Troubles nerveux

Jusqu'à 576 heures d'enregistrement cérébral par animal, par tranches de quatre-vingt-seize heures consécutives chaque semaine : 132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Celles opérées à l'âge adulte vivent seules pendant six semaines, de la chirurgie jusqu'à leurs trois mois, les électrodes implantées dans le cerveau interdisant de les garder en groupe. Le porteur indique que la moitié des souriceaux mutés meurent trois semaines après la naissance et que les autres font des crises d'épilepsie entre une et trois semaines de vie, l'objet du projet étant de caractériser ces crises. Il décrit la connexion hebdomadaire au système d'enregistrement comme "simple à réaliser et indolore", et prévoit la mise à mort des animaux surnuméraires au sevrage pour ne pas stresser leurs parents.

Objectifs

La protéine d’intérêt (PI) étudiée dans ce projet est impliquée dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence frontotemporale (DFT). Ces maladies sont dites neurodégénératives, c’est à dire qu’elles sont caractérisées par une perte progressive des neurones. Ce projet a pour but de mieux comprendre l'implication de cette protéine PI dans la régulation de l’activité des neurones. En condition normale, elle se situe majoritairement dans le noyau, où elle a plusieurs fonctions. Le noyau est la structure qui contient l’essentiel de l’information génétique de la cellule. Il est entouré du cytoplasme, qui est une structure cellulaire dans laquelle les protéines sont produites. Ainsi, PI doit être transportée du cytoplasme (où elle est produite) jusqu’au noyau (où elle doit se trouver pour remplir ses fonctions). Ce transport est permis car PI contient un "domaine de localisation nucléaire”. Ce domaine est une région spécifique qui indique qu’une protéine doit être transportée jusqu’au noyau. En condition pathologique, PI n‘est plus transportée jusqu‘au noyau, la protéine s‘accumule donc dans le cytoplasme. Chez les souris, il est possible d’induire la SLA et la DFT en supprimant le domaine de localisation nucléaire de PI afin qu’elle ne soit plus transportée jusqu’au noyau et s’accumule dans le cytoplasme. Chez les souris et les humains, cela s’accompagne, entre autres, de défauts des neurones inhibiteurs. Ces neurones sont importants pour réguler l‘activité électrique du cerveau en l‘empêchant d‘être trop élevée. Pour comprendre le rôle des neurones inhibiteurs dans les pathologies liées à PI, il existe une lignée de souris dans laquelle PI est mutée spécifiquement dans les neurones inhibiteurs. Les premières caractérisations de cette lignée montrent que cette mutation pourrait être pertinente en dehors de l'étude de la SLA-DFT. Lorsqu’une seule copie du gène PI est mutée (l’autre restant à l’état sauvage), les souris présentent une activité électrique anormale dans le cerveau à l’âge adulte. Lorsque les deux copies du gène PI sont mutées, les souriceaux développent des symptômes qui pourraient être liés à une activité électrique anormale dans le cerveau, voire à des crises d'épilepsie. Ce projet a alors pour but d’évaluer l’activité électrique dans le cerveau de souris juvéniles et jeunes adultes, et de caractériser les possibles crises d'épilepsie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes pathologiques présents chez des souris qui ont une protéine d’intérêt (PI) mutée spécifiquement dans certains types de neurones. Les neurones sont les cellules électriques du cerveau. Leur fonctionnement, et donc le fonctionnement du cerveau, peuvent être modifiés par des mutations. Ainsi, le projet permettra de savoir si l’activité électrique dans le cerveau des souris mutées est anormale avant même qu’elles ne deviennent adultes. Ces souris modélisent des maladies neurodégénératives. Or, les maladies neurodégénératives, telles que la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale, apparaissent majoritairement à l’âge adulte mais il est possible que des altérations soient présentes dès l’enfance, voire avant. En observant des altérations chez des souriceaux et jeunes souris, ce projet soulèverait la question de possibles altérations précoces dans des maladies diagnostiquées bien plus tardivement. Ce projet permettra également d’étudier les mécanismes à l’origine des potentielles crises d’épilepsie. Ainsi, à long terme, ce projet permettra de mieux comprendre l‘implication de PI dans la régulation du fonctionnement des neurones chez l’humain. Un rapprochement pourrait alors être fait entre les pathologies connues pour être liées à PI et l’épilepsie.

