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Caractérisation des phénotypes comportementaux d’un modèle murin porteur de deux mutations identifiées chez une patiente présentant une mort subite inattendue en épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 36 d'entre elles anesthésiées et tuées avant tout réveil. Porteuses de deux mutations relevées chez une jeune fille épileptique morte à 16 ans, elles reçoivent une puce sous la peau, boivent une eau acidifiée pendant quatre semaines, sont exposées à des sons de 110 décibels et reçoivent une injection d'agent convulsivant destinée à tester leur susceptibilité aux crises. Le porteur nomme les épreuves comportementales employées, labyrinthe à bras ouverts, arène, alternance, interactions sociales et test de mémoire, et indique qu'une souris qui convulse plus de trois minutes lors d'une manipulation est mise à mort. L'objectif déclaré se limite à vérifier si ces souris reproduisent les symptômes de la patiente, la validation du modèle conditionnant les recherches thérapeutiques annoncées ensuite.
Objectifs
Notre recherche porte sur la caractérisation in vivo de deux variants identifiés chez une jeune fille atteinte d’épilepsie frontale nocturne décédée brutalement au décours d’une crise d’épilepsie fatale. Les investigations génétiques ont permis d’identifier deux variants de deux gènes, chacun à l’état hétérozygote (où un seul chromosome porte la mutation). Les mutations liées à l'un des gènes sont rapportées dans l’épilepsie frontale nocturne et dans d’autres pathologies tel que le trouble du spectre autistique, mais pas aux crises d’épilepsie fatale. Plusieurs variants du deuxième gène ont été associés à des épilepsies focales héréditaires (dont l’épilepsie frontale nocturne) avec résistance aux médicaments et un risque accru de crise d’épilepsie fatale, mais le variant identifié dans notre cas n’a encore jamais été rapporté dans un cas de crise fatale. Notre objectif est ainsi de caractériser les souris portant les deux mutations afin de déterminer si elles reproduisent les phénotypes observés chez la patiente.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de valider les souris portant deux mutations pour deux gènes impliqués dans des crises d'épilepsie, mais également de mort subite et inattendue en épilepsie. En effet, le projet a pour but de déterminer les phénotypes comportementaux chez la souris et de les comparer à ceux observés chez la patiente afin de déterminer si les souris portant les deux mutations sont un bon modèle pour ces maladies humaines. Une fois le modèle murin validé, il permettra de caractériser les mécanismes physiopathologiques impliqués, ce qui facilitera l’identification des cibles thérapeutiques qui pourront ensuite être testées sur ce même modèle murin.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Une implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes). - Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. - Lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information, des sons à fréquence croissante seront présentés à l'animal sur plusieurs sessions (durée totale du test: environ 45 min). - test de susceptibilité aux crises épileptiques (injection d'un agent convulvisant): 5 sec; durée du test:20 minutes);
Impact sur les animaux
Le modèle murin étudié modélise la situation observée chez une patiente porteuse des deux mutations sur deux gènes différents présentant des crises hypermotrices frontales nocturnes, une forme d’épilepsie modérée pour laquelle elle était traitée depuis l’âge de 11 ans. Il est donc attendu que les souris porteuses de ces deux mutations présentent les mêmes symptômes d’épilepsie frontale survenant pendant le sommeil. Il faudra donc faire une surveillance renforcée des souris en journée pour voir si les souris (qui sont des animaux nocturnes) présentent des épilepsies. Les souris pouvant présenter des crises convulsives spontanées à n’importe quel moment de la journée, il est impossible de mettre en place un suivi permanent. Cependant, les crises ayant tendance à apparaitre après stimulation, elles peuvent se produire lors de la manipulation de l’animal. Si lors d'une manipulation, nous observons une souris qui convulse plus de 3 min (temps au-delà duquel les convulsions peuvent entraîner des dommages sur le cerveau), celle-ci sera euthanasiée. Par ailleurs, ce projet comprend une implantation d'une puce RFID en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'implantation. Le test acoustique présente quant à lui un inconfort léger notamment en raison des stimuli auditifs qui sont de 110dB et durent quelques ms.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue des croisements ou de la réalisation de l'ensemble des expériences, pour prélever des organes en vue des analyses post-mortem.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. L’épilepsie étant causée par un déséquilibre de la balance excitation et inhibition dans le cerveau, il n’est pas possible d’étudier dans un modèle cellulaire l’impact de nos mutations sur le risque de survenue de crises épileptiques.
