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Implémentation d’une stratégie de thérapie génique chez un modèle murin du syndrome de Rett
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Porteuses d'une mutation reproduisant le syndrome de Rett, une partie des 576 souris développe une baisse d'activité, des tremblements et des troubles respiratoires, les mâles mourant en moyenne vers treize semaines. Ces animaux sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance qualifié de léger pour la moitié et de sévère pour l'autre, toutes tuées à l'issue. Le protocole associe une thérapie génique injectée sous anesthésie et de courts tests comportementaux, la maladie elle-même produisant l'essentiel des atteintes. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ne peut rendre compte du polyhandicap étudié, et prévoit une surdose d'anesthésique pour prélever les tissus.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie grave qui touche le développement du cerveau chez les petites filles. Au début, elles se développent normalement, puis entre 6 et 18 mois, elles perdent peu à peu des capacités comme parler ou utiliser leurs mains. Elles peuvent aussi avoir des problèmes pour marcher, respirer et présenter des comportements autistiques. Dans plus de 95 % des cas, la maladie est due à une anomalie d’un gène appelé MECP2, qui est important pour le bon fonctionnement des cellules du cerveau. Pour comprendre la maladie et tester des traitements, nous travaillons sur des souris qui ont des symptômes similaires. Il n’existe pas encore de traitement, mais des études ont montré que rétablir la protéine manquante chez des souris malades améliore fortement leur état, même à l’âge adulte. Cela laisse penser que la maladie pourrait être réversible. Notre projet vise donc à tester une thérapie génique pour réactiver ce gène chez les souris et vérifier si ce traitement fonctionne.
Bénéfices attendus
Le principal défi de la thérapie génique dans le syndrome de Rett est de remettre la bonne quantité de protéine MECP2, ni trop peu ni trop. Des essais sont en cours chez des patientes, mais on ne contrôle pas encore parfaitement cette quantité.Les problèmes de la maladie se passent dans le noyau des cellules, qui est un peu comme le centre de commande des neurones. Notre projet propose d’agir sur une protéine qui aide MECP2 à entrer dans ce noyau. En modulant ce passage, nous cherchons à éviter qu’il y ait trop de MECP2, tout en évitant des effets indésirables. Si cette méthode fonctionne, ce serait une avancée importante dans un domaine où il n’existe pas encore de traitement.
Procédures
Pour administrer la thérapie génique, les animaux seront placés sous anesthésie générale pendant environ 10 minutes, afin qu’ils ne ressentent ni douleur ni stress pendant l’injection. Ils réaliseront ensuite de courts tests comportementaux, non invasifs (sans intervention douloureuse), durant entre 3 et 10 minutes chacun, soit une durée totale estimée à environ une heure par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont surtout liés à l'expression de signes cliniques chez les souris mutantes. Chez les mâles, les premiers signes apparaissent vers 6 semaines de vie ; chez les femelles, plus tardivement, autour de 20 semaines. Les symptômes observés comprennent une diminution de l’activité et des déplacements, une posture anormale des pattes arrière, des tremblements, des troubles respiratoires. Ces signes sont suivis chaque semaine par simple observation. Chez les mâles, on observe également une perte de poids à partir de 4 semaines par rapport aux souris non malades. Leur espérance de vie est réduite, avec un décès en moyenne autour de 13 semaines. Globalement, la maladie apparaît plus tôt et est plus sévère chez les mâles que chez les femelles. Les contraintes liées aux procédures expérimentales restent limitées et impliquent un léger stress lié à l’anesthésie générale de courte durée, un léger stress lié aux tests comportementaux (non invasifs), et une intervention réalisée en fin de vie sous anesthésie profonde afin d’éviter toute douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésique afin de prélever des tissus.
Remplacement
La pathologie nécessite l’étude du cerveau et se caractérise par un polyhandicap. Pour l’étudier sous toutes ses dimensions (ex : analyse des circuits neuronaux, du comportement), un modèle de culture cellulaire n’est pas envisageable. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle animal de la pathologie pour espérer produire des résultats qui seront transférables chez l’homme. L'expérimentation sur l'animal permettra d'acquérir des données cruciales au développement de notre recherche résolument translationnelle.
Réduction
La variabilité inter-individuelle est réduite par l’utilisation de souches murines génétiquement homogènes. Des tests statistiques seront utilisés pour définir le nombre de souris suffisant pour dégager un résultat significatif à notre étude ; en fonction de la distribution des données et la comparaison des différents groupes d’animaux entre eux.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance, le stress et la détresse des animaux, des points-limites seront établis, leur atteinte entraînant la mise à mort anticipée de l’animal. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental. Le transfert des animaux hors de la cage pour étude observationnelle se fera par méthode manuelle en plaçant les souris dans le creux de la main pour réduire le stress lié à la manipulation. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par des chercheurs et zootechniciens qualifiés, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude.
Choix des espèces
L’étude nécessite l’étude de modèles comparables à la pathologie humaine pour assurer une meilleure transférabilité des résultats, un élément nécessaire à une recherche translationnelle valide. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation d’un modèle souris mutantes. La souris présente la possibilité de travailler sur un modèle génétiquement modifié chez qui nous pouvons étudier aussi bien le comportement, la physiologie, mais aussi la morphologie cellulaire et l’expression de gènes avec un degré de complexité biologique ne pouvant pas être atteint (à ce jour) par d’autres modèles ou méthodes. Le modèle que nous étudions au laboratoire est largement utilisé par les laboratoires de recherche sur le Syndrome de Rett. Il est caractérisé dans la littérature ce qui permet de s'appuyer sur un corpus de données important.
Visualisation et modulation des cellules cérébrales individuelles pour l’étude des processus mnésiques en conditions physiologiques et d’exposition toxique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 121 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 315 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, après un conditionnement aversif et une exposition au mercure. Elles subissent des chirurgies cérébrales avec implantation de dispositifs, une restriction alimentaire et des périodes d'isolement. L'étude cartographie les circuits de la mémoire et cherche comment le mercure les perturbe. Toutes sont tuées sous anesthésie profonde pour des analyses du cerveau, les bénéfices médicaux annoncés restant lointains.
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but de décrypter le fonctionnement des circuits cérébraux qui nous permettent de fabriquer, de stocker et de retrouver nos souvenirs. Nous cherchons à comprendre comment les traces de la mémoire s’organisent physiquement dans le cerveau et quels sont les mécanismes biologiques qui les soutiennent. Une partie essentielle de notre travail consiste à cartographier les zones et les groupes de neurones activés lors d'un processus de mémorisation normal. Dans un second temps, nous étudions comment ces circuits sont perturbés par une exposition au mercure. Cette approche permet de mieux comprendre la vulnérabilité de notre mémoire face à des polluants externes et d'identifier, à terme, de nouvelles pistes pour soigner les troubles de la mémoire chez l'humain. Pour atteindre ces objectifs, nous observons des souris lors d'exercices d'apprentissage simples, impliquant des souvenirs agréables ou désagréables. Notre étude s'articule autour de quatre axes majeurs. Nous cherchons d'abord à mesurer l'impact précis du mercure sur l'organisation globale des réseaux de neurones durant un effort de mémoire. Ensuite, nous analysons l'activité électrique de chaque cellule nerveuse pour comprendre comment elles communiquent entre elles lors de l'apprentissage d'un événement. Nous testons également si le fait d'activer artificiellement certains neurones peut influencer le comportement de l'animal ou modifier le souvenir lui-même. Enfin, nous examinons comment cette intervention sur une zone précise du cerveau se répercute sur les autres régions connectées, afin de mieux comprendre la solidarité et la complexité des réseaux de la mémoire.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche apporte des bénéfices fondamentaux pour notre compréhension de la mémoire humaine. En étudiant comment le cerveau fabrique et stabilise les souvenirs, tant au niveau global qu'à l'échelle de chaque neurone, nous levons le voile sur les principes biologiques qui nous permettent d'apprendre et de nous souvenir. L'un des enjeux majeurs de cette étude est d'évaluer la fragilité de ces mécanismes face aux polluants environnementaux comme le mercure, que l'on peut retrouver dans notre alimentation. En identifiant précisément comment ce toxique perturbe les réseaux de neurones, nos travaux fournissent des données essentielles pour mieux protéger la santé publique et comprendre les risques liés à la contamination de notre environnement. Au-delà de l'aspect environnemental, les connaissances acquises ouvrent des perspectives médicales concrètes. Comprendre comment les souvenirs sont stockés ou modifiés permet d'imaginer de nouvelles stratégies pour traiter des pathologies invalidantes. À long terme, ces résultats pourraient aider au développement de thérapies ciblées pour lutter contre les maladies de la mémoire ou pour soulager des troubles psychiatriques complexes, tels que le stress post-traumatique, où certains souvenirs deviennent une source de souffrance chronique. En combinant science fondamentale et enjeux sociétaux, ce projet participe ainsi à l'effort global pour mieux soigner et protéger le cerveau humain.
Procédures
Une grande partie des animaux participant à ce projet subira une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Certains subiront l’implantation de matériel, d'une durée d'environ 45 minutes. D’autres subiront deux interventions. Chacune dure environ 45 minutes et est espacée de 3 semaines. Enfin, un groupe de souris reçoit d'abord une injection ciblée durant 45 minutes, suivie trois semaines plus tard par une seconde intervention qui peut durer jusqu'à 2h. Les animaux subiront entre 4 et 7 tests comportementaux d'une durée comprise entre 4 et 30 minutes selon le groupe afin d'évaluer leur mémoire.
Impact sur les animaux
Les interventions chirurgicales peuvent occasionner des douleurs postopératoires légères et de courte durée. Les animaux subiront une restriction alimentaire de courte durée qui peut entrainer un stress léger. Les produits testés peuvent induire une gêne légère aux animaux pour la durée de l’expérience. Certains animaux seront isolés, ce qui peut provoquer du stress durant la période de l’isolement. Les animaux subissent des stimuli aversifs qui entrainent une gêne et un stress léger et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Celle-ci interviendra alors que l’animal sera profondément anesthésié. Ceci est absolument nécessaire pour les études histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Du fait des approches intégratives de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants reste incontournable. En effet, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données sur ces processus cognitifs, bien trop complexes pour envisager toute simulation informatique. Par ailleurs, de par la nature de nos expérimentations (chirurgie, conditionnement aversif, analyse par immunohistochimie), il nous est impossible d’employer directement des sujets humains. Le modèle souris se révèle alors être idéal du fait de la proximité fonctionnelle entre son système nerveux central et celui de l’humain quant à ses capacités à créer des souvenirs émotionnels simples (auxquels nous nous intéressons, type conditionnement pavlovien) et de sa petite taille. Ceci explique également l’impossibilité d’utiliser des modèles animaux invertébrés, trop éloignés de l’humain pour raisonnablement étudier une réponse émotionnelle à un souvenir ainsi que trop éloignés dans la configuration du système nerveux central, critique à notre étude inter-régions.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au nombre minimal permettant de faire des études statistiquement significatives, nombre choisi sur la base d’expériences présentées dans des articles montrant des analyses similaires. Nous utilisons également les tissus après les expériences, maximisant ainsi l’utilisation de chaque animal.
