Troubles nerveux
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Approche thérapeutique pour prévenir le développement de maladie neurodégénérative : évaluation de l’efficacité de candidats médicaments à un stade pré-symptomatique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour tester un candidat médicament avant l'apparition des symptômes, 792 souris porteuses d'une maladie neurodégénérative génétique sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Le traitement est injecté sous la peau des souriceaux une à deux fois par jour pendant sept ou vingt-huit jours, avec un risque de rejet par la mère, puis neuf prélèvements sanguins sont faits à l'extrémité de la queue au fil de leur vie. Le porteur ne nomme ni la maladie ni la molécule, et annonce que les premiers symptômes, stress, angoisse et troubles moteurs, peuvent apparaître vers huit à neuf mois. Il écrit qu'un traitement efficace dès les stades précoces constituerait une "révolution" dans la prise en charge, alors que le projet en reste au stade préclinique.
Objectifs
Le projet de recherche vise à développer un médicament dont le traitement serait démarré précocement afin de stopper l’évolution d’une maladie neurodégénérative liée à un défaut génétique bien identifié. En effet, il a été montré qu’un traitement sous cutané avec cette molécule permettait d’améliorer les troubles du mouvements et psychiatriques de la souris atteinte de la maladie. Afin de développer un médicament pour les patients atteints de cette maladie à partir de cette molécule, nous allons dans ce projet démontrer qu’en intervenant très tôt dans le développement, bien en amont de l’apparition des symptômes, nous pouvons retarder voire bloquer l’apparition de la maladie.
Bénéfices attendus
Il a été démontré que notre candidat médicament peut améliorer les troubles du mouvement et psychiatriques dans des modèles souris de la maladie à des stades symptomatiques. Il s’agit d’une maladie familiale dont le diagnostic génétique peut être connu bien avant l’apparition des symptômes mais pour lequel aucun traitement curatif n’existe. Disposer d’un médicament efficace dès les stades précoces de la maladie permettrait de bloquer le développement de cette dernière et consistuerait une révolution dans la prise en charge de cette maladie.
Procédures
Le traitement sera réalisé par voie sous cutanée une ou deux fois par jour pendant 7 ou 28 jours (
Impact sur les animaux
Le traitement sera réalisé chez des souriceaux dont le principal effet indésirable est un éventuel rejet par la mère (exclusion du nid). Une toxicité liée à l’excipient est possible. Un léger stress et une fatigue liés à la réalisation de tests comportementaux sont possibles, ainsi qu’un léger stress lié au prélèvement sanguin chez l’animal adulte. Les premiers symptômes de la maladie peuvent apparaitre en fin de vie autour de 8-9 mois d’âge (stress, angoisse et/ou symptômes moteurs).
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin de prélever les cerveaux sur lesquels seront réalisées des analyses biologiques qui nous permettront de comprendre les mécanismes du traitement.
Remplacement
Nous cherchons à étudier les effets d’un traitement précoce avec notre molécule sur l’apparition des symptômes de la maladie à long terme. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.
Réduction
Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu notre projet de façon progressive. Ainsi, le projet est constitué de 4 expériences indépendantes : l’expérience 2 ne sera réalisé que si l’expérience 2 a montré des résultats satisfaisants et ainsi de suite. Si dès l’expérience 1 les résultats ne sont pas satisfaisants, l’étude sera arrêtée et les expériences 2, 3 et 4 ne seront pas réalisées.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages en respectant les normes en vigueur. Les cages sont équipées de litière (avec possibilité de faire un nid) et d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, le tout changé toutes les semaines. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement sera administré par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à montrer qu’un traitement à un âge précoce peut retarder voire bloquer l’apparition de la maladie, notre étude sera réalisée sur des souriceaux et des souris adultes.
Développement de traitement dans un modèle rongeur de la maladie de Lesch-Nyhan
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Injectés au cerveau avec une neurotoxine à l'âge de trois jours, 1 127 rats seront tous tués par surdose médicamenteuse, 650 d'entre eux dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé. Devenus adultes, ils reçoivent cinq jours par semaine pendant cinq semaines un composé antiparkinsonien qui provoque des mouvements involontaires et, chez les animaux lésés, les automutilations caractéristiques de la maladie de Lesch-Nyhan. Leur activité locomotrice et leurs stéréotypies sont enregistrées trois heures d'affilée en cage d'actimétrie. Le porteur signale aussi que la manipulation des nouveau-nés peut entraîner leur rejet par la mère, et rattache le projet à son "activité préclinique de service".
Objectifs
La maladie de Lesch-Nyhan (LN) est une maladie génétique rare qui se manifeste par des troubles neurologiques et comportementaux. Actuellement la prise en charge est symptomatique car il n’existe aucun traitement permettant de guérir les patients de cette maladie. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel. Pour développer de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation d’un modèle rongeur de cette maladie afin d’en reproduire les symptômes et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements. Ce modèle est généré par l’administration chez des ratons nouveau-nés d'une toxine dans le cerveau. A l’âge adulte, un traitement est administré au sein du système nerveux central et ses effets seront observés au niveau comportemental et cellulaire. Le but de ce projet est de permettre l’émergence de nouveau médicament pour cette maladie.
Bénéfices attendus
Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Les expérimentations sont essentiellement menées sur l’animal. Actuellement la prise en charge de cette maladie est symptomatique car il n’existe aucun traitement permettant de guérir les patients. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel. Ce projet préclinique a pour but de permettre l’émergence de traitement pour la maladie de Lesch-Nyhan.
Procédures
Les animaux subiront au maximum deux procédures chirurgicales d’une durée d’une heure, ces chirurgies seront espacées de minimum 4 semaines. A l’âge adulte les animaux recevront un composé utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson, injecté (durée injection : 30 secondes) 5 fois par semaine pendant 5 semaines, qui entraine des troubles moteurs tels que des mouvements involontaires dans les 2 heures suivant l’injection. A 3, 4 et 5 semaines après l’injection intracérébrale, nous observerons au cours d’une session test l’activité locomotrice, les stéréotypies et les automutilations induites par une injection unique du composé. L'activité locomotrice est mesurée dans des cages d'actimétrie et enregistrée pendant 3 heures.
Impact sur les animaux
La maladie de Lesh-Nyhan (LN) est une maladie rare et invalidante. Les nuisances attendues sont celles associées à l’administration de neurotoxine chez les nouveau-nés et d'un traitement à l’âge adulte. L’injection de neurotoxine peut entrainer une perte de poids et la manipulation des animaux nouveau-nés peut entrainer un rejet de la mère. A l’âge adulte les animaux recevront un composé utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson, 5 fois par semaine pendant 5 semaines, qui entraine des troubles moteurs tels que des mouvements involontaires dans les 2 heures suivant l’injection. Ce composé, chez les animaux lésés en néonatal, peut également entrainer des automutilations caractéristiques de la maladie de LN.
Devenir
A l’issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par surdose médicamenteuse et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de rat pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme. -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénératives, l’objectif à terme est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.
Réduction
Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Une étude de puissance a été effectuée, permettant d’établir le nombre à 14 animaux par groupe pour des résultats statistiques exploitables. Afin de réduire le nombre d’animaux, une analyse préliminaire est menée pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à la mise en place du modèle de LN. L’utilisation de tous les animaux issus de la portée (mâles et femelles) nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R. Lorsque cela sera possible, après le sevrage, les animaux utilisés uniquement pour le training maternel seront réutilisés pour d’autres études.
Raffinement
Mesures précoces : le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée quotidiennement par les techniciens qui signalent tout problème aux expérimentateurs (weekend et jours fériés inclus). Des critères de bien-être seront évalués. Si un ou plusieurs signes sont observés les animaux sont pesés quotidiennement. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi des soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution de ces signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animaux à surveiller ». Cette fiche est close quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, un réchauffement, une nourriture adaptée et des traitements vétérinaires si nécessaire. Raffinement des conditions d’hébergements : les animaux seront hébergés en groupes sociaux (en fratrie avec la mère jusqu’au sevrage puis 2 rats par cage) et ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu (nid de papier, maison en carton, bâton de bois à ronger). Les animaux seront surveillés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Raffinement des procédures : les chirurgies sont réalisées sous anesthésie par le froid (nouveau-né) et à l’isoflurane (adulte) avec administration d’analgésique et d’anesthésie local permettant de réduire la douleur et l’angoisse des animaux. Un gel ophtalmique est appliqué afin de compenser la sècheresse oculaire. Un suivi post opératoire spécifique de 3 à 7 jours est mis en place. Des mesures spécifiques peuvent être prises comme : si l’animal manque de tonus, une injection de sérum physiologique sera réalisée. En cas de plaies celles-ci seront nettoyées et désinfectées. Si malgré ces soins, les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, une décision de mise à mort par surdose médicamenteuse est prise par l’expérimentateur.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est proche de celui de l’homme. Ce modèle a un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus la dégénérescence dopaminergique par l’injection de neurotoxine ou de virus est bien établie dans notre équipe et les travaux sur le rat sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. Dans notre étude nous utiliserons des rats nouveau-nés de 3 jours. Le modèle de la maladie de Lesch-Nyhan nécessite que la lésion par neurotoxine soit réalisée pendant la période critique pour le développement de neurones dopaminergiques.
