Troubles nerveux

Une à six heures de chirurgie pour implanter des électrodes dans le cerveau, puis des séances d'enregistrement la tête fixée, montant progressivement jusqu'à deux ou trois heures. 720 souris vont être utilisées ainsi dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie terminale pour prélever le cerveau et vérifier la position des électrodes. Elles subissent aussi une biopsie de la queue, un gavage quotidien démarré neuf jours avant le premier enregistrement et un hébergement individuel. Ces souris portent une trisomie qui modélise le syndrome de Down, et le porteur écrit que le phénotype n'est pas considéré comme dommageable, tout en décrivant l'isolement et la perte de liberté de mouvement comme des inconforts modérés.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'examiner le fonctionnement des circuits corticaux sur des souris modèles du syndrome de Down afin de mieux comprendre les mécanismes responsables des déficits cognitifs et comportementaux associés à cette pathologie et si possible comment les corriger. En effet cette maladie, liée au développement anormal du système nerveux à cause de facteurs génétiques (trisomie), se caractérise par des troubles du comportement, de l'humeur, des relations sociales, et des déficits cognitifs extrêmement invalidants. Les souris modèles du syndrome de Down présentent des déficits génétiques dans des gènes impliqués dans le développement du cerveau et le retard mental. Notre hypothèse principale, que nous testerons par des enregistrements électrophysiologiques et comportementaux, est que certains éléments des circuits neuronaux du cortex sont défaillants sur ces modèles, entrainant une activité cérébrale anormale qui perturbe l'encodage et la computation neuronale. Nous évaluerons également l'action sur le fonctionnement des circuits corticaux de 2 drogues (candidats médicaments) récemment proposées comme ayant un intérêt clinique potentiel contre le syndrome de Down. Ces drogues, qui affectent les mécanismes intracellulaires au sein des neurones, permettraient potentiellement de restaurer des interactions neuronales normales dans ces pathologies, contre lesquelles aucun traitement pharmacologique efficace n'est à ce jour disponible.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, notamment neurodéveloppementales telles que retard mental et syndrome de Down, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.

Procédures

Les animaux seront soumis à 7 types d'intervention, sur une durée totale de 2 à 4 semaines : biopsie de la queue pour phénotypage, procédure instantanée (fraction de seconde), traitement pharmacologique par gavage (1 ingestion par jour, démarrage 9j avant le premier enregistrement); procédures chirurgicales (implantation, sous anesthésie, d'électrodes ou d'une barre miniature pour enregistrement chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine; procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre, d'une durée de 7j, ou en mode tête-fixée, par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 1 à 2 semaines); procédure d'enregistrement sur l'animal anesthésié, d'une durée de 3 à 6h; et enfin anesthésie terminale pour prélèvement du cerveau, procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.

Impact sur les animaux

La biopsie de la queue pour phénotypage génère une douleur légère et de courte durée. Le traitement pharmacologique par gavage (1 ingestion par jour, démarrage 9j avant le premier enregistrement) représente un stress physique et psychologique léger, mais n'est associé à aucune douleur. Les procédures chirurgicales (implantation d'électrodes ou d'une barre miniature sur l'os cranien), d'une durée de 1 à 6h, sont effectuées sous anesthésie générale et donc sans douleur ni inconfort. L'acte chirurgical n'est associé à aucune perte de fonction. La récupération post-chirurgicale est accompagnée de traitement analgésique (démarré dès avant l'acte chirurgical), ce qui limite la douleur à un niveau modéré. La procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre ou en mode tête-fixée n'est associée à aucune douleur particulière. En plus de l'hébergement individuel (isolement), compensé par un enrichissement de l'environnement et des interactions quotidiennes avec l'expérimentateur, l'inconfort lié à la fixation de la tête (perte de liberté de mouvement) est modéré car mitigé par les interactions avec l'expérimentateur (handling, enrichissement comportemental lié à la tâche) et par une habituation très progressive (sessions quotidiennes de quelques minutes au départ). Les procédures d'enregistrement sur l'animal anesthésié et de prélèvement du cerveau sont effectuées sous anesthésie générale sans réveil, complétée par un traitement antalgique, et donc sans aucune perception de la part de l'animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort. Ceci est indispensable pour caractériser l'état histologique du cerveau et pour s'assurer de la localisation des électrodes (identifiée par un marqueur florescent, le DiI) après les enregistrements in vivo.