Procédures

Les souris étudiées pour ce projet pourraient présenter une activité électrique anormale dans le cerveau, voire des crises d'épilepsie. Afin de vérifier cela, les souris seront étudiées et recevront les gestes techniques mentionnés ci-après. Pour savoir si les animaux sont mutants ou non, un prélèvement d’un bout d’oreille et/ou de l’extrémité distale de la queue devra être réalisé. Ce geste sera réalisé par des personnes expérimentées, sur animal vigile, une seule fois dans la vie de l’animal et durant très peu de temps (cela ne prend que quelques secondes par animal). Une chirurgie d'une heure maximum sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Une seule procédure chirurgicale par animal sera réalisée. Chez les souris adultes la chirurgie sera réalisée à partir de 6 semaines (1,5 mois). A partir de ce moment, ces souris devront être isolées jusqu’à leur 12 semaines (3 mois). Elles seront donc isolées durant 6 semaines (1,5 mois) maximum. La chirurgie sera également réalisée sur des souriceaux de moins d’un mois (avant sevrage). Les souriceaux non-sevrés rejoindront le reste de la portée et leurs parents, qui auront été préparés pour éviter de les rejeter. Ils ne seront donc pas isolés. Après une période de convalescence, l’activité électrique du cerveau des animaux sera mesurée. Pour cela les souris devront être connectées à un système d’enregistrement. Cette connexion hebdomadaire est simple à réaliser et indolore pour les souris. Ces dernières seront vigiles, et pourront se déplacer librement durant le test. Pour les souriceaux, ces tests auront lieu sur 5 jours consécutifs, d’abord durant 1h par jour puis en augmentant progressivement cette durée jusqu’à 3h par jour. Au maximum, les souriceaux réaliseront 5 enregistrements par semaine, soit (5 enregistrements x 3h)15h d’enregistrement par semaine . Pour les souris adultes les tests auront lieu (4 enregistrements *24h) sur 96 heures consécutives par semaine jusqu’à leur 3 mois. Au maximum, les souris adultes réaliseront (6x96h) 576 heures enregistrements. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

une partie des souriceaux mutés sont systématiquement plus petits et plus légers que leurs congénères appartenant aux mêmes portées. Par ailleurs, ces souriceaux développeront potentiellement des crises d’épilepsie lorsqu’ils auront entre une et trois semaines. Les premières caractérisations de la lignée montrent que ces souris ont parfois des phases d'absence ou de baisse d’activité. Ces phases sont courtes, le plus souvent suivies par une période où le souriceau redevient actif, et les mères continuent de s’occuper des souriceaux même quand ils sont peu actifs. La moitié de ces souriceaux mutés décèderont trois semaines après la naissance. En revanche, les souris mutées adultes ne présentent pas de symptômes indésirables visibles. Lors du prélèvement (du bout d’oreille ou de l’extrémité de la queue) pour déterminer si l’animal est muté ou non, il pourra ressentir une légère et brève douleur. La chirurgie pourrait créer de l’inconfort et des douleurs, qui seront suivies de près par les expérimentateurs et personnels de soin animalier. Pour mesurer l‘activité électrique du cerveau, les animaux devront être isolés. Pour les souriceaux, il pourrait y avoir un stress et un inconfort lié à l’absence de leur mère. En dehors des phases de test, le protocole mis en place permettra aux souriceaux et à leurs parents d’être hébergés ensemble, ce qui aura un effet bénéfique sur l’ensemble des animaux. A l’inverse les souris opérées à l’âge adulte devront être isolées dès la chirurgie et le resteront pendant la durée de l’étude jusqu’à l’âge de trois mois.