Hétérogénéité des astrocytes dans la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées à douze mois pour analyse de leurs tissus, 808 souris subissent une injection dans le cerveau sous anesthésie, une fenêtre implantée dans le crâne et des séances mensuelles d'imagerie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 720 d'entre elles. Le projet porte sur des sous-populations d'astrocytes chez des souris modèles de la maladie d'Alzheimer et de la maladie de Huntington. Le porteur détaille huit tests comportementaux qu'il qualifie de "peu stressants", auxquels s'ajoutent des frottis vaginaux et des prélèvements d'urine sur les femelles, puis un prélèvement de liquide céphalorachidien avant la mise à mort. Soixante souris ne servent que de stimulus social ou de source d'urine pour les tests des autres, et seront transférées vers d'autres projets ou tuées.
Objectifs
Les astrocytes sont des partenaires clés pour les neurones dans le cerveau. Ils remplissent des fonctions importantes pour le bon fonctionnement des neurones. Les astrocytes sont des cellules hétérogènes, qui sont impliqués dans plusieurs maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer (MA), dans lesquelles ils présentent des changements importants et peuvent avoir des effets délétères ou bénéfiques. Des études récentes montrent que des populations distinctes d'astrocytes coexistent dans les cerveaux atteints de la MA mais leurs impacts sur les neurones sont encore inconnus. Nous avons développé des outils qui permettent de mettre en évidence des sous-populations d'astrocytes dans le cortex d'un modèle murin de la MA et de les analyser fonctionnellement. Ce projet vise à 1) compléter la caractérisation des ces sous-populations dans un modèle plus progressif et reproduisant plus fidèlement les atteintes moléculaires de la MA, 2) analyser leur dynamique d’apparition, 3) comparer ces sous-populations à celles présentes dans le cerveau de souris modèles de la maladie de Huntington, une autre maladie neurodégénérative, 4) cibler une sous-population identifiée comme délétère pour l’inhiber et en évaluer les effets thérapeutiques sur les altérations typiques de la MA dans une souris modèle.
Bénéfices attendus
La MA touche plus de 900 000 personnes en France et représente un fardeau sociétal majeur. Jusqu'à présent, la plupart des stratégies thérapeutiques ont ciblé directement les neurones et ont malheureusement échoué en clinique. Les astrocytes assurent des fonctions clés dans le cerveau qui peuvent être perturbées dans la MA, lorsque les astrocytes sont réactifs. Manipuler ces cellules de soutien pour les rendre plus favorables aux neurones apparaît comme une stratégie alternative potentielle. Les astrocytes sont des cellules hétérogènes qui changent de manière spécifique lors de maladies. Ces changements doivent être définis avec des techniques dédiées. Notre approche permet la caractérisation fonctionnelle des sous-populations d’astrocytes et leur manipulation. Si elle une sous-population d'astrocytes réactifs du cortex de souris est identifiée comme défectueuse en 1ère partie du projet, nous la ciblerons dans la 2e partie de ce projet. Notre approche thérapeutique basée sur le ciblage spécifique de sous-populations d'astrocytes pourrait être plus efficace que des stratégies centrées sur les neurones. En se focalisant sur les astrocytes, ce projet générera de nouvelles connaissances sur la MA et sera facilement transférable à d'autres maladies cérébrales.
Procédures
Les souris recevront une injection intracérébrale sous anesthésie et analgésie (30-45 min de chirurgie par souris). Après 1 mois, certaines souris recevront une injection sous anesthésie gazeuse de 5 minutes. D’autres souris passeront 8 tests de comportement, 4 mois après une injection unique. Ces tests durent entre 5 min et 1h chacun et seront réalisés sur 6-7 semaines en laissant 2-3j de repos entre chaque test. Ces tests sont peu stressants et se basent principalement sur des comportements naturels (exploration, interactions avec congénères). Certaines souris seront implantées avec une fenêtre crânienne sous anesthésie générale et analgésie, pour réaliser de l’imagerie cérébrale sur souris habituées à la contention. Huit sessions de 30 min maximum, seront réalisées chaque mois de l’âge de 5 mois jusqu’à leur euthanasie à 12 mois. Certaines femelles seront prises en contention pendant quelques minutes pour réaliser un frottis vaginal (1 fois par souris) et prélever leur urine (4 fois à 4 jours d’intervalle). Enfin, certaines souris auront un prélèvement de liquide céphalorachidien sous anesthésie et analgésie avant leur euthanasie (prélèvement de 30 min maximum). Les changements comportementaux liés à la modélisation de la maladie d’Alzheimer (réduction fine de la mémoire, légère anxiété mesurées sur des dispositifs dédiés et sensibles) et de la maladie de Huntington (changements légers de motricité mesurés par des dispositifs sensibles, et moins de gain de poids) représentent des nuisances extrêmement légères, qui n’entravent pas la capacité des souris à se nourrir, déplacer, et réaliser leurs comportements habituels en captivité
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les souris utilisées dans ce protocole sont les suivantes : douleur liée à la chirurgie et l’implantation d’une fenêtre crânienne pendant les quelques jours suivants la chirurgie et faible stress ponctuel lié à la contention lors de l’imagerie biphotonique et aux tests comportementaux (qui durent moins d’1h chacun).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’âge de 12 mois, pour analyse post mortem complète des tissus. Les 20 souris femelles et 40 souris mâles naïves servant de stimulus pour les tests de comportement d’interaction sociale et d’exposition à l’urine de femelle, n’ayant pas reçu d’injection ou de chirurgie seront proposées pour utilisation dans d’autres projets et dans le cas contraire seront euthanasiés.
Remplacement
Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones (les cellules vulnérables dans la maladie d’Alzheimer) et différentes cellules partenaires, dont les astrocytes. Ces interactions cellulaires ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. De plus, la vulnérabilité de certaines régions cérébrales nécessite de comparer sur l’organe entier les différentes régions cérébrales qui ont parfois des connections anatomiques et fonctionnelles cruciales pour expliquer cette vulnérabilité sélective, et ne sont pas reproduites in vitro dans toute leur complexité. En particulier, il existe des souris modèles de la maladie d’Alzheimer qui possèdent des mutations génétiques impliquées dans les formes familiales de la maladie d’Alzheimer et reproduisent de nombreux altérations typiques de la maladie d’Alzheimer. Ces modèles permettent d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement cérébral, en interaction avec le système immunitaire périphérique, qui a un rôle clé pour moduler l’inflammation cérébrale. Ces souris modèles ont également l’avantage de permettre d’évaluer des symptômes cliniques typiques de la maladie d’Alzheimer (ex. déficits mnésiques, anxiété), ainsi que leur potentielle restauration par notre stratégie thérapeutique. Au final, seule une approche sur un mammifère modèle possédant un cerveau complexe et exprimant des comportements sophistiqués peut nous permettre d’identifier le rôle de sous-populations d’astrocytes dans les déficits caractéristiques de la maladie d’Alzheimer, en les ciblant par des stratégies thérapeutiques adaptées.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 868 souris nées dans notre élevage ou achetées chez un fournisseur agréé. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux est réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par example, certaines souris auront une évaluation de leur comportement puis seront analysées au niveau biochimique, histologique ou transcriptomique. Les analyses de types « omiques » permettent d’obtenir un grand nombre d’informations à partir d’une souris, de même l’imagerie longitudinale permet d’analyser la même souris au cours du temps au lieu de devoir euthanasier des souris différentes à chaque temps d’analyse. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation (points limites évalués par une grille de suivi), permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liée aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. En particulier le maintien des souris sur une couverture thermostatée jusqu’à leurs premiers mouvements puis en chambre thermostatée jusqu’à leur réveil complet post-chirurgie permet de réduire la mortalité péri-opératoire des souris. L’habituation des souris à la contention et à la manipulation par l’expérimentateur une semaine avant les tests comportementaux permet de réduire le stress des souris. Seules les souris hétérozygotes modèles de la maldie de Huntington seront générées et utilisées dans ce projet, qui ne présentent pas de perte de poids.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les interactions entre neurones et astrocytes ; les organismes modèles simples possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau mammifère. Les souris modèles de la maladie d’Alzheimer utilisée dans ce projet permettent d’étudier les interactions neurones-astrocytes corticaux dans le contexte génétique de la maladie d’Alzheimer. Elles présentent aussi des altérations cognitives et comportementales caractéristiques de cette maladie. La maladie d’Alzheimer se déclare chez l’adulte. Les altérations histologiques, biochimiques, transcriptionnelles ainsi que les altérations fines du comportement apparaissant dans ce modèle de la maladie d’Alzheimer vers 6-9 mois. Les souris seront analysées entre 5 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés.