Remplacement

L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur le cerveau issu de l'animal vivant. Il est en effet à ce stade de nos connaissances impossible de modéliser de façon réaliste le fonctionnement cognitif in vitro ou in silico. Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation dont actes chirurgicaux, perfusion transcardiaque ou mise à mort en cas d'atteinte de point limite).

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Une difficulté notable dans le calcul a priori du nombre d'animaux nécessaire est que les variables étudiées sont nouvelles, et leurs paramètres statistiques (moyenne et variance) par conséquent inconnus. D'après la littérature du domaine, un scénario plausible pour les variables que nous caractérisons est d'être en mesure de détecter une différence de 25% entre 2 échantillons de petite taille issus de distributions suivant une loi Normale dont l'écart type est d'environ 20% de la moyenne. Il faut ainsi un échantillon de 10 animaux pour détecter avec une certitude de 95% (risque α de type I) et une puissance de 0.8 (risque β de type II) une différence de 25% entre 2 moyennes dont les distributions suivent une loi Normale (µ, σ=0.2µ). Le nombre d'animaux retenu dans notre protocole, nécessaire pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences réalisée avec un taux de succès de 50%, est donc de 20 par lot expérimental. Toutefois, les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.

Raffinement

Les dommages en termes de souffrance animale sont minimisés par les conditions d'élevage (cages collectives et enrichies de carré de coton jusqu'à la chirurgie et autant que possible après), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie), le suivi régulier (quotidien dans les periodes péri-opératoires) des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité : cf fiche de suivi en annexe). Les animaux utilisés sont des souris d'une lignée transgénique modèle du syndrome de Down. Ce modèle a pour but de reproduire les altérations développementales des circuits neuronaux qui sous-tendent la pathologie chez l'homme. Toutefois, aucune étude à notre connaissance ne montre que les troubles associés au développement des circuits neuronaux dans le modèle que nous utilisons soient douloureux pour l'animal, et le phénotype n'est pas considéré comme dommageable.

Choix des espèces

Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. Elle est également une espèce de choix pour modéliser les pathologies cérébrales concernées par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (8-12 semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats (meilleure récupération post-chirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.

Jusqu'à trois séances d'IRM de trois heures sous anesthésie, avec quatre prises de sang par séance et des bouchons de mousse enfoncés dans les conduits auditifs pour amortir le bruit de l'aimant : 228 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est soumise six semaines à un régime hyperlipidique qui provoque hyperlipidémie et résistance à l'insuline. L'objet est de suivre l'effet de la neuro-inflammation d'origine alimentaire sur l'activité cérébrale, le cerveau étant prélevé après la mise à mort. Le porteur qualifie pourtant ces procédures de "non-invasives" et estime que le régime n'altérera pas "drastiquement" la qualité de vie des souris.

Objectifs

L'un des plus grands défis dans un environnement obésogène tel que nos sociétés modernes est la gestion du poids à long terme, la plupart des tentatives de perte de poids se soldant par une reprise de poids ultérieure (effet "yo-yo"). Le système nerveux central joue un rôle clé dans le maintien de la balance énergétique en régulant les apports (comportement alimentaire, incluant les dimensions homéostatiques et hédoniques) et les dépenses énergétiques. La plupart des études se sont intéressées à la régulation homéostatique du comportement alimentaire. De nombreuses études ont ainsi montré chez la souris mais aussi chez l’Homme qu’une exposition chronique à un aliment riche en lipides (connue pour conduire à terme à une surchage pondéral voire une obésité) conduit à des modifications neuro-anatomiques, une neuro-inflammation, et ce particulièrement au niveau de l’hypothalamus. Malgré l'accumulation de preuves révélant les interactions entre les régulations homéostatiques et non-homéostatiques du comportement alimentaire, des données manquent sur l’effet d’une exposition chronique à une alimentation hypercalorique sur les réseaux cérébraux sous-jacents. De plus peu de données existent concernant l’effet de la neuro-inflammation induite par un régime riche en lipides sur l’activité cérébrale.