Devenir

Les animaux nécessaires à l’étude seront produits grâce à des accouplements contrôlés, les animaux surnuméraires seront euthanasiés au moment du sevrage (c’est-à-dire lorsqu’ils auront 3 à 4 semaines) pour ne pas stresser leurs parents. Les animaux inclus dans les procédures de chirurgie et enregistrements seront euthanasiés à la suite de la détection de crises épileptiques, ou à l’âge de trois mois maximum si aucune crise ne survient. Ils ne peuvent pas être gardés en vie et réutilisés après ce projet car ils auront des électrodes implantées dans le cerveau. Les parents seront euthanasiés à la fin de l’étude car ils n’auront plus l’âge de se reproduire.

Remplacement

Avec ce projet nous souhaitons étudier l'implication d’une protéine dans la régulation de l’activité électrique du cerveau. Plus précisément, il s’agira de définir si une mutation, lorsqu’elle a lieu dans un type cellulaire spécifique, entraine la survenue de crises d’épilepsie. Nous ne pouvons pas étudier cela avec des cultures cellulaires car elles ne reproduisent pas toutes les propriétés des crises d'épilepsie observées dans un cerveau entier. La modélisation informatique nécessite des données expérimentales encore manquantes et ne nous permet donc pas, pour le moment, de répondre à notre question scientifique. Sachant cela, l’utilisation d’un organisme entier est nécessaire. Cependant, nous ne pouvons pas étudier la mutation d’intérêt chez l’humain car il faudrait s’assurer que la mutation soit présente uniquement dans les cellules qui nous intéressent (ce qui n’est possible qu’avec une étude post-mortem), tout en mesurant l’activité électrique du cerveau des sujets vivants. Finalement, l’utilisation d’animaux est nécessaire afin de reproduire à la fois la complexité du système nerveux et la complexité comportementale.

Réduction

Nous veillerons à générer le minimum d'animaux nécessaires à la constitution des groupes expérimentaux en vue de produire des conclusions scientifiques statistiquement fiables. Au total nous aurons 132 animaux inclus dans le projet, dont 12 reproducteurs et 35 souris opérées. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul statistique. Ce dernier pourra être ajusté selon les premiers résultats, selon les différences observées entre chaque groupe et la possible variabilité au sein d’un même groupe. Une fois les données récoltées, des tests statistiques seront utilisés pour assurer une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés selon les normes en vigueur concernant la taille des cages, le nombre d‘animaux par cage, la température ambiante, le taux d‘humidité, les cycles de lumière, et l’accès à l’eau et à la nourriture. Les cages seront enrichies d’un nid de coton et, si besoin d’une maison en carton. Le prélèvement du bout d’oreille ou de l’extrémité de la queue (pour savoir si les animaux sont mutants ou non) est rapide, parfaitement maitrisé et pratiqué au calme. Il a lieu au même moment que l’identification pour limiter la manipulation de la portée. Le matériel est propre et désinfecté entre chaque animal pour limiter le risque d’infection et de contamination. Le transport des animaux sera réalisé selon les normes en vigueur et avec un transporteur agréé. Les symptômes que pourraient développer les souris ne sont pas encore complètement caractérisés, c’est pourquoi les animaux seront étroitement surveillé par le personnel de soin animalier et les expérimentateurs. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Avant la chirurgie, des phases d’habituation permettront aux souriceaux et à leurs parents de découvrir les gestes et matériaux nécessaires pour l’opération. Lors de la chirurgie et après, une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée sera assurée. Une fois anesthésié, les animaux seront maintenus à bonne température et leurs yeux seront protégés pour qu’ils ne se dessèchent pas. Suite à la chirurgie, les animaux feront l’objet d’un suivi postopératoire avec une surveillance rapprochée jusqu’à leur réveil complet. L’expérimentateur et le personnel de soin animalier réaliseront ensuite une surveillance quotidienne étroite pendant une semaine. Un médicament antidouleur sera administré toutes les 12h. Si nécessaire, ce traitement pourra être prolongé jusqu’au rétablissement de l’animal. Après la chirurgie, les animaux seront pesés chaque jour pendant une semaine, puis une fois par semaine pour s‘assurer qu‘ils ne perdent pas de poids.

