverture du nid sont euthanasiés.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour étudier les gènes impliqués chez des patients souffrant de troubles neurodéveloppementaux. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris, ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neurodéveloppementales chez l’homme. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par portée est couramment modifié génétiquement, ce qui nous permet de mimer les mutations observées chez l’homme. De plus la culture de cellules souches neurales et la culture primaire de neurones à partir de cortex murins sont des techniques bien établies au laboratoire. Selon nos études préliminaires, les très jeunes embryons mutants (avant 2/3 de gestation) ne présentent aucune différence avec les embryons sauvages. A la naissance, nous notons une taille légèrement inférieure et juste avant le sevrage, cette taille ainsi que la taille du cerveau, sont très inférieures chez les double cKO. A deux semaines de vie, on observe également une diminution de la taille (corps et tête) chez les animaux avec une seule copie d’un des deux gènes. Nous souhaitons dans un premier temps étudier tous les stades du développement du cerveau afin de déterminer précisement la dynamique d’apparition des phénotypes et d’identifier le timing précis auquel réaliser la caractérisation moléculaire qui permettra de comprendre les mécanismes qui mènent à l’apparition des phénotypes : stades embryonnaires 14.5 jours, 15.5 jours, 16.5 jours et 18.5 jours post-fécondation et stades postnataux jour de la naissance et 6, 14 et 20 jours de vie. Dans les études suivantes, nous étudierons plus en détail uniquement les stades clé.