Bénéfices attendus

Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension de l’effet de la neuro-inflammation induite par le régime hyperlipidique sur l’activité cérébrale et la connectivité fonctionnelle et éclaireront sur les mécanismes cérébraux qui sous-tendent les modifications du comportement alimentaire (y compris dans l’addiction à la nourriture, le « binge eating » ou l’anorexie). De plus, l’approche par imagerie dans le modèle animal est non seulement une méthode non-invasive mais également une approche facilement transférable à l’Homme.

Procédures

Les souris seront soumises à des anesthésies pour l'acquisition par IRM. Une session d'acquisition durera au maximum 3h et une souris réalisera au maximum 3 sessions d'acquisition. Dans la procédure 1, des prises de sang seront effectuées pour mesurer la glycémie. Elles dureront quelques secondes et seront au nombre de 4 par session d'acquisition IRM pour chaque animal. Dans la procédure 3, une partie des souris sera exposée à un régime hyperlipidique pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

La prise chronique sur des temps longs (>8 semaines) d’un aliment HFD conduit à une prise de poids, des perturbations métaboliques et des modifications de l’activité locomotrice et potentiellement de l’humeur. La période d’exposition au HFD de 6 semaines dans notre projet perturbera le métabolisme des animaux (hyperlipidémie, résistance à l’insuline) mais n’altérera pas drastiquement, à ce stade, la qualité de vie des animaux. Les nuisances liées à l'IRM étant de nature sonores, des protections auditives en mousse seront positionnées dans le conduit auditif des animaux afin d'éviter une dégradation de leur audition.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur. Le contrôle de l'intensité de l'inflammation par des approches de biologie moléculaire nécessite le prélèvement du cerveau et donc l'euthanasie des animaux. D'autres organes pourront être prélevés pour des analyses tissulaires post-mortem complémentaires (par ex: tractus digestif). Un entraînement et le raffinement des gestes techniques employés seront réalisés en amont des prélèvements décrits précédemment.

Remplacement

Cette étude de mesure de la neuroinflammation, de l’activité cérébrale et la de connectivité fonctionnelle entre des structures cérébrales ne peut être réalisée in vitro ni modélisée in silico. En effet, le nombre, la complexité des structures cérébrales mises en jeu, leur activité et leurs interactions dans un contexte intégré ne permet pas de réaliser cette étude sur des modèles cellulaires qui sont insuffisamment représentatifs à l'heure actuelle. De plus, dans la perspective de pouvoir transposer les données générées dans cette étude à l'Homme, l'utilisation d'animaux présentant une bonne analogie fonctionnelle ainsi qu'une bonne homologie anatomique, physiologique et génétique avec l'Homme est requise. Dans cette étude, les travaux seront menés sur la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données publiées générées par les responsables du projet. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de déterminer la pertinence de poursuite ou non de la méthode mise au point. Plus précisément, pour les différents paramètres d'imagerie considérés, des tests statistiques permettant une analyse temporelle et/ou de l'effet de traitements entre plusieurs groupes et/ou de l'effet sexe des animaux lors de mesures répétées en utilisant des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des données. Grâce à l'utilisation d'un suivi longitudinal (mesures répétées chez un même animal), le nombre total d'animaux inclus dans l'étude est réduit.

Raffinement

Les procédures expérimentales prévues sont non-invasives. Les prélèvements pour l’analyse histologique sont post-mortem. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. La durée d’exposition à l’aliment HFD permet de limiter les conséquences négatives sur l’animal.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.

Rendues haplo-insuffisantes pour le gène Nipbl, les souris de ce modèle reproduisent selon le porteur les symptômes du syndrome de Cornelia de Lange, dont des comportements auto-agressifs. 18 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant trois semaines, à partir du sevrage, d'une molécule déjà en essai clinique en cancérologie, puis passent deux heures sous anesthésie gazeuse pour une imagerie cérébrale, à l'issue de laquelle elles sont tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme réduire le nombre d'animaux "au minimum permettant de répondre à la question scientifique" tout en reconnaissant l'absence de données préliminaires sur la taille d'effet attendue, et présente un éventuel effet du traitement comme la première piste thérapeutique pour des enfants qui n'en ont aucune.