Raffinement
Afin d’améliorer les conditions de vie des animaux, réduire la douleur, le stress et l’anxiété causés lors des différentes procédures, un certain nombre de mesures sont mises en place : – Les cages seront enrichies d’un tube en carton qui permettra de manipuler les souris sans les soulever par la queue. – Les animaux seront habitués plusieurs jours avant les expériences aux branchements et débranchements de leurs implants afin de réduire leur stress. – Nous avons amélioré la technique d’implantation des optrodes et des plaques de base du miniscope afin de ne plus avoir à isoler les animaux après implantation. – En plus de l’utilisation d’anesthésiques adaptés et d’anti-inflammatoire, nous appliquons également un anesthésique local ainsi qu’un analgésique lors de la chirurgie et après la chirurgie en cas de signes de douleurs. Nous appliquerons également des points limites spécifiques aux chirurgies (hémorragie ou troubles respiratoires pendant la chirurgie, perte de poids trop importante ou signes de douleur ne s’améliorant pas malgré l’administration d’analgésiques en postchirurgie, etc.) au delà desquels les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Le choix de la souris est essentiel pour cette étude car son cerveau partage des similitudes fondamentales avec celui de l’être humain, particulièrement pour les fonctions complexes comme la mémoire. Les comportements que nous souhaitons étudier sont trop complexes pour justifier de l’utilisation d’espèces non-mammifères (drosophile, poisson-zèbre, etc.). De même, les méthodes in silico et in vitro ne sont pas assez développées pour modéliser ni la mémoire ni le fonctionnement du cerveau à si grande échelle. Par ailleurs, au vu du nombre d’animaux requis, les rongeurs (et plus particulièrement les souris) s’imposent de par la facilité et la stabilité de leur élevage. L’existance de modèles transgéniques chez la souris permet la réalisation de certaines de nos expériences grâce à la puissance de ces outils génétiques. Nous avons choisi d’étudier des souris adultes (âgées de plus de 7 semaines). À ce stade, la croissance de leur cerveau est terminée et sa structure est stable, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.
Identification de nouveaux traitements antiépileptiques et/ou antiépileptogéniques dans un modèle d’épilepsie du lobe temporal chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
10 050 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 150 réutilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à trois neurochirurgies, une épilepsie provoquée par injection d'un produit chimique dans le cerveau, puis des enregistrements de plusieurs heures et des injections répétées. Le projet teste les candidats médicaments d'industriels du médicament sur ce modèle d'épilepsie du lobe temporal. La justification de l'effectif de plus de dix mille souris tient en quelques lignes générales sur la réduction.
Objectifs
Les désordres de type épileptique représentent l’une des atteintes cérébrales les plus importantes au monde. En effet environ 1% de la population mondiale va dans sa vie avoir une crise d’épilepsie. Au niveau de l’activité cérébrale lors d’une crise de type épileptique, il est observé une modification transitoire du fonctionnement d’un ou plusieurs réseaux de neurones qui vont mal fonctionner. Malgré le développement de plus de 20 antiépileptiques lors des 30 dernières années, plus de 30% des patients épileptiques n’ont pas leur épilepsie contrôlée par les antiépileptiques. De plus, les principaux antiépileptiques utilisés en clinique montrent certes une efficacité sur les décharges épileptiques mais provoquent de nombreux effets secondaires (fatigabilité, somnolence, tremblement, troubles de l’apprentissage ou de l’humeur, prise ou perte de poids…). Il apparait donc comme critique de développer de nouveaux traitements antiépileptiques afin de traiter les patients épileptiques résistants aux traitements déjà existants et qui provoquent moins d’effets secondaires afin d’améliorer le contrôle de la maladie et la qualité de vie des patients. Dans ce projet, nous nous proposons de tester, sélectionner et valider de nouveaux candidats médicament développées par les industriels du médicament. Cette approche repose sur l’utilisation d’un modèle de souris reproduisant les principales caractéristiques d’une forme d’épilepsie humaine : l’épilepsie du lobe temporal. Une étude pharmacologique extensive de ce modèle de souris du lobe temporal a montré une certaine résistance à certains antiépileptiques. Ce modèle apparait donc comme un modèle pertinent pour la sélection et la validation de nouveaux traitements antiépileptiques. Ce projet facilitera le développement de candidats médicament antiépileptiques plus efficaces et présentant moins d’effets secondaires pour des patients souffrant d’épilepsies non contrôlées efficacement par les traitements actuels.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels contre l’épilepsie ne sont pas satisfaisants, il est donc nécessaire de valider de nouveaux candidats médicament. Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouveaux médicaments afin de pallier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles.
Procédures
Les animaux de ce projet vont subir jusqu’à 3 neurochirurgies d’environ une heure chacune, et potentiellement une chirurgie (pose de pompe). Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. Une première chirurgie permettra l’induction du modèle par injection de molécule chimique dans le cerveau (durée 2 minutes). Par la suite, les animaux pourront subir d’autres sessions de chirurgie pendant lesquelles les animaux vont avoir soit une seconde injection de matériel génétique ou de vecteur viral (quelques minutes), et/ou la mise en place d’un dispositif d’enregistrement, et/ou la mise en place de chambre implantable en sous cutané pour la délivrance des médicaments (quelques minutes). Les animaux pourront être soumis à des enregistrements (d’une dizaine d’heures maximum) une à deux fois par semaine. Lors de ces enregistrements des traitements pharmacologiques seront administrés : au maximum 2 injections (quelques minutes) par enregistrement (maximum 10h) avec un maximum de 10 enregistrements par plan d’étude croisé. Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du délai possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées une à 2 fois par jour, sur une durée maximum de 4 semaines. Des prélèvements sanguins (d'une durée de quelques minutes) pourront être faits en fonction du plan expérimental établi. Le nombre maximum de prélèvements pouvant être effectués est dépendant de la technique de prélèvement utilisée.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir une à trois neurochirurgies d’environ une heure comprenant la période d’anesthésie, et potentiellement une chirurgie « simple » pour la pose sous cutanée de pompe. Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Un état de mal-être pourra persister quelques heures après l’injection qui rend les animaux épileptiques. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir lors des injections des candidats médicament, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation due aux mécanismes d'action des molécules testées. Les prélèvements sanguins pourront produire une douleur modérée (piqure d’aiguille). La répétition des injections peut engendrer un stress léger lors de la manipulation de l’animal et une douleur modérée au point d’injection (piqure d’aiguille). Les enregistrements peuvent engendrer un stress léger du fait de la manipulation des animaux. Des pertes de dispositif permettant l’enregistrement des neurones du cerveau peuvent survenir, entrainant la mise à mort de l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dans le but de faire des prélèvements et des analyses du cerveau et des tissus. Si les animaux ne sont pas mis à mort, ils pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d'injection maximum n'a pas été atteint - le bien-être de l'animal le permet. Une procédure de ré-utilisation des animaux a été écrite et validée par le vétérinaire référent.
Remplacement
Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).
Réduction
Dans le cas des études de test pharmacologique, chaque animal sera testé avant et après les injections pour permettre de comparer les effets du médicament et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisé. Le nombre d’animaux a ainsi été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées
Raffinement
Les souris qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Le projet implique la mise en place d’un système d’enregistrement de l'activité des neurones chez le rongeur avec une chirurgie. Une injection d’analgésique sera faite avant la neurochirurgie et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille mesurant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Dès l’apparition d’un signe clinique d’alerte (poids, comportement...) nous nous réfèrerons à une grille de cotation interne spécifique permettant de prendre les mesures nécessaires en fonction des points limites identifiés afin de préserver le bien-être animal. L’évaluation est réalisée jusqu’à disparition du signe d’alerte. Lors des injections, une surveillance particulière est portée sur les animaux. Un arbre décisionnel peut être consulté en cas d’altération de l’état général de l’animal après l’injection afin de le soulager.
Choix des espèces
Dans ce projet nous utiliserons des souris. Le modèle a été développé chez la souris, car il reproduit les principales caractéristiques observées chez les patients souffrant d’épilepsie du lobe temporal. Ce modèle permet une quantification précise des crises pour évaluer l’effet des candidats médicament. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet. En effet, ce modèle a été développé chez des animaux adultes afin de travailler sur un cerveau mature qui restera stable tout au long de l’étude.
Etude du sommeil dans un modèle murin de la dystrophie myotonique MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
60 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, après implantation sous anesthésie d'électrodes cérébrales. Elles sont ensuite isolées deux fois une semaine dans des barils individuels pour les phases d'enregistrement. L'étude cherche à caractériser les troubles du sommeil dans un modèle murin de dystrophie myotonique. Elles sont tuées à la fin pour revérifier leur génotype et prélever le cerveau, les bénéfices espérés restant formulés au conditionnel.
Objectifs
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1, prévalence : 1/8000) est une maladie génétique qui affecte presque tous les organes, comme le cœur et les autres muscles, mais aussi le cerveau. Il en résulte des troubles neurologiques qui ont un impact délétère sur les patients DM1 et leurs familles. Outre des symptômes cognitifs handicapants tels qu'une déficience intellectuelle sévère dans la forme congénitale, on retrouve chez les patients DM1 des altérations motrices, des changements de la perception de l’espace, un déficit attentionnel, de la fatigue intellectuelle et quelques cas d'épilepsies. Une somnolence excessive pendant la journée est également un symptôme fréquent. Initialement focalisée sur le muscle, la recherche sur DM1 dispose de peu de données sur la pathologie cérébrale et les mécanismes à l'origine des troubles neurologiques, comme l'altération de la qualité du sommeil, ont été très peu ou pas étudiés à ce jour. Notre but est de caractériser, dans le modèle murin de la pathologie, les modifications du sommeil.
Bénéfices attendus
La description très détaillée du cycle veille-sommeil au travers du modèle murin apporteront des informations inédites sur la pathologie DM1. Nous pensons que les résultats obtenus aideront à la prise en charge de la maladie afin d'améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Les 60 souris auront une implantation chirurgicale, sous anesthésie générale, d'électrodes pour les mesures de l'activité électroencéphalographiques (EEG) et électromyographiques (EMG), chaque implantation durera au maximum une heure (en moyenne 45 minutes). Les souris seront placées en chambres d’enregistrement pour deux sessions d’une semaine d’enregistrement : une semaine après l’implantation chirurgicale et un mois après.
Impact sur les animaux
Outre l’injection intrapéritonéale de l’anesthésique qui pourra générer un léger stress, la chirurgie pratiquée ne devrait pas induire d’effets indésirables. L’effet indésirable attendu durant les phases d’enregistrement sera uniquement dû à l’isolement des animaux dans des barils individuels (les souris seront isolées deux fois 7 jours).
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de revérifier leur génotype. De plus, les cerveaux seront également prélevés pour des études ex vivo de biologie moléculaire, qui seront déterminées après l'analyse des résultats sur la qualité du sommeil.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro d’études du sommeil. L’étude du cycle veille-sommeil n'est possible que sur un animal entier, vigile et se comportant normalement.
