Troubles nerveux

360 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leur cerveau soit prélevé. 324 d'entre elles subissent une chirurgie crânienne destinée à léser le cortex moteur, 312 une seconde chirurgie pour la greffe de neurones issus de cellules souches humaines, et 54 une intervention de deux à quatre heures dont elles ne se réveillent pas. Trois cents animaux passent sept sessions de tests moteurs, préhension de nourriture, équilibre et marche, précédées chaque fois d'un jeûne de quinze heures destiné à les motiver à saisir les boulettes. Le porteur conclut qu'il n'est pas possible de modéliser un cerveau de mammifère in vitro ou in silico et que le recours à des animaux vivants et "intègres" reste "essentiel".

Objectifs

La médecine réparatrice a le potentiel de remplacer les tissus endommagés ou malades. Le cerveau est la cible de nombreuses pathologies dont les traumatismes crâniens. Selon les différentes sources disponibles, on dénombre en France annuellement environ 155 000 traumatismes crâniens, cependant les solutions thérapeutiques proposées demeurent limitées. Le cerveau adulte présente une faible capacité d’autoréparation, que ce soit dans la genèse de nouveaux neurones ou de nouvelles connexions projetant sur de longue distance. La transplantation cellulaire offrirait ainsi une stratégie thérapeutique viable pour les patients en apportant de nouvelles cellules en remplacement de celles perdues suite à une lésion. Malgré les progrès significatifs réalisés au cours des dernières années, la translation de la stratégie expérimentale vers une application clinique reste encore limitée. Nos travaux ont pour finalité de développer une méthodologie de thérapie cellulaire efficace et sûre, laquelle utiliserait des neurones provenant de cellules souches humaines, en combinaison avec de nouveaux biomatériaux, afin d’améliorer l'efficacité de la transplantation cellulaire à long terme. Nous pensons fortement que la combinaison de ces nouveaux neurones avec des biomatériaux est une étape cruciale dans la médecine réparatrice du cerveau. En effet, les biomatériaux devraient favoriser la survie des neurones greffés et donc soutenir la régénération tissulaire. Des tests de comportement permettront d'examiner l'effet sur la récupération motrice des animaux et de comparer l'effet du biomatériau sur la réparation du cerveau.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d'étudier l’effet d’un biomateriau sur la réparation des réseaux neuronaux après transplantation de nouveaux neurones chez le rongeur. Ce biomatériau peut être utilisés pour fournir un support structurel, libérer des facteurs de croissance, ou encore promouvoir la régénération tissulaire dans la zone lésée du cortex cérébral. Les objectifs incluent la réduction de l'inflammation, la promotion de la cicatrisation, la restauration des connexions neuronales et la récupération des fonctions altérées à la suite de lésions corticales. A plus long terme, les bénéfices attendus de ce projet sont le développement de thérapie clinique chez l'Homme autour de la transplantation cellulaire combinée à des biomateriaux, afin d’améliorer la qualité et la fiabilité des transplantations et ainsi améliorer la prise en charge des patients souffrants de lésions cérébrales suite à un traumatisme crânien ou un accident vasculaire cérébral.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : -intervention 1 : chirurgie craniale pour induire une lésion : 1 fois (10 minutes par animal, 324 animaux); - intervention 2 : chirurgie craniale avec greffe de neurones : 1 fois (10 minutes par animal, 312 animaux); - intervention 3 : chirurgie craniale sans réveil avec enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (2-4 heures par animal, 54 animaux). Sur animaux vigiles : -en amont de chaque chirurgie, 1 injection sous cutané d'antalgique (360 animaux)- au maximum soixante dix pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (une fois à 2 fois par semaine, sur toute la durée du projet, 360 animaux); -au maximum 7 sessions de 3 tests de comportement moteur (test de préhension de nourriture, test d'équilibre, test de marche,15 minutes par souris et par test, 300 animaux); - mise à jeun d'une durée inférieure à 16h (7 fois à 2 mois d'intervalle, 300 animaux)

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie générale et la chirurgie cranienne, les effets indésirables attendus sont la douleur liée à la chirurgie minimisé par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie, ainsi qu'une légère perte de poids transitoire. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieure gauche. L’acte de pesée et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress transitoire. Un jeûne de 15 heures sera réalisé avant le test de préhension de nourriture afin que les animaux soient motivés à récupérer les boulettes de nourriture.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques, électrophysiologiques ou transcriptomiques.

Remplacement

L’impact de la composition des biomatériaux utilisés dans cette étude aura été testé au préalable dans un modèle in vitro. Ceci permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la possibilité de la réparation du cerveau lésé sur le plan neuroanatomique et fonctionnel. Les symptômes cliniques des traumatismes crâniens qui nous intéressent concernent la motricité. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparait essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser un cerveau de mammifère in-vitro ou in silico, qui nous permettrait d’étudier l’effet bénéfique de la transplantation sur la motricité.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires en expérimentation tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour avoir une étude interprétable sur le plan statistique par l’utilisation d'un test statistique approprié. Ceci a permis de déterminer un nombre de 360 animaux avec la moitié de mâles et la moitié de femelles. Nous commencerons pas réaliser une étude pilote qui va consister à tester au maximum 10 biomatériaux pour sélectionner le meilleur candidat. Nous procéderons avec une démarche pas à pas (par groupe de 6 animaux) transplantés, répétés au maximum 10 fois, soit 60 animaux maximum au total. Si aucun biomatériau ne donnne de résultat satisfaisant, le projet sera arrêté.