Objectifs

Le syndrome de Cornelia de Lange est une maladie rare du développement qui affecte plus de 9000 enfants en Europe, 30 000 aux Etats Unis. Il s’agit d’un retard de développement de la croissance accompagné de défaut de formation du cerveau, du système auditif, du cœur et d’une partie du système digestif. la cause génétique de ce syndrome est une insuffisance du gène nommé Nipbl. Il en résulte des problèmes d'expression de nombreux gènes. Les enfants souffrant de ce syndrome sont de plus petite taille que la normale, marchent très tardivement , doivent subir des interventions chirurgicales réparatrices, ne parlent pas ou parfois très tardivement, et ont des comportements auto-agressifs. Il n’y a aucune piste thérapeutique à ce jour. Avec un modèle de souris haplo-insuffisant pour le gène Nipbl, qui récapitule les symptomes des patients, nous avons trouvé que le syndrome induisait un arrêt de la prolifération cellulaire embryonnaire prématurée. Des cellules sénescentes ( en arrêt de prolifération) ont été identifiées dans tous les organes au cours du développement y compris dans le cerveau des nouveaux nés. Le traitement des souris gestantes par une molécule en essai clinique en oncologie permet la naissance de souriceaux de taille normale sans malformation cardiaque sans cellule sénéscente y compris dans le cerveau. Notre projet va étudier si le traitement des souris au sevrage et au cours de la maturation du cerveau peut prevenir ou limiter la sénéscence dans le cerveau et les effets fonctionnels tels que l 'agressivité .

Bénéfices attendus

Un effet positif du traitement sur le fonctionnement neuronal serait un atout majeur et permettrait d’apporter pour la première fois une piste thérapeutique pour les patients qui n’en ont aucune jusqu ‘aujourdh’ui. ce projet ouvrirait les discussions avec les cliniciens qui s 'ocupent des enfants affectés par le syndrome afin d'évaluer l 'utilisation du médicament.

Procédures

Les souris seront traitées avec le médicament pendant 3 semaines par un gavage quotidien durant 15 secondes . Elles seront ensuite anesthésiées pour un examen d'imagerie cérébrale de 2 heures . elles seront mises à mort à la fin de l 'examen

Impact sur les animaux

La prise du médicament par gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiquée par un expérimentateur très habitué. Le processus ne prend que 30s . Examen clinique par IRM sous anesthésie gazeuse : la seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque le vetflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.

Devenir

Les souris seront mise à mort à la fin du protocole d'imagerie pour collecter les cerveaux à des fins d'histologie

Remplacement

Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. L’étude de l’impact de la délétion de Nipbl sur le développement cérébral et l’éventuelle correction de ces anomalies par le traitement nécessite de recourir à l’animal car il n’existe aucune alternative. Il n’est pas possible d’obtenir ces informations par les organoides qui ne peuvent rendre compte du développement, de la maturation et du fonctionnement d’un organe aussi complexe que le cerveau. Il n’existe pas non plus de modèle informatique de la maladie.

Réduction

Le recours à l’animal étant incontournable, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum grâce à l’utilisation de méthodes non-invasives d’Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) et de Spectroscopie à Résonnance Magnétique (SRM). Ces méthodes avancées permettent de réaliser des explorations couvrant la totalité du cerveau et d’obtenir un grand nombre d’informations quantitatives dans le cadre d’un examen clinique sous anesthésie générale. Le caractère non invasif de l’exploration rend possible la réalisation d’examens répétées sans dommage pour l’animal. En l’absence de données préliminaires permettant de connaitre la "taille d'effet" attendue et compte-tenu de notre expérience en IRM préclinique, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum permettant de répondre à la question scientifique

Raffinement

Le raffinement concernera la diminution du stress par l’utilisation d’une anesthésie légère lors de l’IRM. Les animaux étant hébergé dans le même bâtiment que celui où sera réalisé l’imagerie, le délai d’acclimatation ne sera que de 2 à 3 jours, une habituation à l'expérimentateur sera assurée lors de l’arrivée des animaux. Pendant les sessions d’imagerie, les animaux seront plongés sous anesthésie gazeuse afin d’éviter tout stress. Ils bénéficieront d’un monitorage physiologique continu (t° rectale, respiration) avec un système dédié au rongeur permettant d’adapter immédiatement l’anesthésie afin d’éviter toute situation de détresse cardio-respiratoire. Les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en plexiglas, cartons à ronger, fast-track, balançoires). Des points limites adaptés et précoces seront mis en place pour la procédure . Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage.