Evaluation de phénotype dommageable lors de la création par croisement ou de la réception de lignées de souris sur le plateau d’élevage. Elevage de lignées de souris génétiquement modifiées.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
122 000 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage de lignées génétiquement modifiées, 12 000 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'activité déclarée tient en une biopsie d'oreille pour génotypage et en la surveillance des lignées dont la modification génétique altère la santé, par exemple par une susceptibilité accrue aux tumeurs. Environ 107 800 souris seront tuées, 12 200 gardées pour la reproduction et 2 000 réutilisées, le porteur indiquant que les souris au génotype sans intérêt sont mises à mort quand aucun autre projet ne peut les prendre. Sur les 122 000 déclarées, la très grande majorité n'existe donc que pour faire naître les quelques individus porteurs du bon génotype.
Objectifs
Il s'agit de définir et de détecter des lignées de souris pouvant altérer leur bien-être dans un élevage de souris génétiquement modifiées et de produire des souris génétiquement modifiées nécessitant une caractérisation génétique.
Bénéfices attendus
Ceci permet de produire et de maintenir des lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à des projets de recherche en raffinant les techniques d'élevage de ces lignées. Ceci permet à la fois de détecter et de prendre en charge l'apparition de caractères dommageables. Ce projet permet d'anticiper la prise en charge des signes nécessitant des soins et de permettre une réaction immédiate en cas d'apparition de ces signes.
Procédures
Identification et prélèvements pour caractérisation des souris (moins d'une minute). Biopsie pour génotypage qui concerne les souris du projet. Conditions d'élevage spécifique des modèles adaptés en fonction de l'évaluation de l'impact du modèle sur le bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés au caractère dommageable des lignées entretenues : par exemple, une susceptibilité plus grande à l'apparition de tumeurs... La biopsie pour génotypage qui sera faite à l’oreille.
Devenir
Les animaux d'intérêt sont utilisés dans des procédures expérimentales dans d'autres établissements utilisateurs ou peuvent servir en tant que reproducteur. Les animaux dont le génotype n’a pas d’intérêt pour les projets expérimentaux initiaux sont soit utilisés pour d’autres projets expérimentaux dans d'autres établissements utilisateurs quand c’est possible, soit euthanasiés s’il n’y a pas de possibilité de les utiliser dans d’autres procédures.
Remplacement
Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques).
Réduction
La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire (d'une part pour l'évaluation du phénotype dommageable et d'autre part la production de lots expérimentaux). La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc).
Raffinement
Le raffinement concernant l'évaluation et l'entretien de lignées à phénotype dommageable ou potentiellement dommageable est obtenu en appliquant scrupuleusement les consignes des chercheurs concernant l'apparition des signes attendus ou supposés pour chaque lignée considérée. Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (frisottis, batonnet de coton, maison en carton si besoin, mise à disposition si besoin de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière, etc... adaptation du nombre d'animaux / Cage au phénotype). Les conditions sanitairess sont élevées afin de réduire le risque de caractère dommageable lié au statut sanitaire. La biopsie pour le génotypage se fait à l'oreille.
Choix des espèces
Souris, car on peut facilement créer et produire de nouveaux modèles pour répondre à une question scientifique. Tout âge : animaux jeunes à âgés selon le type de procédures expérimentales dans lesquelles ces animaux sont par la suite utilisés en utilisation continue.
Induction de maladie démyélinisante chez le petit animal de laboratoire à la Cuprizone. Et évaluation de l’action de cellules thérapeutiques par injection intracérébrale dans ce modèle animal.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1125
Nourris quotidiennement à la cuprizone pour provoquer une dégénérescence du cerveau, puis injectés dans le cerveau sous anesthésie, 1 125 souris et 1 125 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet évalue pour un donneur d'ordre extérieur des cellules thérapeutiques dont la nature n'est pas précisée, avec mise à mort d'animaux à des temps intermédiaires et autopsie systématique. Interrogé sur le remplacement, le porteur ne mentionne aucune alternative sans animaux et recopie mot pour mot son paragraphe sur la surveillance des effets indésirables. Il justifie le choix du rongeur par la transposition des doses aux "premiers patients", et présente l'injection intracérébrale comme porteuse de "grands espoirs thérapeutiques sur le long terme".
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer les effets d’une injection intracérébrale de cellules thérapeutiques fournies par notre client, chez le petit animal de laboratoire atteint de dégénérescence cérébrale. Ce mode d’administration intracérébrale d’agents thérapeutiques vient bousculer aujourd’hui les schémas thérapeutiques classiques de faible efficacité dans le traitement de certaines maladies induisant la dégénérescence du système nerveux central. De nombreux essais d’administration intracérébrale se multiplient aujourd’hui au stade préclinique voire pour certains au stade clinique, car ils représentent de grands espoirs thérapeutiques sur le long terme. Des études pilotes seront réalisées pour chaque type de cellules thérapeutiques étudiées. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ces cellules ainsi que tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié dans le sang. De même, l’analyse de certains organes préalablement choisis sera réalisée afin de confronter les résultats des différentes observations, mesures, dosages spécifiques. Dans le cadre de ce projet, un autre type cellulaire de référence connu pour ses effets sera choisi dans l’axe thérapeutique ciblé et sera administré pour comparaison. La durée des protocoles d’étude variera de 2 jours à 6 mois, en fonction de la durée d’induction de la dégénérescence cérébrale et des cellules thérapeutiques à évaluer. Des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires. A chaque sacrifice, une analyse des cadavres et des organes sera réalisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - A court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur les processus de dégénérescence cérébrale ainsi que sur la tolérance et l’efficacité des cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central. - A moyen terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur la détection et le suivi des modifications physiologiques apparaissant au cours du développement de maladies dégénérescentes ainsi que sur l’injection intracérébrale de cellules thérapeutiques chez le petit animal de laboratoire. - A plus long terme : ce projet devrait permettre d’établir des plans de prévention et de diagnostic robustes et précoces indispensables à la prise en charge de du système nerveux central (identification de nouvelles cibles thérapeutiques)
Procédures
L’administration de la cuprizone se fera quotidiennement via la nourriture (à raison de 0.2% du poids de la nourriture). Le temps d’administration dépendra du design du protocole et des résultats des études pilotes. Les injections des cellules thérapeutiques dans le système nerveux central seront réalisées sur animaux anesthésiés et maintenus sur tapis chauffant. L’administration sera unique. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés. Quand nécessaire, une analgésie appropriée sera appliquée à l’animal avant le prélèvement. Les prélèvements au niveau de l’aorte abdominale ne se feront qu’en point final avant sacrifice de l’animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifiés, les animaux seront autopsiés minutieusement et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser tout marqueur physiologique/physiopathologique et/ou évaluer une toxicité éventuelle par exemple. Les organes seront également utilisés afin de localiser les cellules thérapeutiques et/ou pour réaliser d’autres dosages spécifiques en parallèle des analyses histopathologiques.
Remplacement
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près. Plus généralement, les différents effets indésirables possibles et les actions correctrices associées sont décrits dans l’Annexe 1.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux différents traitements et en en accord avec le Code rural et de la pêche maritime, 15 animaux par groupe sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Dans le cas ou leur hébergement ne pourra se faire en groupes, un enrichissement adapté sera fourni et un suivi renforcé sera effectué. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par le traitement à la Cuprizone et/ou les différents principes actifs testés afin d’éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’injection stéréotaxique, des traitements antalgiques pré et post chirurgie dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien, et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.
Choix des espèces
Les rongeurs ont été choisis pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central étant fréquemment évaluées chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats à l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.
Rôle du système d’activation du plasminogène dans le lait maternel et de son importance au cours du développement post-natal.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Anesthésiées cinq fois en huit jours pour une ponction de lait précédée d'une injection d'ocytocine, 70 femelles allaitantes sont au centre de ce projet, qui déclare 420 souris au total dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le porteur veut doser les protéines du système d'activation du plasminogène dans le lait de souris normales et de souris privées du gène tPA, pour comprendre leur rôle dans le développement du cerveau. Aucune souris ne sera tuée à l'issue, toutes doivent être réutilisées dans d'autres projets, ce que le porteur avance comme un argument en faveur du protocole. Il répète trois fois, dans les mêmes termes, que les procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux.