Réduction
60 animaux au maximum devraient être utilisés. Nous prévoyons d’utiliser 12 animaux par groupe (souris transgéniques et leurs contrôles). L’obtention des données qualitatives et quantitatives sera analysée par des tests classiquement utilisés dans l’étude du sommeil sur ces effectifs. Si les 12 premières souris d'un groupe donnent des résultats de qualité, on n’utilisera pas les 3 souris supplémentaires de ce même groupe.
Raffinement
Des mesures appropriées seront prises pour suivre la pathologie (surveillance de la pousse des dents qui seront coupées si elles deviennent trop longues), pour minimiser le stress et mal-être individuel (hébergement enrichi et en groupe avant la chirurgie pour éviter un isolement social), pour gérer la douleur avant, pendant et après la chirurgie (médications par un anti-inflammatoire, surveillance de la cicatrisation au niveau de l’implant d’électrodes), et pour limiter l’isolement pendant les phases d’enregistrement électroencéphalographique avec des cages individuelles en espace ouvert pour empêcher que les congénères ne dégradent les implants et permettre aux animaux de se voir et sentir leurs odeurs.
Choix des espèces
Notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies comme celle que nous étudions. Les souris transgéniques créées en insérant le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie permettent d'étudier les mécanismes physiopathologiques. De plus, chez la souris adulte, l’anatomie, les réseaux neuronaux et la neurophysiologie sont maintenant bien caractérisés et de nombreux tests ont été développés pour mesurer le sommeil dans les meilleures conditions possibles et en réponse aux exigences de l'expérimentation animale. Le modèle souris possède enfin les grands principes d’organisation anatomique conservés chez l’homme et les souris ont une taille cérébrale qui permet d’étudier les oscillations locales de l'hippocampe ciblé dans notre projet. L'étude sera réalisée sur des souris âgées de 2 mois (plus précisément 8 semaines) afin d'être à un âge 1/ où le phénotype DM1 est bien établi et 2/ compatible avec l'implantation aisée des électrodes pour la mesure du sommeil.
Evaluation de nouvelles formulations de polyph?nols v?g?taux sur la physiopathologie de mod?les murins de scl?rose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
Exposées aux symptômes d'une sclérose en plaques induite, traitées par injections ou par voie orale, puis soumises chaque semaine à des tests de motricité et de douleur: 920 souris vont être utilisées, dans des procédures classées de souffrance légère à modérée. Moins de la moitié développe les symptômes de la maladie, les troubles moteurs et sensitifs pouvant durer plusieurs semaines. Le porteur teste de nouvelles formulations de polyphénols végétaux et annonce des bénéfices cliniques renvoyés au long terme. Les 920 souris sont mises à mort en fin de protocole, le cerveau et la moelle épinière prélevés pour analyse.
Objectifs
La scl?rose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune d?my?linisante chronique du syst?me nerveux central touchant 2,5 millions de personnes dans le monde et 110 000 personnes en France. Il s'agit d'une pathologie complexe ou des dysfonctionnements de la r?ponse immune entrainent des l?sions du syst?me nerveux central. En fonction de la localisation de ces l?sions, les troubles neurologiques peuvent ?tre divers : troubles de la marche, de l'?quilibre, de la vision mais ?galement troubles sensitifs. Bien que pr?sent chez plus de 75% des patients, ces sympt?mes douloureux sont tr?s peu ?tudi?s d?un point de vue physiopathologique et sont la plupart du temps r?sistant aux m?dicaments disponibles. L'objectif de ce projet est d'?valuer de nouvelles strat?gies th?rapeutiques adapt?es permettant d?am?liorer les sympt?mes douloureux associ?s ? la SEP.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet devrait permettre de confirmer une meilleure biodisponibilit? des mol?cules anti-oxydantes gr?ce aux nouvelles formulations test?es. L?objectif ? long-terme ?tant de d?velopper l?utilisation clinique des nouvelles formulations de polyph?nols en r?alisant l?ensemble des ?valuations pr?cliniques n?cessaires ? la mise en place d?essais cliniques futurs.
Procédures
Au cours de ce projet, deux mod?les de SEP chez la souris seront utilis?s pour ?valuer l?absence de toxicit? et l?efficacit? de nouvelles formulations de polyph?nols. Pour cela, les souris seront expos?es : 1) aux sympt?mes de la maladie, 2) ? des administrations r?p?t?es des m?dicaments, 2) ? des tests comportementaux r?guliers (toutes les semaines pendant 3 semaines ou tous les 2 mois pendant 5 mois, selon le mod?le ?tudi?) et en fin de protocole ? une mise ? mort afin de pr?lever les tissus cibles (cerveau et moelle ?pini?re) afin de comprendre l?effet des traitements au niveau du tissus. Les sympt?mes pr?sents dans nos mod?les sont principalement des troubles moteurs l?gers et des troubles sensitifs qui perdureront sur les 10 ? 20j de l'?valuation des traitements au moins chez les animaux ne recevant pas de traitement mais le placebo pour le premier mod?le et pendant environ 3 mois pour le second. Les animaux seront trait?s soit par injection intrap?riton?ale ou par voie orale. Enfin, les tests comportementaux r?alis?s seront constitu?s de 2 ? 4 tests ?valuant la motricit? et l?anxi?t? (au total 1h d??valuation correspondant ? nuisance l?g?res) et 2 tests ?valuant la douleur (au total 20 minutes d??valuation correspondant ? nuisance mod?r?e) Au total, 920 souris devraient ?tre inclus dans le projet, moins de la moiti? pr?senteront les sympt?mes de la maladie.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les nuisances attendues pour l'animal sont : - le stress physique lors des tests comportementaux d'intensit? l?g?re (1h par semaine pendant les 3 semaines d'?valuation ou 1h ? l??ge de 2, 5 et 8 mois selon les protocoles) et d'intensit? mod?r?e (20 minutes par semaine pendant les 3 semaines d'?valuation ou 20 minutes ? l??ge de 2, 5 et 8 mois selon les protocoles) - la douleur : d'intensit? mod?r?e 4 fois pendant moins d?une minute lors de l'induction du mod?le ou de la biopsie de queue pour le g?notypage des animaux transg?niques puis 1 fois par jour
Devenir
Au cours de ce projet, l'ensemble des souris utilis? (920) sera mis ? mort en fin de protocole, mais le cerveau et la moelle ?pini?re de tous les animaux inclus dans les protocoles de traitement (576) seront pr?lev?s afin de poursuivre les ?tudes sur les tissus cibles des traitements et de mieux caract?riser l'effet du traitement au niveau cellulaire apr?s avoir caract?ris? l'effet du traitement au niveau comportemental. Ainsi le maximum est fait pour obtenir le plus grand nombre de donn?es ? partir du nombre le plus restreint d'animaux utilis?s.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet sur les polyph?nols, toutes les formulations test?es chez l?animal auront ?t? pr?alablement ?valu?es lors d??tude in vitro sur des cultures cellulaires neuronales afin de tester leur innocuit? (test de viabilit?) et leur efficacit? (mod?le de toxicit? induite par le stress oxydant). N?anmoins, dans le cas de l'?valuation de nouvelles strat?gies th?rapeutiques, le remplacement du mod?le animal n'est pour le moment pas possible car au cours de ces exp?riences doivent ?tre ?valu?es : 1) la pharmacodynamie du m?dicament c'est ? dire sa capacit? ? modifier le fonctionnement de cellules conduisant ? la modification du fonctionnement d'un organe (dans le cas qui nous int?resse la correction d?anomalies du syst?me nerveux central permettant la restauration de fonctions neurologiques) ; 2) la pharmacocin?tique du m?dicament c'est ? dire sa capacit? une fois administr? ? l'animal de trouver sa cible (dans le cas qui nous int?resse le syst?me nerveux central) ? une concentration suffisamment importante pour provoquer l'effet pharmacodynamique attendu sans g?n?rer d'effets ind?sirables.
Réduction
Toutes les formulations test?es chez l?animal au cours de ce travail auront ?t? test?es pr?alablement sur des cultures cellulaires de lign?es neuronales tout d?abord pour leur absence de toxicit? puis pour leurs propri?t?s antioxydantes. Seules les meilleures formulations in vitro seront test?s chez l?animal. De plus les exp?rimentations sont organis?es de fa?on ? obtenir des r?sultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d?animaux possible gr?ce : 1) au calcul de taille d?effet en amont du projet par l?analyse de donn?es pr?liminaires, 2) l?utilisation de tests statistiques rigoureux adapt?s au protocole exp?rimentale, 3) la r?alisation des exp?riences par blocs au cours desquels 3 formulations seront test?es vs 1 groupe placebo ce qui permettra de r?duire le nombre de groupes placebo.
Raffinement
En plus des r?gles r?glementaires du bien-?tre animal r?glementaire, en cas de comportement anormal ou dans le cadre du suivi sp?cifique ? la mise en place des proc?dures, une ?valuation quotidienne en utilisant une grille de scoring sera r?alis?e et selon les scores obtenus (en fonction de l?intensit? et de la dur?e des probl?mes), des r?ponses standardis?es et obligatoires seront mises en place d?butant par une surveillance renforc?e des animaux, puis l?intervention du v?t?rinaire r?f?rent pour la mise en place d?un traitement adapt? et pouvant aller jusqu?? la mise ? mort de l?animal si la d?gradation observ?e est trop s?v?re ou irr?versible.
Choix des espèces
Le choix de l?esp?ce s?est port? sur la souris car les deux mod?les utilis?s dans ce projet mod?lisent de fa?on fid?le (sympt?mes et l?sions du syst?me nerveux central) deux formes diff?rentes de la scl?rose en plaques. Ils permettent donc de tester nos m?dicaments potentiels dans en s?approchant le mieux possible de la pathologie humaine. Ce choix est ?galement support? par l?existence de nombreux outils d?analyse (comportement, imagerie, ?) d?velopp?s pour cette esp?ce. Dans la proc?dure 1, les souris seront utilis?es au stade de jeune adulte (6-8 semaines) afin de mimer la physiopathologie de la scl?rose en plaques qui est une maladie neurologique du jeune adulte diagnostiqu?e la plupart du temps avant 30 ans. Dans la proc?dure 2, les traitements seront initi?s ? l?apparition des premiers sympt?mes chez des souris ?g?es de 3 mois. Pour cela, le traitement sera r?alis? chez des animaux ?g?s de 3 mois (? l?apparition des premiers sympt?mes) ? 8 mois avec des ?valuations comportementales ? l??ge de 3 (avant le traitement), 5 et 8 mois) suivies d?analyse sur les pr?l?vements tissulaires. L'utilisation de ce second mod?le permettra d'?tudier les phases plus tardives de la maladie.
Effets anti-stress d’un produit d’origine animale (contrôle de lots de production), administré en aigu par voie orale, dans le test d’enfouissement défensif conditionné (EDC) chez le rat mâle Wistar adulte. (Acronyme : EDC-LPL-2026-2031)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour contrôler les lots de production d'un produit anti-stress d'origine animale, 1 080 rats mâles vont être soumis à une administration orale unique puis à un test d'enfouissement défensif conditionné, dans des procédures classées modérées. Le porteur affirme qu'aucune procédure n'engendrera de douleur, alors que le test repose sur l'exposition à une source aversive et que la gravité déclarée reste modérée. Les rats sont ensuite réutilisés pour la formation aux gestes techniques, ceux qui ne le sont pas étant mis à mort. La finalité est un contrôle qualité commercial reconduit d'année en année.