Raffinement

Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Avant le début des tests de comportement, une habituation à l'expérimentateur sera réalisée (3 fois/semaine sur 2 semaines). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et contrôle de la température corporelle à l'aide d'un tapis chauffant. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire durant 72h. Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) et des actions seront mises en place en cas de problème(s) observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. En effet, il est possible de mimer chez la souris les lésions du cortex moteur qui peuvent survenir chez l'Homme dans différentes situations (accident de la route, traumatisme crânien, accident vasculaire cérébral...). Nous utiliserons des souris âgées de 3 mois au début de cette étude. Nous souhaitons travailler avec des souris adultes matures ce qui correspond à l'âge où le développement biologique est passé, mais pas encore affecté par le vieillissement.

Pour vérifier si le microbiote intestinal de patientes anorexiques oriente les préférences alimentaires, 252 souris reçoivent par gavage des selles humaines transplantées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour l'étude de leurs tissus. Chaque animal subit six prélèvements sanguins sur animal vigile, un régime riche en fibres qui fait perdre du poids, un hébergement individuel et huit tests comportementaux, les 126 femelles recevant en plus trente-six frottis vaginaux. Le porteur signale un risque de traumatisme de l'œsophage lié au gavage et un risque d'anémie lié aux prises de sang, et renvoie à des points limites dont il ne dit pas lesquels.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires (TCA) qui touche jusqu’à 3.6% de la population féminine et dont le taux de mortalité est élevé. Il s’agit d’une maladie psychiatrique chronique qui se caractérise par une restriction alimentaire volontaire, une peur intense de devenir gros alors que le poids est faible et par une perturbation de l’image de son propre corps. La restriction alimentaire est qualitative et quantitative avec une aversion intense pour les lipides et les glucides et une alimentation très riche en fibre et pauvre en protide. Les causes exactes de l’anorexie mentale restent encore mal connues. Il a été mis en évidence la présence d’un déséquilibre du microbiote intestinal chez les patients AM. Ce déséquilibre pourrait être secondaire à la restriction alimentaire, mais aussi responsable de la préférence alimentaire et donc jouer un rôle majeur dans la persistance des symptômes chez les patientes souffrant d’une forme chronique de la maladie. Dans ce projet de recherche, nous émettons l’hypothèse que la préférence alimentaire particulière de l’anorexie mentale est déterminée par l’environnement microbiotique intestinal. L’objectif de l’étude est de mettre en évidence une différence de préférence alimentaire entre les groupes mimant l’anorexie mentale et les sujets sains pour répondre à la l’hypothèse que le microbiote dans patients atteints d’anorexie mentale les pousse à préférer manger des aliments végétaux. Cette étude permettra aussi de montrer le transfert de symptômes de l’anorexie mentale touchant de nombreux organes à travers le microbiote.

Bénéfices attendus

L’étude permettra la validation du modèle de l’anorexie mentale par transfert de microbiote fécal, d’améliorer la compréhension de la physiopathologie de l’anorexie mentale, de la compréhension des mécanismes d’influence microbiote/hôte.

Procédures

Tous les animaux vigiles seront gavés 4 fois soit au total. La contention et le gavage sont réalisés en moins de 10 secondes. Prélèvement de selles : 252 animaux 3 prélèvements par animal seront réalisés. Réalisé après émission naturelle. Durée 1 minute. Prélèvement sanguin : 252 animaux Les prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles. Chaque prélèvement dure en moyenne 10 secondes, pour un nombre total de 6 prélèvements par animal soit au total 1 minute de prélèvement sanguin par animal. Prélèvement d’urine : 252 animaux Emis naturellement sur animal vigile. Durée du recueil : 10 secondes, 1 fois au cours du protocole. frottis vaginaux : 126 animaux Réalisation de frottis vaginaux chez les groupes d’animaux femelles. 36 prélèvements par animal durée du recueil 10 secondes. 252 animaux subiront 1 fois chaque test comportemental pour une durée totale de 40 min. Ceci porte le nombre de tests à 8 par animal. La durée cumulée d’épreuves comportementales sera de 145 min sur 6 semaines. Pour 252 souris. Injection sur animal vigil d’une durée de 5 secondes. Soit 1 injection par animal.

Impact sur les animaux

Gavage oral : Risque de traumatisme de l’œsophage lors de la manipulation. Hébergement individuel : Stress induit par l’isolement du fait des caractéristiques communautaires de l’espèce non satisfaites. Régime : perte de poids lié au régime riche en fibre. Prélèvements sanguins: douleurs et stress induit par la prise manuelle et la piqure et la coupure effectuée par la lancette. Les prélèvements seront tous espacés d’un minimum de 7 jours. Risque d’anémie lié aux prélèvements sanguins. Injections: Douleur liée à la piqure et l’injection de liquide Lavage vaginal : stress lié à la prise par la queue et le lavage. Tests comportementaux : induction d’un stress volontaire par la mise en conditions expérimentales. Mise a jeun une fois d’une durée de 4h et une fois d’une durée de 6h. Stress lié à la privation d’aliment dans l’environnement Prélèvement d’urine : émission naturelle, stress lié au placement en pot de recueil

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour l’étude scientifique des tissus

Remplacement

Notre projet nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire car il n'existe pas de techniques actuellement satisfaisantes et éthiques pour étudier le retentissement à un niveau physiologique du déséquilibre bactérien intestinal chez l’humain et ses effets sur la physiologie de l’intestin et le comportement alimentaire. Les techniques in vitro permettent des études à des échelles microscopiques (interactions au sein d’un tissu) mais non à l’échelle globale de l’organisme, ne permettent pas des études d’un point de vue comportemental. Les techniques d’études in silico ne sont pas applicables à l’échelles des interactions microbiote hôte d’un point de vue comportementale et physiologique car les connaissances ne sont actuellement pas assez développées pour créer des modèles informatiques prédictifs.

