Troubles nerveux
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Hébergement, reproduction et génotypage de souris génétiquement modifiées pour des études immunohistochimiques et électrophysiologiques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 111 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage et de génotypage de lignées génétiquement modifiées, 1 543 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 568 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Le seul geste pratiqué sur l'animal vivant est le prélèvement d'un millimètre de queue pour le génotypage, dont le porteur reconnaît qu'il génère stress, douleur ponctuelle et saignement. Les souris dont le génotype ne convient pas à la gestion de l'élevage sont mises à mort, les reproducteurs sélectionnés étant maintenus en vie pour produire les portées suivantes. Le porteur indique qu'une des lignées manifeste des symptômes nuisant à sa santé et prévoit un génotypage avant la troisième semaine pour repérer les mutants avant l'apparition de la maladie.
Objectifs
L'équipe étudie le système nerveux moteur situé dans la moelle épinière impliqué dans la locomotion. Ce réseau de neurones, pour qu'il fonctionne correctement, doit être régulé finement. L'un des projets de l'équipe est d'étudier les mécanismes moléculaires au niveau de ces neurones qui seraient responsables de l'activation de ce réseau innervant les muscles locomoteurs. Des protéines particulières présentes en grande quantité à la surface des neurones, sont principalement ciblées. Ainsi, l'élevage de ces lignées de souris chez qui certaines protéines sont altérées ou spécifiques d'un neurone identifié, est primordial pour caractériser et spécifier leur activité générée dans les neurones du système nerveux.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des animaux de ces lignées faite de façon précoce nous permet d'optimiser la gestion de l'élevage mais aussi de contrôler et maîtriser la non apparition du phénotype dommageable chez les souris susceptibles de le développer. L'utilisation de souris génétiquement modifiées est nécessaire pour mieux comprendre la contribution de protéines d'intérêt dans l'activité du réseau locomoteur spécifiquement dans des neurones identifiés. De plus, une inactivation de la protéine ciblée chez ces animaux particuliers, nous permet d'explorer des mécanismes qui lui sont spécifiques et ainsi mettre en lumière des concepts pouvant être communs à certaines pathologies comme la lésion de la moelle épinière, l'épilepsie ou d'autres maladies neurodégénératives. La recherche qui découle de ces lignées de souris profitera à l'ensemble de la communauté scientifique en lien avec ce domaine de recherche.
Procédures
La plupart des interventions sur ces animaux se fera post-mortem. La seule intervention que ces animaux subissent de leur vivant, est le prélèment de tissu à l'extrémité de la queue (segment de 1mm) pour le génotypage grâce à une paire de ciseaux adaptée, notamment chez le jeune qui n'a pas de poils. Il n'est prévu qu'une seule intervention par animal d'une durée de 1 minute. Une fois que le génotypage sera mis au point sur le follicule pileux, un génotypage plus tardif pourra être effectué si celui ci est compatible avec la technique expérimentale utilisée.
Impact sur les animaux
Biopsie de l'extrémité de la queue qui peut engendrer un stress, une douleur ponctuelle et un saignement. Les femelles reproductrices seront soumises à un stress accru lors de la dernière semaine de gestation du fait de leur isolement comme pour les mâles reproducteurs séparés de la femelle.
Devenir
Mise à mort des animaux de génotype non utile pour la gestion de l'élevage en gardant en vie les animaux reproducteurs sélectionnés en fonction de leur génotype. Utilisation des animaux sélectionnés pour les expérimentations pour l'objectif scientifique.
Remplacement
Nos évaluations et caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des neurones connectés les uns aux autres formant ainsi un réseau complexe. Pour cela, nous utilisons des tissus prélevés sur souris d'élevage. En effet, il n'est pas possible de reproduire sur un modèle bioinformatique ou en culture cellulaire la complexité de ces connexions ou la particularité d'un neurone spécialisé, même si de nombreuses études préliminaires in vitro ont permis de diminuer le nombre d'animaux nécessaires et/ou à retarder leur utilisation.
Réduction
Les techniques de prédilection employées dans cette étude sont de l'ordre de 4. Elles nous permettent d'utiliser un même animal pour plusieurs mesures et différentes conditions d'exposition. Le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre une significativité dans nos résultats est ainsi limité à son strict minimum. En effet, grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques, à chaque question scientifique posée, nous estimons un nombre d'individu minimal suffisant pour atteindre une significativité. Ainsi par exemple, pour tester l'efficacité d'une molécule médicamenteuse sur l'activité du neurone, nous choisissons deux techniques spécifiques qui nécessitent chacune, 8 animaux par condition. En revanche, pour toutes les questions relatives à l'efficacité d'une molécule médicamenteuse sur la quantité de protéine présente à la surface de neurones ou sur sa manière dont elle est exprimée à l'intérieur d'un tissu en fonction des traitements employés, cela nécessite l'emploi de 2 autres techniques qui demandent entre 4 et 12 animaux par condition. Sur l'ensemble de la saisine, il y aura 2111 souris qui seront génotypées. Plus de la moitié sera utilisée pour leur génotype d'intérêt en lien avec les questionnements scientifiques du projet de recherche, tandis que l'autre partie sera utile pour le maintien de la lignée. Dans un moyen long terme, nous estimons que la mise au point du génotypage sur follicule pileux nous permettra le maintien de la lignée sans geste invasif et sans phénotype dommageable, puisque l'on privilégiera les accouplements sans risque. Seul le prélèvement d'un peu de tissu de l'extrémité de la queue sera toujours effectué sur les souriceaux provenant d'un accouplement à risque dédié à une série expérimentale spécifique.
Raffinement
Après sevrage, les animaux seront hébergés entre 3 et 5 par cage en fonction de leur âge, de leur sexe et de leur poids. Les cages seront enrichies régulièrement de rondin de bois, de tunnel, de matériel de nidification. Concernant les accouplements à risque, une observation renforcée sera mise en place par l'expérimentateur et les zootechniciens pour cette lignée qui manifeste des symptômes nuisant à la bonne santé de l'animal uniquement chez les souris dont la mutation touche les gènes impliqués. Un génotypage systématique des animaux sera fait avant la 3eme semaine post-natale afin d'identifier les mutants le plus tôt possible avant l'apparition de symptômes de la pathologie. Un point d'arrêt sera de toute façon établi en cas d'apparition précoce des symptômes. La biopsie sera effectuée par un personnel qualifié qui maitrise le geste avec agilité et rapidité permettant ainsi de limiter le stress, l'inconfort et la douleur chez l'animal.
Choix des espèces
Les lignées de souris seront utilisées essentiellement jusqu'à la 2eme semaine post-natale en expérimentation pour l'enregistrement de l'activité des neurones ou la quantification de protéines d'intérêt à la surface des neurones et leur localisation dans le tissu nerveux. Ce stade précoce est essentiel pour la compréhension de la contribution des protéines ciblées dans la mise en place de l'activité neuronale. Une inactivation provoquée d'une de ces protéines chez des animaux génétiquement modifiés nous permet d'explorer des mécanismes qui lui sont spécifiques et ainsi mettre en lumière des concepts pouvant être communs à certaines pathologies comme la lésion de la moelle épinière, l'épilepsie, ou d'autres maladies neurodégénératives.
Evaluation des effets de composés dans des modèles cognitifs chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
22050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal peut subir jusqu'à 28 tests comportementaux non détaillés, 672 administrations de substances et 90 prélèvements sanguins, certains protocoles incluant des chocs électriques provoquant une réaction aversive. Le porteur signale désorientation, convulsions rares, apathie, perte de poids et léthargie selon les substances employées pour induire un trouble cognitif. Il reconnaît tester aussi des molécules déjà sur le marché, pour mesurer la "prédictivité" de ses propres modèles.