Objectifs
Les troubles anxieux et liés au stress sont particulièrement fréquents dans les pays industrialisés. Il est estimé que 13 à 22% des habitants de ces pays développeront une pathologie anxieuse au cours de leur vie. Selon l'American Institute of Stress, ce problème est à l'origine de 75 à 90% des nouvelles consultations médicales et de 60 à 80% des accidents de travail. Les traitements disponibles concernant l’anxiété et le stress présentent de nombreuses limites dues aux effets secondaires importants et/ou à l’efficacité limitée. En effet, différents traitements médicamenteux peuvent être prescrits (anxiolytiques, anti-dépresseurs) mais l’indication de ces traitements n’est pas toujours prioritairement l’effet anti-stress et ils ne sont pas dénués d’effets secondaires. Dans ce contexte, la recherche de nouveaux produits plus efficaces représente donc un enjeu sociétal et économique majeur.
Bénéfices attendus
L'enjeu de ce projet est d'évaluer et de vérifier l'efficacité de traitements dans la lutte contre le stress et l'anxiété qui sont développés pour une utilisation chez l'Homme et chez l'animal.
Procédures
Dans cette étude, un traitement sera administré une fois par jour sur les 1080 animaux vigiles (éveillés) par voie orale et ce une seule fois. L’administration ndu traitement e prend pas plus de 15 secondes par animal et ne nécessitent pas une anesthésie. Un test comportemental sera réalisé une fois pendant 5 minutes sur ces 1080 animaux pour évaluer les effets des traitements sur le stress et l'anxiété. Aucune procédure n’engendrera de douleur.
Impact sur les animaux
Les traitements administrés par voie orale s’effectueront sur animal vigile. De plus, l’administration orale sur animaux vigiles limite le risque de fausses routes et aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire, n’est nécessaire et ne sera donc utilisée. Le test comportemental s’effectuera sur animal vigile sans aucune médication, analgésique ou antiinflammatoire, pour ne pas perturber l’activité des animaux. Le test comportemental (enfouissement défensif conditionné) réalisé s’appuie sur le comportement naturel des rongeurs qui consiste à projeter le matériel présent sur le sol de leur environement vers une source potentiel de danger aversif.
Devenir
Lorsque cela sera possible, les animaux seront réutilisés pour la formation aux gestes pratiques au sein de l’établissement. Tous les animaux non réutilisés seront mis à mort dans des conditions éthiques.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet, les études in silico (modélisation informatique) ou in vitro ne permettant pas de prédire ou d’évaluer les effets sur l’anxiété d’un traitement. Le modèle rongeur est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre ces pathologies. La complexité des mécanismes mis en jeux ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rongeur. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Les données historiques de notre laboratoire, une étude de puissance statistique en amont, et notre expérience du modèle, permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non des traitements testés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles et isolés de tous bruits extérieurs et auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Les animaux seront hébergés dans une pièce en cycle de lumière inversé avec une température qui sera maintenue à 22±2°C et une hygrométrie de 50±20%. Les animaux auront une semaine d’acclimatation aux conditions de laboratoires avant de procéder au test comportemental, soit moins de deux semaines en tout. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la phase de test comportementale. Les expérimentateurs sont formés et habitués aux évaluations comportementales et prendront toutes les dispositions nécessaires à la bonne réalisation de celle-ci. Les traitements seront effectués sur animaux vigiles par du personnel entrainé ayant les compétences requises pour effectuer ces gestes et une observation régulière des animaux sera effectuée après la réalisation de chaque traitement. Des points limites adaptés sont fixés, si nous constatons l'atteinte d'un de ces points limites, l'animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
Le modèle rat est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre le stress. De plus, ce modèle est déjà très utilisé et validé dans les tests défensifs visant à étudier les comportements de type anxieux. Des rats mâles adultes seront utilisés afin de pouvoir comparer les données de cette étude à l'ensemble des données déjà disponibles et validés pour le contrôle de production des lots de produits précédents.
Modèle murin de consommation chronique d’alcool : Mise en place et étude d’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune hébergée seule jusqu'à dix-sept semaines pour mesurer sa consommation d'alcool. Rendues dépendantes, elles reçoivent des candidats médicaments par voie orale, intraveineuse ou intrapéritonéale, avec des prélèvements sanguins répétés puis, à la demande du client, une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le projet est présenté comme une prestation proposée à des laboratoires privés ou académiques, la finalité commerciale précédant l'apport scientifique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun test ne rend compte du comportement sur un 'organisme vivant entier' et conclut au recours 'nécessaire' à la souris.
Objectifs
Selon l’OMS, le trouble lié à la consommation d'alcool touche environ 283 millions de personnes, à l’échelle mondiale. En France, il est estimé à 1.5 millions de personnes et environ 70 000 personnes meurent des conséquences directes ou indirectes de l’alcool. L’alcoolisme est donc un problème de santé majeur pour lequel aucun traitement satisfaisant n’existe actuellement. Le projet présenté ici a pour objectif de mettre en place un modèle murin de consommation d’alcool et d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments dans le cadre d’une prestation proposée à des laboratoires privés ou académiques. L’alcoolisme chronique, appelée alcoolodépendance, est le fait de présenter une addiction à l’alcool sous la forme d’une alcoolisation quotidienne et régulière tout au long de la journée pour maintenir un taux constant d’alcool dans le sang. Tout comme la drogue, la dépendance à l’alcool est définie comme le besoin d’en consommer pour maintenir un état auquel l’organisme s’est habitué. Cette dépendance s’installe souvent sur le long terme et de manière insidieuse. L’objectif de ce projet sera : 1) de mettre en place un test murin de consommation chronique d’alcool. 2) d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments, ayant déjà démontré leur pertinence sur la dépendance liée à la consommation d’alcool grâce à d’autres tests réalisés en amont de ce projet (in vitro, organoïdes ou autres). Actuellement, il existe plusieurs traitements de première intention, utilisables dès que possible après l'arrêt de la consommation d'alcool dans l'objectif de réduire l'appétence pour l'alcool et ainsi les risques de rechute. S’ils ont une efficacité démontrée, ils ont un effet d’une amplitude modérée et présentent de nombreux effets indésirables (nausées et/ou vomissements, céphalées, sédation ou insomnie, anxiété, nervosité...). Ce projet est donc pertinent pour le développement de nouveaux candidats médicaments pouvant améliorer la qualité de vie des personnes dépendantes de l’alcool.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mettre en évidence l’efficacité de potentiels nouveaux candidats médicaments dans un modèle murin d’alcoolisme. Les résultats obtenus, s’ils sont positifs, permettront la poursuite du développement de ces candidats médicaments dans la lutte contre l’alcoolisme.
Procédures
Chaque étude aura pour durée maximale 17 semaines. Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (1 à 2 minutes selon le type d’administration). La fréquence d'administration dépendra des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments, au maximum 2 administrations par semaine pour la voie intraveineuse sur 9 semaines, 2 administrations par jours pour la voie orale sur 4 semaines ou 1 administration par jour pour les voies orales, intrapéritonéales, ou sous cutanées sur 9 semaines. Dans le cas d’une demande précise du donneur d’ordre, les animaux (à la fin de l’étude) peuvent être soumis à une perfusion intracardiaque (entre 5 et 20 min selon le débit de perfusion) sous anesthésie générale précédée d’une analgésie. Des prélèvements sanguins submandibulaires sur animaux vigiles (1 fois toutes les deux semaines maximum) ou intracardiaque sur animaux anesthésié (1 seule fois en fin d’étude) pourront être réalisés.
Impact sur les animaux
Les animaux sont stabulés individuellement dès leur arrivée dans nos locaux et jusqu’à la fin de l’étude soit au maximum 17 semaines. Ce mode d’hébergement est nécessaire à la mesure précise de la consommation individuelle d’alcool. La consommation d’alcool peut engendrer des signes comportementaux d'intoxication (non attendu dans le projet, les animaux ayant en permanence de l’eau à disposition). Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. Avant de réaliser des études dans le cadre de ce projet, nous nous assurerons auprès du demandeur que des études in vitro et/ou vivo auront été préalablement réalisées afin que les candidats médicaments soient administrés à des doses ne présentant pas de toxicité. Les futurs candidats médicaments peuvent avoir différents modes d’administration. Une administration (per os, sous-cutanée, intrapéritonéale) d’un candidat médicament entraîne une contention de l’animal qui peut induire un stress. Pour une administration Intraveineuse effectuée dans la veine caudale, les souris seront placées dans un tube de contention induisant un stress pour l'animal. Les animaux pourront être soumis à un prélèvement de sang submandibulaire réalisé sous anesthésie générale. Si le donneur d'ordre souhaite réaliser des études complémentaires sur les organes des animaux (ex : histologique), une perfusion intracardiaque sera réalisée sur des animaux anesthésiés et ayant reçu au préalable un analgésique.
Devenir
Afin d’effectuer des analyses complémentaires, l'ensemble des animaux sont soumis à la fin de l’expérience à des prélèvements sanguins ou d’organes.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier la consommation d’alcool. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, permettant de conclure de manière fiable. Etant donné la variabilité de la consommation d’alcool chez la souris, 12 animaux par groupe sont prévus afin d'assurer une analyse statistique pertinente. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.
Raffinement
Une attention particulière sera portée aux enrichissements du milieu pour réduire au maximum les effets de l’isolement. De plus, les animaux sont stabulés sur des portoirs conventionnels en cages transparentes, de cette façon les animaux peuvent voir les congénères des cages adjacentes et ne sont pas isolé olfactivement. Toutes les expériences seront réalisées après une période d’acclimatation de 14 jours. Une observation quotidienne sur des caractéristiques spécifiques (physiologie clinique, aspect général, comportement...) sera effectuée durant la période d’expérimentation par du personnel formé au soin. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs critères prédéterminés (repérés le plus précocement possible grâce à l'observation et à l'appui d'une grille du bien-être animal) sera mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est largement utilisée pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer de façon fiable les doses administrables à l'homme dans le cadre d’essais cliniques ultérieurs. Le choix de la souris C57bl/6 a été fait suite à une étude bibliographique approfondie qui démontre que cette lignée de souris à une appétence naturelle pour l’alcool. Elles consomment spontanément l’alcool qui leur est proposé contrairement à d’autres lignées (comme DBA/2 ou BALB/C) qui le rejettent. Cette préférence stable permet de modéliser la consommation volontaire, un aspect essentiel pour reproduire le comportement humain vis-à-vis de l’alcool. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux âgés de plus de 3 semaines et de 24 mois maximum. Les modèles sont susceptibles d’être utilisés pour l’étude de produits potentiellement actifs chez le jeune, l’adulte ou la personne âgée.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique de différentes stratégies de thérapie génique dans le modèle murin de la maladie de Pelizaeus Merzbacher.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Génétiquement modifiées pour reproduire une maladie de la myéline, une partie des 376 souris développe tremblements, troubles moteurs puis convulsions et meurt vers l'âge de trois mois. Elles vont être utilisées dans des procédures allant jusqu'à un niveau de souffrance sévère pour 96 d'entre elles, toutes tuées à l'issue. Après une injection de thérapie génique sous anesthésie, elles passent des tests moteurs et une IRM de deux heures. Le porteur définit des points limites, mais garde une partie des animaux au-delà de deux mois pour suivre la survie, jusqu'à l'aggravation de la maladie.