Choix des espèces

Ce projet sera mené avec des souris, qui sont encore aujourd’hui l’un des modèles animaux les plus pertinents dans le domaine de la recherche sur les maladies neurodégénératives et l’épilepsie. Ce choix a été motivé par des raisons scientifiques : 1) Cette étude nécessite des modifications génétiques très précises (mutation d’une protéine d’intérêt dans un seul type de cellules du cerveau). 2) Avoir une lignée pure, dont certaines caractéristiques génétiques sont stables, homogènes et utilisées dans les laboratoires du monde entier, permet de pouvoir comparer et reproduire des résultats. De cette façon, le nombre d’animaux nécessaires est réduit. 3) Cette espèce est largement utilisée pour étudier les crises d’épilepsie. Elle a été explorée de manière exhaustive, du niveau moléculaire jusqu‘à l‘échelle du comportement animal. Cela permet d‘avoir une solide base scientifique sur laquelle le projet se repose. 4) Les rongeurs ont un cerveau qui génère des activités électriques et des crises d’épilepsie dont les mécanismes pathologiques, au niveau moléculaire et cellulaire, sont similaires à l'humain. Les procédures seront réalisées sur des animaux de 7 jours (prélèvement pour savoir si les animaux sont mutés ou non) à 3 mois (euthanasie). Pour une partie des animaux, la chirurgie aura lieu quand ils auront 12 à 14 jours. Pour l’autre partie, la chirurgie sera réalisée quand les animaux auront 6 semaines (1,5 mois).

Les souris mâles utilisées ici sont privées du gène Mecp2 et développent dès l'âge de trente jours des apnées, une hyperventilation, une perte de mobilité et une perte de poids. 1 695 souris entrent dans le projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour tester un virus modifié censé délivrer une copie saine du gène au système nerveux central. Chaque animal subit une biopsie d'identification, une injection sous anesthésie gazeuse, un gavage, des tests comportementaux dont l'un dure jusqu'à quarante-huit heures, puis une ponction et une perfusion intracardiaques. Une partie des souris est gardée en vie comme reproductrices, les autres sont tuées à la fin des procédures pour prélever leurs organes, et le porteur présente l'étude sur les femelles comme une étape "indispensable" avant l'essai clinique.

Objectifs

Le syndrome de Rett (RTT) est une maladie rare neurodéveloppementale d’origine génétique liée au chromosome X. Elle conduit à une déficience intellectuelle progressive et sévère majoritairement chez les filles. Dans 95% des cas le RTT est dû à une mutation du gène MECP2. Le RTT ne connait à ce jour aucun traitement curatif. Les traitements administrés ciblent les symptômes et complications liées à la maladie afin de les alléger et ainsi améliorer la vie des patientes. Parmi les symptômes on retrouve notamment une perte des fonctions motrices volontaires, des troubles de la respiration et des troubles divers affectant le sommeil et l’alimentation. En 2007, la preuve de concept selon laquelle il est possible de restaurer un phénotype sain (c’est-à-dire que la souris malade est guérie) chez la souris mâle déficiente pour Mecp2 même à un stade avancé de la pathologie est publiée. Cette avancée est porteuse d’espoir et laisse place à de nombreuses études notamment en thérapie génique de remplacement visant à intégrer dans les cellules une copie saine du gène via un virus modifié. La cible étant le système nerveux central, les études se heurtent à un obstacle majeur : le passage de la barrière hémato-encéphalique présente autour du système nerveux central pour le protéger contre les substances étrangères. Jusqu’ici le virus le plus adapté pour infecter mène à un taux d’infection des cellules assez faible et plusieurs études utilisant ce virus rapportent également une forte expression du gène apporté dans le foie causant une toxicité. Récemment, une publication a montré le potentiel d’un nouveau virus conçu de manière à avoir une forte infection dans le système nerveux central mais pas ailleurs. Ces caractéristiques pourraient résoudre les effets secondaires observé avec le précédent virus. L’objectif de l’étude est de caractériser ce virus appelé AAV.Cap-B10 dans le cadre d’un traitement par thérapie génique sur des souris mâles Mecp2 et femelles déficientes et d’évaluer l’efficacité et la toxicité du traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’un nouveau virus capable de cibler spécifiquement le système nerveux central sans infecter les autres organes dans le cadre d’une thérapie génique d’une pathologie neuronale. Si l’infection s’avère spécifique et homogène les résultats pourront servir à d’autres équipes cherchant à infecter le système nerveux central dans d’autres pathologies du cerveau. De plus, si le traitement est efficace les résultats serviront de bases pour une étude sur le modèle femelle Rett, étape indispensable avant le passage en essai clinique chez les patientes.