Réduction
Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Nous appliquerons des analyses statistiques adéquates pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (mutants vs contrôles) : nombre et durée des entrées dans les bras ouverts d'un labyrinthe; distance parcourue et temps passé dans le centre d'une arène; nombre d'alternance; nombre et type d'interactions ; performance lors du test du mémoire; caractérisation des crises épileptiques après administration d'un agent pro-convulsivant.
Raffinement
Afin de réduire l'inconfort des animaux et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupération entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Afin de prévenir la survenue de crises épileptiques, nous éviterons les bruits au maximum et nous manipulerons les souris avec douceur, en utilisant un tunnel lors de chaque manipulation et change de cage. La manipulation par tunnel sera mise en œuvre dès le sevrage afin que l’animal s’y habitue. Si lors d'une manipulation, nous observons une souris qui convulse plus de 3 min (temps au-delà duquel les convulsions peuvent entraîner des dommages sur le cerveau), celle-ci sera euthanasiée. Par ailleurs, chacune des lignées sera maintenue à l'état hétérozygote pour chacune des mutations individuelles, pour ne pas induire de phénotype dommageable
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme. En particulier, deux gènes sont fortement conservés entre la souris et l’humain. Par ailleurs, grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations ponctuelles dans le génome de la souris et modéliser ainsi une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques et cellulaires. Enfin, des résultats sont disponibles sur des modèles de souris ne portant qu'une seule des deux mutations, pouvant permettre de comparer ces résultats à ceux qui seront issus du modèle souris mutées pour les deux gènes. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 5 à 18 semaines. Cet âge a été choisi selon la symptomatologie clinique, la patiente portant ces deux mutations ayant présenté un tableau clinique à l'adolescence (âge du décès de la patiente à 16 ans).
Optimisation de l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique par une approche d’ultrasons chez le porc pour la délivrance ciblée de médicaments
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour régler un système à ultrasons qui ouvre la barrière entre le sang et le cerveau, dans une collaboration entre entreprises privées et laboratoire public, 6 cochons d'environ trois mois vont être opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Pendant trois à cinq heures, chacun reçoit des cathéters dans la veine jugulaire et la carotide, subit une ouverture du crâne avec pose d'un implant, puis des injections de produits de contraste et des examens IRM. Le porteur annonce une hausse locale de température de 1,5 °C et une micro-hémorragie, sans douleur ni souffrance selon lui puisque l'animal reste anesthésié. Les gestes nouveaux sont d'abord répétés sur les corps d'animaux non-humains tués dans d'autres protocoles. Le porteur justifie la mise à mort finale par une chirurgie qui ne permettrait pas une récupération "sans nuisance majeure".
Objectifs
Les systèmes de génération d'ultra-sons pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique (BHE) sont utilisés dans le traitement de certains cancers du cerveau. Leur utilisation pour d'autres maladies cérébrales à ouvert de nouveaux espoirs. Cependant, leur utilisation pour des méthodes ne visant pas la destruction cellulaire, requière de nouveaux tests et mise au point en recherche pré-clinique. Ce projet est une collaboration entre des entreprises privées et un laboratoire publique. Grâce à une première collaboration sur modèle rongeur, nous avons pu optimiser les paramètres acoustiques et développer une nouvelle méthode d'analyse d'image utilisant 2 marqueurs de perméabilité membranaires afin de mieux quantifier l'ouverture de la BHE. L'objectif technique de la présente étude pré-clinique vise à valider notre méthode et sa performance sur un modèle plus proche de l'homme (pour les paramètres ultrasonores d'ouverture de la BHE), sur une autre modalité d'imagerie plus proche de la clinique (IRM) en comparant deux agents de contrastes de tailles différentes.