Objectifs
Le trouble cognitif est un trouble mental fréquent au cours du vieillissement normal puisqu'il touche jusqu'à 50 % des sujets âgés de plus de 55 ans. Les principaux types de troubles cognitifs marqués sont le délire, la démence, la perte d’attention et l'amnésie. Les cas les plus sévères sont associés aux maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington. A l’heure actuelle, il y a seulement quatre médicaments (donepezil, rivastigmine, galantamine et memantine) reconnus officiellement pour le traitement des symptômes cognitifs. Les effets de ces molécules restent modestes et ne sont pas dénués d’effets secondaires dont les plus courants sont des troubles gastro-intestinaux. Ainsi, la recherche vise à trouver un médicament plus efficace sans effets secondaires majeurs et à disséquer les mécanismes conduisant aux troubles cognitifs. A l’heure actuelle, le criblage des molécules aux effets procognitifs peut se faire sur les modèles basés sur la capacité d’apprentissage et de mémoire chez le rat ou la souris non transgéniques ayant un dysfonctionnement mnésique naturel lié au vieillissement ou induit pharmacologiquement. En effet, en fonction de la situation considérée les troubles cognitifs peuvent résulter de l’altération de différents phénomènes comme l’altération de la voie cholinergique, l’altération de la voie glutamatergique, l’augmentation de l’inflammation cérébrale,… Dans ce projet, nous nous proposons de tester des traitements en développement sur leur efficacité à améliorer la cognition. Chaque procédure de ce projet utilise un moyen diffèrent pour induit un trouble cognitif chez la souris afin de mimer différentes situations pathologiques de l’altération de la fonction cognitive mais utilise le même test d’évaluation de la cognition chez la souris.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter les troubles cognitifs. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles,c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.
Procédures
Les animaux de ce projet être amenés à réaliser 28 tests comportementaux d’évaluation de leur capacité cognitive et/ou de motricité (10-30 min), recevoir un maximum de 672 administrations et de 1 à 90 prélèvements sanguins sur une période de 168 en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.
Impact sur les animaux
Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des souffrances au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des comportements liés à la mémoire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 à 15 animaux. Des analyses statistiques finales seront réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 360 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi par du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Lors de l’utilisation de souris âgées le nombre d’animaux par cage est réduit et l’enrichissement doublé pour limiter les phénomènes de dominance. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en oeuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris dans les études des phénomènes mnésiques. De plus tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Les atteintes cognitives sont des phénomènes qui peuvent être liés à l’âge mais cela n’est pas systématiquement le cas. Ainsi dans ce projet nous utilisons des souris âgées au minimum 4 à 5 semaines au début du projet.
Entretien de la lignée transgénique MAPT+ (suprexprimant le gène humain de la forme T34 de la protéine tau portant la mutation P301S)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Mises à mort avant six mois, 1638 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, pour entretenir une lignée génétiquement modifiée qui surexprime une protéine tau humaine mutée. Chaque animal subit un génotypage par section de deux millimètres de queue dans ses deux premières semaines de vie. Le porteur signale que la vie en élevage peut entraîner des blessures de bagarre, un pelage dégradé et un amaigrissement, et que le tatouage et le génotypage causent stress ou douleur. La mise à mort précoce vise à éviter le "phénotype dommageable" que la lignée est justement conçue pour développer.
Objectifs
Tau est une protéine qui stabilise le cytosquelette cellulaire. Elle est abondante édans le cerveau, et beaucoup plus rare ailleurs. Des mutations de cette protéine sont retrouvées dans de nombreuses pathologies neurodegeneratives, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la démence frontotemporale… La lignée qui fait l’objet de cette saisine présente une évolution rapide de la maladie, avec des répercussions cellulaires constatées des 3 mois. Le choix de cette lignée est justifié par le modèle expérimental, la tranche d’hippocampe en culture, qui implique l’utilisation d’animaux jeunes.Le but de ce projet est l’entretien de la lignée murine transgénique surexprimant le gène humain codant pour la protéine tau portant une mutation pathologique, en vue d'utilisation à des fins de recherche fondamentales.
Bénéfices attendus
La lignée sera utilisée dans le cadre d’un grand projet de recherche impliquant cinq instituts, , dont le but est de comprendre les mécanismes communs entre 3 pathologies neurodégénérative très fréquentes : la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer et la sclérose latérale amyotrophique. Nous espérons que ces travaux nous permettrons de disséquer les perturbations de communications cellulaires constatées dans ces 3 maladies. La lignée sera également utilisée pour des projets propres au laboratoire, dont le but sera de déterminer les altérations mitochondriales dans la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Toutes les animaux seront soumis à une procédure de génotypage entre lors des deux premières semaines de vie. 0,2 cm de queue seront prélevés avec un ciseau pour génotypage. La procédure de prélevement dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles pouvant se declarer suite à bagarre chez les animaux maintenus en élevage à savoir blessure, plaie, pelage dégradé, amaigrissement visible. les animaux pourront également ressentir du stress ou une douleur lors des procédures de tatouage et génotypage.
Devenir
Les souris seront mises à mort avant 6 mois. Cela permet d’éviter l’apparition du phénotype dommageable. Certains animaux seront utilises pour des cultures de tranches de cerveau (modèle in vitro de la maladie d''Alzheimer) une semaine après la naissance.
Remplacement
D'un point de vue méthodologique, nous nous engageons à respecter les règles de remplacement, de réduction et de raffinement. Pour le R de remplacer : Malheureusement, les modèles in vitro de la maladie d’Alzheimer existant à ce jour sont incomplets (cellules en cultures ne représentant pas l’intégralité des communications physiologiques entre les cellules du cerveau). Les modèles s’appuyant sur des organismes simples tels que zebrafish ou c. elegans ne sont encore que préliminaires. Ainsi, le modèle murin reste la référence dans l’étude de ce type de pathologie, justifiant le maintien de leur utilisation.
Réduction
Dans le cadre du respect de la règle des 3R, pour diminuer le nombre d’animaux, la production sera contrôlée par l’établissement utilisateur. 819 animaux sont concernés par cette saisine selon le calcul suivant: Sachant que 1 femelle produit en moyenne 9 bébés par portée pour cette lignée nous aurons la production de : 1 portée toutes les 3 semaines sur 5 ans = (260/3) = 86,7 portées x 9 bébés x 2 couples = 1560 souris produites Dont 780 hétérozygotes et 780 WT (répartition du génotype 50/50). Les 28 males reproducteurs seront issus de ces 780 hétérozygotes. Nous ajoutons 5% pour tenir compte des variabilités potentielle de répartition de génotype dans les portées, ou de nombre de portées par femelle : 1560*5/100=78. 1 portée toutes les 3 semaines est suffisante au maintien de la lignée et au prélevement des individus nécessaires pour maintenir le modèle in vitro de la maladie d’Alzheimer.
Raffinement
Tout est mis en place pour le bien etre animal. Les souris seront hébergées en cages collectives avec un milieu enrichi. La production sera faite en croisant des males hémizygote pour la mutation et des femelles wild type. Afin de raffiner les procédures, les males reproducteurs hémizygotes feront l’objet d’une surveillance régulière,afin de leur assurer une vie sans souffrance. Ils seront sacrifiés à 6 mois, soit bien avant l’apparition du phénotype dommageable. Ce point pourra être ajusté en fonction du bien-être de l'animal, si les points limites définis en terme d'apparence, plaie, perte de poids ou comportement pathologique sont atteints.
Choix des espèces
La souris est le modèle de rongeur le plus utilisé à l’heure actuelle pour l’étude des mécanismes neurodégénératifs dans le cadre de la maladie d’Alzheimer. Afin de pouvoir intégrer nos résultats dans la littérature existante, nous utiliserons la souris comme modèle expérimental. Les animaux seront utilisés jusqu'à 6 mois. C’est un bon compromis entre des animaux assez âgés pour pouvoir assurer un maintien de la lignée, mais assez jeunes pour ne pas présenter les premières manifestations du phénotype dommageable.
