Troubles nerveux

40 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres études après une période de repos. Sous anesthésie générale, chaque animal peut subir jusqu'à cinq fois sur deux ans des prélèvements de moelle osseuse, de liquide cérébrospinal, des lavages broncho-alvéolaires ou des prises de sang. L'objectif est de fournir du matériel biologique de primate pour mettre au point des techniques d'analyse. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, la proximité des primates avec l'humain étant présentée comme sans équivalent.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre à disposition de la communauté scientifique du matériel biologique de primate (liquide cérébrospinal, échantillons pulmonaires ou de moelle osseuse, accompagnés ou non de prélèvement sanguin), qui ne peut être collecté que sous anesthésie générale des animaux. Ces prélèvements sont nécessaires à la mise au point de techniques d'analyses sur ces échantillons, à la sélection d'animaux sur certains critères physiologiques, ou encore à la réalisation de test in vitro afin d’appréhender la toxicité ou l'efficacité d’un produit, au lieu de ou avant de le tester chez l’animal. Ce projet vise donc à pouvoir prélever certains échantillons biologiques de primate sous anesthésie, dans le but de réaliser des tests préliminaires ou en remplacement d'études in vivo sur cette espèce.

Bénéfices attendus

Tout test de matériel biologique obtenu lors de protocoles expérimentaux utilisant l'animal nécessite au préalable d'être mis au point, affiné, voir validé selon un certain cadre réglementaire. Ces mises au point nécessitent elles-mêmes l'utilisation de matériel biologique, qui doit être obtenu sur la même espèce. Beaucoup de tests sont basés sur des produits sanguins, mais certains nécessitent d'autres matrices biologiques plus difficile d'accès, comme la moelle osseuse, le liquide cérébrospinal ou les lavages pulmonaires. La moelle osseuse pourrait par exemple être utilisée dans le cadre de la mise au point d'un test visant à caractériser les cellules progénitrices du sang, pour le développement d'une thérapie contre des maladies héréditaires. Le liquide cérébrospinal pourrait être utilisé pour mettre au point une méthode de mesure d'un produit injecté dans le sang d'un patient, pour évaluer sa capacité à passer dans le cerveau. Cela peut avoir des implications pour évaluer la potentielle neurotoxicité d'un produit, ou au contraire sa capacité à atteindre le cerveau pour lutter contre des maladies neurodégénératives. Finalement, les lavages pulmonaires permettent d'avoir accès à du liquide et à des cellules de poumons, sans pour autant sacrifier l'animal : cela permettrait d'étudier le microbiote pulmonaire d'animaux, ou encore d'utiliser ces échantillons pour mettre au point des méthodes d'investigation de virus pulmonaires comme le SARS-CoV-2 (ex: PCR). Ces prélèvements sous anesthésie de matrices biologiques spécifiques pourront potentiellement être accompagnés de prélèvements sanguins dans la limite des recommandations de volume et fréquence pour l'espèce. Ces prélèvements de sang pourront être réalisés seulement s'il est jugé scientifiquement ou éthiquement pertinent de les faire sur le même animal plutôt que sur une cohorte différente. Dans certains cas, ces échantillons pourraient être utilisés pour réaliser des tests in vitro remplaçant l'utilisation de l'animal, comme par exemple dans le cadre de tests de toxicité d'un produit sur les cellules progénitrices de la moelle. Dans ce contexte, les différents prélèvements réalisés sont nécessaires pour mettre au point ou améliorer des méthodes d'analyses existantes. Ce projet contribuera donc à réduire le nombre d’animaux utilisés en étude, en permettant le développement de méthodes d'analyses plus fines ou de test in vitro remplaçant l'animal lors de phases expérimentales précoces.

Procédures

Les animaux seront manipulés afin de réaliser une injection d’anesthésique. Les procédures se déroulent entièrement sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à une parmi les 4 procédures différentes, chacune nécessitant entre moins d’une minute et trois minutes . Les prélèvements possibles seront : prélèvement de moelle osseuse, prélèvement de liquide cérébrospinal, lavage broncho-alvéolaire et prélèvements sanguins. Le temps entre l’induction de l’anesthésie de l’animal et son réveil est d’environ 1h.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de liquide cérébro-spinal est réalisé sous anesthésie. Une légère gêne au lieu de ponction peut être ressentie au réveil par l’animal. Le lavage broncho-alvéolaire peut provoquer une gêne chez l'animal suite à l'administration de liquide dans les poumons. De plus, dans le cadre de ce protocole, les prélèvements seront par définition ponctuels et donc non répétés dans le temps. Le prélèvement de moelle osseuse peut quant à lui provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement. ire un hématome sur la zone de prélèvement.