Procédures

Les animaux seront soumis à: - une biopsie pour identification et classement des animaux (une dizaine de secondes – 1 fois) – déclaration de la maladie (troubles respiratoires, moteurs; stress et perte de poids) - une anesthésie générale gazeuse au cours de laquelle sera réalisée l'injection pour la thérapie génique (durée environ 10min - 1 fois) - des tests comportementaux non invasifs (durée variable selon les tests de 5minutes à 48h – 1 à 3 fois par tests selon les groupes) - une administration par voie orale par gavage (30s à 1 minute) - une anesthésie générale profonde pour la mise à mort (durée 30min – 1 fois) – ponction cardiaque (1 fois 1min au décès) – perfusion intracardiaque (1 fois 1min au décès)

Impact sur les animaux

Dans ce modèle de souris, les mâles et les femelles déclarent plusieurs symptômes mimant ceux présents dans le syndrome de Rett. Les mâles montrent une apparition sévère des symptômes de manière précoce (environ 30 jours après la naissance). Chez les femelles les symptômes apparaissent plus tardivement (vers 5mois) et sont moins sévères, la souris est progressivement atteinte. Les effets cliniques attendus chez ces souris sont sévères et comprennent : - une altération des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation - une altération des fonctions motrices conduisant à une réduction de la mobilité - une sensibilité accrue au stress et une perte de poids seulement chez les mâles (les femelles présentent à l’inverse une prise de poids). Les nuisances générées par les procédures comprennent : - le stress léger lié à la réalisation d'une anesthésie générale gazeuse - le stress léger lié aux tests comportementaux non invasifs - la douleur modérée, de courte durée, modulée par une anesthésie et analgésie adaptée) liée au prélèvement intracardiaque et à la perfusion intracardiaque terminale.

Devenir

Certains animaux seront gardés en vie comme reproducteurs. Les autres animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales pour prélèvements d'organes.

Remplacement

La pathologie nécessite l’étude du cerveau et se caractérise par un polyhandicap. Pour l’étudier sous toutes ses dimensions un modèle de culture cellulaire n’est pas envisageable. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle animal de la pathologie pour espérer produire des résultats qui seront transférables chez l’homme. L'expérimentation sur l'animal permettra d'acquérir le recul et les compétences requises à une recherche translationnelle.

Réduction

La variabilité interindividuelle est réduite par l’utilisation de souches murines fixées génétiquement. Le nombre d’animaux a été déterminé en se basant sur nos études précédentes et sur le calcul statistique de puissance avec GPower pour répondre à la question expérimentale de façon que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats. Cependant, nous utilisons un nouveau vecteur et une nouvelle construction. De ce fait, les effets attendus pourraient ne pas correspondre à ceux émis pour effectuer le calcul de puissance. C’est pourquoi, les expérimentations seront initialement réalisées sur la moitié du n prévu. Les données obtenues feront l’objet d’une analyse statistique préliminaire (étude pilote) en fonction du résultat : - les expérimentations seront arrêtées si aucune différence ne ressort entre les groupes - le nombre d’animaux par groupe sera augmenté si une différence entre les groupes semble exister mais ne ressort pas suffisamment pour atteindre la significativité. Enfin, les expérimentations post-mortem seront réalisées sur un demi- cerveau au lieu d’un cerveau entier (certaines expériences nécessitant des tranches et d’autres le broyage), permettant de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires pour ces expérimentations.