Objectifs
Des études chez l’Homme mettent en évidence une expression variable des protéines du système d’activation du plasminogène (i.e. tPA, uPA, PAI-1, neuroserpine, thrombine) dans le lait maternel selon que la naissance des enfants ait lieu prématurément ou à terme. Ces protéines sont connues pour être exprimées dans certaines cellules du système nerveux central (cellules gliales, neurones) et pouvant jouer un rôle important dans le neurodéveloppement. Par exemple, le tPA, considéré comme un neuromodulateur, joue un rôle important dans la mise en place du cortex cérébral et de la lignée oligodendrocytaire. Son absence au cours du développement entraine des altérations de la compaction de la gaine de myéline, sous-jacents à des troubles moteurs et cognitifs. Ainsi, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de ces protéines présentes dans le lait maternel dans le développement cérébral et de pouvoir par la suite, effectuer un enrichissement du lait maternel en ces protéines pour corriger d’éventuelles anomalies neurodéveloppementales. La première étape du projet consistera au dosage des divers acteurs du système d’activation du plasminogène chez des souris contrôle et déficientes pour un de ces acteurs (tPA). Pour ce faire, le lait des souris allaitantes sera prélevé manuellement, tous les 2 jours, du 7ème au 15ème jour post-partum afin d’analyser sa composition grâce à des techniques de biologie moléculaire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’influence de la composition du lait maternel sur le développement cérébral. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude de la composition de lait maternel implique que celui-ci soit prélevé sur des mères allaitantes, in vivo. De plus, les méthodes de ce projet seront de classe légère et les animaux ne seront pas mis à mort, ce qui leur permettra d’être réutilisés dans d’autres projets.
Procédures
Seules les femelles allaitantes seront soumises à l’anesthésie et au prélèvement de lait un jour sur deux du 7ème jour post-partum au 15ème post-partum (soit 5 anesthésies / prélèvements par femelle ; n = 70 ; durée de la procédure = 20 minutes). Chacun de ces prélèvements nécessitera une injection d'ocytocine en bolus au préalable (2 secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-anesthésies, du stress. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observation des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être, grimace scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
Les procédures subies par les animaux ne dépassant pas la classe légère et n’ayant pas le besoin de récupérer des tissus, les animaux pourront être gardés en vie et réutilisés dans un autre protocole à l’issu de ce projet.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, sur l’implication du lait maternel dans le développement du système nerveux central.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, une procédure de mise au point permettra l'élaboration d'un protocole efficace pour prélever un maximum de lait sur chaque mère allaitante, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés par la suite. Le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour l’étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne s'isolent pas de leurs congénères. Les femelles allaitantes seront également placées dans un environnement enrichi : 2 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser. Durant le prélèvement, les souris seront sous anesthésie générale selon le mode identifié comme le plus adapté au moment de la mise au point (gazeuse ou injectable). Les yeux des souris seront couverts de gel oculaire afin de prévenir de la déshydratation. Les animaux seront manipulés progressivement tous les jours. Cette habituation à l’expérimentateur et à leur environnement permettra de limiter le stress possiblement occasionné lors des phases de manipulations.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, l’utilisation des souris comme modèle d’étude permet l’utilisation de nombreuses souches transgéniques disponibles au laboratoire. Ces éléments positionnent alors ce modèle comme le plus en adéquation avec le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au sein de l’unité et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les 2 procédures concernent le prélèvement de lait maternel chez des souris allaitantes, tous les deux jours, du 7ème au 15ème jour post-partum (période où la production de lait est la plus importante). De plus, le dosage des différentes protéines à plusieurs stades post-partum permettra de mettre en évidence leur cinétique et pic d’expression en fonction de la période de développement post-natal des souriceaux.
Hébergement de rongeurs génétiquement altérés présentant une altération de la réponse immunitaire
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Réutilisées pour 2 700 d'entre elles dans des projets sur le cancer ou le système nerveux central, tuées pour les 620 autres, 3 320 souris génétiquement modifiées sont déclarées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, sans intervention prévue. Le projet porte sur leur hébergement en cages ventilées et matériels stérilisés, l'immunodéficience de ces lignées les rendant vulnérables aux infections. Parmi elles, 320 souris "sentinelles" servent de détecteurs du statut sanitaire de l'animalerie, précisément parce que leur déficit immunitaire prononcé les rend très sensibles aux agents infectieux, et sont tuées entre quatre et cinq mois après lecture des contrôles. Les 300 reproductrices sont tuées à six mois, et le porteur présente l'ensemble du dispositif comme un objectif de raffinement destiné à empêcher l'apparition d'un "phénotype dommageable".
Objectifs
Le projet est porté par une plateforme qui élève des souris génétiquement modifiées au service de laboratoires qui les utilisent dans différents projets autorisés. Les animaux en élevage sont particulièrement fragiles ; différentes mesures sont mises en place pour les protéger en particulier des infections. Parmi ces mesures, en accord avec le vétérinaire référent de notre structure, nous utilisons des souris "sentinelles" du statut sanitaire, qui, du fait de leur déficit immunitaire prononcé, ont une grande sensibilité aux agents infectieux. De plus, parmi les souris élevées, certaines ont un déficit immunitaire modéré ; ces souris sont utilisées dans des projets d'études des cancers ou de maladies du système nerveux central qui nécessitent d'avoir recours à des greffes de cellules dites "étrangères". Les souris avec une immunodéficience modérée ne rejettent pas les cellules étrangères greffées. Le projet consiste à mettre en place des conditions environnementales adaptées pour héberger des souris présentant une immunodéficience et empêcher que l'immunodéficience ne conduisent à un état de mal-être. L'objectif du projet est donc d'empêcher l'apparition d'un "phénotype dommageable" dans le respect des 3R.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont : la réduction du nombre d'animaux élevés par maitrise du statut sanitaire et le raffinement des conditions d'hébergement permettant de minimiser au maximum les situations de mal être des souris hébergées.
Procédures
Aucune intervention prévue sur les animaux.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable prévus sur les animaux dans les conditions d’hébergement mises en place dans le projet.
Devenir
La plupart des animaux (2700) seront réutilisés dans des projets scientifiques en cancérologie ou étudiant des maladies du système nerveux central. Les animaux reproducteurs seront mis à mort après 6 mois d'âge (300). Les animaux sentinelles pour la gestion sanitaire de l'animalerie seront mis à mort après obtention des résultats des contrôles sanitaires soit entre 4 et 5 mois d'âge (320).
Remplacement
Les animaux hébergés dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents experts scientifiques, projets pour lesquels il n'existe à ce jour aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Les animaux sentinelles étaient initialement utilisés dans l'ensemble de l'animalerie pour surveiller le statut sanitaire ; nous les utilisons maintenant uniquement dans la zone d'élevage où les animaux sont particulièrement fragiles. Pour les élevages, l'utilisation d'animaux sentinelles est considérée comme le moyen le plus efficace de repérer des agents infectieux.
Réduction
La mise en œuvre de conditions d'hébergement limitant la contamination des souris immunodéficientes par des micro-organismes permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en limitant les infections qui pourraient avoir un impact sur la viabilité de ces souris. De plus, pour les lignées en élevage sur site, la stratégie d’accouplement à la demande et non en continue (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) permet de limiter également la production d'animaux surnuméraires. L'utilisation des animaux sentinelles permet de contrôler la qualité du statut sanitaire et la bonne santé de l'ensemble des animaux dans la zone d'élevage ; les animaux sentinelles contribuent ainsi à une meilleure maitrise du nombre d'animaux élevés sur site.
Raffinement
Le raffinement des conditions d'hébergement passe par un hébergement en cage ventilée avec filtration de l'air sur filtre à haute efficacité de filtration pour exclure toute contamination dans l'air entrant et sortant cage à cage ; l'air de la zone d'élevage étant lui-même filtré et renouvelé à haute fréquence. Cette approche est couplée à une décontamination/stérilisation de l'ensemble des matériels pouvant être au contact des animaux (matériels d'hébergement, aliments, litière, matériel d'enrichissement, eau de boisson...etc): décontamination thermique,chimique, par irradiation aux rayons gamma ou par ultrafiltration avec stérilisation aux ultra-violets pour l'eau d'abreuvement. Enfin, le port d'équipements de protection individuelle pour les manipulateurs permet également de renforcer la barrière sanitaire mise en oeuvre pour éviter une contamination de l'animalerie et l'apparition de situations de mal-être chez les souris immunodéficientes en particulier. Le suivi des animaux est réalisé quotidiennement par des personnels expérimentés formé à l’utilisation d’un outil développé par le centre national 3R en Angleterre : l’échelle de la grimace de la souris qui permet d’identifier la douleur de façon précoce. Cette échelle est basée sur l’observation fine des yeux, du nez, des joues, des oreilles et des moustaches avec 3 niveaux d’expression. Les expressions faciales s’intensifient en réponse à une douleur, et peuvent être utilisées comme un élément de l’évaluation clinique. Des critères stricts et précoces de prise en charge de la douleur ont été définis.
Choix des espèces
La pertinence de l'espèce choisie a été justifiée dans les projets de recherche réalisés dans notre l'animalerie. Pour les animaux élevés sur site, ils sont transférés aux laboratoires pour une inclusion dans les projets de recherche à l'âge adulte soit entre 2 et 3 mois. Pour les animaux non élevés sur site, les animaux arrivent en provenance d'élevages agréés juste après leur sevrage. Pour les animaux sentinelles, ils sont remplacés à l'âge de 5 mois par des animaux dits "naifs". Le délai de 4 mois au sein de notre animalerie est un compromis pour repérer rapidement des contaminations récentes tout en utilisant un minimum d'animaux.