Bénéfices attendus
L'objectif moyen-terme du projet vise à permettre le démarrage des essais cliniques dans le traitement de maladies cérébrales afin d'évaluer si la méthode permet d'augmenter l'entrée des médicaments dans le cerveau. En effet, une première version du système est déjà utilisée en cancérologie. Néanmoins, l'utilisation à des fins de protection cellulaire et non de destruction cellulaire, pour d'autres pathologies cérébrales nécessite une meilleure caractérisation et calibration du système ultrasonores de sorte à ne pas induire de lésions thermiques. L'intérêt long-terme réside l'utilisation de cette méthode en pratique clinique courante dans le traitement pharmacologique des maladies cérébrales.
Procédures
L’animal est anesthésié profondément tout au long de l’expérimentation, jusqu’à l’euthanasie, soit environ 3-5h. L’expérimentation consiste en : - La pose de cathéters au niveau de la veine jugulaire et de la carotide - D’une craniotomie avec mise en place d’un implant - L’injection des produits d’intérêt par le cathéter, activation de l’implant et examens IRM
Impact sur les animaux
Deux effets liés au traitement par ultrasons peuvent survenir : une augmentation locale de la température de 1,5°C (n’engendrant donc pas de brûlure du tissus) et une micro-hémorragie localisée (ne remettant pas en cause la vie de l’animal pendant l’expérimentation et n’entrainant ni douleur, ni souffrance, ni angoisse sur l’animal anesthésié). Il s’agit de procédure sans réveil après l’expérimentation.
Devenir
Il s'agit d'une procédure sans réveil. La chirurgie prévue dans le protocole ne permet pas une récupération sans nuisance majeure pour l'animal. Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu de la procédure.
Remplacement
L’ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons a déjà été validée sur modèle in vitro, sur un modèle in vivo de rongeur et est déjà utilisé en clinique dans le traitement de certaines tumeurs cérébrales. Dans ce dernier cas, les ultrasons permettent de favoriser l'entrée de chimiothérapies dans la tumeur et génèrent un effet thermique destructeur supplémentaires. L'application à des pathologies dans lesquelles on voudrait apporter un traitement pharmacologique sans destruction cellulaire requière une amélioration et une évaluation du protocole de stimulation ultrasonore. L’impact sur le cerveau nécessite d’expérimenter sur animaux. Notre étude antérieure réalisée sur la souris a permis de tester un nombre important de configuration ultra-sonores et le présent projet vise à valider les meilleurs sur le modèle pré-clinique de porc.
Réduction
- Les effectifs ont été calculés au plus juste pour obtenir des résultats statistiquement exploitables : le nombre d’animaux a été fixé à 6 afin de pouvoir comparer la diffusion des deux agents de contraste. Cette procédure étant une preuve de concept expérimentale sur gros animal, une augmentation des effectifs pour avoir plus de puissance statistique n'est pas nécessaire. - Afin de réduire le nombre d’animaux, nous réaliserons des tests de positionnement, de chirurgies et d’imagerie sur des animaux en post-mortem, à la fin d’autres protocoles expérimentaux. Ceci nous permettra d’acquérir une expérience pour réaliser notre procédure dans les meilleures conditions. - Enfin, l’utilisation de l’imagerie IRM permet de limiter le nombre d’animaux, chaque animal étant son propre contrôle.
Raffinement
L’intégralité de l’expérimentation (depuis la pose des cathéters jusqu’à la mise à mort de l’animal) sera réalisée sous anesthésie générale profonde et sous couverture analgésique adaptée . En outre, une partie de la chirurgie prévue dans ces procédures est une chirurgie acquise depuis longtemps par nos expérimentateurs : pré-anesthésie, pose de voie centrale veineuse et artérielle. La partie nouvelle de chirurgie, à savoir l’implantation du système à ultrasons, sera travaillée sur des animaux d’autres protocoles en cours, en post-mortem. Une fois les protocoles réalisés, notre équipe viendra travailler, en présences de neuro-chirurgiens afin d’acquérir les gestes adéquats à la réalisation du protocole. Le protocole ne commencera qu’après cette étape, et l’assurance que les gestes sont maîtrisés.