Objectifs
La maladie de Pelizaeus Merzbacher est un défaut héréditaire de formation de la myéline (membrane isolante permettant le transport du message nerveux dans les neurones) du système nerveux central. Cette maladie se caractérise chez les patients de sexe masculin par une altération précoce du développement psychomoteur (inférieur à 6 mois de vie). Au cours des premières années de myélinisation active, le manque de force musculaire est associé à des signes neurologiques progressivement modifiés par la maturation du système nerveux. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement pour cette pathologie. L’objectif de ce projet sera de tester sur un modèle animal de la pathologie (souris génétiquement modifiées) différentes stratégies thérapeutiques basées sur une approche de thérapie génique.
Bénéfices attendus
La maladie de Pelizaeus-Merzbacher est une maladie génétique rare de la famille des leucodystrophies. Sa fréquence est de 1 pour 100 000 naissances. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour cette pathologie. Ce projet pourrait permettre d’établir la preuve de concept de l’efficacité d’une des approches de thérapie génique proposées, de valider la dose optimale pour un traitement afin de mener un projet de plus grande envergure à plus long terme. Ainsi ce projet pourrait contribuer à proposer un essai thérapeutique chez les enfants souffrant de la maladie de Pelizaeus Merzbacher et pouvoir ainsi proposer un traitement chez l’Homme.
Procédures
Sur un total de 376 animaux, 312 animaux recevront une injection sous anesthésie générale (durée 5 min au total, une fois) et 64 serviront de contrôles non injectés Une partie d’entre eux (280) participera ensuite à 3 tests comportementaux afin d’évaluer les déficits locomoteurs. 2 sessions de tests seront réalisées (à 1 mois puis 2 mois) et pour chaque session les tests seront répartis sur 3 jours. Nous aurons un jour avec un test évaluant la motricité (3 essais, 4 minutes maximum par essai), puis un jour avec un test évaluant la mobilité générale (2 minutes par test, 1 essai) et enfin un jour avec un test d’évaluation de la force musculaire (2 minutes par test environ, 1 essai). Une partie de ces animaux aura ensuite un examen d’imagerie par résonance magnétique sous anesthésie générale (une fois, 2h maximum). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les prélèvements d’intérêt.
Impact sur les animaux
La lignée de souris génétiquement modifiée utilisée dans le projet présentera un phénotype dommageable chez certains animaux se traduisant par l’apparition de tremblements dès 12 jours, de troubles moteurs dès 4-5 semaines et des crises de convulsion à partir de 2 mois entrainant leur décès vers l’âge de 3 mois. Les troubles moteurs pourront engendrer un stress et de potentielles pertes de poids pour l’animal. Les anesthésies générales réalisées pour administrer la thérapie génique et pour l’imagerie par résonance magnétique pourront engendrer des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de difficultés cardiaque et respiratoire. L’injection de la thérapie génique sera associée à des risques d’inconfort au niveau de la zone d’injection, de saignement après injection et un risque rare de lésion oculaire. Les tests comportementaux pourront générer un stress en lien avec le changement d’environnement et le test en lui-même.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont réalisés post-mortem pour pouvoir répondre à notre objectif scientifique
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la maladie de Pelizaeus Merzbacher. Nous avons donc besoin de modèles animaux vivants permettant de reproduire la maladie pour l’étudier et surtout pour évaluer l’effet bénéfique d’approches thérapeutiques telles que la thérapie génique. Un modèle animal de choix existe déjà pour étudier cette maladie, il s’agit d’une lignée de souris génétiquement modifiée qui reproduit avec une bonne fiabilité la majorité des symptômes décrits chez les patients.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire. De ce fait un nombre de 20 à 24 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de prendre en compte la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 376 souris sera nécessaire pour ce projet. De plus nous réaliserons ce projet par étape nous permettant de n’utiliser que le nombre strictement nécessaire d’animaux, notamment si la première étape ne permet pas d’obtenir des résultats concluants les étapes suivantes en seront pas initiées. L’ensemble des résultats sera analysé à l’aide des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’eau et de croquettes à volonté, ainsi que d’un enrichissement de leur environnement composé à minima d’un carré de coton pour nidifier et d’un bâtonnet de bois à ronger. Ils seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie celle-ci sera transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe afin de mettre en place une prise en charge rapide et adaptée pour l‘animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Une partie des animaux utilisés dans le projet présentera un phénotype dommageable, pour sa prise en charge nous faciliterons leur accès à la nourriture dès le sevrage en leur mettant à disposition des croquettes directement en fond de cage voir de l’eau gélifiée en supplément si nécessaire. Tous les animaux seront pesés à minima une fois par semaine, puis 2 fois par semaine pour ceux conservés au-delà de 2 mois. A partir de cet âge de 2 mois un suivi quotidien pour chaque animal avec un test de retournement permettra de valider son autonomie à pouvoir se déplacer et s’alimenter. L’administration de la thérapie génique et l’imagerie par résonance magnétique seront réalisées sous anesthésie générale afin de réduire le stress et bénéficier d’une bonne immobilité de l’animal. Nous prendrons en charge les risques associés à ces anesthésies en maintenant la température des animaux tout au long de leur anesthésie (chambres d’induction et de réveil chauffées, tapis chauffant), en appliquant un gel oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire ou inconfort post-injection de la thérapie (appliqué après l’administration de la thérapie), et en surveillant visuellement la profondeur de l’anesthésie pour adapter si nécessaire le pourcentage d’anesthésique à chaque animal. Pour les tests comportementaux les animaux bénéficieront d’une période d’habituation de 30 minutes à la pièce d’expérimentation avant chaque test. Les tests seront répartis sur 3 jours afin de laisser un temps de repos aux animaux entre chaque test. Pour le tests nécessitant 3 essais les animaux bénéficieront d’une période de repos de 30 minutes entre chaque essai.
Choix des espèces
La souris est une espèce largement utilisée pour modéliser les pathologies humaines. Son génome est bien connu et des outils sont disponibles pour le modifier. Ainsi, une lignée de souris génétiquement modifiées existe déjà pour modéliser la maladie de Pelizaeus Merzbacher. Celle-ci permet de reproduire la majorité des symptômes rencontrés chez les patients et nous permettra donc d’évaluer l’efficacité thérapeutique de notre stratégie de thérapie génique. Les souris seront utilisées juste après leur sevrage et analysées jusqu’à l’âge de 2 mois pour la majorité avant l’apparition des symptômes invalidants. Seul un groupe de souris permettant d’apprécier la survie sur le meilleur de nos traitements sera gardé au-delà de l’âge des 2 mois avec suivi attentif. Le choix de l’âge d’injection est justifié du fait de la présence des premiers signes de la maladie sans pour autant que celle-ci soit trop avancée. Le choix de l’âge de l’euthanasie à deux mois permet d’une part de pouvoir voire un effet moléculaire optimal de la thérapie génique administrée mais également de constater ces effets avant la progression de la maladie. En effet prélever les animaux en fin de vie, quel que soit leur âge ne nous montrerait que l’état final de l’animal avant la mort lié à la progression de la maladie, c’est-à-dire que tous les animaux en fin de vie devraient avoir les mêmes caractéristiques finales.
Etude d’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans deux modèles de souris de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), ou maladie de Charcot (MODIFICATIONS)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Génétiquement modifiées pour développer une forme de sclérose latérale amyotrophique, 3 030 souris perdent progressivement l'usage de leurs membres postérieurs, jusqu'à la paralysie pour l'une des lignées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des administrations répétées de candidats médicaments par voie orale, intraveineuse ou intrathécale sous anesthésie, des prélèvements de sang mensuels et une pose de pompe sous-cutanée. Toutes sont tuées, une partie dès l'atteinte d'un point limite avant la fin, pour prélever leurs organes. Le porteur revendique le recours à l'animal comme "incontournable", faute de méthode évaluant les symptômes moteurs de la maladie.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), appelée couramment maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative qui se caractérise par une dégénérescence progressive des neurones du cortex moteur, des motoneurones du tronc cérébral et de la moelle épinière. On distingue des formes sporadiques et des formes familiales. Quelle que soit la forme de la maladie, les signes cliniques sont identiques. Cependant, en fonction de la région initiale d’atteinte, on distingue deux variétés de SLA : (1) une forme spinale qui affecte tout d’abord les motoneurones de la moelle épinière et qui est caractérisée par une atteinte de la motricité des membres supérieurs et inférieurs; et (2) une forme bulbaire, affectant les motoneurones du tronc cérébral et provoquant des troubles de la parole et de la déglutition. Au cours des 25 dernières années, la recherche sur les patients SLA a révélé des mutations dans plus de 20 gènes, dont 2 d’entre eux sont les plus affectés et ont été associés à des cas familiaux de la SLA. Des mutations de ces 2 gènes ont été associées à la neurodégénérescence observée dans la SLA. Par conséquent, ces deux gènes font actuellement l’objet de nombreuses recherches, notamment pour le développement de stratégies thérapeutiques. Afin d’étudier la progression de la maladie et d’aider au développement de nouveaux candidats médicaments, des modèles de souris transgéniques ont été générés pour mettre en évidence les mécanismes physiopathologiques responsables de la dégénérescence moto-neuronale observée dans la SLA. Par conséquent et pour étudier deux voies fortement représentés chez les malades de la SLA, nous utiliserons dans ce projet deux modèles de souris transgéniques dont les deux gènes d'intérêt ont été modifiés et présentant des signes pathologiques qui reprennent la pathologie humaine sous sa forme spinale avec une dégénérescence progressive des motoneurones entraînant un déficit moteur progressif. Les souris présentent, à partir de 6 semaines, des tremblements des membres inférieurs, des signes de faiblesse musculaire ainsi que des déficits moteurs qui s’aggrave avec l’âge. Ces deux modèles fournissent des outils précieux pour identifier les mécanismes sous-jacents à la pathogenèse SLA et pour étudier les stratégies thérapeutiques à mettre en place pour arrêter la maladie, et dans notre cas, d’étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Bénéfices attendus
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), ou maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte des motoneurones à la fois centraux et périphériques. Il s'agit de la plus fréquente des maladies du motoneurone de l'adulte (environ 2.5 malades pour 100000 habitants en France). Son diagnostic repose avant tout sur des éléments cliniques et l'exclusion d'autres pathologies. Ainsi, le délai entre l'apparition des symptômes et la pose du diagnostic est souvent long (9 à 13 mois), alors même que l'évolution de la maladie est rapide, avec un décès survenant généralement dans les 3 à 5 ans (le plus souvent par détresse respiratoire). Il s'agit d'une pathologie complexe et hétérogène dont les processus physiopathologiques sont encore mal compris. Les seuls traitements actuellement utilisés chez les patients atteints de SLA ne permettent, tout au plus, qu'une amélioration mineure de la survie, avec des résultats controversés. Ainsi, ce projet est utile pour avancer dans le traitement de cette maladie et donc le développement de nouveaux candidats médicaments.