Raffinement

L’hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l’expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées en groupe, dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau ad libitum, dans des conditions environnementales maitrisées et conformes à la réglementation. Les souris étant particulièrement sujettes au stress, la manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (cupping et tunnels) et à la fragilité de la lignée. Une période d’habituation à l’expérimentateur et aux tests de comportements est prévue le cas échéant. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures expérimentales induisant de la douleur, ici les injections des vecteurs viraux et des microbulles de gaz inerte via la voie rétro-orbitale le cas échéant. Cette anesthésie, sous forme gazeuse (isoflurane), suit les protocoles standards et sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire approprié. Des points limites clairs sont définis et évalués via une grille de suivi du phénotype des animaux afin de mettre en place les soins adaptés le plus précocement possible (antiseptiques, antalgique, anti inflammatoire). En parallèle, l'état général de nos animaux ainsi que l'état de la cage, de la nourriture et de l'eau seront surveillés quotidiennement. Des périodes d’habituation avec les expérimentateurs et pour les tests comportementaux le cas échéants sont prévues afin de diminuer le stress de nos animaux.

Choix des espèces

La souris permet actuellement de disposer facilement et rapidement d’un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L'intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle pré-clinique, repose essentiellement sur la proximité physiopathologique avec l'espèce humaine (transférabilité des résultats), un élément nécessaire à une recherche translationnelle valide. Le modèle Mecp2-deficient est le modèle le plus largement utilisé par les laboratoires de recherche dans les études sur le Syndrome de Rett. Il est largement caractérisé dans la littérature ce qui permet une bonne compréhension des animaux. Les souris seront incluses dans les procédures 2 et 3 à 30 jours post-natal (P30). Période à laquelle apparaissent les premiers symptômes chez les mâles et donc est plus proche de ce qui se passerait chez l’homme. L’apparition des premiers symptômes étant nécessaire au diagnostic de la pathologie. Les femelles et mâles utilisés pour la reproduction seront mis en procédure 1 durant la période de fertilité optimale respectivement de 2 à 8 mois et de 2 mois à 1 an post-natal afin d’obtenir des mâles et des femelles malades nécessaires à l’étude. Les deux premiers mois correspondent au temps d’acquisition de la maturité sexuelle.

Une grande partie de la voûte crânienne retirée, la peau seule refermée sur le cerveau : 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. 160 subissent cette craniectomie, 160 un accident vasculaire cérébral provoqué, 180 les deux combinés, 160 constituant le groupe témoin avec des incisions cutanées refermées. Le porteur indique que le déficit neurologique provoqué peut entraîner des difficultés à se mouvoir, à se nourrir et à s'hydrater, ainsi que des troubles de la vigilance pouvant conduire au décès. Il affirme que ces procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et ne peuvent être remplacées, tout en écrivant que le bénéfice de la craniectomie décompressive est déjà démontré chez les patients.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologique fréquente et grave dont un des traitements standards est l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le tPA, par son action lytique sur le caillot fibrino plaquettaire, restaure le flux d’une artère occluse et améliore le pronostic neurologique du patient lorsqu’il est mis en place précocement. Un AVC malin est un type particulier d’AVC qui présente un volume important et notamment plus de 50% du territoire de l’artère sylvienne. Il est associé à plus de 80% de mortalité. La craniectomie décompressive (CD), procédure courante en neurochirurgie, permet de limiter à 30% le taux de mortalité de ces AVC. Elle consiste à retirer une grande partie de la voûte crânienne et à ne fermer que la peau sur le cerveau. Cela permet de limiter la compression du cerveau, de diminuer la pression intracrânienne et d'améliorer la perfusion cérébrale. Son bénéfice a été clairement démontré en clinique. Elle limite le risque de lésions cérébrales secondaires et diminue donc le risque de handicap séquellaire lourd. Cependant, même si la craniectomie décompressive présente un bénéfice à court terme en contrôlant l'augmentation de la pression intracranienne, il est probable que le fait de laisser le patient sans voûte crânienne puisse modifier la physiologie cérébrale, ainsi que les phénomènes secondaires à l’œuvre après une lésion cérébrale. Il est décrit dans la littérature que la voute cranienne est composé de niches de leucocytes. Dès lors, enlever la voûte cranienne pourrais influencer la neuroinflammation qui est un phénomène central lors d'un AVC.