Réduction

Le nombre d’animaux destiné au projet a été estimé au regard d’une étude autorisée précédemment, et afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons.

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue dans les suites de la transplantation de microbiote fécal sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Afin de limiter le stress associé à l’hébergement individuel les cages sont transparentes, permettant un contact visuel et olfactif avec les congénères, et enrichies (papier à déchiqueter, matériel de nidification et bâton à ronger). Les points limites déterminés seront appliqués par les expérimentateurs en cas de constatation de leurs manifestations.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris qui est une espèce de référence et un modèle très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. Les souris seront des jeunes adultes âgés de 6 semaines au début de l'expérience. Ceci est nécessaire pour être au plus proche des conditions de maladie chez l’homme qui débute au jeune âge adulte.

De l'alcool est injecté sous la peau de souris gestantes, neuf fois entre le douzième et le vingtième jour de gestation, pour reproduire une alcoolisation fœtale. 1 921 souris, mères et petits confondus, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur note que les souris vacillent après l'injection, l'alcoolémie étant mesurée trente minutes plus tard, et affirme qu'elles ne montrent pas de signe de souffrance au moment de l'injection. Toutes sont tuées, les mères anesthésiées puis mises à mort pour prélever les embryons, les souriceaux pour prélever leur cervelet à neuf stades de développement.

Objectifs

Les Troubles Causés par l’Alcoolisation Fœtale ou TCAF sont des troubles du neurodéveloppement liés à des consommations modérées ou discontinues d'alcool pendant la grossesse. Cette pathologie, dont la prévalence est évaluée à 1% des naissances, se traduit par l’apparition d’atteintes neurologiques chez l'enfant avec des répercussions fonctionnelles qui se révèlent progressivement avec l’âge. Dès lors, de nombreuses études visant à caractériser les anomalies du neurodéveloppement chez les enfants TCAF se sont portées sur des structures intégratives telles que le néocortex ou encore l’hippocampe. Celles-ci ont notamment révélées une tortuosité significative des vaisseaux sanguins induisant un mauvais positionnement des cellules nerveuses. Pour autant, plusieurs déficits observés chez ces enfants, tels que les troubles orthoptiques ou des défauts de motricité fine, suggèrent que le cervelet pourrait également participer aux déficits induits par une alcoolisation in utero. Les objectifs de ce projet seront donc (i) de caractériser la vascularisation et les interactions neurovasculaires au cours du développement du cervelet, puis ii) d’évaluer l’impact de l’alcoolisation in utero sur la mise en place vasculo-associée des cellules du cortex cérébelleux. A terme, nous pourrons ainsi déterminer si le cervelet participe aux déficits observés chez les enfants TCAF afin d'optimiser leur prise en charge.

Bénéfices attendus

Le présent projet permettra tout d'abord d’identifier pour la première fois le mécanisme de mise en place de la vascularisation dans le cervelet murin en développement. Ainsi, nous pourrons déterminer si une migration vasculo-associée participe à la mise en place du cervelet au cours de l'embryognenèse ou lors de la période postnatale et si celle-ci est altérée en condition d'alcoolisation foetale comme déjà démontré dans le cortex cérébral et la rétine. De plus, l’implication d'un service de pédiatrie néonatale dans ce projet nous permettra d’envisager une transposition de nos résultats immunohistochimiques à l’enfant. Dès lors, une corrélation entre les altérations histologiques du cervelet et les atteintes neurodéveloppementales observées chez les enfants atteints de TCAF pourra être envisagée et la prise en charge de ces enfants pourra alors prendre en compte les déficits neurologiques de manière plus intégrée, i) en orientant la thérapeutique vers la cible vasculaire et ii) en incluant la participation du cervelet lors des traitements symptomatiques.

Procédures

Afin de mimer une alcoolisation foetale, de l’alcool sera administré par voie sous cutanée à des souris gestantes du 12ème au 20ème jour embryonnaire soit 9 injections au total Avant la procédure d'injection, les souris gestantes seront préalablement légèrement anesthésiées afin de limiter le stress. La manipulation dure environ 1 minute pour chaque injection. Ce protocole d'alcoolisation répétée par injection est décrit dans des cas d’alcoolisation maternelle. Lors des prélèvements des embyrons, les mères seront soumises à une anesthésie dans une chambre d'induction avant leur euthanasie. Lors des prélèvements des cervelets chez les souriceaux postnataux, les animaux sont également anesthésiés avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

A la suite de l’injection d’alcool chez les mères gestantes, les souris vacillent reflétant l’alcoolémie mesurée après 30 minutes comme observé chez l’humain après alcoolisation. Au cours de l’injection, les souris ne montrent pas de signe de souffrance. Les études déjà réalisées sur ce modèle murin TCAF n'ont pas démontré d'augmentation de fausses couches ou de mortalité précoce chez les embryons/souriceaux.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans cette étude sera euthanasié à la fin de l'expérimentation soit du fait du prélèvement d'organes ou d'embryons, soit du fait qu'ils auront reçu des injections journalières pendant 9 jours (de NaCl 0.9% ou d'alcool) et qu'ils ne pourront donc pas être réutilisés pour d'autres expérimentations (mères gestantes).