Étude du remodelage veino-lymphatique chez la souris pour comprendre la physiopathologie de l’hypertension intracrânienne idiopathique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue pour analyse du cerveau et des méninges, 764 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Les deux veines jugulaires leur sont bouchées par chirurgie, un tube est posé dans le crâne pour des injections quotidiennes pendant six jours, et certaines sont maintenues seules en cage douze à quatorze jours avec ce tube en place. Le porteur ajoute un régime gras de quatre à dix semaines pour les rendre obèses, des IRM, des mesures de pression intracrânienne et des tests comportementaux dont il ne précise pas la nature, et reconnaît que l'isolement avec cathéter peut provoquer souffrance et troubles du comportement. Sur le remplacement, il se borne à quelques phrases générales concluant que le recours aux animaux est "inévitable", sans examiner les modèles disponibles.
Objectifs
Les vaisseaux lymphatiques récemment mis en évidence dans les enveloppes entourant le cerveau semblent impliqués dans beaucoup de maladies neurologiques. Ces vaisseaux lymphatiques ne sont pas présents dans cerveau mais autour, dans l’enveloppe la plus externe au cerveau : la dure mère. Au sein même de cette enveloppe, ils sont plus spécifiquement localisés le long des grosses veines du cerveau appelés sinus veineux duraux. Des travaux récents ont montré que cette proximité entre les veines et les lymphatiques jouait un rôle clé dans les défenses immunitaires du cerveau. Nos hypothèses sont les suivantes : 1) Une altération des veines cérébrales influera sur la fonction des vaisseaux lymphatiques, et inversement, 2) La mauvaise circulation de ces vaisseaux chez l’Homme pourrait être impliquée dans une maladie rare dont les mécanismes sont encore inconnus : l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I). Cette maladie touche spécifiquement la femme jeune en surpoids et associe une accumulation d’eau dans le cerveau à des rétrécissements (sténoses) des veines. Nos objectifs sont de caractériser les mécanismes de cette maladie, et d’explorer également pourquoi ces malades ont des problèmes de mémoire qui pourraient être liées à une inflammation du cerveau. Dans cette étude, nous allons combiner une analyse par imagerie par radiologie du réseau veino-lymphatique dural chez l’Homme (patients avec HTIC-I et contrôles), et une étude expérimentale sur des modèles animaux d’HTIC-I. Notre programme d’étude chez la souris est le suivant : 1) Créer un modèle animal d’HTIC-I chez la souris 2) Étudier comment une atteinte du flux veineux peut affecter le réseau lymphatique 3) Étudier si en augmentant ou diminuant les fonctions lymphatiques, on modifie les caractéristiques de l’HTIC-I 4) Analyser les conséquences sur le comportement et la mémoire de l’altération des réseaux lymphatique et veineux 5) Analyser les conséquences sur l’inflammation du cerveau et des méninges d’une altération des réseaux lymphatique et veineux 6) Étudier comment le genre féminin et l’obésité participent à la physiopathologie de la maladie. Nous utiliserons sur 5 ans un total de *764* souris incluant 25 souris transgéniques.
Bénéfices attendus
D'un point de vue médical, l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I) est une maladie mystérieuse aux frontières de la neurologie, de l'ophtalmologie et de la neurochirurgie. Cette maladie affecte les femmes jeunes en âge de procréer et peut conduire à une altération majeure de la vision pouvant rendre les patients aveugles. Les traitements existants soulagent les symptômes, mais ne ciblent pas la cause de la maladie, ils sont agressifs, ont une efficacité limitée et sont associés à des risques et effets secondaires importants. De nouveaux traitements, plus efficaces et moins invasifs, ciblant directement la cause biologique de la maladie semblent nécessaires. Cependant, une étape nécessaire de ce développement est de comprendre les mécanismes biologiques impliqués. A long terme, l'objectif de cette étude est d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles avec un potentiel réaliste pour améliorer les symptômes de ces patients. D'un point de vue scientifique, l'HTIC-I est un modèle de maladie cérébrale qui semble parfaitement illustrer une dysfonction initiale des systèmes veineux et lymphatique cérébraux. Tandis que le rôle et l'anatomie des lymphatiques ont été bien étudiés chez l'animal, leur caractérisation chez l'humain et leur rôle dans les pathologies neurologiques est très méconnu. L'exploration du complexe veno-lymphatique et de sa plasticité pourrait conduire à des avancées significatives en neurosciences.
Procédures
Après avoir administré des médicaments pour soulager la douleur et s'être assuré que les souris sont bien hydratées, les procédures suivantes sont effectuées dans des conditions stériles de chirurgie. Un protocole de gestion de la douleur est mis en place après chaque opération. Voici ce qui est réalisé : Chirurgie pour boucher les veines jugulaires des deux côtés du cou (environ 1 heure, avec une préparation de 30 minutes). Mesure de la pression à l'intérieur du crâne (environ 30 minutes, avec une préparation de 30 minutes). Injection de produits biologiques dans le liquide cérébral (environ 30 minutes, avec une préparation de 30 minutes). Installation d'un petit tuyau à l'intérieur du crâne pour injecter des médicaments (environ 30 minutes, avec une préparation de 30 minutes). Installation et injection de substances fluorescentes à travers ce tube (environ 1 heure et 30 minutes, avec une préparation de 30 minutes) IRM du cerveau (environ 40 minutes, avec une préparation de 30 minutes). Mesure du flux sanguin dans le cerveau à l'aide de Doppler (environ 1 heure, avec une préparation de 30 minutes). Les autres procédures ne nécessitent pas de médicaments pour la douleur ou d'anesthésie et incluent : Des tests comportementaux étalés sur deux jours et demi. Un régime alimentaire riche en graisses pour rendre l'animal obèse pendant 4 à 10 semaines. L'isolement de l'animal pendant 12 à 14 jours avec un petit tube restant à l'intérieur du crâne. Une injection quotidienne à travers ce tube pendant 6 jours. Observation de l'activité dans des cages spéciales pendant 31 jours. Observation de l'activité dans des cages équipées de roues d'exercice, avec l'isolement de l'animal pendant 4 périodes de 3 jours. Une injection dans une veine pour introduire des traceurs dans le sang (environ 10 minutes).
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous devons considérer les éventuelles conséquences négatives qui peuvent être regroupées en deux catégories : celles liées aux interventions chirurgicales effectuées sous anesthésie générale et celles sans anesthésie. Les effets indésirables des chirurgies sous anesthésie générale incluent les risques associés à l'anesthésie tels que les accidents pendant l'administration de l'anesthésie (comme des erreurs chirurgicales, des saignements ou une mauvaise réaction à l'anesthésie pouvant entraîner la mort de l'animal ou l'arrêt de la chirurgie), ainsi que les effets indésirables post-opératoires tels que la douleur, les infections au niveau de la cicatrice ou du site opératoire, le stress, une réduction de l'activité et des comportements anormaux. Les procédures effectuées sans anesthésie sont moins graves mais peuvent causer de l'inconfort ou du stress chez l'animal, ce qui doit être surveillé et pris en compte. Par exemple, les souris obèses peuvent avoir des difficultés à se déplacer. De plus, l'isolement des animaux portant un cathéter intracrânien peut provoquer de la souffrance et des perturbations comportementales, qui doivent être détectées et traitées précocement et préventivement en enrichissant leur environnement. L'injection intraveineuse peut entraîner des douleurs au site d'injection, des ecchymoses ou des saignements. Pour atténuer ces douleurs, des médicaments antalgiques seront systématiquement administrés avant l'intervention.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études histologiques et biochimiques de la dure mère et du cerveau des animaux.
Remplacement
Pour notre projet, il n'y a pas d'autre choix que d'utiliser des animaux pour atteindre nos objectifs. Lorsque nous étudions comment les maladies affectent le corps ou comment fonctionnent certains processus biologiques, il est souvent nécessaire d'utiliser des modèles animaux. Ces modèles nous aident à comprendre comment le corps réagit dans différentes situations, ce qui est essentiel pour faire progresser la recherche médicale et scientifique. Bien sûr, nous cherchons toujours des alternatives quand c'est possible, mais dans certains cas, l'utilisation d'animaux est inévitable pour obtenir des informations précieuses sur notre santé et sur le fonctionnement de notre corps.
Réduction
Pour mener à bien notre étude, nous aurons besoin d'un certain nombre de souris pour différentes analyses. Tout d'abord, pour les analyses après le décès des souris, où nous injecterons préalablement des substances pour examiner certains aspects, nous aurons besoin de 710 souris. Ensuite, pour des analyses cliniques par imagerie ou tests comportementaux, nous aurons besoin de 54 souris supplémentaires. Pour minimiser les inconvénients pour les souris, nous allons combiner les études post-mortem avec les études cliniques. Nous avons calculé le nombre optimal de souris par groupe pour chaque type d'analyse, en tenant compte des risques de perte pendant les procédures. Par exemple, pour les analyses cellulaires, nous aurons besoin d'au moins 18 souris par groupe en raison du faible nombre de cellules dans certaines parties du corps. De plus, pour valider nos résultats, nous devrons utiliser des souris génétiquement modifiées. Nous aurons besoin d'environ 25 de ces souris. Enfin, en considérant toutes les analyses prévues, y compris une nouvelle procédure pour évaluer le flux sanguin, nous aurons besoin d'un total de 764 souris pour atteindre nos objectifs de recherche. Toutes ces étapes sont essentielles pour obtenir des données précises et fiables afin de mieux comprendre certains processus biologiques et médicaux.