Devenir

Après une période de repos adéquate, les animaux seront disponibles pour intégrer d'autres études, sur avis vétérinaire.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'animal dans le cadre de ce projet. L'utilisation de celui-ci est indispensable afin d'obtenir le matériel biologique nécessaire à la mise au point, la calibration et la validation de méthodes d'analyses biologiques. Ces méthodes visent en effet directement les cellules de l'espèce animale concernée (cytométrie en flux, tests de stimulation de cellules immunitaires, caractérisation de l'expression de certains gènes…), ou peuvent être fortement influencées par le milieu biologique dans lequel elles sont réalisées (mesure de la quantité d'un anticorps ou d'une protéine exogène par ELISA ou spectroscopie de masse). Le raffinement de ces méthodes d'analyses sert d'une part à transférer des protocoles d'analyses d'une espèce à l'autre, et à améliorer leurs sensibilité et spécificité, réduisant ainsi potentiellement le nombre d'animaux nécessaires lors d'études subséquentes. De plus, la disponibilité de matériel biologique permet de la réalisation d'étude d'efficacité ou de toxicité in vivo, qui pourront potentiellement permettre de remplacer ou réduire le besoin d'études in vivo.

Réduction

Afin de ne pas surestimer le nombre d'animaux utilisés, le nombre d’animaux pour ce projet a été défini par une analyse rétrospective des prélèvements de liquide cérébrospinal et de prélèvements pulmonaires fait au sein de l’entreprise au cours des dernières années, modulée par la trajectoire de croissance de notre activité . Afin d’assurer un nombre minimum d’animaux, les animaux pourront être prélevé un maximum de 5 fois sur une période de 2 ans dans le cadre de cette DAP.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement aux animaux (après les manipulations et fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). Les fruits et légumes frais qui leurs seront fournis seront variés d'un jour à l'autre, tout comme la façon de les préparer, afin de stimuler les animaux. Un fond musical sera diffusé dans l'animalerie tout au long de la journée afin d'habitue les animaux à la voix humaine et de masquer les sons liés à l'utilisation quotidienne de l'animalerie. Toutes les procédures décrites dans ce protocole auront lieux sous anesthésie, accompagnées de mesures de soutien en fonction de la procédure en question. Par exemple, les prélèvements de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal seront précédés d'injection d'analgésique, les prélèvements pulmonaires seront accompagnés de monitoring dédié et de supplémentation en oxygène. Les animaux seront gardés sur coussin chauffant durant la procédure afin de ne pas occasionner d'hypothermie. Les volumes maximum de matrice biologique à prélever sont basés sur une analyse de la littérature disponible, ou sur les pratiques utilisées en clinique humaine le cas échéant. L'animal sera suivi par le personnel d’étude tout au long de l'anesthésie et surveillé au moment de son réveil ainsi que durant les heures suivantes. Un suivi clinique quotidien ainsi que la mise en place de points limites spécifique à chaque procédure permet d’évaluer quotidiennement le bien-être de l’animal. En fonction de la procédure réalisée, un score neurologique pourra aussi être réalisé, si nécessaire, les jours suivant les prélèvements afin d’assurer qu’il n’y ait pas de dommage neurologique.

Choix des espèces

Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Cette proximité permet de les utiliser dans le cadre de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou prophylactiques. Cette espèce est donc particulièrement utilisée pour tester l'efficacité ou la toxicité de drogues visant des processus biologiques spécifiques à l'homme ou aux espèces proches. Ces études peuvent couvrir les thérapies géniques ou cellulaires visant à corriger l'expression de gènes défectueux, les études infectieuses sur des virus n'infectant que l'homme ou certains primates, ou encore les thérapies visant le système nerveux central (la barrière hémato-encéphalique de l'humain étant très proche de celle du singe). Ce type d'étude nécessites la mise au point de méthodes d'analyses dédiées, pour lesquelles l'accès au matériel biologique de l'espèce cible est nécessaire. Ainsi, des études visant des maladies génétiques ou des leucémies auront besoin d'analyser la moelle osseuse des animaux, les études infectieuses de virus respiratoire (le singe étant le modèle de référence pour l'infection au SARS-CoV-2) auront besoin d'échantillons pulmonaires, et les études visant le système nerveux auront besoin d'échantillons de liquide cérébrospinal pour mettre au point leur méthode de dosage. Les mises au point et/ou test préliminaires de ce projet concerneront des candidats médicaments humains. Les animaux pourront être des juvéniles à mature, en fonction des besoins de l’étude. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des matures en fonction des objectifs des études. Par exemple, des prélèvements de moelle osseuse peuvent chercher certaines populations de cellules précurseurs plus fréquentes chez le juvénile que chez l'animal mature.