Choix des espèces
Suite à notre étude sur la souris, réalisée pour tester et affiner les paramètres ultrasonores utilisés et mettre au point une nouvelle technique d'analyse d'image permettant de quantifier l'ouverture de la BHE, et avant de pouvoir proposer des essais cliniques chez l'homme, nous avons choisi le porc qui est un bon modèle animal pré-clinique et qui permet d'utiliser le matériel d'usage clinique (poids de corps, volume de la tête et volume sanguins sont assez proches de ceux de l'homme) et de valider l’ouverture de la BHE et l’innocuité sur le tissu cérébral par l’IRM clinique. En outre, les protocoles déjà en cours au sein du laboratoire, nous permettrons d’acquérir les gestes chirurgicaux nécessaires, en amont de la phase pilote, sur des animaux en post-mortem. Nous utiliserons de jeunes porcs d’environ trois mois ayant un poids compris entre 35 et 40 kg. Notre laboratoire a une bonne expérience de l’utilisation de ces animaux, à cet âge. En effet, les résultats obtenus ont fait l’objet de nombreuses publications, issues de notre laboratoire. En outre, pour des raisons pratiques, les animaux de plus de 45-50 kg sont non adaptés à nos installations La taille de ces animaux sera suffisante pour l’implantation et la réalisation des images. Ces tailles seront comparables et transposables à des données cliniques.
Manipulation transgénique des taux d’acides gras polyinsaturés dans des populations neuronales spécifiques: conséquences sur la prise de décision
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique de quatre-vingt-dix minutes, une privation alimentaire maintenue à 90 % de leur poids pendant environ huit semaines et treize semaines de régimes lipidiques modifiés, puis un conditionnement opérant où il faut appuyer sur un levier pour obtenir de la nourriture. 720 sont tuées pour analyse histologique et les 120 géniteurs à sept ou huit mois, à la fin de leur période de reproduction. Le porteur qualifie les effets de la privation alimentaire de "très limités" et justifie le recours aux souris par des dimensions comportementales qu'il déclare non modélisables in vitro ou in silico.
Objectifs
Le but de ce projet est de déterminer quelles sont les types de neurons qui sont vulnérables à une déficience en acides gras polyinsaturés (AGPI) de type n-3. Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique qui permettra de restaurer les taux d'AGPI dans des populations spécifiques de neurones en situation de carence générale en AGPI n-3. Nous testerons les processus de prise de décision par des tâches comportementales de conditionnement opérant où l'animal doit appuyer sur un levier pour obtenir une récompense alimentaire. Nous mesurerons l'activité neuronale par des approches d'imagerie in vivo chez l'animal se comportant.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de comprendre comment le statut cérébral en AGPI - qui est perturbé dans plusieurs pathologies psychiatriques- influence les processus de prise de décision.
Procédures
Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) durant environ 8 semaines - 1 chirurgie stéréotaxique d'environ 90 minutes- Exposition chronique à des régimes modifiés en lipides pendant environ 13 semaines
Impact sur les animaux
Une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) a des effets très limités pour l'animal. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. L'exposition chronique à des régimes modifiés en lipides n'a pas d'impact évident pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (720). Les géniteurs (120) seront mis à mort à l'âge de 7-8 mois, à la fin de la période de reproduction.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes.
Raffinement
Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille et seront consignés sur une fiche de scorage. Si un score élevé persiste pendant plus de 48h les animaux seront mis à mort. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations en AGPI sur le cerveau mature.