Raffinement
Lorsque les animaux arrivent, on leur laisse une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement. Pendant toute l'étude, les souris seront logées par groupes de trois dans des cages ventilées pour qu'elles puissent avoir une vie sociale enrichissante. Elles auront de la nourriture et de l'eau à disposition en permanence, ainsi que des matériaux pour se construire un nid douillet. Si une souris a des difficultés à se déplacer, par exemple juste après une opération, on adaptera son alimentation en rendant les croquettes plus faciles à manger et en lui fournissant une sorte de gelée hydratante. Chaque jour, on vérifiera les conditions de vie des souris et on surveillera leur santé de près. On pèsera leur poids deux fois par semaine après une opération. Après chaque intervention, on notera le temps passé en chirurgie et on observera de près les effets immédiats et à court terme. Pour s'assurer que les souris ne souffrent pas, on utilisera une grille de surveillance simple qui évalue différents aspects de leur bien-être. Si une souris montre des signes de douleur ou de détresse, on lui donnera des médicaments adaptés pour soulager sa souffrance. Avant toute opération, les souris recevront des médicaments pour éviter qu'elles ne souffrent trop. Si une procédure pourrait causer de la douleur, les souris seront endormies pour qu'elles ne ressentent rien. Enfin, les souris qui vivent seules auront une attention particulière et auront accès à des jouets et à d'autres éléments qui les divertiront. Tout est mis en place pour que les souris se sentent aussi bien que possible tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Notre objectif est de comprendre comment le système veineux et lymphatique se modifie et quelles sont les molécules impliquées dans ce processus. Pour cela, nous devons utiliser des modèles animaux, et la souris est le choix le plus adapté pour notre recherche. Des méthodes chirurgicales et de manipulation du système lymphatique ont déjà été mises au point avec succès sur des souris, ce qui nous permet de nous baser sur une solide expérience préexistante. Toutes nos expériences seront menées sur des souris adultes, une fois que leur système lymphatique aura atteint sa pleine maturité, environ huit semaines après leur naissance. Les injections dans le crâne et la mesure de la pression intracrânienne seront effectuées sur des souris jeunes adultes âgées de 2 mois à un an. À cet âge, le crâne est complètement développé et stable, ce qui garantit une précision chirurgicale lors des procédures stéréotaxiques.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement modifiés dans notre institut
- Conservation des espèces
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Gardés vivants à l'issue de la procédure, 20 000 rats vont subir une biopsie de l'oreille dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, leur devenir étant ensuite décidé par le chercheur en charge de la lignée. Chaque animal reçoit une bague à une oreille et un poinçon de 1,5 mm à l'autre, entre 12 et 15 jours de vie, avant le sevrage, pour permettre le génotypage. Le porteur justifie ce calendrier par l'organisation de l'animalerie, un gain "de temps, de place et de travail" et une capacité d'hébergement limitée. Ces 20 000 interventions accompagnent la gestion d'un élevage de lignées transgéniques créées sur commande, activité que l'établissement décrit comme une prestation.
Objectifs
Réaliser une biopsie d'oreille sur les rats génétiquement modifiés afin de pouvoir génotyper les animaux d'intérêt (Fondateurs, maintien de lignées, ou validation de cryoconservation des modèles).
Bénéfices attendus
Caracérisation génétique des lignées commandées pour les projets scientifiques des chercheurs et optimisation de la gestion des élevages. Il est important de réaliser le génotypage des animaux tôt, afin d'avoir les résultats si possible avant le sevrage, pour constituer les cagées directement. Cela permet un gain de temps, de place et de travail dans l'animalerie.
Procédures
Nous identifions les animaux par la pose d'une bague d'oreille et nous génotypons les animaux par une biopsie de 1.5mm de diamètre sur l'autre oreille à l'aide d'une pince spécialement dédiée. Cette procédure est réalisée une seule fois par animal. L'acte de biopsie et identification est très rapide (maximum 20 secondes pour les 2 actes d'identification et de biopsie). L'animal est donc contenu durant quelques secondes seulement et remis immédiatement à la mère.
Impact sur les animaux
Le poinçon peut entrainer douleur légère et de courte durée au site de prélèvement
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à la suite de cette procédure peu invasive. La biopsie permettra de déterminer le génotype de l'animal. Le chercheur en charge de la lignée déterminera son devenir en fonction des projets qu'il mène.
Remplacement
Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour le prélèvement de tissus.
Réduction
La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente. Le raffinement de nos techniques de transgénèse, de procréation médicalement assistée et de cryoconservation permet de générer de moins en moins d'animaux pour l'ensemble des prestations de l'institut, ce qui permet de réduire de manière importante la quantité d'animaux générés et donc biopsiés. De plus, nous utiliserons dès que possible, de schémas d’accouplement optimisés ne nécessitant pas ou peu de génotypage, afin de produire un maximum d’animaux « utiles »
Raffinement
La méthode de poinçon à l'oreille est éprouvée, précise, rapide et standardisée ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs sur les animaux. De plus, les animaux sont surveillés quotidiennement ce qui permet de faire un suivi de la cicatrisation dans le temps. Nos rats sont hébergés en cages ventilées, en groupe, avec de multiples enrichissements : bâton de bois à ronger, balles de bois à ronger, nids, croquettes de nourriture au fond de la cage.
Choix des espèces
Le rat, comme la souris , est un très bon modèle d'expérimentation animale car il est de petite taille, son génome est parfaitement connu et il a un taux de reproduction très rapide. Il est couramment utilisé par les chercheurs qui nous commandent des prestations de création de lignées transgéniques Les rats seront prélevés entre 12 et 15j de vie, avant le sevrage. Cet âge a été judicieusement choisi car avant 12j, l'oreille ne s'est pas assez développée et ce n'est qu'un bourgeon sur lequel il est difficile de réaliser une biopsie. et après 15j, nous n'aurions pas les résultats de génotypage avant le sevrage (3 semaines), ce qui ne nous permet pas de faire les cagées définitives. Notre capacité d'hébergement est limitée et il nous faut donc optimiser la place constamment. Ce fonctionnement nous permet d'économiser du temps, des ressources et de la manutention pour les animaliers.
Etude de la dégénérescence des cellules oligodendrocytaires et étude des effets de la stimulation magnétique répétitive transpinale dans le développement de la SLA chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard à 110 jours pour prélever la moelle épinière, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes subissent une biopsie de la queue vers six jours, et 260 d'entre elles portent une mutation qui provoque une paralysie progressive, avec des tests moteurs hebdomadaires que le porteur n'énumère pas. Quatre-vingts souris reçoivent en plus une stimulation magnétique de la moelle sous anesthésie générale pendant quatorze jours. Le porteur fixe le point limite à une paralysie modérée qu'il décrit comme ayant "peu d'impact sur la vie de l'animal", et prévoit croquettes mouillées et biberons à longue tétine pour que les souris n'aient pas à se redresser.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs (appelés aussi motoneurones). Elle se déclare à l’âge adulte, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif et l'issue de la maladie est fatale. De plus, les mécanismes conduisant à la dégénérescence des motoneurones restent mal connus à ce jour. En outre, une dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures a été observée, cette dégénérescence étant considérée comme une conséquence de celle des motoneurones. Cependant, des études récentes suggèrent que la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures pourrait précéder, voire contribuer, à celle des neurones moteurs. Le premier objectif de ce projet sera donc d'étudier la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures au cours de l'évolution de la maladie chez des souris transgéniques qui reproduisent la sclérose latérale amyotrophique. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité thérapeutique d’un traitement non-invasif dans le développement de la maladie. En effet, il a été démontré que la stimulation magnétique répétitive permet d'augmenter la survie des neurones et de réduire la démyélinisation après une lésion traumatique de la moelle épinière. Par conséquent, nous étudierons les effets de la stimulation magnétique répétitive sur la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures. Pour cela, afin de pouvoir étudier spécifiquement les oligodendrocytes et les oligodendrocytes matures dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique, des souris permettant de suivre spécifiquement ces cellules seront croisées avec des souris développant la sclérose latérale amyotrophique au cours du temps ; ces deux lignées de souris étant présentes au sein de notre animalerie.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intéresse aux mécanismes qui concourent à la dégénérescence des motoneurones et donc au développement de la sclérose latérale amyotrophique dans un modèle de souris qui reproduit la maladie décrite chez l’Homme. Il permettra donc le cas écheant de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de cette maladie. Cette étude nous permettra également d’avoir une meilleure connaissance sur les bénéfices d’une méthode non invasive (stimulation magnétique répétitive) dans ce contexte pathologique. Cela permettrait, sur un plus long terme, d’envisager de proposer ce traitement dans le cadre de la prise en charge des patients qui développent la sclérose latérale amyotrophique.