Remplacement

Certains déficits observés chez les enfants TCAF, tels que les troubles cognitifs, orthoptiques ou des défauts de contrôle de la motricité fine laissent penser que le cervelet pourrait participer aux déficits induits par une alcoolisation foetale. A l'appui de cette hypothèse, les images d'IRM montrent que ces enfants présentent un volume cérébelleux plus faible. De plus, plusieurs études réalisées sur des modèles animaux ont montré que les populations nerveuses du cervelet présentent une sensibilité importante à l'alcool. Cependant, au regard de ces travaux, il reste difficile d'évaluer l'impact d'une exposition prénatale à l'alcool sur le développement du cervelet. En effet, les modèles utilisés jusqu'alors sont soit des cultures cellulaires, ce qui ne permet pas d'obtenir un système intégré, soit des souris entre le 4ème et le 10ème jour postnatal, ce qui correspond au 3ème trimestre de gestation chez l'Homme, alors que les différents types cellulaires sont déjà présents au sein du cervelet, et ce qui implique d'étudier les effets directs de l'alcool et non l'effet d'une alcoolisation de la mère sur le développement du petit. De plus, il n'existe que peu voire pas de données sur la mise en place de la vascularisation et sur l'existence d'une migration vasculo-associée au cours du développement embryonnaire du cervelet, et, par voie de conséquence, l'impact de l'alcoolisation foetale sur ces événements précoces n'a jamais été étudié. Notre étude vise donc tout d'abord à décrire la vascularisation du cervelet chez des embryons de souris à différents âges pour déterminer si les cellules cérébelleuses utilisent les vaisseaux sanguins en tant que support de migration au cours de l'embyrogenèse. Puis, en utilisant un modèle animal TCAF, nous pourrons identifier les mécanismes impactés par une alcoolisation foetale afin de mieux appréhender la participation du cervelet aux déficits TCAF et d'adapter la prise en charge thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet et obtenir des résultats statistiquement interprétables à l'aide du test non paramétrique Mann-Whitney. 1. Pour la caractérisation de la vascularisation et de la migration vasculo-associée dans le cervelet au cours du développement, les âges d’intérêt ont été identifiés en s’appuyant sur la littérature afin qu'ils soient en corrélation avec les étapes clefs du neurodéveloppement cérébelleux humain. Ainsi 4 stades embryonnaires et 5 stades postnataux seront étudiés à raison de 4 animaux par stade pour obtenir une moyenne statistiquement interprétable des paramètres vasculaires et vasculo-associés. Ces 4 animaux devront être de portées différentes pour prendre en compte la variabilité inter-portée dans l'interprétation des résultats. Pour les marquages immunohistochimiques, 10 anticorps différents sont requis pour identifier l'ensemble des vaisseaux sanguins et des populations cellulaires cérébelleuses. En transparisation, les marquages immunohistochimiques sont obligatoirement réalisés sur des embryons ou cervelets postnataux entiers, ce qui nécessitera 4 animaux de portée différente par stade et par marquage. En revanche, pour l'immunohistochimie sur coupe, la taille du cervelet permettra de réaliser plusieurs marquages différents sur le même échantillon, permettant de réduire le nombre d'animaux. 2. Pour étudier l'impact d'une alcoolisation foetale sur la vascularisation et la migration vasculo-associée, il sera nécessaire de réitérer l'ensemble des marquages précédents sur des embryons « contrôle sham » dont la mère a reçu des injections de NaCl pour confronter les résultats obtenus avec les animaux « alcoolisés in utero » et éviter les biais expérimentaux liés à l'injection en elle-même. Pour les études de PCR et western blot, la taille du cervelet nécessitera un animal par condition et par technique jusqu'à l'âge de la naissance inclus. En revanche, pour les stades plus tardifs, ces 2 techniques pourront être réalisées en parallèle sur un même animal en divisant le cervelet en deux au moment du prélèvement. Enfin, pour la zymographie, un animal par condition sera nécessaire du fait de la préparation de l'échantillon.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. Ils seront maintenus dans un environnement stabilisé (température 21 ± 1 °C, hygrométrie 55%, luminosité 100 lux avec photopériode régulée (cycle jour/nuit 12h/12h)). Ils auront libre accès à l’eau et à la nourriture, et un enrichissement sera mis en place (tunnel en carton, demi-sphère de cellulose et lanières de papier kraft). Ils seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et leur bien-être sera surveillé après les injections d’alcool/NaCl. En cas de dépassement des points limites identifiés (signe de douleurs extérieurs indexés sur Mouse Grimace Scale, manifestations de signe de détresse ou d’infection) ou de défauts significatifs de développement, les animaux seront mis à mort comme décrit précédemment. Lors de la procédure d'alcoolisation foetale, les mères seront conservées dans leur cage d’hébergement et amenées dans la pièce d’expérimentation 1h avant les injections pour limiter tout stress de l’animal. Cette pièce est calme et isolée d'autres animaux. Les mères ayant reçu l'injection seront surveillées en temps réel pendant 45 min avant leur retour dans leur hébergement. Lors des prélèvements, les animaux en attente de l'euthanasie sont placés à l'écart de la table d'expérimentation pour éviter tout stress environnant.