15 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue pour études histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation sous anesthésie, trois IRM et jusqu'à neuf ponctions de sang et neuf ponctions de liquide céphalo-rachidien, pour tester la faisabilité d'une thérapie de la leucodystrophie métachromatique. Le porteur reconnaît des risques anesthésiques, des douleurs post-opératoires et des fuites de liquide provoquant maux de tête et vomissements. Il présente l'étape chez le primate comme "indispensable" et "requise" par l'agence du médicament avant un essai chez l'humain, l'efficacité n'ayant été montrée que chez la souris.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique (MLD) est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (gaine qui isole la fibre nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une dégradation très rapide dans les 6 mois suivant les premiers symptômes et un décès des patients dans les deux ans au maximum. De nos jours la majorité des patients atteints de MLD sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités avant l’apparition des symptômes mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques. Une composante particulière de la MLD est la neuro-inflammation que développent les patients et qui est présente aussi dans le modèle souris de la pathologie. Dans ce contexte, nous proposons de mener le projet de recherche qui a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la pathologie. L’efficacité de la thérapie a été évaluée préalablement dans le modèle murin de la pathologie et les résultats préliminaires démontrent des résultats très encourageant. L’objectif ici est de démontrer la faisabilité et la tolérance de notre approche chez le primate non humain (PNH).

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de leucodystrophie métachromatique (MLD) ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Ce projet a pour but d'identifier une nouvelle voie thérapeutique pour ces patients. Le projet sera mené sur un modèle animal extrêmement proche de l’être humain afin de pouvoir proposer pour les différentes pathologies d’intérêt, un traitement et sa mise en place. A terme l’objectif est de pouvoir mettre en place un essai clinique chez l’Homme dans les prochaines années.

Procédures

- 3 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale repartis dans le projet ( un pré op, un immédiatement après la chirurgie et un avant la necropsie - Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie sera pratiquée sur les animaux (durée environ 1h30). - 9 prélèvements sanguins maximum et 9 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (durée du geste maximum 30min pour les 2 gestes, respectivement 10 min et 15 min max) réalisés sous anesthésie générale et analgésie. Dans ce projet, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien + IRM selon les temps d’intérêt de l'étude, ou chirurgie + IRM). des administrations IM en vigile pour induire l'anesthésie et la pose de cathéter à chaque IRM

Impact sur les animaux

L’animal sera confronté à une chirurgie sous anesthésie générale générant un risque anesthésique et infectieux, et de potentielles douleurs post-opératoires. Sur le protocole, plusieurs prélèvements de sang et de LCR seront réalisés amenant un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques ) et la formation possibles d’hématomes au niveau des sites de ponctions. Enfin, l’animal sera soumis à un stress lié à la contention en cage pour la réalisation des injections (anesthésie, analgésie, antibiotique,…) même s’il est réalisé par des personnes formées et auxquelles les PNH sont habitués.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux (n=15) sera euthanasié pour permettre les etudes histologiques et de biodistribution composant l'etude preclinique permettant de supporter une étude de Toxicologie et la soumission aux agences reglementaires.

Remplacement

Toutes les études possibles sur des cellules ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des constructions et des implants. Une preuve de concept a été établie dans le modèle souris de la pathologie. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité et de tolérance chez le gros animal (primate non humain). Ces étapes sont requises par l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé pour toute demande d’autorisation d’étude clinique chez l’Homme.