Etude chez la souris du rôle joué par la neuroinflammation périnatale dans la progression de la tauopathie à l’âge adulte, une composante majeure de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Injectées dix fois en cinq jours peu après leur naissance, avec une substance inflammatoire ou une solution saline, puis opérées du cerveau à l'âge adulte pour une partie d'entre elles, 1 869 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, de même que les reproducteurs en fin de fertilité et les descendants au génotype non retenu. L'équipe veut savoir si cette inflammation précoce accélère ou freine l'accumulation de la protéine Tau chez des souris transgéniques ou injectées d'un vecteur viral, et une partie des souris passe quatre à cinq tests comportementaux de mémoire que le résumé ne nomme pas. Le porteur qualifie l'injection dans le cerveau d'acte "peu invasif" dont les souris récupèrent "très rapidement". Il indique aussi que, dans sa colonie, les souris porteuses de plaques amyloïdes connaissent une mortalité précoce liée à des crises d'épilepsie spontanées, de 6 % chez les mâles et 13 % chez les femelles, qui peut atteindre 30 % après une injection intracérébrale.
Objectifs
Il n'existe pas actuellement de traitement curatif de la maladie d’Alzheimer (MA) dont le nombre de cas est amené à augmenter régulièrement au cours des prochaines décennies du fait du vieillissement de la population. L'amélioration de la connaissance de la MA permettra d'identifier de nouvelles possibilités de traitements et de nouveaux marqueurs diagnostiques afin d'améliorer la prise en charge des patients, ce qui est un enjeu crucial de santé publique. Cette maladie, causée par une lente dégénérescence des neurones, se caractérise par la présence dans le cerveau de plaques amyloïdes, et de dégénérescences neurofibrillaires, résultant de l’accumulation de la protéine Tau. La protéine Tau est exprimée dans les axones des neurones, où elle régule la dynamique du réseau de microtubules (sortes d’armatures de soutien des cellules). Dans la MA, on assiste à une modification de la protéine Tau qui se traduit par une formation d'agrégats toxiques s’accumulant dans les neurones entrainant leur mort. Ce phénomène, appelé tauopathie, joue un rôle majeur dans la maladie d'Alzheimer, car il existe une très bonne corrélation entre la progression de la tauopathie et celle des symptômes de la maladie. Les recherches récentes désignent la neuroinflammation (mécanisme de l'immunité cérébrale pour protéger le cerveau des agressions) comme acteur majeur parmi l’ensemble des causes de la MA. Il est bien établi que la microglie, cellule immunitaire cérébrale, joue un rôle dans l’élimination des plaques amyloïdes. Le rôle de la microglie dans la tauopathie est cependant moins étudié. Pourtant, des études récentes suggèrent que la microglie joue un rôle dans la propagation de la tauopathie entre neurones connectés. Il est donc crucial de déterminer quel état microglial favorise ou au contraire ralentit la progression de la tauopathie. Pour répondre à cette question nous utiliserons deux modèles murins de la maladie d’Alzheimer dans lequel un syndrome inflammatoire sera induit par des injections de protéines stimulant la réaction immunitaire. Ce protocole sera appliqué sur différents animaux modèles de la MA soit transgéniques, soit par transfert de gène à l'aide de vecteurs AAV. Cela permettra d'analyser l'effet de la modification à long terme de la microglie sur l'évolution de la tauopathie, et de déterminer quel état d'activation microgliale il faut favoriser pour lutter contre la progression de la tauopathie.