Etude du remodelage des neurones à parvalbumine dans l’hippocampe de souris modèles de la maladie d’Alzheimer soumises à un enrichissement environnemental
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 570 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de léger à modéré, 1 456 étant mises à mort pour prélèvement de tissus et 114 gardées vivantes pour d'autres projets. Modèles d'Alzheimer, elles subissent des chirurgies d'une à deux heures et demie avec injections et pose d'électrodes, des enregistrements cérébraux en cage isolée et des tests de mémoire spatiale et sociale. Le projet cherche à relier l'effet d'un environnement enrichi sur la mémoire au remodelage de certains neurones de l'hippocampe. Le porteur affirme qu'étudier des comportements complexes rend "indispensable" le modèle animal.
Objectifs
Dans le cerveau, certains neurones jouent un rôle clé dans le contrôle de l’activité des autres neurones et dans la formation et le maintien des souvenirs. Après un apprentissage, ces neurones subissent des modifications qui leur permettent d'assurer la stabilité des souvenirs nouvellement acquis. Or, ces neurones fonctionnent de façon anormale dans le cerveau de souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA) ainsi que celui de patients atteints par cette pathologie. Chez l'humain, les études épidémiologiques indiquent qu'une vie riche en expériences diverses, que ce soit sur le plan intellectuel, sportif ou social par exemple, permet de former une réserve cognitive qui permettrait de diminuer les risques ou de ralentir la progression des maladies neurodégénératives. Cette ressource repose sur le fait que le cerveau peut compenser différentes lésions ou affections cérébrales en utilisant des réseaux neuronaux préexistants, ou en activant de nouvelles connexions neuronales. En accord avec cette idée, les souris modèles de la maladie d'Alzheimer placées dans un environnement enrichi (EE) qui comporte des expériences sensorielles et sociales stimulantes (cages plus grandes, avec plus de congénères, et des objets changés régulièrement) ont des capacités d’apprentissage et de mémoire améliorés au moins pendant plusieurs mois. Ce projet vise à démontrer que les améliorations comportementales observées chez les souris Alzheimer sont directement liées aux modifications subies par les neurones impliqués dans la formation et le maintien des souvenirs suite à ces stimulations. Il cherchera également à évaluer si les changements subis par ces neurones suite au séjour dans l’EE s’accompagne d’un rétablissement de l’activité électrique dans la région cérébrale clef dans la formation des souvenirs, l’hippocampe.
Bénéfices attendus
Ce projet se place dans le contexte général de la compréhension des substrats neuronaux à l’amélioration comportementale et cognitive observée suite à des stimulations sensorielles et sociales dans la maladie d’Alzheimer (concept de réserve cognitive). Précisément, l’objectif de ce projet est de montrer le lien causal entre le remodelage d'une population de neurones et l’amélioration de la mémoire après le séjour dans un environnement enrichi (EE) chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Dans un premier objectif, nos expériences nous permettront de déterminer si c’est l’activation de ces neurones qui sous-tend l’amélioration de la mémoire des souris, ou s’il s’agit de la modification de ces neurones, ou si les deux sont nécessaires. Le deuxième objectif permettra d’étudier si les changements subis par ces neurones suite à un séjour dans un EE s’accompagnent d’un rétablissement de l’activité électrique cérébrale. Le troisième et dernier objectif permettra d’évaluer si la stimulation de ces neurones, en dehors de toutes stimulations environnementales, et suffisante pour obtenir des bénéfices comportementaux et d’activité cérébrale chez les souris modèles de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale d’une durée variant de 1h à 2h30 en fonction des gestes réalisés : ils pourront recevoir des injections (entre 1h et 1h30 par animal), des poses d'électrodes (environ 1h par animal), ou la combinaison des deux gestes précédemment cités (entre 2h et 2h30 par animal). Une partie des individus sera soumise à trois enregistrements de l’activité cérébrale, espacés dans le temps, et qui dureront de 72h à 24h. Durant ces phases d’enregistrements, les animaux seront placés dans des cages individuelles. Enfin les souris sont soumises à des tests comportementaux afin d’évaluer leur mémoire spatiale (3x10 min par animal) et leur mémoire sociale (90min par animal).
Impact sur les animaux
La procédure chirurgicale peut induire une douleur modérée au stade post opératoire (environ 12h). De plus, durant les enregistrements de l’activité cérébrale, les souris seront placées individuellement dans des cages isolées les unes des autres ce qui peut induire un stress durant les premières heures (3 sessions d’une durée totale de 120h). Par ailleurs, toutes les manipulations liées aux tests comportementaux peuvent engendrer un stress léger. Enfin, dans le cadre de leur suivi à l’aide d’une grille de scoring par le personnel de l’animalerie, les animaux sont pesés deux fois par semaine, ce qui peut engendrer un léger stress dû à leur manipulation.
Devenir
1456 souris seront mises à mort pour réaliser des prélèvements de tissus et effectuer des observations anatomiques et histologiques nécessaires à la validation scientifique de ce projet. 114 souris seront maintenues en vie et pourront être réutilisées dans d’autres projets.
Remplacement
L’objectif du projet étant l’étude de comportements complexes et les activités cérébrales associées à la maladie d'Alzheimer, il est indispensable de travailler sur un modèle animal. Il s’agit de valider une stratégie thérapeutique dans un modèle préclinique.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum pour nous permettre de comparer statistiquement les groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d'animaux, la mémoire sociale et la mémoire spatiale seront étudiés sur les mêmes individus.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupe de 2 à 5 individus dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Après réception, un temps d'habituation d'une semaine est respecté avant le début des expériences. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par du personnel formé au soin et des points limites ont été définis à partir d’une grille de scoring. En cas de blessure ou de souffrance, les animaux recevront un traitement analgésique adapté. Tous les signes de souffrance détectés lors de l’observation quotidienne tels qu’un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos voûté, une expression faciale modifiée, une altération du pelage, une perte de poids > 20% conduiront à la mise à mort de l’animal en accord avec le vétérinaire référent. Concernant les chirurgies, elles seront réalisées sous anesthesie générale dans des conditions aseptiques et accompagnées d'une analgésie.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris car il existe des souris modifiées génétiquement présentant des symptômes similaires à la maladie d’Alzheimer humaine. Elles seront utilisées à l’âge de 5-6 mois car à cet âge, les souris présentent un stade modéré́ de la maladie. En ce qui concerne les souris démonstratrices pour les tests de mémoire sociale, elles seront toutes des femelles non-transgéniques, âgées entre 3 et 9 mois. Cette tranche d'âge correspond à des souris adultes. En effet, il est préférable d'utiliser des souris démonstratrices ni juvéniles (moins de 8-10 semaines), ni âgées (plus de 9-10 mois), ce qui pourrait entrainer des comportements sociaux différents.
Evaluation préclinique d’une immunothérapie combinée dans la Maladie d’Alzheimer et autres pathologies liées à la protéine Tau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
1 958 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent un modèle de maladie neurodégénérative ou un système immunitaire déficient, subissent une biopsie d'identification sur souriceau vigile, jusqu'à 35 injections dans l'abdomen, jusqu'à deux injections dans le cerveau sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, pour tester une immunothérapie ciblant les cellules immunitaires dans la maladie d'Alzheimer. Les retombées annoncées pour les patients sont renvoyées à de futurs essais cliniques, alors que le porteur a déjà lancé un essai pilote. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent qu'une fraction des interactions en jeu et conclut qu'un modèle animal est "totalement indispensable".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive de la mémoire et des fonctions cognitives. Elle est définie par deux types de lésions cérébrales : celles liées à la protéine A-Béta, et celles liées à la protéine Tau. Ces agrégats protéiques induisent une réaction immunitaire à plusieurs composantes. La première composante, consiste en une inflammation chronique cérébrale pouvant avoir des effets bénéfiques ou délétères. Des études récentes ont montré l’existence d’une seconde composante, par laquelle des cellules immunitaires infiltrent le cerveau et promeuvent la progression du déclin cognitif. Plusieurs analyses chez l’Homme et dans des modèles expérimentaux suggèrent que ces cellules ont un rôle délétère dans la MA. Des études ont montré que la modulation de ces cellules immunitaires délétères permet de réduire la perte de mémoire et de modifier l’inflammation cérébrale dans un modèle murin de pathologie A-Béta. Ces cellules immunitaires régulatrices pourraient également contrôler les réactions immunitaires pathogènes liées à la protéine Tau pathologique. Sur la base d’études pré-cliniques dans un modèle murin de pathologie Tau, l’objectif de ce projet est d’évaluer une approche thérapeutique innovante ciblant les cellules immunitaires dans la MA et d’autres pathologies liées à la protéine Tau.