Procédures
Dans ce projet, 2 lignées d’animaux génétiquement modifiés à phénotype dommageable sont étudiées. Les deux lignées sont des modèles de la sclérose latérale amyotrophique (ou maladie de charcot) mais ne développent pas la maladie de la même façon puisque les voies altérées dans les deux lignées sont différentes. Pour la lignée SOD1, les animaux développent des déficits moteurs qui évoluent tout au long de la vie de l’animal pour atteindre une paralysie des membres postérieurs et une diminution significative du poids (points limites définis dans le projet). Pour la lignée TDP-43, les animaux développent des déficits moteurs qui évoluent assez rapidement et se limite au bout de quelques semaines à une atteinte des membres postérieurs induisant une démarche laborieuse. Contrairement à la lignée SOD1, aucune paralysie des membres postérieurs n’est observée, les animaux ne montrent pas de perte de poids significative et il n’y a pas de mort prématurée observable sur la durée de notre projet. Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (1 à 2 minutes selon le type d’administration hormis pour les administrations intrathécales (MODIFICATION) ET SOUS-CUTANÉES CONTINUES PAR POMPE OSMOTIQUE. Les fréquences d'administration dépendront des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments. La fréquence et la durée maximales d'administration sont définies selon le type d'administration utilisée de la façon suivante : -Administration orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée : 1 administration par jour pendant 3 mois -Administration intraveineuse : 2 administrations par semaine pendant 3 mois -Intranasale : 1 administration par jour pendant 6 mois -Intrathécales 3 administrations maximum réalisées sous anesthésie générale à une fréquence d’une par mois (temps minimal entre chaque administration). La durée de l’administration sera de 15-20 min environ. MODIFICATION : -SOUS CUTANÉE CONTINUE PAR IMPLANTATION DE POMPE OSMOTIQUE 15 MINUTES ENVIRON PAS PLUS DE 3 RENOUVELLEMENT AVEC 2 SEMAINES ENTRE CHAQUE RENOUVELLEMENT MINIMUM. Des prélèvements de sang à la veine mandibulaire seront réalisés tous les mois (durée environ 2 min). MODIFICATION : UN PRELEVEMENT DE LIQUIDE CEPHALO-RACHIDIEN POURRA ETRE REALISE SOUS ANESTHESIE GENERALE ET ANALGESIE JUSTE AVANT LA MORT DE L’ANIMAL (DUREE DU PRELEVEMENT 20 MIN MAXIMUM).
Impact sur les animaux
Ces modèles de souris transgéniques présentent des phénotypes dommageables avec une dégénérescence progressive des motoneurones entraînant un déficit moteur. Pour une des lignées, les animaux développent des difficultés progressives de mouvements des membres postérieurs, de perte de poids significative ou de mort prématurée avant la fin de l’étude. Les animaux issus de l'autre lignée utilisée dans ce projet développent également des difficultés progressives de mouvements des membres postérieurs allant jusqu’à la paralysie complète. Chez le fournisseur, les animaux à l'âge de 10 jours sont soumis au prélèvement d'un petit morceau de queue utilisé comme matériel biologique pour le génotypage. Lors du transport des animaux par avion d'une durée maximale de 5 jours (entre le moment où les animaux sortent de l’animalerie du fournisseur et celui où ils arrivent dans nos locaux), les animaux jeunes (3-4 semaines au minimum soit après sevrage) peuvent présenter un déficit moteur précoce léger dans le cas de la première lignée. Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. Dans notre projet, des études in vivo ont déjà été réalisées au préalable avec les candidats médicaments et ne montrent aucune toxicité particulière de ceux-ci. Les futurs candidats médicaments peuvent avoir différents mode d’administration. Une administration (intra-veineuse, per os, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intranasale) d’un candidat médicament entraîne une contention de l’animal qui peut induire un stress particulier. L’administration dans la colonne vertébrale sous l'arachnoïde au niveau lombaire (intrathécale) (MODIFICATION) ET L’IMPLANTATION D’UN DISPOSITIF DE DIFFUSION DE CANDIDAT MÉDICAMENT EN SOUS-CUTANÉ seront réalisées sous anesthésie générale précédée d’une analgésie. Ces actes peuvent entrainer une perte de poids des animaux ainsi qu'une légère déshydratation durant 24 à 48h. Un risque de lésion de la moelle épinière est possible dans moins de 5% des cas (MODIFICATION) POUR L’ADMINISTRATION INTRATHÉCALE. Un stress peut également être présent lors de la manipulation des animaux pour leur passage dans les différents tests moteurs. Des prélèvements de sang au niveau de la veine submandibulaire seront réalisés avec un intervalle minimal d’un mois sur animaux anesthésiés.
Devenir
En fin d’étude, pour des analyses sérologiques, histologiques, moléculaires et immunohistochimiques, les animaux seront soumis à différents types de prélèvements (organes) post mortem. L’ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l’étude comportementale sera mis à mort.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte d’un grand nombre de ces phénomènes, et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer les symptômes moteurs de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc incontournable pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.
Réduction
Les études internes précédemment réalisée dans notre EU sur les tests moteurs utilisés dans ce projet avec d’autres lignées ont montré qu’un nombre d’animaux égal à 15 par groupe est nécessaire pour observer des effets significatifs des candidats médicaments dans les tests comportementaux utilisés dans cette étude. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés. Les données seront présentées en moyenne et erreurs standard à la moyenne (SEM). Les différences entre les groupes seront évaluées à l’aide de tests paramétriques. Les tests paramétriques seront utilisés car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Des tests non paramétriques pourront être utilisés en deuxième intentions. Le choix des tests paramétriques ou non paramétriques sera fait en fonction des résultats obtenus dans le test de normalité. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, en plus des analyses comportementales, des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés sur les animaux pour des études complémentaires.
Raffinement
(MODIFICATION) L’éleveur des animaux a obtenu la certification AAALAC et ISO9001. La certification AAALAC oblige à suivre une réglementation internationale très stricte en matière de bien-être animal et du principe des 3R. Une période d’habituation sans expérimentation est laissée aux animaux d’au minimum une semaine après leur arrivée. Durant cette période d'habituation, les animaux sont soumis à une évaluation journalière suivant la grille scoring mais aucune pesée de sera réalisée pour éviter un stress supplémentaire lié à la préhension de l'animal en surplus du stress récent induit par le transport et le changement d'environnement. Les souris seront ensuite pesées une fois par semaine. Lorsqu’une perte de poids sera observée, la fréquence des pesée pourra être augmentée en fonction de la perte de poids et de l‘apparition des déficits moteurs. Par ailleurs, leur état général sera évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un des points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Des procédures particulières seront mises en place suivant l’atteinte moteur des animaux (alimentation hydratée et hydrogel placé dans le fond de la cage). Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux. Pour les procédures chirurgicales, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Après ces chirurgies et afin de faciliter leur convalescence, de l’hydrogel sera placé dans le fond de la cage pour les premières 24h et plus si besoin. Le poids des animaux sera suivi quotidiennement pendant une période minimale de (MODIFICATION) 48 OU 72h SELON LA CHIRURGIE et jusqu’à reprise du poids initial. Des procédures particulières pourront être mise en place en cas d’altération de l’état physique des animaux après la chirurgie (mise en place d’une analgésie, alimentation hydratée et hydrogel dans le fond de la cage en concertation avec le vétérinaire). Une période d’au moins (MODIFICATION) 7 À 10 jours de récupération sera respectée (MODIFICATION) SELON la chirurgie avant que les animaux ne soient soumis à un autre test de comportement.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments, et les données obtenues nous permettent maintenant de calculer les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette pathologie dans toute sa complexité. En effet, les animaux sont essentiels pour modéliser les mécanismes physiopathologiques de la SLA. Ils sont donc nécessaires pour évaluer l'efficacité des candidats médicaments. Au minimum 5 semaines pour la lignée TDP-43 et 12-13 semaines pour la lignée SOD1 au début de l’analyse comportementale. Dans ce projet, l’expérience et l’administration de traitements sont initiés à un moment où les animaux sont jeunes, avant le début des premiers symptômes pour pouvoir commencer à administrer le candidat médicament au moment où les premiers symptômes de la maladie apparaissent. Le génotypage est effectué chez le fournisseur à l'âge de 10 jours. Ils partiront de chez lui, après sevrage, à l'âge de 3-4 semaines pour la lignée TDP-43 (au minimum) et plus tardivement pour les souris SOD1 (au minimum 10 semaines).
Evaluation d’une approche par thérapie génique dans un modèle murin de Charcot-Marie-Tooth 4C. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Soumises à des tests répétés sur rotarod, de force musculaire et à des mesures par électrodes implantées sous la peau, 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces souris reproduisent la maladie de Charcot-Marie-Tooth et reçoivent une injection unique d'un vecteur de thérapie génique sous anesthésie. Les tests, réalisés deux à trois fois selon les animaux, précèdent le prélèvement des organes après mise à mort. Le porteur espère un effet transposable à l'humain, un bénéfice qui reste conditionné aux résultats obtenus sur ce modèle.
Objectifs
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une neuropathie d'origine génétique qui se manifeste dès l'enfance ou à l'âge adulte par une faiblesse musculaire et une diminution de la sensibilité des pieds et des mains. Ces manifestations sont la conséquence d'une atteinte des nerfs périphériques des jambes et des bras. Elle est accompagnée d'une atrophie musculaire progressive. La CMT touche environ 1 personne sur 2 500 dans la population générale à la naissance. Le modèle murin étudié développe les mêmes symptômes que ceux décrits chez l’Homme : faiblesse musculaire, diminution de la sensibilité au niveau des pattes. Contrairement à l’homme ces souris ne présentent pas de scoliose. Ces manifestations sont la conséquence d’une atteinte des nerfs périphériques. Ces souris ont un développement et une durée de vie comparable à celles de souris génétiquement non modifiées Ce modèle murin permettra d’étudier les effets du traitement par transfert de gène sain. Dans un premier temps, nous évaluerons les effets de cette thérapie avec des tests comportementaux : force musculaire, position des pattes, sensibilité à un stimulus électrique (électromyographie). Dans un second temps, une analyse biomoléculaire et histologique sera réalisée afin de regarder les effets de ce traitement par transfert de gène au niveau cellulaire et tissulaire.
Bénéfices attendus
La thérapie génique est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. Elle s’appuie sur une dizaine d’années d’essais chez l’homme. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique dans notre modèle ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement applicable à l’homme.