Choix des espèces

La Souris est un modèle de choix pour l’étude de nombreux systèmes physiologiques complexes dont les mécanismes sont similaires aux mammifères. C'est le cas du développement cérébral par exemple. Or le cervelet suit les mêmes étapes de développement que le reste du cerveau avec des séquences de prolifération, migraion, différenciation et apoptose. L'utilisation de ce modèle est donc tout à fait pertinent dans cette étude. De plus, la majorité des publications antérieures relatives aux TCAF a été réalisée chez la souris. Par souci de cohérence et de vision intégrée de l'effet de l'alcoolisation foetale sur le développement nerveux, il est donc nécessaire de poursuivre avec ce modèle murin avant la transposition clinique. Les stades de développement d’intérêt ont été déterminés sur la base des événements clefs de la neurogenèse du cervelet qui sont également bien identifiés chez l'Homme. Ainsi les stades embryonnaires choisis correspondent respectivement à la naissance des cellules de Purkinje, à l’émergence des précurseurs des cellules en grains puis des cellules de Golgi, et enfin à la mise en place de la couche granulaire externe. Puis, pour les études postnatales, les trois premières semaines postnatales représentent successivement une phase de prolifération des cellules en grains dans la couche granulaire externe, le développement de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje, la mise en place du circuit cortical cérébelleux et enfin la fin du développement du cervelet chez le jeune adulte. L'alcoolisation sera réalisée uniquement chez la mère gestante mais pas directement sur le souriceau postnatal.

Jusqu'à 36 tests comportementaux, 336 administrations et 44 prélèvements sanguins peuvent être infligés au même animal sur 84 jours. 9 400 souris et 7 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le porteur mesure ainsi l'anxiété et la dépression des rongeurs pour tester des molécules, en les mouillant, en leur injectant un produit qui provoque une apathie de 24 heures, ou un composé panicogène qui déclenche selon ses propres termes un sentiment désagréable d'anxiété dans l'heure. Il annonce 255 études sur cinq ans et présente le bien-être des animaux non-humains comme "primordial".

Objectifs

L’anxiété et la dépression sont des troubles psychiatriques principalement responsables d'invalidité et de mortalité prématurée. Au niveau mondial, on estime qu’environ 300 millions de personnes souffrent de troubles anxieux, soit ~4 % de la population mondiale. Un nombre similaire de personnes souffrent de dépression. On estime que la perte de productivité due à la dépression et à l’anxiété coûtera à l’économie mondiale 1 000 milliards de dollars par an et devrait atteindre 16 000 milliards de dollars d’ici 2030. L’anxiété et la dépression se différencient par les sensations et les sentiments qu’elles provoquent : la peur en particulier pour la première (sentiment général d’insécurité et par une sensation d’inquiétude démesurée), et la tristesse pour la seconde (tristesse profonde, perte de plaisir et d’envie, perte d’énergie et repli sur soi). Ainsi, l’anxiété et la dépression sont des pathologies différentes mais elles sont imbriquées à différents points de vue Les médicaments existants et approuvés présentent des effets secondaires notoires et peuvent être inefficaces chez certains patients. On parle ainsi de forme de résistance aux médicaments. Les comportements d’anxiété et de dépression ne sont pas le propre de l’Homme, on les retrouve également chez les animaux et notamment chez les rongeurs. Ainsi l’utilisation des rongeurs, souris comme rat, sont des modèles couramment utilisés pour évaluer de nouvelles molécules thérapeutiques. Dans ce projet nous allons mettre en œuvre plusieurs procédures permettant de mesurer le niveau d’anxiété et de dépression des rongeurs et ainsi d’évaluer l’effet de nouvelles molécules thérapeutiques. Les procédures seront au nombre de 4 : -La première étudie chez la souris le niveau naturel d’anxiété et de dépression des animaux dans les conditions d’hébergement de notre laboratoire. -La seconde étudie chez le rat le niveau naturel d’anxiété et de dépression des animaux dans les conditions d’hébergement de notre laboratoire. -La troisième étudie chez la souris l’état d’inconfort induit par une inflammation par un traitement. -La quatrième étudie une forme particulière d’anxiété, le phénomène de panique. Il est induit chez le rat par une administration d’un composé panicogénique connu chez l’homme.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter l’anxiété et la dépression. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles.

Procédures

Les animaux qui réaliseront la procédure 1 ou la procédure 2 pourront être amener à réaliser 36 tests comportementaux anxio-dépressif et/ou de motricité (10-30 min), recevoir un maximum de 336 administrations et de 1 à 44 prélèvements sanguins sur la période de 84j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 seconds en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Les animaux qui seront en procédure 3 subiront au maximum 4 tests de comportement de dépression et/ou d’activité locomotrice (10-30 min) dans les 48h, de plus les animaux subiront une injection d’une substance induisant un état inflammatoire léger et transitoire et bien entendu le traitement avec la molécule à étudier (le schéma de traitement sera fixé en fonction des données pharmacologiques disponible sur cette molécule). Pour les animaux de la procédure 4, chaque individu sera manipulé quotidiennement de 30sec à 1 min pendant une semaine. Une injection d’un composé panicogénique sera réalisée. Ils subiront au maximum 2 tests de comportement de dépression et/ou l’activité locomotrice (environ 10min). De plus les animaux seront sujet à un traitement avec la molécule à étudier (le schéma de traitement sera fixé en fonction des données pharmacologiques disponible sur cette molécule).

Impact sur les animaux

Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (

Devenir

Une partie des animaux est mis à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des comportements d’anxiété et de dépression nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Des analyses statistiques finales sont réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 255 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures. De plus dans nos modèles, quand c’est possible, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, l’enrichissement du milieu comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu pour augmenter la superficie de la cage. Pour les rats, l’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Si des animaux se retrouvent mouiller pendant un test de comportement alors ils seront séchés avant leur retour dans leur cage d’hébergement. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en œuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. Une partie des animaux sont habitués à l’Homme par une manipulation quotidienne (30sec-1min/jour, handling).

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat dans les études des phénomènes d’anxiété et de dépression. De plus tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Etant donné que nous n’étudions pas une pathologie liée au vieillissement, qui affecte les jeunes adultes et que nous avons une longue expertise dans ce modèle en utilisant des souris de 4 à 5 semaines au début du projet et des rats de 6-7 semaines au début du projet, nous allons continuer avec ce stade de développement.