Bénéfices attendus
La Maladie d’Alzheimer (MA) touche environ 1 million de personnes en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Cette maladie, sans traitement, nécessite une prise en charge importante liée à la perte d’autonomie des patients. Des études précliniques antérieures dans un modèle murin de MA ont apporté la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique d’un traitement à faible dose d’une molécule. Cette preuve nous a permis d’initier un premier essai clinique pilote pour évaluer l’efficacité thérapeutique de ce traitement modulant les réponses immunitaires délétères dans la MA précoce. Ce projet vise à présent à évaluer et établir la preuve de concept pré-clinique de l’efficacité accrue d’une nouvelle approche ciblant les réponses immunitaires pathogènes associées aux agrégats de protéine Tau. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.
Procédures
Les animaux modèles de la Maladie d’Alzheimer développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Les animaux seront identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie (>1mm) effectuée de manière précoce sur animal vigile. Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des injections répétées au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) à raison d’un maximum d’une injection quotidienne durant 10 jours à l’âge de 3 mois puis de rappel toutes les 3 semaines durant 5 jours jusqu’à l’âge de 9 mois (environ 20 secondes par injection). Les injections seront réalisées sur animal vigile avec au minimum 1 injection et au maximum 35 injections intra-péritonéales sur la durée du traitement. Ils auront également au maximum deux injections au niveau du crâne (intracérébroventriculaire) à l’âge de 3 mois pour la première et la seconde à un temps qui sera défini au cours du projet (environ 30 minutes par procédure chirurgicale). Ces injections seront réalisées sous analgésie et anesthésie. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile à la fin des 10 premiers jours puis au maximum toutes les 2 semaines sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement). Les animaux seront prélevés entre 1 et 9 fois sur la durée du traitement. Des tests comportementaux seront effectués à l’âge de 9-10 mois. Ces tests durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 6 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de maintien prévue en vue des prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entraîner des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensibles aux infections. La biopsie (
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact du traitement sur les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
L’ensemble de ce projet vise à mieux comprendre les interactions neuroimmunes au cours des maladies neurodégénératives. Il nécessite donc l’utilisation d’un système expérimental intégré, permettant de comprendre la physiologie du système nerveux central et ses interactions encore mal connues avec le système immunitaire. Ces interactions ne peuvent être reproduites par des cultures cellulaires, qui ne permettent que l’étude du contact entre les cellules immunitaires et les cellules nerveuses. Or, ce type d’interaction ne constitue qu’une fraction minoritaire des échanges en jeu dans les maladies neurodégénératives. Des simulations informatiques ont également été effectuées et nous ont permis de valider que des réponses immunitaires spécifiques contre la protéine Tau étaient possibles. Cependant, l’effet de la modulation de ces réponses sur les maladies neurodégénératives ne peuvent être évaluées que dans un organisme vivant. Un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1958 souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux des pathologies neurodégénératives et de lignée immunodéficiente nécessaire à la mise en œuvre de ce projet. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Dans le cadre des traitements, ils seront initiés à l’âge de 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie. Les animaux seront ensuite analysés à 9-10 mois (âge normal d’apparition des troubles cognitifs). Justification du sexe : Concernant les modèles transgéniques utilisés, nos résultats préliminaires indique qu’il existe une différence de phénotype comportemental et neuroimmunitaire entre mâles et femelles. Ainsi, l’ensemble des expériences sera réalisé sur les deux sexes de manière indépendante.
Etude de la plasticité de la myéline dans le cadre d’un hébergement individuel chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est hébergée seule pendant huit semaines, condition dont le porteur reconnaît qu'elle peut provoquer anxiété, agressivité et baisse des capacités cognitives, avant des tests d'interaction sociale avec un congénère. L'étude cherche à savoir si l'isolement modifie la myéline chez des souris porteuses d'une mutation, en écho à l'isolement social des personnes âgées. Le porteur affirme que ces questions "intégrées" rendent les études sur l'animal "incontournables".
Objectifs
Notre groupe étudie la physiopathologie de maladies du cerveau, avec un intérêt plus particulier pour certaines maladies dans lesquelles sont observées des anomalies de la myéline, une structure qui entoure les axones des neurones et permet d’optimiser la vitesse de conduction de l’influx nerveux. Nos travaux ont montré qu’une mutation dans un gène que nous étudions conduit à des anomalies de la myéline chez des souris génétiquement modifiées. L’objectif du projet proposé ici fait suite à ces observations et vise à déterminer si les anomalies de la myéline chez ces souris peuvent être modifiées en fonction des conditions de vie, en particulier dans le cadre d’un hébergement individuel.
Bénéfices attendus
La myéline joue un rôle essentiel dans le fonctionnement du cerveau. Des modifications de la myéline ont été associés à de multiples conditions physiologiques et pathologiques tout au long de la vie, notamment au vieillissement normal du cerveau, et à des troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques (schizophrénie, troubles bipolaires, troubles du spectre autistique), des maladies dégénératives (maladie d'Alzheimer) ou démyélinisantes (sclérose en plaques). L’un des enjeux actuels majeur est d’identifier des éléments qui pourraient améliorer ou défavoriser la condition des patients et/ou personnes âgées. Plusieurs études ont démontré, chez l’homme comme chez la souris, que l’état structurel et fonctionnel de la myéline est influencé par les conditions de vie. Par exemple, des modifications structurelles « favorables » de la myéline ont été observées dans le cadre de l'apprentissage d'une nouvelle langue ou de nouvelles tâches motrices, telles que la pratique du piano et du jonglage. À l'inverse, il a été montré que certaines formes de privation sensori-motrice, comme l'isolement social, entraînent une diminution de la myéline et une réduction de l'interaction sociale. De nombreuses mutations du gène que nous étudions ont été identifiées dans la population générale. Nos études ont montré qu’elles pourraient constituer un facteur de variabilité interindividuelle au niveau de la structure de la myéline. Notre projet va permettre d’évaluer leur impact potentiel chez les patients et les personnes âgées qui souffrent fréquemment d’isolement social (Croix Rouge : 23 pourcents des personnes isolées, sans contact social régulier, sont des personnes âgées de plus de 75 ans).
Procédures
1) Hébergement individuel d’animaux vigiles pendant 8 semaines, puis regroupement 4 par cage pendant 4 semaines pour une partie des animaux. 2) Hébergement en groupes (4 par cage) d’animaux vigiles pendant 8 semaines ou 12 semaines. 3) Test d’interaction sociale d’animaux vigiles avec un congénère de même âge et de même sexe : 3 fois 30 minutes par animal. 4) Chirurgie sans réveil sous anesthésie/analgésie : 1 fois par animal, temps inférieur à 2 minutes
Impact sur les animaux
Les souris hébergées en individuel peuvent présenter des comportements anxieux plus importants, de l’agressivité et une diminution de la cognition. Le test de comportement (interaction sociale) peut également induire des comportements anxieux et de l’agressivité chez les animaux. L’administration des anesthésique et antalgique avant la chirurgie sans réveil peut induire un stress et une légère douleur chez l’animal au point d’injection.
Devenir
L’analyse d’état de la myéline sera réalisée par des techniques qui nécessiteront d’euthanasier les souris par des méthodes réglementaires.
Remplacement
Les questions que nous posons dans ce projet concernent des aspects très intégrés pour lesquels les études sur l’animal sont incontournables. La souris constitue un modèle de choix dans la mesure où : 1) le développement et la structure de la myéline sont très bien conservés entre l’homme et la souris; 2) Des études scientifiques ont montré que les conséquences sur la myéline de l’hébergement individuel chez la souris miment les conséquences observées chez l’homme ; 3) le développement et la structure de la myéline ont été extrêmement bien caractérisés chez la souris, favorisant l’identification de phénotypes robustes.