Procédures
Injection du vecteur) : Cette injection (1 seule par animal) se fera sous anesthésie en moins de 15 secondes. Habituation à l’expérimentateur : 3 minutes par jour par souris, 5 jours consécutifs. Une à deux fois selon le protocole. Tests comportementaux : Deux types de tests comportementaux seront réalisés afin d’évaluer la coordination et la force musculaire de l’ensemble des animaux. Ces tests vont permettre d’étudier les effets du traitement par transfert de gène thérapeutique dans le système périphérique pour contrecarrer les mécanismes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Test 1 : test de coordination Durée : 20 minutes/jour c’est-à-dire 4 passages d’environ 5 minutes max sur le rotarod avec 1 heure de repos entre chaque passage. Répétition : 3 jours consécutifs Test 2 : test de force musculaire Durée : 15 minutes Répétition : 1 fois par jour, 3 jours consécutifs Test 3 : test pour évaluer l’asymétrie motrice Durée : 15 secondes Répétition : 1 fois Ces trois tests seront réalisés MODIFICATION : 2 À 3 fois selon les animaux. Mesures électrophysiologiques : Ces tests se feront sur des animaux anesthésiés. Ces tests seront réalisés après les tests comportementaux, les animaux seront donc habitués à l’expérimentateur. La mesure de la vitesse de conduction nerveuse consiste à stimuler un nerfet à mesurer la vitesse de transmisssion du signal. . Parallèlement, la réponse d'un muscle distal sous influence du nerf stimulé est recueillie par d’autres électrodes. Durée : 15 minutes maximum. MODIFICATION 2 À 3 répétitions selon les animaux. Répétition : les mesures seront réalisées au total 2 À 3 FOIS selon le groupe.
Impact sur les animaux
- Une possible complication liée à l’injection - est un gonflement autour du site d’injection. - Les tests comportementaux sont réalisés sur les animaux vigiles et sont conçus pour entrainer un minimum de nuisances. Cela peut cependant entrainer un stress chez les animaux que nous maintiendrons le plus bas possible. . Les mesures électrophysiologiques nécessitent l’implantation de fines électrodes sous la peau. L’implantation de ces électrodes est comparable à la pénétration d’une aiguille fine dans la peau. Cela peut entraîner un picotement ou une légère piqûre. Les souris CMT ont un développement, une durée de vie, et une fertilité comparable à celles des animaux non génétiquement modifiées. Cette pathologie se caractérise par une crispation des orteils et une diminution de la vitesse de conduction nerveuse. La diminution de la vitesse de conduction nerveuse peut se traduire chez l’animal par une faiblesse musculaire, pouvant entrainer une diminution du poids.
Devenir
A la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés. Le but est de prélever les organes post-mortem et de réaliser des analyses tissulaires.. Le but est de regarder l’effet du vecteur thérapeutique sur les marqueurs de la maladie de Charcot-Marie-Tooth.
Remplacement
Toutes les constructions génétiques utilisées seront caractérisées in vitro avant leur utilisation chez l’animal. Des études in vitro sur des cultures de cellules ont déjà été menées. Cependant, elles ne nous permettent pas d’évaluer l’efficacité du vecteur pour corriger les manifestations cliniques de la maladie à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
La constitution des groupes est basée sur notre expérience et le type d’analyses réalisées, afin d’obtenir des données statistiquement significatives permettant d’évaluer l’effet thérapeutique du traitement. Nous avons effectué une recherche bibliographique afin de nous assurer de ne pas dupliquer des protocoles expérimentaux déjà réalisés. Cette recherche nous a permis d’optimiser nos procédures et le nombre d’animaux afin d’obtenir des résultats statistiques exploitables, robustes et valables. La constitution des groupes est également basée sur notre expérience et le type d’analyses réalisées, et un test statistique. Les effectifs prévus ont été réduits au maximum.
Raffinement
L’injection du vecteur thérapeutique se fera sous anesthésie générale. Un analgesique sera appliqué au niveau de l’œil avant que l’animal ne soit placé dans la boîte à induction. Une fois l’animal endormi, l’injection est réalisée en moins de 15 secondes par un expérimentateur maitrisant cette technique. La souris injectée est ensuite placée dans une cage propre jusqu’à son réveil. Elle est ensuite immédiatement replacée dans sa cage d’origine. Une observation hebdomadaire des animaux, des pesées hebdomadaires seront réalisées. Un soutien nutritionnel sera apporté si besoin. Test comportementaux et tests d’électrophysiologie: Les tests seront précédés d’une phase d’habituation (handling) à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences. Puis auront les tests d’éléctrophysiologie. Cinq minutes avant l’anesthésie, la peau sera insensibilisée avec de la crème analgesique au niveau des sites de pose des électrodes afin d’éviter le picotement ou la légère piqûreCes tests seront réalisés après les tests comportementaux, les animaux seront donc habitués à l’expérimentateur. Pendant les mesures l’animal sera placé sur un tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle. La souris est ensuite placée dans une boite chauffante jusqu’à son réveil. Elle est ensuite remise dans sa cage d’origine. Des points limites seront mis en place afin de s’assurer de réduire au maximum la douleur éventuelle : suivi respiratoire, arrêt des tentatives de mesures électrophysiologiques en cas de 2 échecs consécutifs lors des mesures. Des points limites ont été établis afin de réduire au maximum les nuisances chez les animaux. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce d’étude préclinique a plusieurs justifications : - l’existence d’un modèle murin reprenant de nombreuses caractéristiques de la maladie humaine - la grande majorité des études de thérapie génique commence dans un modèle de souris pathologique, et selon les résultats peut se déployer chez un plus grand animal - la maitrise par notre équipe des tests comportementaux et électrophysiologiques chez la souris permettra une étude fine de ce modèle. L’injection du vecteur se fera à deux stades de vie différents : - à l’âge de 10 jours de vie dans le but de stopper ou ralentir l’apparition des signes cliniques - à l’âge de 3 mois , à un moment où les signes cliniques sont déjà présents. Le but est de ralentir l’évolution des signes cliniques ou les stopper.
Evaluation de nouveaux radiotraceurs de la transmission cholinergique en Tomographie par Emission de Positon chez le rat sain, dans des modèles de maladies neurodégénératives et troubles du développement.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Jusqu'à sept séances d'imagerie TEP sous anesthésie et une chirurgie cérébrale pour le modèle de Parkinson: 156 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue. Une partie sont des rats SHR qui développent une hypertension avec l'âge, atteignant cœur, reins et cerveau. L'objectif est de valider de nouveaux radiotraceurs cholinergiques en vue d'un transfert vers la clinique humaine. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal entier et conclut au caractère indispensable du recours au rat.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer et d’évaluer de nouveaux traceurs utilisés en imagerie médicale afin de mieux observer le fonctionnement du cerveau et du système cardiovasculaire. Ces traceurs, appelés ont été conçus par notre équipe et seront utilisés en imagerie TEP (tomographie par émission de positons), une technique permettant de visualiser l’activité de certains systèmes biologiques dans l’organisme. L’étude se concentre sur le système cholinergique, un système de communication entre les cellules nerveuses qui repose sur une molécule appelée acétylcholine. Ce système joue un rôle essentiel dans la mémoire, l’apprentissage, les mouvements et la régulation de la pression artérielle. Son dysfonctionnement est impliqué dans plusieurs maladies, comme la maladie de Parkinson, le trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH) et certaines maladies cardiovasculaires. Dans la maladie de Parkinson, un déséquilibre entre différents systèmes de communication du cerveau contribue aux troubles moteurs. Dans le TDAH, des anomalies du système cholinergique ont également été mises en évidence. Par ailleurs, ce système intervient dans la dilatation des vaisseaux sanguins et le contrôle de la tension artérielle ; lorsqu’il fonctionne mal, il peut favoriser l’hypertension. Un traceur existe déjà pour étudier ce système chez l’homme, mais il est aujourd’hui utilisé uniquement en recherche. Un des traceurs développés par notre équipe, présente de meilleures performances et a déjà fait l’objet de tests de sécurité montrant qu’il est non toxique, même à des doses très supérieures à celles utilisées en imagerie. L’un des objectifs du projet est donc de finaliser sa validation afin de permettre son utilisation chez les patients. En parallèle, un second traceur, a été mis au point pour étudier un autre élément clé du système cholinergique, situé cette fois au niveau des cellules nerveuses qui reçoivent le message. Ce traceur est plus performant que ceux actuellement disponibles. Grâce à ces deux outils complémentaires, le projet vise à mieux comprendre les dysfonctionnements du système cholinergique dans des modèles de la maladie de Parkinson et du TDAH, ainsi que leurs liens avec l’hypertension et les maladies cardiaques, afin d’améliorer à terme le diagnostic et la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider des radiotraceurs, afin d’améliorer la compréhension des pathologies cérébrales et cardiaques liées au système cholinergique. Le but du financement est de pouvoir finaliser le transfert vers la clinique. Dans un objectif de réduction et raffinement, nous utiliserons les mêmes animaux pour poursuivre la validation de notre nouveau radiotraceur, pour pouvoir le transférer également en clinique humaine. Ces traceurs permettront un diagnostic clinique plus précis ainsi que le suivi thérapeutique des pathologies associées aux altérations cholinergiques.
Procédures
Pour la chirurgie du modèle de maladie de Parkinson (MP), les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse d’environ 1 heure et recevront 2 injections (1 i.p. et 1 s.c.) de moins d’une minute chacune. Une partie des animaux auront deux séances d’imagerie TEP (environ 70-130 min/séance), réalisées avant et après la chirurgie, sous anesthésie gazeuse, avec une injection du traceur par voie i.v. (< 1min). Dans le modèle spontané de TDAH, les animaux auront au maximum 7 séances d’imagerie entre 6 et 14 semaines d’âge. Lors de la première séance, une injection i.p. (< 1 min) du traceur sera effectuée sous anesthésie gazeuse avant l’imagerie qui durera 30 min. Les imageries suivantes (traceur 1 et 2) se dérouleront également sous anesthésie, gazeuse avec une injection des traceur i.v. (< 1 min) en début d’acquisition. Chaque imagerie durera entre 60 à 120 minutes.
Impact sur les animaux
Pour tous les groupes, la manipulation/contention des animaux peut provoquer un léger stress, qui reste temporaire. Groupes 1, 2 et 3 : Après chirurgie, les animaux seront observés afin de vérifier l’absence de signes douloureux tels que : un changement de comportement, une agressivité inhabituelle, une diminution du toilettage, des difficultés à se déplacer, une perte de poids ou un état général affaibli. Groupes 2, 3, 4 et 5 : Après les examens d’imagerie, un petit hématome peut apparaître au niveau de la queue, à l’endroit où une veine a été utilisée pour l’injection. Cet effet est généralement léger et transitoire. Groupes 4 et 5 : Après certains examens d’imagerie, une gêne ou une légère douleur peut être ressentie au point d’injection pendant quelques minutes seulement. Groupe 4 (rats SHR) : Avec l’âge, ces rats développent naturellement une hypertension artérielle, qui peut affecter plusieurs organes comme le cœur, les reins et le cerveau, et s’accompagner de troubles métaboliques et cognitifs.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés pour des études in-vitro.
Remplacement
L'objectif du projet étant de développer des traceurs d'imagerie utilisables chez l'humain, aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal entier, étant donnée la complexité des processus mis en jeu telles que l'altération de la transmission cholinergique, les données pharmacocinétiques et de biodistribution et métabolisme multi-organes. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude du développement de nouveaux radiotraceurs d'imagerie.