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies où cette interaction joue un rôle (AVC et processus inflammatoires). Nous souhaitons évaluer l’évolution de la neuro inflammation lors de la réalisation d’une craniectomie et notamment mettre en évidence une modification de l’infiltrat leucocytaire. Cela permettra d’améliorer nos connaissances sur les craniectomies décompressives, et donc potentiellement d’en affiner les indications et les caractéristiques techniques. Ainsi, nous espérons améliorer la prise en charge future des patients.

Procédures

L’ensemble des animaux de la procédure seront soumis à une craniectomie décompressive (n = 160 ; 15 minutes), un modèle d’AVC (n = 160 ; 75 minutes), ou la combinaison des 2 techniques (n = 180 ; 90 minutes). Le groupe « sham » subira des incisions cutanées, ensuite refermées (n = 160 ; 5 minutes). 24 heures et 5 jours après, chaque animal fera l'objet d’un examen par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n = 660 , 45 minutes), ainsi qu’une évaluation comportementale (n = 660, 2 minutes). Un génotypage par biopsie sur la queue sera effectué à 1 semaine de vie pour les souris transgéniques (n=560).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress. La procédure d’AVC provoque un déficit neurologique qui peut entrainer une situation anxiogène importante associée à de difficultés pour se mouvoir, se nourrir et s‘hydrater. L’augementation de la pression dans la tête peut être à l’origine de troubles de la vigilance et peut conduire au décès. En plus, on peut noter des dysrégulations thermiques et des troubles hydroélectrolytiques dans le contexte de souffrance cérébrale. La biopsie de la queue lors du génotypage peut entrainer une douleur légère et de courte durée.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du système nerveux central (SNC).

Remplacement

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Au vu de l’implication à la fois locale et systémique de l’inflammation, il est nécessaire de réaliser les procédures in vivo. De plus, nous souhaitons évaluer l’inflammation dans la moelle osseuse, les méninges et le parenchyme ce qui implique d’avoir un ensemble de tissus (méninges, parenchymes…) non modélisables actuellement.

Réduction

Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Dans chaque phase du projet, le minimum d’animaux a été prévu afin d’arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet et des données de la littérature sur la neuroinflammation. Les procédures décrites ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas d'animaux. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’imagerie par résonnance magnétique sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s’alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l’oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage maximum, coton, paillettes, petite maison. Pendant les 48h critiques au modèle, les animaux seront également évalués et pesés 3 fois par jour pour surveiller les points limites. Une mise à mort sera réalisée si les points limites sont atteints et non reversés. Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau cervical et/ou crânien. Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront d’une couverture analgésique. Au vu des difficultés d’alimentation attendues, nous leur disposeront des croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage et mettrons également du « diet gel ».

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques. Ces modèles transgéniques ne peuvent être réalisés que chez la souris. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires. Ceci se justifie par le fait que l’AVC touche principalement les adultes. De plus, les études antérieures concernent également des modèles murins adultes. Dans ce sens, afin de faciliter le comparatif, nos souris le seront également.