Réduction
Nous veillerons à réduire au maximum le nombre de souris utilisées : 1) en combinant plusieurs approches expérimentales ; ainsi, les couples de reproduction seront réalisés de façon à ce que tous les souris soient utilisées et réparties dans les différentes procédures ; 2) en optimisant au maximum les données obtenues à partir d’une expérience donnée. Par ailleurs : 1) La transmission de la mutation pour la lignée transgénique que nous étudions étant mendélienne, nous serons en mesure de comparer les souris sauvages et mutantes issues d’une même portée ; 2) Tous les animaux générés, mâles ou femelles, seront informatifs ; 3) Nos très bonnes connaissances des protocoles, ainsi que la littérature scientifique, nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque expérience, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse et reproductibilité des résultats qui seront analysées avec des tests statistiques. Nous utiliserons pour ce projet 288 souris.
Raffinement
Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux seront stabulés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température et de l’hygrométrie, un cycle de lumière (12/12) et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Afin de minimiser l’impact de l’hébergement individuel, les souris seront hébergées dans un environnement sécurisant (maisonnettes/nid/bâton à ronger) et des observations du bien-être seront réalisées 1 fois/jour. En cas de comportements anormaux des points limites sont définis : manque de toilettage, prostration, léthargie ou manque d’intérêt pour la nourriture, agitation excessive, stéréotypies et/ou de perte de poids. Si un point limite est détecté, l’état des animaux sera surveillé plusieurs fois par jour. En cas de souffrance, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées. L’acte de chirurgie sera réalisé sous anesthésie/analgésie conformément aux bonnes pratiques vétérinaires en vigueur.
Choix des espèces
Choix des souris : 1) Le développement et la structure de la myéline sont très bien caractérisés chez la souris, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. 2) Les conséquences de l’hébergement individuel / réintégration sociale sur la structure de la myéline ont été bien caractérisées chez des souris de type sauvage, constituant une référence pour notre étude et permettant d’optimiser les conditions expérimentales pour réduire au maximum le nombre de souris utilisées. 3) Nous pouvons également comparer des souris sauvages et mutantes issues d’une même portée dans la mesure où la transmission de la mutation que nous étudions est mendélienne. Stade de développement : Nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines, âge auquel la mise en place de la myéline est terminée, la rendant sujette à modification au cours de l’hébergement individuel. Nous suivrons en ce sens un protocole publié, montrant pour la première fois l'impact de l'hébergement individuel sur la myéline chez des souris adultes.
Plasticité fonctionnelle de la voie descendante réticulo-spinale après lésion de la moelle épinière et stimulation régénérative
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une lésion de la moelle épinière leur est infligée sous anesthésie, avec deux heures de chirurgie et des injections de traceurs, ce qui provoque une paralysie des membres postérieurs et des difficultés à se nourrir et boire au réveil. La moitié reçoit ensuite une stimulation magnétique, et tous les animaux sont tués vingt à soixante-cinq jours après la lésion pour prélever la moelle. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne remplace l'expérimentation in vivo et que le modèle animal reste "nécessaire" pour mesurer la repousse des fibres nerveuses.
Objectifs
Les lésions médullaires traumatiques sont responsables d’une perte des fonctions sensitives, autonomes et motrices liées à une forte inflammation, une démyélinisation ainsi qu’une diminution de la repousse axonale. La thérapie par stimulation magnétique trans-spinale répétitive a permis notament de réduire l’inflammation, induire une remyélinisation et une repousse axonale après lésions médullaires traumatiques. Toutefois, la plasticité et l’identité précises des voies descendantes qui sont influencées par cette stimulation trans-spinale après lésions médullaires ne sont pas connues. C’est pourquoi ici, nous souhaitons mettre en évidence les effets de la lésion médullaire dans un premier temps ainsi que ceux de la thérapie par stimulation magnétique trans-spinale répétitive dans un second temps sur la plasticité des fibres réticulospinales.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intéresse à la plasticité des voies descendantes après lésion médullaire traumatique. Ces connaissances sont essentielles afin de mieux prendre en charge ces pathologies et mettre en place des thérapies qui pourront induire une repousse axonale et donc à terme une récupération fonctionnelle chez les patients souffrant de ce type de traumatismes. Cette étude nous permettra également d’avoir une meilleure connaissance sur les bénéfices d’une méthode non invasive (stimulation magnétique répétitive) dans ce contexte lésionnel. Cela permettrait, sur un plus long terme, d’envisager de proposer ce traitement dans le cadre de la prise en charge des lésions médullaires chez l’Homme.
Procédures
120 souris (60 males et 60 femelles) seront utilisées sur lesquelles seront réalisées une lésion de la moelle épinière sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. Le jour même après la lésion et afin de mettre en évidence les fibres nerveuses ayant survécu, l’injection d’un premier traceur en dessous de la lésion sera également réalisée, la durée de cette intervention sera de 15 minutes. Puis une seconde injection de traceurs, permettant de visualiser les axones des populations neuronales d’intérêt, sera réalisée au niveau du tronc cérébral, cette intervention durera 1 heures et 15 minutes. De ce fait, à J0 l’ensemble des interventions chirurgicales prendra un temps de 2h par souris. Tous les animaux opérés recevront une injection d’antalgique 20 minutes avant la chirurgie et une seconde 6 heures après la chirurgie. De plus, après la chirurgie, à J0, nous procéderons à une injection de sérum physiologique afin de prévenir les animaux d’une déshydratation. Le lendemain et jusqu’au 14 ème jour après la lésion, sous anesthésie générale, la moitié des souris (soit 60 souris) sera utilisée pour la procédure de stimulation magnétique pendant 10 minutes. Le 15ème ou le 60ème jours après la lésion, une troisième injection de traceurs en dessous de la lésion sera réalisée, permettant ainsi de mesurer la repousse des fibres nerveuses, la durée totale de cette intervention prendra 20 minutes. L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié 5 jours après la seconde injection de traceurs, soit 20 et 65 jours maximum après la lésion afin de récupérer la moelle épinière. Cette chirurgie durera 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
- Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie - Paralysie des membres postérieurs, de type hémiplégie - Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s’abreuver après le reveil
Devenir
L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (65 jours maximum après la lésion médullaire) afin de procéder au prélévement de la moelle et du tronc cérébral. Les souris ayant subis des lésions médullaires (120 souris), ne peuvent de ce fait pas, même si cela était possible d’un point de vue expérimentale, faire l’objet d’un don ou bien d’une « réutilisation ».
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer la plasticité des fibres descendantes après lésion de la moelle épinière et mise en place de thérapie comme la stimulation magnétique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué à partir d’études précédentes, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 à 10 animaux. Il faut prendre en compte dans ces expérimentations le fait que les injections stéréotaxiques au niveau du tronc cérébral peuvent ne pas être effectuées au bon endroit du fait de variations anatomiques inter-individuelles et donc ne pas marquer les fibres d’intérêt. De ce fait, nous prevoyons d’inclure 15 souris par groupe. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6 par groupe.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés. Par ailleurs, les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisèment d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse à la plasticité des voies descendantes après lésion médullaire traumatique. Ces connaissances sont essentielles afin de mieux prendre en charge ces pathologies et mettre en place des thérapies qui pourront induire une repousse axonale et donc à terme une récupération fonctionnelle chez les patients souffrant de ce type de traumatismes. Cela nécessite la mise en place de modèles comparables aux pathologies humaines. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de modèles animaux. Les animaux utilisés seront agées de 8 semaines, les lésions médullaires chez l’Homme concernent le jeune adulte, de ce fait afin de mimer au mieux ces lésions, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines.