4 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, orale ou intraveineuse jusqu'à une fois par semaine pendant quinze mois, subissent jusqu'à deux injections intracérébrales sous anesthésie, des prélèvements sanguins toutes les trois semaines pendant trente semaines et une privation totale d'eau pouvant atteindre vingt-quatre heures. L'objectif déclaré est de fabriquer puis de valider des modèles de maladies neurologiques rares, en vérifiant que les souris développent bien tremblements, incoordination motrice, dermatites et perte de poids. Celles qui se dégradent sont tuées en cours d'étude, les autres à la fin, pour prélever fluides et tissus. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "indispensable", une majorité des aspects d'une maladie ne pouvant selon lui être reproduits in silico ou in vitro.

Objectifs

En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares est estimé actuellement à 3.5 millions. Une maladie est dite rare lorsqu’elle affecte moins d’une personne sur 2000. Plus de 7000 maladies rares, dont environ 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares, et en particulier les maladies rares neurologiques, sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. L’atteinte peut être visible dès la naissance ou l’enfance, comme par exemple dans l’amyotrophie spinale infantile ou l’épilepsie infantile. Cependant, plus de 50% des maladies rares apparaissent à l’âge adulte, comme la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique ou les ataxies spinocérébelleuses. La moitié des personnes atteintes présentent des déficits moteurs, sensitifs ou intellectuels et dans 9 % des cas, une perte totale d’autonomie. II est possible de reproduire en partie les symptômes de la pathologie chez la souris à la suite d’une altération de son génome, d’une modification de son environnement (mise à jeun hydrique) ou encore en lui administrant des agents ou préparations biologiques destinées à modifier le fonctionnement du système nerveux central. La souris présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. En effet, 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque l’homologie homme/souris n’est pas possible, l’ajout du gène humain dans le génome de la souris permet la création de lignées génétiquement modifiées. Ces souris génétiquement modifiées permettent de mettre en évidence un phénotype pathologique (tremblements, altération du poids…) ainsi que l’identification de nouveaux bio-marqueurs et de nouvelles cibles qui contribuent au développement de meilleurs traitements des maladies neurologiques rares. C’est dans ce contexte que notre équipe tente aujourd’hui de générer des nouveaux modèles de pathologies humaines chez le rongeur et de les caractériser afin de déterminer s’ils peuvent ou non devenir des modèles pertinents pour évaluer des composés issus de notre recherche sur leur capacité à ralentir ou arrêter la progression de ces maladies, dans le but de proposer aux patients des traitements adaptés et personnalisés.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier et de sélectionner le meilleur modèle transgénique ou la meilleure méthode d’induction conduisant aux modèles de neuro-physiopathologies les plus pertinents sur une cible donnée dans le cadre de la recherche contre les maladies rares neurologiques.

Procédures

•Administration des médicaments vétérinaires analgésiques et anesthésiques par voie sous cutanée ou intra-péritonéale (contention d’une durée maximale de 30s) •Administration de composés de référence ou véhicule par voie intra-péritonéale, sous-cutanée, per os ou intra-veineuse (chez la souris vigile en simple contention d’une durée maximale de 30s – 1 fois par semaine pendant 15 mois maximum) OU sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique par voie intra-cérébrale (durée maximale de 25 minutes – 2 fois maximum espacé de 14 jours) •Administration de substrat de bioluminescence selon la procédure expérimentale mise en oeuvre par voir intra-péritonéale (chez la souris vigile par contention d’une durée maximale de 30s – 1 fois par mois pendant 15 mois maximum) •Prélèvement de sang répété sur animal vigile (1 fois toutes les 3 semaines pendant 30 semaines maximum) : oContention d’une durée maximale de 2min oPiqûre de la veine marginale de la patte d’une durée maximale de quelques secondes oPrélèvement de sang d’une durée maximale de 15 secondes

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : -Des injections d’analgésiques et/ou d’anesthésiques réalisées en Sous cutanée, Intra péritonéal. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. -De l’administration d’agents inducteurs ou de composés de référence réalisées chez la souris vigile en Sous cutanée, Intra péritonéale, Intraveineux et Per Os. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. -OU selon la procédure mise en oeuvre, de la phase chirurgicale (2 chirurgies maximum séparées de 14 jours minimum d’une durée d’environ 20 minutes chacune) et du suivi post-opératoire. -Des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale ou saphène de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. -D’une perte de poids potentielle limitée à 20% du poids de l’animal. -Des signes cliniques observables associés à l’injection des agents inducteurs (troubles du comportement, altération de l’état général). La mise à jeun hydrique complète d’une durée maximale de 24h. Au-delà de 12h de jeun hydrique, les animaux peuvent présenter une perte de poids (

Devenir

Toutes les souris sont soit euthanasiées en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiées en fin d’études afin de réaliser des prélèvements de fluides et/ou de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, IPS…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal mimant la physiologie de la pathologie humaine. Il est donc nécessaire de valider les modèles physiopathologiques avant que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal (sain ou génétiquement modifié) possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant de tester l’efficacité des agents inducteurs aboutissant à la mise en place des modèles physiopathologiques plus relevant que les modèles in vitro existants, pour le traitement de maladies neurologiques rares. L’identification de modèles physiopathologiques qui récapitulent précisément les symptômes retrouvés chez les patients est critique afin de tester l’efficacité des nouvelles thérapies sur ces mêmes altérations. Le recours à l’animal est indispensable étant donné qu’une majorité des aspects physiopathologiques d’une maladie ne peuvent être récapitulés in silico ou in vitro.