Réduction

Il y a 15 animaux maximum prévus sur ce projet, correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité des différentes approches avec des lots d’animaux. Une première étude de faisabilité sur 4 animaux suivi d’une étude de toxicité sur 11 PNH maximum, repartis en lot de 2 à 3 individus selon les demandes de nos partenaires et des agences réglementaires. L'étude concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié sans analyse statistique.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté. Le nombre d'anesthesies est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandation en terme de Bien être animal validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la même anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie. Un analgésique sera utilisé pour éviter tout inconfort. La procédure chirurgicale est raffinée avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, un suivi et un maintien des paramètres physiologiques de l’animal. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si necessaire. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Enfin, en termes de raffinement nous avons travaillé sur la taille de notre puce à implanter qui est 10 à 15 fois plus petite que celle de notre étude précédente qui avait été utilisée chez la souris et donc parfaitement adaptée à l’implantation prévue dans ce projet. Tout ce projet sera réalisé en conditions de Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL) pour bénéficier du meilleur suivi qualité et permettre la valorisation de ces expériences auprès des agences réglementaires françaises et internationales en vue d’un essai clinique de phase I/II chez l’homme.

Choix des espèces

La capacité des implants a secréter de manière efficace de la protéine d'interet qui soit mobilisable par les systèmes nerveux centraux et périphériques est dépendante de l’organisme dans lequel on réalise l’implantation. Ainsi à finalité clinique, l’implantation chez le primate non humain est une étape indispensable en vue de la préparation d’un dossier d’essai clinique afin d’obtenir les donner de faisabilité et de tolerance dans un organisme entier qui soit en plus comparable à l’homme d’un point de vue physiologique et immunitaire notamment. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (2-8 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́, de plus compte tenu des patients ciblés par nos approches, ils auront une taille similaire à nos patients pédiatriques.

3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de peptides déclenchant des symptômes migraineux et une hypersensibilité à la lumière, mesurée par un test de boîte claire et obscure, et peuvent subir jusqu'à 34 prélèvements sanguins en 28 jours. Le porteur veut cribler des molécules contre la photophobie migraineuse pour développer des traitements chez l'homme. Il affirme que la migraine reste difficile à modéliser in vitro.

Objectifs

La migraine est une maladie neurovasculaire qui affecte plus de 12% des adultes. Elle se caractérise par d’intenses céphalées, résultantes d’une hyperexcitabilité neuronale. Ce phénomène de suractivation neuronale est lié à des facteurs génétiques complexes associés à des facteurs environnementaux, et s’accompagne fréquemment d’une hypersensibilité au bruit et à la lumière (photophobie). Plusieurs neuropeptides ont été mis en évidence comme ayant un rôle crucial dans le déclenchement des migraines. Les taux dans le sang de certains peptides se voient nettement augmentés lors de migraines. Dans notre laboratoire, nous utilisons ces peptides pour modéliser la migraine chez la souris et l’évaluation de l’état migraineux est suivi par la mesure de l’hypersensibilité à la lumière dans un dispositif de boite claire et obscure. Le test est basé sur la possibilité laissée à l’animal de choisir de rester dans un compartiment peu éclairé par rapport au second compartiment fortement éclairé. Ainsi un traitement induisant une hypersensibilité à la lumière ou photophobie, ici l’utilisation des peptides CGRP, PACAP38 ou VIP chez la souris, causera une diminution de l’exploration du compartiment lumineux. Ainsi dans ce projet, nous allons utiliser ce modèle comme un outil d’évaluation des nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de la migraine.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de mettre en évidence des molécules qui seraient capables d’agir sur la photophobie induite chez des souris et ainsi de développer des traitements contre les céphalées migraineuses chez l’Homme.

Procédures

Dans ce projet, un animal subira au maximum 3 tests comportementaux (d’une durée de 20 à 30 min chacun). De plus les animaux subiront un maximum de 6 injections de peptides et bien entendu le traitement avec la molécule à étudier (le schéma de traitement sera fixé en fonction des données pharmacologiques disponible sur cette molécule). En cas une injection intraveineuse, elle dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Pour le reste des administrations (Per-Os, IP, SC, IN et IM), la durée est de moins de 30 seconds en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. En parallèle des tests de comportement, des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon les tests et la voie d'administration choisie, les animaux pourront subir de 1 à 34 prélèvements sanguins sur la période de 28 jours en ne dépassant pas les recommandations. Les prélèvements de sang durent 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, une baisse de l’activité locomotrice peut être attendue à la suite du traitement avec le peptide inducteur des symptômes migraineux. Les souris traitées avec les peptides peuvent présenter une sensibilité à une forte lumière une fois la deuxième injection de peptide réalisée. De plus les administrations peuvent induire une douleur localisée et passagère.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