Etude du mécanisme antidépresseur de la psilocybine/psilocine chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
900 souris d'une souche anxieuse vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est soumise à des tests comportementaux après administration de psilocybine, de psilocine ou de sérum salé, une autre à une chirurgie stéréotaxique d'implantation d'une sonde de microdialyse dans le cortex préfrontal. Le porteur qualifie cette chirurgie de "mineure" au motif que le cerveau serait dépourvu de fibres nociceptives, et étudie les mécanismes antidépresseurs de la psilocybine. Sur le remplacement, il affirme qu'on ne peut modéliser les troubles de l'humeur ni les effets des molécules in vitro.
Objectifs
Notre projet vise à édudier les effets antidépresseurs rapides de la psilocybine et de son métabolite la psilocine. Ces effets seront aussi étudiés d'un point de vue neurochimique dans le cortex médian préfrontal des souris, une région cérébrale impliquée dans l'effet antidépresseur des molécules déjà commercialisées. Il est donc important de comprendre comment la psilocybine affecte le fonctionnement des différents types de neurones du cortex. Ce travail vise donc à évaluer comment la psilocybine et la psilocine affectent les neurotransmetteurs et si cela participe à la réponse comportementale antidépressive.
Bénéfices attendus
La mise en évidence des mécanismes neurochimiques sous-jacents aux effets antidépresseurs de la psilocybine ou de son principal métabolite seront une avancée supplémentaire dans le développement d'une nouvelle classe d'antidépresseurs non monoaminergiques d'action rapide.
Procédures
En comportement: administration de psilocybine, de psilocine ou de saline pour chaque souris. Chaque souris sera testée en comportement pour évaluer l'effet anxiolytique et antidépresseur de la psiloxybine/psilocine. En neurochimie: anesthésie de la souris, chirurgie stéréotaxique pour implanter la sonde de microdialyse, administration de psilocybine, de psilocine ou de saline pour chaque souris: 24h après, collecte des dialysats du cortex toutes les 30 minutes pendant 4 heures, soit 9 dialysats/souris. Comportement : nombre n=750, durée 5 minutes/souris. Chirurgie : implantation stéréotaxique de sondes de microdialyse: nombre d'interventions: une par souris, durée 24h/souris.
Impact sur les animaux
Les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable. Pour l'implantation intracérébrale de canule qui inclue le positionnement sur le cadre stéréotaxique, la trépanation osseuse et l’incision du scalp, l'animal est sous anesthésie. Le cerveau étant dépourvu de fibres nociceptives, le niveau de douleur pour ces implantations intracérébrales est modéré.
Devenir
Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure, pour analyse post-mortem.
Remplacement
Les expériences in vitro et in vivo sont complémentaires et ne s’excluent pas l’une l‘autre. De plus, la psilocybine est une pro-drogue, la psilocine étant son métabolite actif, le métabolisme hépatique de la psilocybine est donc nécessaire à l’obtention des effets antidépresseurs. A ce jour, il n’est possible ni de modéliser les troubles de l’humeur, ni de modéliser les effets de molécules sur de tels troubles in vitro ou in silico. Les mécanismes sousjacents sont trop complexes pour cela. Il est donc nécessaire de recourir à l’expérimentation in vivo dans une telle situation.
Réduction
La technique de microdialyse utilise chaque animal comme son propre témoin, de plus plusieurs, dialysats et donc plusieurs données sont générées pour chaque animal. Pour le comportement le nombre d'animaux est minimisé grâce à l'expertise du laboratoire dans ce type d'observations.
Raffinement
Une anesthésie générale est mise en place pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse et bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux. Cependant pour prévenir des douleurs induites un traitement antalgique sera entrepris le jour de la chirurgie . Un suivi quotidien des animaux sera assuré et l’état général des animaux sera évalué. Une pesée hebdomadaire sera également effectuée. Les points limites définis dans les différentes procédures expérimentales seront strictement appliquées.
Choix des espèces
L'utilisation de de souris est nécessaire pour ce projet, en particulier la souche Balb/C qui a un phenotype naturellement anxieux. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines, il s'agit d'un stade de développement couramment utilisé dans la littérature pour les tests comportementaux qui seront mis en oeuvre dans ce projet.
Perturbations vasculaires d’origine inflammatoire dans un modèle d’accident vasculaire cérébral thrombo-embolique ou thrombotique : une opportunité thérapeutique ?
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
1430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère du cerveau, après pose d'une prothèse crânienne, avec suivi par imagerie puis exsanguination par ponction cardiaque, pour étudier le rôle de l'inflammation dans les lésions post-AVC. Le porteur indique des douleurs postopératoires et des déficits fonctionnels, et prévoit une mise à mort au-delà de 15 % de perte de poids ou d'un score de douleur élevé. Il affirme que ces procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées, les stratégies d'amélioration de la reperfusion restant à développer.
Objectifs
Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, différents compartiments vont être séquentiellement touchés : le compartiment vasculaire sera immédiatement affecté, suite à la formation d’un thrombus qui induit in situ une diminution du débit sanguin cérébral (DSC). S’ensuit une perte de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et l’apparition de dommages parenchymateux. L'inflammation est connue pour jouer un rôle central dans l’extension de l’atteinte vasculaire au parenchyme. Ainsi, Ddans ce projet, nous allons identifier, dans un premier temps, l’impact d’une inflammation systémique sur le débit sanguin cérébral. Dans un second temps, nous caractériserons l’influence de l’inflammation ischémique sur la modulation de la reperfusion cérébrale post-ischémie dans deux modèles d’AVC (thrombo-embolique et thrombotique). Enfin nous chercherons à limiter les effets de cette inflammation pour améliorer le devenir post-AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie de l’AVC et plus particulièrement sur la modulation de la reperfusion post-ischémie par l’inflammation périphérique, afin de développer des stratégies thérapeutiques d’amélioration de la reperfusion.
Procédures
Procédure 1 : injection intrapéritonéale de Lipopolysaccharide (ou sérum physiologique) + évaluation par Imagerie par Résonance Magnétique (durée : 50min) ou par Imagerie par Ultrasons (durée : 40min) et exsanguination par perfusion intracardiaque. Procédures 2 & 3 : J-10 : Pose d’une prothèse crânienne (durée : 40min). J0 : Induction de l’ischémie cérébrale +/- Thrombolyse à 20 minutes ou 4 heures après l’occlusion artérielle (durée : 50min). +10min, +1h, J+1, J+5 : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique structurelle et moléculaire (durée : 50min) ou par Imagerie par Ultrasons (durée : 40min). J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 5min). J+5 : Exsanguination par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient, selon leurs degrés de gravité du stress pour l’ensemble des procédures : Leger. Une perte de poids pour l’ensemble des procédures, une hypothermie lors des phases d’anesthésies : Modéré. Des douleurs post-opératoires, des déficits fonctionnels dans le cadre de l’ischémie cérébrale : Sévère.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs tissus pour des analyses cytologiques et histologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, des approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacés par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de paipier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons une litière plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Durant la pose de prothèse, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux seront couverts avec du gel oculaire afin de ne pas éblouir les animaux et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post-opératoires chauffées puis remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra d’identifier les animaux les plus « à risque ».
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les AVC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles pré-clinique.
Potentiel thérapeutique de l’immunoblocage de l’interaction entre l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) lors des traumatismes crâniens
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur inflige un traumatisme crânien, suivi d'IRM, d'évaluations neurologiques et d'une perfusion intracardiaque létale au trentième jour, pour tester un anticorps censé bloquer une interaction moléculaire aggravant les lésions. Le porteur indique une perte de poids, une hypothermie, des douleurs et des déficits cognitifs, et prévoit une mise à mort si le poids chute de plus de 15 % ou si le score de douleur dépasse un seuil. Il affirme que ces procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées, la stratégie thérapeutique pour les patients restant à proposer.