Choix des espèces

la souris peut être facilement modifiée génétiquement. Notre modèle murin récapitule parfaitement le phenotype des patients. elle est un bon modèle de biologie du développement, un avantage pour une pathologie du développement . Les souris seront traitées post-sevrage (3 semaines) lors de la maturation du cerveau qui persiste jusque 3 mois chez les rongeurs.

Le protocole revient à faire passer à des rongeurs l'équivalent préclinique des essais de phase 1 menés sur des volontaires humains sains, pour établir la dose à laquelle une molécule en développement devient toxique. 1 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les uns pour des prélèvements, les autres parce qu'ils ont reçu des substances dont le porteur ignore les effets à long terme. En douze semaines, un même animal peut recevoir jusqu'à 336 administrations, subir 64 prélèvements sanguins et passer 60 tests comportementaux, censés mesurer la motricité, la cognition, la douleur, l'anxiété et la dépression, sans qu'aucun de ces tests soit nommé. Le porteur affirme que ces modèles ont une "prédictivité reconnue", au motif qu'ils "répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché".

Objectifs

La nécessité d’évaluer la sécurité des médicaments et des molécules en cours de développement est apparue suite aux accidents thérapeutiques du début du XXème siècle voire aux tragédies comme ce fut le cas pour la thalidomide. Dans ce cadre, l’étude de l’index thérapeutique et de l’innocuité d’une molécule est primordiale. Il s’agit de déterminer les doses à administrer afin d’obtenir la concentration sanguine permettant l’effet recherché mais également d’évaluer la dose à laquelle les premiers effets secondaires apparaissent. Ces études sont fréquemment réalisées sur des rongeurs et pourraient être également considérées comme l’équivalent préclinique des études de phase 1 en développement clinique impliquant des volontaires sains. Dans ce projet, nous proposons d’administrer des composés en cours de développement à des rongeurs puis d’adresser jusqu’à 3 questions interdépendantes : - La première interrogation est de savoir comment le composé se comporte vis-à-vis de l’organisme - Ce projet permet également d’évaluer les éventuels effets secondaires d’une molécule lors de son administration aux doses que l’on souhaite utiliser pour traiter la maladie. Pour cela, des animaux sains sont traités par le composé à tester et leur comportement est observé pour détecter des effets non souhaités. - Finalement, ce projet permet de déterminer la dose d’apparition des effets indésirables. Ceci est réalisé en administrant un composé à une dose supérieure à la dose thérapeutique et à étudier leur comportement pour détecter des effets non souhaités.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la connaissance des effet secondaires des nouveaux médicaments et à la sélection de nouveaux traitements ayant une balance bénéfice/risque la meilleure possible.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront sur une période de 12 semaines un maximum de 336 administrations, de 64 prélèvements sanguins ( en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire) et de 60 tests de comportements, ces tests de comportements permettront de mesurer l’impact de la molécule sur le système moteur, cognitif, nociceptif mais aussi sur le niveau d’anxiété ou de dépression des animaux. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Les tests de comportement sont généralement courts (entre 30 sec et 5 min) et ne dépasse pas 30 min pour le plus long.

Impact sur les animaux

LLes administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal. Les tests de comportement peuvent induire un inconfort thermique, un stress, une légère désorientation ou des douleurs de courte durée.

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu’il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses globales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi, vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les analyses du présent projet nécessitent des observations uniquement possibles chez l’animal vivant. De plus, les effets secondaires sont par nature imprévisibles. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes Après analyse de puissance statistique, nous envisageons d’utiliser 10 animaux par groupe. Des analyses statistiques finales sont réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 50 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 25 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu. Pour les souris, l’enrichissement du milieu comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Pour les rats, l’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Une grille de score permet de surveiller les points limites préalablement défini et le devenir de l’animal est évaluer à l’aide d’un arbre décisionnel permettant d’éviter les souffrances inutiles.Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de leur mise en oeuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Des raffinements spécifiques pour chaque procédure seront mis en place.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat. De plus, tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (souris de 4 à 5 semaines et des rats de 6-7 semaines au début du projet). Il s’agit de s’adresser à des animaux dont l’activité spontanée est suffisante pour réaliser les tests proposés.