Réduction

Les phases de caractérisation et de validation des modèles permettent d’appréhender le nombre d’animaux qui sera nécessaire pour les études d’efficacité de traitements pharmacologiques. Aucun animal ne sera utilisé pour des études d’efficacité si le modèle d’induction n’est pas validé préalablement. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, un accompagnement par le service des Biostatistiques sera assuré dans le but d’affiner le design expérimental. Pour les procédures dans lesquelles plusieurs paramètres seront testés (temps de traitement, durée de la modification environnementale...), les conditions les moins invasives seront testées en priorité pour conclure sur la validité du modèle établi dans ces conditions et éviter l’utilisation de cohortes supplémentaires. Les conditions expérimentales sont basées sur l’expérience et les données disponibles dans la littérature. Le prélèvement de sang répété, peu invasif et rapide, permet de prélever des échantillons de sang plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans le projet, tout en respectant les limites de volémies physiologiques. Lors des prélèvements effectués à la fin des études, un maximum de tissus et de fluides seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant différentes analyses biochimiques et/histologiques. Ce process nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque modèle étudié.

Raffinement

Dans les modèles dont l’induction le nécessite ou lors de l’administration de certains composés de référence, les injections intracérébrales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire. Les souris seront hébergées en groupe dès l’arrivage et pendant toute la durée de l’étude, sauf si les caractéristiques liées à la souche ne le permettent pas (agressivité entre congénère…) et en accord avec les recommandations de la Structure de Bien-Être Animal. Toute la phase chirurgicale, d’une durée d’environ 20 minutes, se fera sur couverture chauffante et/ou dans des enceintes chauffées réduisant ainsi significativement le risque d’hypothermie. Lors des injections de vecteurs viraux, il sera possible de suivre l’expression des protéines d’intérêt grâce à l’appareil IVIS Lumina. Il permet de réaliser une lecture de bioluminescence et de vérifier la qualité de l’injection intracérébrale. Les éventuelles recommandations en termes de limite d’âge ou de conditions de maintien émises par la Structure de Bien-Être Animal seront appliquées aux souris âgées ou génétiquement modifiées qui peuvent développer des signes pathologiques avec le temps. Des prélèvements de sang à la veine marginale ou saphène de la patte peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur de possibles biomarqueurs. Si des prélèvements sanguins répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excèdera pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien qui est accru lors des périodes post-chirurgicales (7 jours consécutifs) et pour les souris génétiquement altérées, réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Les recueils d’urine pour les examens biologiques seront réalisés sur litière hydrophobe en remplacement des cages à métabolisme, maintenant ainsi les animaux dans de meilleures conditions de stabulation. Le volume de recueils sera régulièrement contrôlé pour arrêter la diurèse si le volume nécessaire est obtenu et sans dépasser une durée maximale de 4h pour limiter le stress des animaux. Ce projet bénéficie d’une expérience interne et de données déjà existantes sur de nombreux modèles, tels que les « seeds » et les vecteurs viraux, mis en œuvre dans le cadre de plusieurs projets. Ainsi, cela constitue un socle de connaissance solide sur lequel nous nous appuyons afin de définir des mesures de raffinement cohérentes.

Choix des espèces

- La souris présente comme le rat une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. En particulier, sur le plan comportemental, de nombreux modèles d’induction et de tests ont été développés chez la souris, en miroir des fonctions cognitives, sensori-motrices, et des états émotionnels de l’Homme. - Les procédures d’induction et d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. Les modèles d'induction par agents biologiques chez la souris sont plus largement décrits dans la littérature que les modèles rat et notre expertise actuelle pour la souris est plus avancée que pour le rat. - La souris est génétiquement modifiable et ce avec des techniques de plus en plus performantes (ex : édition du génome), offrant une large palette de modèles pertinents pour l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles des maladies neurodégénératives. Les souris seront utilisées du stade « jeune adulte sevré » au stade « animal âgé ». L’âge des souris au moment des études effectuées dépendra du modèle utilisé : -Si l’étude concerne des injections de composés par voie cérébrale/orale ou périphérique, les souris utilisées sont de jeunes adultes sevrés ou adultes au moment de l’administration. L’âge d’utilisation dépendra des éventuelles recommandations en termes de limite d’âge qui pourront être émises par la Structure de Bien-Etre Animal.

Toutes tuées à la fin des expériences comportementales pour des analyses histologiques de leurs tissus, 1 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est isolée en cage individuelle dès huit semaines, pour six à sept semaines dans le cas de 1 224 d'entre elles, et 1 176 subissent trois jours de restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids. 576 souris reçoivent en plus une chirurgie d'injection intracérébrale d'environ quatre-vingt-dix minutes. Le porteur reconnaît que l'absence d'interaction sociale peut être une source de stress, tout en présentant l'isolement comme la condition pour mesurer la prise alimentaire individuelle et pour éviter les bagarres "fréquentes chez les souris mutantes", et conclut que ses études comportementales ne sont pas aversives.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’apporter de nouvelles données concernant les mécanismes qui régulent la balance énergétique ainsi que les processus motivationnels pour des récompenses naturelles. Ce projet permettra de disséquer les circuits impliqués dans la motivation pour l'exercice physique et d’étudier des cibles potentielles dans le traitement des troubles alimentaires (obésité, anorexie).