Objectifs
Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) endogène joue un rôle critique aussi bien dans la circulation sanguine que dans le parenchyme cérébral, notamment en interagissant avec les récepteurs du glutamate de type N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Dans ce projet, nous allons définir la participation de cette interaction entre le tPA et le récepteur NMDA dans le cadre des traumatismes crâniens (TC), qui restent mal pris en charge sur le plan clinique. Nous testerons aussi le potentiel thérapeutique d’un anticorps que nous avons produit au laboratoire et qui bloque cette interaction. Nous évaluerons à la fois le bénéfice histologique (inflammation, hémorragie, lésion cérébrale) et le bénéfice fonctionnel à long terme (suivi longitudinal).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et de proposer une stratégie thérapeutique au bénéfice des patients.
Procédures
Traumatisme crânien (J0) (Durée : 15min ; n=80) + traitements (n=40) + IRM (J3, J15, J30 ; Durée : 60min/Session) + évaluation neurologique (J3, J15, J30 Durée : 30min/Session) + perfusion intracardiaque (J30) (n=80) (total d’environ 5h réparties sur 4 jours, de J0 à J30).
Impact sur les animaux
L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, une hypothermie (lors des phases d’anesthésies), des douleurs post-opératoires, du stress (notamment lors des phases de tests comportementaux), des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable comme les pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée (ex : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ce modèle.
Mécanismes des récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, dont 752 en gravité sévère. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau, implantation d'électrodes de deux à six heures et injection de virus, puis des enregistrements neuronaux pendant l'éveil et le sommeil et des tests comportementaux aversifs, pour étudier des récepteurs du glutamate liés à la mémoire de la peur et à l'anxiété. Le porteur qualifie ces procédures comportementales de "modérément aversives et brèves" sans détailler les tests, et signale des douleurs postchirurgicales, des risques anesthésiques et un isolement. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne préserve un réseau neuronal intact, les retombées contre les troubles anxieux étant renvoyées au long terme.
Objectifs
Le projet se déroulera dans deux EU différents. La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté à ce projet par rapport au projet principal déjà autorisé. Le projet vise à l’étude des récepteurs ionotropiques du glutamate, qui font partie d’une grande famille de récepteurs aux neurotransmetteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le cerveau des vertébrés. Ces récepteurs du glutamate jouent un rôle central dans la communication entre neurones et dans les processus cognitifs tels que l’apprentissage et la mémoire. Les récepteurs du glutamate étant impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’une sous-population de récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement, dans un cadre physiologique et pathologique. Il s’agira notamment de comprendre l’importance de ces récepteurs dans la formation et la stabilisation des souvenirs associant un contexte à une émotion donnée et leur implication dans les comportements liés à l'anxiété. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à la réactivation et la coordination de plusieurs structures cérébrales pendant l'exécution et la consolidation des souvenirs aversifs dépendante du sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements in vivo chez des souris libres de leurs mouvements et endormies. L'identification des processus de formation de souvenirs émotionnels est essentielle pour comprendre comment ces processus sont affectés dans la maladie. Ce projet devrait permettre des avancées scientifiques sur les mécanismes et la diversité des récepteurs du glutamate, sur la régulation des signalisations neuronales et des fonctions cérébrales et comportementales associées. Notre travail ouvrira de nombreuses perspectives tant avec des implications importantes sur notre compréhension de la neurotransmission et le développement de nouveaux agents protecteurs contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Ainsi des retombées sont attendues tant dans le domaine fondamental qu’appliqué (développement de nouvelles stratégies thérapeutiques).
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ces troubles touchent environ 15 à 20 pourcent de la population à un moment ou un autre de leur vie. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Les animaux provenant de notre établissement seront impliqués dans 2 transports (aller et retour). Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr) avec ou sans comportement (1h maxi / jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) comportement 2) injection de virus + comportement 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones + comportement. Seule l'injection de virus sera réalisée dans notre EU(2). L'ensemble des autres procédures est réalisé dans l'EU1. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui, selon les besoins, pourra permettre des prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes (hors enregistrement de l’activité neuronale et comportement) est réalisés sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement nécessaire à la préservation des électrodes (stress modéré) ; comportement (stress modéré) ; 2 transports entre les établissements utilisateurs (source de stress) ; identification génétique des animaux réalisés par prélèvement de quelques millimètres à l’extrémité de la queue (douleur légère et stress de courte durée).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure, au sein de l'établissement d'origine des animaux, afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Ce projet est réalisé sur deux établissements et a déjà été autorisé pour l'établissement n°1. Aucun animal supplémentaire n'a été ajouté.
Remplacement
Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 2104 animaux: dont 1920 impliquées sur ce site.
Raffinement
Après leur réception, les animaux sont habitués aux expérimentateurs par une manipulation bienveillante pendant 5jrs (5min) de manière à réduire le stress lors des procédures. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes ou individuellement et disposeront d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur, les animaux seront exclus du protocole. Les procédures comportementales sont modérément aversives et brèves et n'induisent pas d'angoisse sur le long-terme.
Choix des espèces
Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage la qualifient comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Nous utiliserons des souris non génétiquement modifiées et des souris génétiquement modifiées dans le cadre de ce projet. Ces souris se développent normalement et ont un comportement général sans anomalies évidentes. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Analyse longitudinale de l’effet remyélinisant d’une molécule dans un modèle de souris démyélinisé en utilisant l’imagerie par résonance magnétique – EU 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues démyélinisées par une alimentation spéciale pendant douze semaines, elles reçoivent des injections intramusculaires d'une molécule puis passent des examens d'imagerie par résonance magnétique de deux à quatre heures sous anesthésie, transportées entre deux établissements. Le projet suit la régénération de la myéline dans un modèle de sclérose en plaques. Le porteur affirme que la remyélinisation ne peut être reproduite in vitro et impose le test dans un "organisme entier".
Objectifs
Dans le système nerveux central, le prolongement majeur des neurones que l’on appelle l’axone est entouré d’une gaine de lipides, ou myéline, qui permet d’optimiser la réponse du neurone et participe au fonctionnement correct des différents tissus et organes du corps humain. Les maladies qui détruisent la myéline dans le système nerveux central sont dites démyélinisantes. La plus commune est la sclérose en plaques (SEP) qui atteint une majorité d'adultes jeunes entre 20 et 40 ans. Les troubles neurologiques associés touchent diverses fonctions comme la motricité, la sensibilité, la vision. Une régénération spontanée de la myéline détruite existe au cours des premières étapes de la maladie, mais le processus finit par s’épuiser conduisant donc à des handicaps irréversibles. Les traitements actuellement disponibles permettent de réduire l'inflammation déclenchée par le système de défense de l’organisme contre les agressions extérieures, mais aucun ne favorise la régénération de la myéline indispensable pour éviter une maladie très invalidante. Nous avons précédemment mis en évidence des propriétés remyélinisantes (régénération de la myéline) intéressantes pour une molécule dans des modèles de démyélinisation (perte de myéline) focale. L’objectif de ce projet est la mise en place d’une étude longitudinale destinée à visualiser par imagerie par résonance magnétique (IRM) la régénération de la myéline induite par cette molécule en utilisant un modèle chronique de démyélinisation chez la souris, classiquement utilisé pour refléter plusieurs caractéristiques des phases tardives de la SEP. La présente demande concerne donc un projet multi-sites (2 établissements utilisateurs). La première partie (établissement utilisateur 1/2) a été préalablement autorisé par le ministère. La deuxième partie est réalisée dans un deuxième établissement utilisateur car elle nécessite une expertise et un équipement spécifiques indisponibles dans le premier établissement utilisateur (l'imagerie par résonance magnétique chez la souris). Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté par rapport au projet initial autorisé dans le premier établissement utilisateur.