Procédures
L'ensemble des animaux, soit 360 souris, subiront une biopsie de queue vers 6 jours afin de réaliser le génotypage de ces animaux. Pour une première série d’expérimentations ; 100 souris controles (50 males et 50 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences d’histologie. De la même facon, 100 souris exprimant les symptomes de la sclérose latérale amyotrophique (50 males et 50 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences d’histologie. Pour une seconde série d’expérimentations 160 souris exprimant les symptomes de la sclérose latérale amyotrophique (80 males et 80 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences de comportements et d’histologie. Les tests de comportements seront réalisés à partir de l’âge P50 et seront effectués toutes les semaines. La moitié de ces souris, soit 80 souris, bénéficiera d’un traiment par stimulation magnétique qui durera 14 jours. Ce traitement se fera sous anesthésie générale pendant 10 minutes (10hz pendant 10 secondes suivies de 20 secondes sans stimulation avec une intensité de 0.4T). Les animaux seront stimulés soit de J50 à J64 soit de J80 à J94. Enfin l’ensemble des animaux sera euthanasié, à un age de P110 au maximum afin de récupérer la moelle épinière.
Impact sur les animaux
Nous avons bien conscience que dans notre étude certains animaux mimant la maladie humaine vont développer certains signes de paralysie progressive et que l’aggravation de leur état conduira à un arrêt de toute procédure pour ces animaux. Ce projet impose également une douleur de courte durée à la suite du prélévement de queue (biopsie) afin de réaliser le génotypage
Devenir
L’ensemble des animaux (360 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (à P110 maximum) afin de procéder au prélévement de la moelle.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, la sclérose latérale amyotrophique résulte d'interactions pathogènes complexes entre les neurones moteurs et les autres constituants cellulaires de la moelle épinière, en particulier les cellules microgliales, les astrocytes et également les oligodendrocytes. L’étude de l’implication de ces différentes populations cellulaires dans le développpement de la maladie ne peut donc se faire que via l’utilisation d’animaux entiers vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué à partir d’études précédentes, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 à 10 animaux et les expériences fonctionnelles nécessitent un minimum de 10 animaux. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6 par groupe. L'utilisation de 10 animaux pour certaines expériences se justifie par la variation pouvant être observée notamment lors des tests fonctionnels.
Raffinement
Les expériences sont concues pour apporter le moins d’inconfort possible aux animaux. Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Nous avons défini un point limite ; score de 2 sur une échelle de 4 où la paralysie est modérée et a peu d'impact sur la vie de l'animal. Toutefois, par souci de précaution, afin de leur permettre aisèment d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
La découverte d’un lien génétique chez certains patients a permis de développer des modèles murins de la sclérose latérale amyotrphique ou SLA. Nous utiliserons ici l'un de ces modèles de souris qui mime la maladie. Ces souris présentent une mort progressive des neurones permettant le controle moteur, reproduisant ainsi les caractéristiques de cette maladie. Cette souris est donc un modèle de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et l'effet de thérapies potentielles. Afin d’étudier la dégénérescence des cellules qui produisent la myéline, ces souris seront croisées avec un second modèle de souris de manière à pouvoir suivre ces cellules spécifiquement durant le développement de la maladie. Les animaux utilisés seront agées entre 15 et 110 jours. En effet, nous voulons étudier la dégénérescence des cellules myélinisantes et des neurones au cours du développement de la SLA chez la souris. Les premiers temps expérimentaux correspondent aux stade pécoces pré-symptomatiques (P15 et P30) de la maladie, puis à P50, P80 et P110 ; périodes qui correspondent respectivement à l’apparition des premiers signes notamment des symptomes locomoteurs et à l’apparition de la paralysie.
Modèle murin de maltraitance physique infantile : syndrome du bébé secoué
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Secoués sous anesthésie générale à l'âge de sept jours pour reproduire le syndrome du bébé secoué, 909 souriceaux sont tous tués aux stades étudiés pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur liste les atteintes attendues : douleurs cérébrales liées aux lésions, difficulté à s'alimenter, retard du développement psychomoteur, rigidité corporelle, mouvements de convulsion, respiration anormale et anomalies du comportement. Une partie des souriceaux subit en plus une craniotomie d'une heure sous anesthésie, sans réveil. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative parfaite" à un organisme vivant pour étudier les conséquences du secouement, et présente ce modèle comme une préparation d'interventions de prévention chez les enfants.
Objectifs
Les violences faites aux enfants et adolescents sont un fléau sanitaire et sociétal mondial. Un quart des adultes déclarent en avoir été victime mais une minorité d’entre eux est repérée suffisamment précocement pour éviter les conséquences « vie entière » somatiques et neuropsychiatrique de ces violences et leur impact socio-économique majeur. Les violences faites aux enfants et adolescents sont définies par l’OMS comme toutes les formes de mauvais traitements physique et/ou affectifs, de sévices sexuels, de négligences ou d’exploitation, entraînant un préjudice réel ou potentiel pour la santé de l’enfant, sa survie, son développement ou sa dignité, dans le contexte d’une relation de responsabilité, de confiance ou de pouvoir. Dans les pays à économie développée, les estimations de fréquence usuellement acceptées indiquent que 4 à 16% des mineurs seraient victimes de maltraitance physique. Pour les enfants survivants aux violences physiques du syndrome du bébé secoué, les conséquences à long terme sont majeurs sur le plan neurologique et développemental (périmètre crânien diminué, épilepsie, déficiences motrices visuelles intellectuelles, trouble du langages, et anomalies comportementales). Enfin, la pandémie de COVID-19 a augmenté la fréquence et la gravité des violences. Le syndrome du bébé secoué a vu son incidence doubler en 2021 et la mortalité décupler par rapport à la période de prépandémie. Dans ce projet, nous modéliserons chez le souriceau le syndrome du bébé secoué (traumatisme crânien). Plusieurs analyses seront réalisées à des temps spécifiques de la maturation du cerveau : enfance, adolescence et adultes. Nous établirons un profil comportemental individuel sur plusieurs composantes (motrice, sociale, cognitive). Les effets au niveau moléculaires de ces maltraitances seront également étudiés afin de permettre un futur transfert vers la clinique chez l’humain. Les analyses seront ciblées sur les marqueurs moléculaires de deux axes identifiés chez l’humain comme étant tout particulièrement perturbés après exposition à des maltraitance dans l’enfance : la neuroinflammation et la production d’hormones. Les études de la génétique et des protéines sont réalisés sur le sang et le cerveau des animaux juvéniles, adolescents et adultes. Enfin des approches thérapeutiques telles que la thérapie comportementale et des tests de médicaments ciblant les régulateurs clés seront entreprises.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier les mécanismes et l'évolution du traumatisme crânien du syndrome du bébé secoué à l’échelle cellulaire comme comportementale pour mieux définir la période la plus propice pour les futures études thérapeutiques chez les enfants et adolescents. Il permettra de préparer des interventions de prévention secondaires adaptées et correctrices.
Procédures
Les souriceaux subiront un traumatisme crânien par secouement sous anesthésie générale. Après le traumatisme, des groupes d’animaux de différents âges seront anesthésiés, et une perfusion intra-cardiaque sera réalisée post- mortem pour éliminer le sang des vaisseaux du cerveau qui sera étudié. La perfusion est réalisée sous anesthésie générale et avec analgésie. Certains animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale pour réaliser des mesures d’imagerie du cerveau (durée 1 heure). Cette chirurgie consiste en une craniotomie afin de permettre le passage du signal. Cette procédure est sans réveil, les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation. Cette procédure sera réalisée exclusivement par des expérimentateurs aguerris, maîtrisant parfaitement toutes les techniques requises.
Impact sur les animaux
Tout d'abord le jour du traumatisme crânien par secouement : - Séparation d’avec la mère lors de l’anesthésie par inhalation - Une hypothermie causée par l’isolement d’avec la mère - Le secouement horizontale. Ensuite, suite au traumatisme du secouement : - Douleurs cérébrales suite aux lésions occasionnées par le secouement - Difficulté à s’alimenter engendrant un petit poids - Retard dans le développement psychomoteur - Hypertonique, ou rigidité corporel, mouvements anormaux de convulsions, - Respiration anormale - Anomalie du comportement
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt. Les cerveaux seront prélevés post-mortem pour les différentes analyses qui permettront d’étudier de manière approfondie le tissus cérébral après le traumatisme, ainsi que l’inflammation cérébrale.