Bénéfices attendus

Ce projet vise une meilleure compréhension de la régulation de la balance énergétique d’un point de vue motivationnel et des circuits jouant un rôle dans ce mécanisme. L’utilisation de notre modèle comportemental permettra d’approfondir les connaissances au sujet de la neurobiologie des troubles alimentaires (anorexie, obésité). A long terme, ces données pourront être utilisées pour investiguer les cibles potentielles dans le traitement de ces troubles alimentaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à : (1)Hébergement individuel : cette condition concernera tous les animaux (1368). La durée de l’isolement sera de 6 à 7 semaines pour 1224 animaux et de 1,5 semaines pour 144 animaux. (2)Chirurgie pour injection intracérébrale : cette intervention concernera les animaux des procédures 1 et 3 : 576 animaux. La durée de ces chirurgies sera d’environ 90 min. (3)Injection sous cutanée : Les animaux ayant reçu des chirurgies pour injection intracérébrale (576 animaux) recevront 2 injections sous cutanée (analgésique et anesthésique local au niveau du crâne). Dans la procédure 4, 144 animaux recevront 1 injection (injection de micropuces permettant d’identifier les différents animaux). (4)Injection intra-péritonéale : ce geste concernera tous les animaux ayant reçu une chirurgie, soit 576 animaux. Les animaux recevront 4 injections d’analgésique (1 durant la chirurgie et 3 en post-opératoire). 192 animaux parmi ces animaux recevront aussi 2 injections durant l’étude comportementale. (5)Test comportemental : tous les animaux de cette étude seront concernés, soit 1368 animaux. Cette étude va durer 2 semaines pour les 192 animaux de la procédure 1 et 3,5 semaines pour les 1176 animaux des autres procédures. (6)Restriction alimentaire : Cette restriction sera de 3 jours et correspond au maintien à 90% de leur poids initial. Elle concernera les animaux des procédures 2, 3 et 4, soit 1176 animaux.

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet nécessitent de pouvoir étudier la prise alimentaire individuelle des souris. Celles-ci seront donc hébergées de manière individuelle dès l'âge de 8 semaines et ce jusqu'à la fin des procédures. Cette absence d’interaction sociale peut être une source de stress pour les animaux. Les injections avant les tests comportementaux peut également entrainer une douleur. Afin de diminuer la gêne engendrée par ces injections, le côté de l'animal qui sera injecté sera interverti chaque jour. La restriction alimentaire, permettant de faciliter l’apprentissage des animaux, pourrait entrainer une perte de poids supérieure à 15%. Dans ce cas, la restriction serait immédiatement arrêtée. Cependant, cette restriction ne devrait théoriquement pas entrainer cet effet indésirable parce qu’elle sera limitée à 3 jours. L'opération ne présente pas de risques majeurs et la douleur associée sera contrôlée par une anesthésie et des analgésiques adéquats. Si ces mesures sont prises correctement, il n'y a pas de signes de douleur après l'opération ou pendant la convalescence. Les traitements médicamenteux, les injections intrapéritonéales, et produits utilisés (et les doses) sont bien contrôlés en laboratoire et tolérés par les animaux.

Devenir

Les animaux de toutes les procédures seront mis à mort à la fin des expériences comportementales et des tissus seront récupérés pour procéder à des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico. De plus l'utilisation d'invertébrés, serait incompatible avec l'étude de la motivation pour une récompense telle que l'activité physique ou la prise alimentaire.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux à inclure sera de 12/groupe. Ce nombre d’animaux/groupe a été fixé (1) en utilisant des calculs de puissance nous permettant d’obtenir une différence significative pour les différentes variables d’intérêt qui seront évaluées dans l’étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (2) en se référant à des publications du domaine (3) en prenant en compte la variabilité que nous retrouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. Nous utiliserons 2 cohortes d'animaux (n=12/groupe/cohorte) afin de valider la reproductibilité des résultats. Nous avons regroupé dans la mesure du possible différents tests comportementaux sur les mêmes lots de souris, et avons conçus nos expériences de manière à obtenir un maximum d'informations à partir des mêmes animaux.

Raffinement

Pour le raffinement, plusieurs précautions seront prises en compte. Les souris seront hébergées dans des cages individuelles pour contrôler la consommation de nourriture et pour éviter les bagarres, fréquentes chez les souris mutantes. Les cages d’hébergement des souris seront enrichies en matériel de nidification (7 carrés de cellulose), ainsi que d’un morceau de bois à ronger et d’un tunnel en carton (comme prévu par la directive 2010/63/CE). Durant les études comportementales, les animaux seront manipulés grâce au tunnel en carton présent dans leur cage d’hébergement afin d’éviter la préhension par la queue. Les animaux, vivant dans les chambres opérantes, auront du nid provenant de leur cage d’hébergement, ainsi qu’un abri/jouet. Les chirurgies intracérébrales seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux recevront un traitement analgésique. Suite à la chirurgie, chaque animal est suivi quotidiennement (poids, prise alimentaire, aspect général) et une étiquette est accrochée au dos de sa carte de cage individuelle pour le personnel animalier, avec l’ensemble des informations concernant son suivi post-opératoire sur une semaine. Des points limites ont été définis par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 15%/jour, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Si ce point est atteint, nous préviendrons immédiatement la vétérinaire de l’établissement afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (comme la poursuite du traitement analgésique). En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort par dislocation cervicale afin de lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions pas soulager. Nos études comportementales ne sont pas aversives, nous ne devrons donc en théorie jamais atteindre ce point limite.

Choix des espèces

1) Ce projet nécessite l’utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement chez les modèles de souris. 2) Reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Des modèles animaux moins évolués (par exemple, ver C. elegans ou poisson zèbre) ne peuvent convenir pour nos observations comportementales (course et prise alimentaires). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) qui se justifie par l’immaturité du système nerveux au cours de l’adolescence.