La migraine est un trouble neurovasculaire complexe, dont l’origine et les mécanismes ne sont que partiellement appréhendés. Il implique diverses structures cérébrales, nombreux vaisseaux sanguins intracrâniens et nerfs sensoriels. Cette synergie reste difficile à modéliser in vitro. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet font l’objet, autant que possible, d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses biochimiques ou histologiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués de 12 animaux. Toutefois l’effectif pourra être amené à n = 20 par groupe. Des analyses statistiques finales seront réalisées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial pendant les expérimentations. Ainsi, plusieurs mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion d’une phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) à l’arrivée des animaux, avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux seront hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres par un enrichissement important du milieu. L’enrichissement comporte un tunnel en carton accroché à la grille de la cage afin d’en augmenter le volume utile, une maisonnette en carton afin de permettre aux animaux de se cacher et de la frisure pouvant servir de matériel de nidification, de jeu et de matériel à grignoter. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les souris traitées avec les peptides peuvent présenter une sensibilité à une forte lumière une fois la deuxième injection de peptide réalisée. L’éclairage de la salle de comportement est atténué. Les animaux sont anesthésiés pour les traitements par voie intraveineuse et pour les prélèvements sanguins. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à un mal-être ou une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien-Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines).

2 979 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un modèle transgénique de trisomie 21 présente des malformations cardiovasculaires et une fréquence anormale d'hydrocéphalie, et les souris subissent tatouage et coupe de la queue, chirurgies cérébrales avec implants optiques, restriction alimentaire de six jours et tests cognitifs. La plupart sont tuées pour prélever le cerveau, tandis que le porteur indique garder les surplus d'élevage porteurs du génotype pour d'autres projets. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative aux modèles souris et prête aux procédures un caractère de "stricte nécessité".

Objectifs

Le syndrome de Down (SD) est causé par une modification du chromosome 21 humain. Il entraîne des caractéristiques physiques et neurologiques spécifiques, y compris des problèmes intellectuels. Les personnes atteintes de SD ont des difficultés avec des fonctions cérébrales importantes pour mener une vie autonome, comme l'attention et la mémoire. Ces fonctions dépendent d'une partie du cerveau appelée le cortex préfrontal. Les personnes atteintes de SD rencontrent des difficultés dans leurs interactions sociales et ont du mal à filtrer les informations, en particulier au niveau de certaines cellules cérébrales. On pense que l’excès d'inhibition du cortex préfrontal est un mécanisme important à l'origine des problèmes intellectuels chez les personnes atteintes de trisomie. Cependant, on ne sait pas encore quel rôle jouent les différents types de cellules cérébrales dans ces difficultés. Ce projet vise à comprendre comment les modifications des circuits cérébraux chez les personnes atteintes de trisomie du chromosome 21 influent sur leurs capacités cognitives. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles murins de la trisomie.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes physiologiques et moléculaires impliqués dans le dysfonctionnement des circuits corticaux qui sous-tendent les déficits cognitifs connus. En particulier, ce projet fournira des informations précieuses sur les cibles moléculaires potentielles pour les thérapeutiques pharmacologiques visant à améliorer les performances cognitives des personnes atteintes du syndrome de Down.

Procédures

Ce projet nécessitera d’élever nos animaux pour réaliser nos procédures expérimentales, afin de piloter de manière raisonnée cet élevage et ne pas produire plus d’animaux que nécessaire certains mâles pourraient êre isolés de manière temporaire. Dans le cadre de l’élevage il y aura la réalisation d’un tatouage et d’un prélèvement de l’extrémité terminale de la queue à l’âge de 10 jours. Les deux actes ne sont réalisés qu’une seule fois et dureront moins de 2 minutes par animal au total. Nous allons enregistrer l'activité électrique neuronale dans la region préfrontale du cerveau en utilisant des souris transgéniques. Pour cela, les animaux subiront une chirurgie sous anesthesie générale qui prendra environ 30-40 minutes par animal. Ensuite, nous implanterons du matériel optique pour stimuler le cerveau avec de la lumière (30 minutes d'intervention pendant la même anesthésie). Nous enregistrerons l'activité des neurones chez des animaux qui seront éveillés et libres de leurs mouvements, ce qui nécessitera 1 à 3 heures d'intervention. Nous allons également stimuler le cerveau de ces animaux pendant qu'ils effectuent des tâches cognitives. Cette étape impliquera à nouveau une chirurgue et une implantation de fibres optiques pour la stimulation. Certaines de ces expériences nécessiteront des injections de substances pharmacologiques dans la cavité abdominale des souris et une restriction alimentaire pendant 6 jours pour les motiver à effectuer certaines tâches comportementales. Enfin, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de permettre les différents prélèvements et analyses nécessaire. Toutes les opérations chirurgicales (durée 30-40 min) seront effectuées sur des animaux complètement endormis et soumis à un traitement analgésique avant, pendant et après l'intervention.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage et au moment du tatouage au niveau de la pulpe digitale. Les systèmes cardiovasculaire et gastro-intestinal des embryons de notre modèle de souris de la trisomie 21, présentent des malformations ce qui complique leur survie. Les malformations du système cardiovasculaire sont similaires à celles observées chez les patients atteints du syndrome de Down. Ces souris présentent aussi des déficiences intellectuelles observées dans les tests de mémoire de court et de long terme. Des observations préliminaires indiquent une fréquence anormalement élevée d'hydrocéphalie. Nous allons surveiller et documenter l'incidence des hydrocéphalies afin de déterminer si cela est dû à un accouplement particulier avec des lignées de souris congéniques ou si cela fait partie du phénotype. Concernant la chirurgie des implants les nuisances comprennent douleur post opératoire, risque potentiel d’infection et de perte de l’implant. Stress et isolement pour les tests comportementaux et contraintes avec la restriction alimentaire. Dans le cas où il serait nécessaire d’isoler un animal, s’agissant d’animaux grégaires, il pourrait ressentir un stress.