Remplacement
Il n’y a pas d’alternative parfaite à un modèle sur un organisme vivant pour étudier les conséquences du secouement sur le cerveau et les anomalies du développement qui en découle. Plusieurs analyses de notre projet ne peuvent être modélisée hors de l’organisme vivant, ni par des méthodes utilisant des modèles informatiques de théories de toxicité. Ce modèle, de bébé secoué, réalisé sur organisme vivant nous permet de s’intéresser à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Nos analyses sont réalisées régulièrement dans notre laboratoire, ainsi nous savons combien d’animaux sont nécessaires afin d’obtenir un résultat. En conséquence, le nombre d’animaux pour ce projet sera au maximum de 909 animaux afin d’obtenir des résultats analysables par les tests statistiques. Le cerveau des animaux issus de l’analyse de la connectivité neuronale et ceux issus des analyses du comportement seront prélevés pour les analyses du tissus cérébral ce qui a réduit le nombre d’animaux dans notre projet. Il est prévu de mettre en place le modèle avec 48 animaux, mais si la fréquence d’agitation est déterminée sur moins d’animaux nous en utiliserons moins ce qui réduira le nombre total d’animaux.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement de l’hébergement avec du papier doux absorbant pour la fabrication du nid comme cela est fait dans leur milieu naturel. Les animaux seront réchauffés à l’aide d’une lampe au moment de la procédure du secouement. On surveillera l’état général des animaux dans le nid à l’aide d’un document appelé « arbre décisionnel ». Il permet d’observer les souriceaux dans la portée sans les déranger à nouveau car les soins apportés par la mère sont importants. Dès qu’un animal ne va pas bien il est vite repéré car il est blanchâtre et/ou immobile, donc il attire l’œil. Pendant les protocoles nécessaires pour la mise en place des appareils d'imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l'animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure sera interrompue et l'animal euthanasié. Les animaux seront euthanasiés après administration d’un analgésique et d’un anesthésique. C’est quand la mort sera vérifiée (plus de réflexes) que nous procéderons alors aux prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. Le modèle de secouement sera fait à 7 jours de vie, ceci correspond à la petite enfance chez l’humain. Nous étudierons les interactions entre les cellules du cerveau en développement sur un modèle de bébé secoué, pour cela il est nécessaire d’utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l’homme. La souris remplit très bien cette condition. Notre objectif étant d’étudier l’effet du secouement sur le cerveau en développement, nous nous intéresserons à 3 temps de vie : 8 à 21 jours (petite et moyenne enfance), 45 jours (adolescence), et 6 mois de vie (adulte), afin d’étudier l‘évolution du traumatisme cérébrale et les effets à long terme.
Evaluation de traitements contre les comorbidités associées au syndrome de Dravet dans un modèle murin EU 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Soumises à une biopsie d'oreille puis à des injections ou des gavages quotidiens pouvant aller jusqu'à 42 administrations, 275 souris sont toutes tuées à l'issue, 200 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 75 d'un niveau léger. Ces souris portent une mutation qui déclenche des crises d'épilepsie spontanées, et le porteur indique que 40 à 50 % d'entre elles n'atteindront pas l'âge de 60 jours. Il annonce jusqu'à cinq tests comportementaux par animal sans préciser lesquels, alors que l'objet déclaré du projet porte justement sur l'hyperactivité, la sociabilité et la cognition. Il affirme que l'usage d'animaux transgéniques est "indispensable" pour reproduire un syndrome d'origine génétique, et compte sur ce modèle pour proposer des traitements des comorbidités du syndrome de Dravet.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l’impact de traitements (pharmacologiques et ou probiotiques) sur les comorbidités liées à l’épilepsie, telles qu’une hyperactivité, une altération de la sociabilité ou des déficits cognitifs. Le syndrome de Dravet est une épilepsie rare de l’enfant qui a pour cause (dans plus de 80% des cas) une mutation hétérozygote (ne touchant qu’un allèle sur les 2) du gène SCN1A, codant pour un canal sodique. Ce syndrome épileptique est très bien caractérisé au niveau des crises épileptiques, mais l’est moins pour les comorbidités psychiatriques qui se développent à plus long terme. Des modèles murins du syndrome de Dravet ont été établis par transgène en délétant ou en mutant le gène Scn1a, ce qui mène au développement de crises épileptiques, provoquant dans certains cas une mort prématurée (phénotype aussi présent chez l’homme), ainsi que certaines comorbidités. Nous proposons d’utiliser un des modèles murins qui récapitule un grand nombre des caractéristiques du syndrome de Dravet : des crises précoces spontanées, une mort prématurée (nommée SUDEP = sudden unexpected death in epilepsy), et des altérations comportementales, comme une hyperactivité, une diminution de la sociabilité ou encore des déficits cognitifs. Ce modèle robuste est toujours utilisé pour le développement de traitements pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Le syndrome de Dravet est un syndrome épileptique de l’enfant dont les traitements actuels ne permettent pas de soigner tous les patients. De plus, même si certaines crises sont atténuées par les traitements actuels, les comorbidités psychiatriques associées à ce syndrome ne sont pas traitées et entrainent une diminution de la qualité de vie des patients. Ce projet vise à tester de nouveaux traitements chroniques pour atténuer les comorbidités psychiatriques, ce qui permettra de proposer de nouveaux traitements chez l’homme.
Procédures
Tous les nouveaux-nés (environ 200) seront identifiés et génotypés à l’aide d’un prélèvement (biopsie) à l’oreille qui sera effectuée une seule fois (maximum 5 minutes/animal). Pour l’évaluation du comportement, les animaux (150) seront testés au maximum 5 fois à l’aide de test allant de 8 min à 30 min/jour, le tout sur 5 semaines maximum. Pour les traitements, les animaux (120) seront administrés quotidiennement (une fois par jour, maximum 2 min/animal) par voie intrapéritonéale (injection) ou voie orale (gavage) pendant la durée des tests comportementaux soit au maximum : 42 fois au total.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues (connues de la littérature) sont : 1) Une survenue de crises épileptiques spontanées, qui peuvent entrainer une mort prématurée (environ 40% à 50% des animaux au maximum n’atteignent pas l’âge de 60 jours). 2) Un stress et une douleur associée à la biopsie d’oreille pour l’identification et le génotypage simultané 3) un stress dû au transport entre le site de maintien de la lignée et le site de test. 4) un stress dû aux tests comportementaux (isolement dans un environnement nouveau) 5) un stress et une douleur dus à l’administration chronique des traitements (par gavage ou injection intrapéritonéale) Les traitements seront effectués par une personne expérimentée pour limiter le stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car le comportement (locomoteur, social, cognitif) ne peut être étudié au niveau cellulaire (in vitro) ou par modélisation (in silico). De plus, afin de mimer un syndrome d’origine génétique, l’utilisation d’animaux transgéniques est indispensable
Réduction
Afin de limiter l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype dommageable, les animaux HE seront générés à partir de fécondation in vitro d'ovules de femelles C57BL/6 à l’aide de sperme issus de male modèle de Dravet. Nous ferons aussi une planification rigoureuse des expériences, en testant d’abord le phénotype comportemental du modèle murin dans nos conditions expérimentales (environnement) avant de tester de possibles traitements. Le calcul du nombre des animaux est fait selon une approche statistique, il nous faut donc au minimum 12 animaux par groupe pour pouvoir évaluer le phénotype des animaux.
Raffinement
Pour la procédure d’élevage, les animaux sont hébergés en isolateur enrichies avec des morceaux de coton et de la frisure de carton servant de matériel de nidification. La température est de 22°C +/-2°. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 6h/18h. Une manipulation réduisant le stress des animaux sera réalisée (manipulation dans le creux de la main). Le transport entre le site d’élevage (procédure 1) et le site utilisateur (procédures 2 et 3) se fera dans des cages où les animaux seront groupés en conservant les groupes sociaux, avec de la frisure de carton en enrichissement, de l’eau gélifiée et de l’aliment, et dans des conditions environnementales contrôlées. Pour les procédures comportementales, les animaux sont hébergés dans des cages ventilées enrichies avec de la frisure de carton. La température est de 22°C +/-2°. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 7h/19h. Une surveillance attentive et quotidienne des animaux est réalisée. Des points limites strictes sont définis pour chacune des procédures. Les administrations (injection intrapéritonéale ou gavage oral à l’aide de sondes souples) seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
Afin de modéliser au mieux le syndrome de Dravet, qui est à plus de 80% dû à une mutation génétique, l’espèce souris dont la modification génétique du gène Scn1a déjà publié est la plus pertinente. Ce modèle récapitule le phénotype Dravet : crises fébriles, crises spontanées, SUDEP et comorbidités psychiatriques. Pour la procédure 1, les animaux seront élevés de la naissance à leur expédition à partir de 8 semaines d’âge. Pour les autres procédures (2-3), des animaux adultes (à partir de 8 semaines d’âge) seront réceptionnées et utilisés. A cet âge, la survie n’est plus diminuée (stabilisation de la mortalité) et les comorbidités psychiatriques au syndrome de Dravet sont bien retrouvées chez l’adulte.