Réduction
L’utilisation de techniques d’imagerie réalisées directement chez l’animal vivant permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’étude en utilisant le même animal pour mesurer plusieurs paramètres à différents âges. Malgré cette réduction, le nombre d’animaux par groupe reste déterminé par la nécessité d’obtenir des résultats fiables et suffisamment précis pour répondre correctement à la question scientifique étudiée. Le nombre d’animaux a été calculé à partir de résultats déjà publiés et de données précédemment obtenues au laboratoire. Ces calculs prennent en compte les différences naturelles entre les animaux ainsi que les effets attendus entre les groupes étudiés. Il a ainsi été estimé que 10 animaux par groupe pour le modèle de MP et 20 animaux par groupe pour le modèle de TDAH permet de détecter des différences d’environ 15 % entre les groupes, avec un haut niveau de fiabilité des résultats. Ce nombre offre également une marge de sécurité pour identifier des différences plus faibles ou faire face à une variabilité plus importante que prévue. Au total, cette étude utilisera 156 rats, répartis de manière équilibrée entre femelles et mâles. Parmi eux, certains seront utilisés pour l’apprentissage et la mise au point des techniques, tandis que d’autres feront partie des groupes expérimentaux, incluant des animaux présentant des atteintes ciblées dans différentes régions du cerveau, afin de comparer leurs effets.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des conditions, conformes aux normes en vigueur, avec un environnement enrichi (tunnels, bâton à ronger, papier absorbant, etc…) pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés au moins une semaine avant le début des expériences et surveillés quotidiennement. Toutes les mesures nécessaires seront mises en place pour limiter la douleur et l’inconfort (antalgiques). Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse, avec une surveillance continue de la température corporelle et de la respiration. Les examens d’imagerie réalisés à différents moments chez un même animal permettent de mieux comprendre les mécanismes étudiés tout en réduisant le nombre total d’animaux utilisés. Après chirurgie, un traitement antidouleur et un complément alimentaire seront systématiquement proposés. L’état des animaux sera évalué chaque jour. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce la plus adaptée pour cette étude en raison des similitudes entre son cerveau et le cerveau humain (circuits cholinergiques comparables entre les 2 espèces), ainsi qu’en raison de la taille de son cerveau qui est compatible avec la résolution spatiale de notre imageur. Les rats Wistar seront étudiés à l’âge adulte. Concernant les souches SHR et WKY, les animaux seront étudiés avant leur 8ème semaine de vie (avant apparition de l’hypertension) jusqu’à leur 14ème semaine de vie qui correspond aux premiers stades d’apparition de l’hypertension.
Développement de nouveaux candidats médicaments : Etude comportementale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Société de services en études précliniques, l'établissement propose une offre de tests comportementaux qu'il veut étendre aux maladies du système nerveux central. 5 360 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer une vingtaine de candidats médicaments. Chaque animal peut subir jusqu'à cinq tests dont la nage forcée, une privation de nourriture, un isolement de 72 heures et l'implantation répétée de pompes osmotiques sous la peau. Le porteur mesure la résignation à l'immobilité dans la nage pour évaluer un état dépressif, et présente ces tests comme le cœur de son offre commerciale.
Objectifs
Notre établissement utilisateur est une société de services spécialisée dans les études précliniques qui fournit une offre variée de tests de comportement chez la souris. Nous souhaitons par ce projet pouvoir offrir notre expertise du comportement murin dans le domaine des maladies liées au système nerveux central (maladies neurodégénératives, maladies neurologiques ou psychiatriques ou troubles neuro-développementaux) à des acteurs scientifiques académiques ou privés. Les modèles développés dans notre société nous permettent d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur les fonctions cognitives, la mémoire, le comportement anxio-dépressif, l’activité motrice ainsi que la force motrice des animaux. Dans les pathologies telles que la maladie d’Alzheimer par exemple, on retrouve différents symptômes comme les troubles cognitifs et perte de mémoire mais également des symptômes anxieux et dépressifs. Notre objectif est donc ici de pouvoir proposer une gamme de tests comportementaux chez le rongeur permettant d’étudier l’effet d’un potentiel candidat médicament dans des maladies liées au système nerveux central. Selon la cible thérapeutique d’intérêt du candidat médicament et donc de ses propriétés pharmacologiques, il pourra être testé dans un ou plusieurs tests de comportement réalisés en routine dans notre EU afin de définir son efficacité thérapeutique dans un des domaines cités précédemment ainsi que ses potentiels effets secondaires. Le nombre estimé de candidats médicaments testés lors de ce projet est de 20.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de permettre l’avancée de potentiels candidats médicaments dans leur développement préclinique afin de développer et de rendre accessibles des nouveaux médicaments dans des pathologies touchant le système nerveux central et qui aujourd’hui ne possèdent pas de réel traitement ou des traitements ayant des effets limités avec beaucoup d’effets secondaires.
Procédures
Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (moins d’une minute, au maximum 90). Les fréquences d'administration dépendront des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments. Un prélèvement sanguin sur animal anesthésié sera réalisé en fin d’étude d’une durée inférieure à 2 min avec un volume maximal de 0.5 ml. Les animaux seront soumis à un ou plusieurs tests de comportement (maximum 5 d’une durée de 5 min à 15 jours selon le test). Les animaux pourront être soumis à une implantation de pompe osmotique par voie sous-cutanée d’une durée de 5 minutes environ qui aura lieu au maximum 3 fois avec 2 semaines entre chaque renouvellement minimum. Selon le test comportemental, les animaux pourront être soumis à une privation de nourriture (inférieure à 24h une seule fois) ou à un isolement de 72h maximum une seule fois sur la durée de l'étude.
Impact sur les animaux
Les administrations d’un produit peuvent induire une légère douleur au site d’administration et un stress lié à la contention de l’animal. Les administrations répétées peuvent également induire des hématomes. L’implantation d’un dispositif de diffusion de candidat médicament en sous-cutané (à 3 reprises maximum au court d’une étude) implique la réalisation d’un acte chirurgical sous anesthésie générale précédée d’une analgésie de moins de 10 minutes. Les risques liés à ce type de procédure sont les suivants : douleur post-opératoire, œdème, inflammation ou hématome au point d’implantation, risque faible d’infection locale. Les tests de comportement utilisés dans ce projet peuvent induire un stress léger (ex : Test d’activité locomotrice) à modéré (ex : test de la nage forcée) de courte durée. Les animaux doivent être isolés durant une période de 72h avant le test d’hyperthermie induite par un stress. Durant les 24h qui précèdent le test d’alimentation supprimée par la nouveauté, les animaux sont soumis à une restriction alimentaire complète. L’administration de candidats médicaments peut entraîner des effets tels que l’hyperactivité, la sédation ou une myorelaxation. Les molécules administrées pour l’induction des modèles de pathologie peuvent induire des déficits de mémoire et/ou une hyperactivité.
Devenir
En fin d’étude, pour des analyses sérologiques, histologiques, moléculaires et immunohistochimiques, les animaux pourront soumis à différents types de prélèvements (organes) post mortem. L’ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l’étude comportementale sera mis à mort.
Remplacement
Le développement de candidats médicaments, en amont de l’utilisation de l’animal, est réalisé en plusieurs étapes : L’identification de la cible thérapeutique (pathologie), la compréhension des voies neurobiologiques de cette pathologie, la découverte de composés modulant la cible thérapeutique, l’optimisation de ces composés pour améliorer leur spécificité, leur profil pharmacocinétique et leur sécurité, leur validation fonctionnelle in vitro (cultures de neurones, organoïdes) et leur évaluation pharmacocinétique et toxicologique in vitro. Suite à ces étapes et en amont du présent projet, des études in vivo pourront également être réalisées ou sous-traitées par le donneur d’ordre afin de déterminer plus précisément leur pharmacocinétique et leur toxicité. L’ensemble de ces études permettent de choisir les doses dénuées de toxicité, ainsi que la voie et le temps d’administration qui seront optimaux pour notre projet. Ce projet consiste à évaluer différents comportements chez l’animal représentatifs de pathologies. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Selon notre expérience, les tests statistiques utilisés dans ce projet montre la nécessité d’un nombre d’animaux par groupe égal à 12 pour observer des effets significatifs des candidats médicament (p
Raffinement
Une période d’acclimatation de 6 jours minimum sera respectée avant d’inclure les animaux dans une étude. Autant que possible, les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Une stratégie d’enrichissement particulière sera mise en place pour les animaux isolés et les animaux stabulés durant plus d’un mois. Leur état général sera évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. Si un animal atteint un des critères prédéfinis dans notre grille de scoring à un moment donné de l'expérience, il sera immédiatement mis à mort. Lors de la chirurgie pour l’implantation de système de diffusion sous-cutanée, l’administration d’antidouleur sera réalisée afin de garantir l’analgésie. Une période de récupération minimale de 5 jours sera respectée avant le passage en test de comportement et, pour les tests de piscine de Morris ou de stress de nage forcée, la période nécessaire à la cicatrisation complète sera respectée (environ une semaine confirmée par avis vétérinaire). Les injections intrapéritonéales seront préférentiellement réalisées dans le quart inférieur gauche afin d’éviter le colon descendant situé dans le quart inférieur droit. Les administrations sous-cutanées seront réalisées sur 3 sites d’injection alternativement (entre les omoplates ou sur chacun des flancs latéraux). L’implantation d’un système de diffusion sous-cutané sera réalisée sous anesthésie générale précédée d‘une analgésie. Les animaux seront soumis à une habituation progressive à la contention et à l’instillation intranasale (suivie d’une récompense alimentaire) sur une durée de 3-4 semaines avant l’administration du candidat médicament. Après chaque séance dans la piscine de Morris et après le test de la nage forcée, les animaux sont placés dans une cage contenant un tissu sec sur tapis chauffant jusqu’à ce que l’animal soit sec. La résignation des animaux, mesurée par le temps d’immobilité, sert à évaluer un potentiel « état dépressif » ou un effet antidépresseur par exemple. Dans les deux cas, une vigilance particulière est apportée aux animaux pendant (avec des critères d’arrêt strict) et après le test. Des études in vitro et in vivo seront réalisées préalablement à ce projet pour définir les doses non toxiques, n’induisant pas de nuisances potentiellement invalidantes pour les animaux (nuisances supérieures à une hyper ou hypoactivité ou myorelaxation chez les animaux), qui seront utilisés dans notre projet.
Choix des espèces
Le choix des rongeurs se justifie par la richesse et la complexité de leur répertoire comportemental, qui permettent d’explorer de manière pertinente les fonctions motrices, cognitives et émotionnelles ciblées dans ce projet. Des espèces présentant un système nerveux central moins développé ne disposent pas d’une organisation neurobiologique ni d’expressions comportementales suffisamment élaborées pour répondre de façon fiable aux objectifs scientifiques poursuivis. De plus, la souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de transposer (par des modèles A partir de 5 semaines d’âge. Les pathologies étudiées peuvent toucher l’adolescent, l’adulte comme le sujet âgé.