Bénéfices attendus
Du point de vue scientifique, ce projet pourrait permettre d’identifier une molécule remyélinisante qui comblerait le vide thérapeutique actuel dans le domaine de la sclérose en plaques. Cette molécule pourrait permettre d’éviter les handicaps neurologiques irréversibles qui finissent par apparaître au cours du temps chez les malades.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur (EU 1/2) : les souris traitées auront reçu un traitement dans leur nourriture pendant 12 semaines afin de mettre le modèle de la maladie en place. Tous les animaux (traités et contrôles) seront transportés de leur établissement utilisateur d’origine vers un deuxième établissement utilisateur (EU 2/2). Dans le second établissement utilisateur (EU 2/2) : les souris traitées recevront la molécule à tester ou son contrôle, vigiles, tous les 4 jours pendant 21 jours (6 injections au total par animal), par voie intramusculaire après une anesthésie locale (le temps d’une injection dure environ 30 secondes). Trois examens IRM seront réalisées sur une partie de ces souris traitées sous anesthésie gazeuse à 0, 3 et 6 semaines après le début du traitement. Les autres souris traitées seront imagées si besoin pour obtenir nos effectifs statistiques si nous rencontrons un problème. Les souris contrôles seront quant à elles soumises à un unique examen IRM sous anesthésie gazeuse. La procédure IRM dure 4h maximum par animal, 2h30 en moyenne (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal).
Impact sur les animaux
Avant leur arrivée dans notre établissement les animaux (32 souris) auront ingéré une nourriture en poudre supplémentée par une molécule entraînant une perte de myéline (gaine de lipide présente autour des prolongement des neurones) mais cette perte est restreinte au cerveau sans atteinte de la moelle épinière et n’entraîne donc pas de troubles moteurs. A l’issue du transport entre l’établissement d’origine et d’accueil, la période d’acclimatation sera inférieure à 7 jours pour 16 animaux, pouvant causer du stress. La période d’acclimatation est réduite pour ces animaux, car il est nécessaire de pouvoir établir le niveau de démyélinisation basal le plus rapidement possible après la préparation du modèle, avant de commencer le traitement par la molécule ou le véhicule. La molécule à évaluer dans ce projet, tout comme le véhicule contrôle, sera administré par voie intramusculaire (I.M.), car les connaissances pharmacocinétiques actuelles ne permettent pas d’utiliser une autre voie. Il est possible que cela provoque une gêne et une légère douleur au niveau du site d’injection se traduisant par un léger boitillement des animaux à la suite de l’injection. Aucun effet indésirable n’est attendu par la molécule elle-même, car il s’agit d’une molécule déjà testée à la même dose chez d’autres modèles rongeurs, dans le cadre d’autres applications thérapeutiques, sans reporter de toxicité. Les animaux subiront une anesthésie générale unique (8 souris) ou à jusqu’à 3 reprises lors des sessions d’IRM (20 minmum à 32 maximum) pouvant causer un stress thermique (hypothermie), des difficultés cardio-respiratoires et une non récupération de la vigilance suite à l'anesthésie.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux (40 souris) seront euthanasiés au sein du deuxième établissement utilisateur. Ce projet est réalisé sur deux établissements utilisateurs et n'ajoute aucun animal supplémentaire. Pour les animaux ayant effectué au moins un examen par imagerie par résonance magnétique (IRM) (au minimum 28 animaux, au maximum 40 animaux), le cerveau sera prélevé pour réaliser des analyses histologiques dans le cadre de l’évaluation de l’efficacité de notre molécule d’intérêt.
Remplacement
Le processus de remyélinisation (regénération de la myéline) met en jeu plusieurs types cellulaires en dehors des cellules qui synthétisent la myéline, en particulier des cellules inflammatoires. L’évaluation sur culture de ces cellules a permis de déterminer l’effet pro-myélinisant in vitro de la molécule. Mais le processus de remyélinisation qui a lieu dans un organisme à l’issue d’un processus de démyélinisation (perte de myéline) se fait au sein d’un environnement inflammatoire mettant en jeu d’autres types de cellules et des neurones qui sont tous impliqués de manière complexe dans la remyélinisation, ce que l’on ne peut pas reproduire in vitro. Aussi le test de la molécule dans un organisme entier est nécessaire.
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisés est de 40 souris, dont 8 souris contrôles non traitées (4 mâles et 4 femelles) et 4 groupes de 8 animaux traités avec une molécule permettant d’établir notre modèle pathologique, puis par un véhicule ou la molécule d’intérêt à tester. L’étude longitudinale nous permet de réduire le nombre d’animaux tout en examinant 3 temps successifs. Notre expertise dans le domaine nous permet de dire que 5 animaux par groupe seront suffisants pour visualiser l’effet remyélinisant (regénération de la myéline) si l’on considère les valeurs moyennes dans les conditions 'tests' et 'contrôles' classiquement observées dans nos analyses histologiques. Nous traiterons 8 animaux par groupe pour créer notre modèle, étant donné la durée de l’expérience (18 semaines) et la nécessité de 3 anesthésies générales successives, espacées de 3 semaines, qui pourraient conduire à la perte prématurée de certains animaux. Les 3 animaux supplémentaires viendront en remplacement des éventuels animaux perdus. Nous pourrons ainsi maintenir un effectif suffisant pour notre interprétation statistique. Pour les animaux contrôles, 4 animaux de chaque sexe nous permettent de mesurer un niveau basal de myélinisation pour les comparer par la suite avec les animaux traités.
Raffinement
Dans l'établissement utilisateur 1 sur 2: Les injections intramusculaires (I.M.) sont effectuées par du personnel maîtrisant ce geste, après anesthésie locale avec un système de contention adapté. La molécule injectée a déjà été testée chez des modèles rongeurs à la même dose, sans reporter d’effet toxique. Les 4 dernières semaines de traitement, les animaux seront habitués au système de contention (1 fois par semaine). Dans l'établissement utilisateur 2 sur 2: Le jour du transfert tous les animaux repassent à la nourriture classique avec de la nourriture pulvérisée non supplémentée pour assurer la transition. Le transport est réalisé par un transporteur agréé au calme dans une boîte de transport (trajet inférieur à 30 min) avec leurs congénères, de quoi boire et s’alimenter ainsi que de l’enrichissement. Les animaux seront observés à leur arrivée et transférés en zone d’hébergement avec les mêmes congénères et de l’enrichissement dans des cages ventilées et dans des conditions contrôlées de température, hygrométrie, éclairage afin de garantir le respect des normes sanitaires. Avant l’imagerie, les souris sont laissées 30 min dans la pièce de préparation puis observés pour vérifier leur état. Lors de l’imagerie (sous anesthésie générale), l’animal est positionné dans un système de contention dédié au système d’imagerie. Un anesthésique local est appliqué au niveau des points d'appui pour éviter toute douleur, un gel ophtalmique est appliqué pour éviter la déshydratation oculaire. La température de l'animal est maintenue à température physiologique grâce à un tapis chauffant placé sous la cage d’induction puis avec un système de circulation d'eau chaude intégré au berceau IRM. Un contrôle des paramètres physiologiques est réalisé avec une sonde rectale et un capteur de pression respiratoire. De la vaseline sera appliquée avant d’introduire la sonde de température. La profondeur de narcose est contrôlée pendant l’examen (4h maximum) via le rythme cardio-respiratoire. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas d’atteinte de points limites établis (respiration trop lente ou rapide, température corporelle anormale). Pour le réveil l’animal sera placé dans une chambre thermostatée à 37 degrés, sous surveillance et stimulation régulière. La remise en zone d’hébergement sera faite avec des animaux ayant repris une activité normale dans leur cage.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur notre plateforme d’imagerie, leur taille permet de les utiliser dans ce type de scanner par imagerie par résonance magnétique (IRM) pour acquérir des images 2D, 3D ou 4D (dimension temporelle) capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribuent à répondre aux questions scientifiques posées. Nous disposons d’un modèle souris de démyélinisation (perte de myéline) classiquement utilisé pour refléter plusieurs caractéristiques des phases tardives de la sclérose en plaques (SEP) chez lequel nous souhaitons tester un traitement via l’injection intramusculaire d’une molécule pour ses capacités remyélinisantes (regénération de la myéline). Les souris (mâles et femelles) seront âgées entre 20-21 semaines (correspondant à l'âge du début du traitement par la molécule et au pic de démyélinisation) à 26-27 semaines (soit à 6,5 mois, 3 semaines après la fin du traitement par la molécule d'intérêt pour étudier les effets à long termes après l'arrêt du traitement).