Devenir

Les animaux reproducteurs seront euthanasiés à 18 mois maximum. Les animaux non porteurs des génotypes d’intérêt seront euthanasiés. Une partie des animaux sera euthanasiée afin de prélever leur cerveau pour analyse post-mortem. Les animaux produits dans notre procédure d’élevage non utilisés dans ce projet et porteurs d’un génotype d’intérêt seront utilisés dans des projets scientifiques dédiés de notre équipe, donc en utilisation continue.

Remplacement

Les questions traitées dans cette étude n’ont pas encore trouvé de réponse dans les recherches menées par la communauté scientifique internationale et, à notre connaissance, a l’heure actuelle nous sommes la seule équipe à y travailler. Il n’existe pas de méthode alternative autre que le recours aux modèles souris de la trisomie et aux croisements avec des souris exprimant des rapporteurs fluorescents, pour atteindre les objectifs du projet: analyses des caractéristiques physiologiques ainsi que moléculaires des circuits neuronaux inhibiteurs génétiquement identifiés dans le contexte de la trisomie. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information (comportement, neuropathologie produisant des déficiences cognitives et neurodegeneration chez l'Homme).

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 2979) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux seront implantés d’un côté à la fois pour l'électrophysiologie et la photométrie par fibre, et d’un autre pour l'électrophysiologie et l'optogénétique afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur un même animal. Notre maitrise du geste chirurgical limite les pertes d’animaux en post-opératoire. Toutefois, les avantages de l'utilisation d'animaux pour de nombreuses techniques sera mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte de l'expérience cumulée au cours de la vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris aux tâches cognitives réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et il est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépend de la variabilité de la lecture biologique. Il est donc nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Des tests paramétriques et non-paramétriques sont utilisés en fonction de la distribution normale ou non-normale des données. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur une plateforme en ligne ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.

Raffinement

Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront approuvés par le comité d’ethique et le Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Des croquettes adaptées à la gestation/allaitement seront mise à disposition pour les animaux en accouplement. Toutes les expériences seront réalisées sur des souris âgées de moins de 120 jours après la naissance pour garantir qu’elles s n’arrivent pas aux phases critiques du phénotype Un suivi de poids sera réalisé de manière hebdomadaire afin de détecter l’apparition de formes marquées du phénotype. Pour les animaux fragilisés par le phénotype des croquettes seront disponibles en fond de cage, de l’hydrogel, ou des biberons d’accès facilité (tétine plus longue). Nous serons attentifs et tracerons tous les signes d’hydrocéphalie dès la naissance des petits. Nous définirons des points limites qui, s'ils sont atteints, nous conduiront immédiatement à l'euthanasie de l'animal afin de réduire les souffrances inutiles.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types d’interneurones que nous étudions. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et les portées sont importantes, permettant de produire suffisamment d’animaux pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. Le développement du cerveau est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Nous maîtrisons suffisamment les techniques proposées dans ce projet pour réduire le nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures (mâles et femelles). L'élevage nécessite d'avoir des animaux reproducteurs adultes. Toutes les procédures qui nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. En outre, toutes les expériences seront réalisées chez des souris adultes, lorsque les circuits corticaux ont atteint un stade de maturation final.