Bénéfices attendus
La maladie d’Alzheimer est une maladie incurable et mortelle causée par la dégénérescence progressive des neurones,ayant pour conséquence des déficits cognitifs importants évoluant invariablement jusqu’à la démence et la perte d’autonomie complète. Elle touche près d’une personne sur 5 au-delà de 75 ans. Les traitements disponibles actuellement ne font que ralentir très modérément la progression de la maladie. Il est donc nécessaire de mettre au point des nouveaux traitements qui représenteront de réelles avancées thérapeutiques pour les patients et leurs proches. Pour mettre au point ces nouveaux traitements, il est nécessaire de mieux comprendre quelles sont les causes de la maladie, ce qui permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. C’est l’objectif principal de ce projet qui vise à mieux comprendre l’implication d’un type de cellules cérébrales impliquées dans la réaction immunitaire, les cellules microgliales, dans la progression de la maladie d’Alzheimer. Ces cellules sont les macrophages résidents du cerveau et sont activées concomitamment à la neurodégénérescence. Nous utiliserons un modèle d’activation à long terme de la microglie obtenu par administration d’une cytokine pro-inflammatoire dans les jours qui suivent la naissance. Ce protocole sera combiné à des modèles murins de maladie d’Alzheimer. Afin de mieux cerner le rôle de la microglie dans le développement de la pathologie, les effets de l’injection de la substance activant la réaction inflammatoire sur l’évolution des symptômes cognitifs et des lésions tissulaires seront étudiés. Nous réaliserons également une étude des gènes exprimés par la microglie afin de caractériser les voies de signalisation et les processus métaboliques dérégulés. En plus de l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’activation microgliale en fonction des phases de la maladie d’Alzheimer, et quelle(s) stratégie(s) thérapeutique(s) adoptée(s) aux différents stades de la pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - L’ensemble des animaux inclus dans les cohortes expérimentales recevront une injection d’une substance inflammatoire) ou de solution saline (10 injections sur 5 jours sur souriceaux vigiles [30 secondes par injection]). - Une partie des animaux recevra une injection intracérébrale à l’âge adulte (entre 3 et 9 mois en fonction des groupes) par une technique de chirurgie spécifique au cerveau (durée de la chirurgie : 20 à 30 minutes. Cet acte est peu invasif et les animaux récupèrent généralement très rapidement dans un délai de l’ordre de quelques heures. - Une partie des animaux recevra une injection unique de vecteur utilisé pour apporter le gène d’intérêt aux cellules cibles à l’âge adulte (2-3 mois). Cet acte dure moins d’une minute et se pratique sous anesthésie légère. Une partie des animaux sera soumise à 5 tests comportementaux peu stressants et destinés à évaluer leur capacités cognitives et mnésiques. Chacun de ces tests durent entre 30 sec et 6 min par souris et par jour. L’ensemble des tests est effectué sur une période de 4 à 6 semaines en fonction du nombre de tests prévus (4 à 5).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à différents types de manipulations qui entraineront des effets indésirables différents : - L’injection de la substance inflammatoire aux souriceaux entraîne des effets secondaires minimes, principalement une inflammation périphérique et centrale, ainsi qu’une hypothermie transitoire. Tous ces effets cessent après l’administration. - Les effets secondaires liés à l’injection intracérébrale se limitent à une douleur transitoire au niveau de l’abord chirurgical (incision du scalp et pose d’agrafes). - Deux des trois modèles de souris utilisés ne présentent pas de symptômes plus invalidants que les déficits cognitifs décrits dans la littérature. - Les souris présentant des plaques amyloïdes ont un phénotype dommageable (présence d’un caractère qui altère gravement l’état général de l’animal) car elles présentent des crises d’épilepsie spontanées conduisant à une mortalité précoce avec un pic entre 1 et 3 mois d’âge. Dans notre colonie, la mortalité est de 6% chez les mâles et 13% chez les femelles, mais elle peut atteindre 30% suite à une injection intracérébrale. - L’injection intraveineuse peut entraîner une hémorragie légère qui se résorbe spontanément en quelques minutes. - Les tests comportementaux sont réalisés sur animaux vigiles et peuvent entraîner un stress léger. Ce stress sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement.
Devenir
Tous les animaux qui seront inclus dans des cohortes expérimentales sont in fine destinés à une étude histologique (analyse des tissus) et/ou transcriptomique (analyse de l’expression des gènes) des régions atteintes du cerveau, ce qui nécessite leur euthanasie pour prélever cet organe. L’euthanasie interviendra par des méthodes adaptées et validées. Les animaux reproducteurs des différentes lignées transgéniques utilisés pour générer les souris incluses dans les cohortes expérimentales seront euthanasiées en fin de période de fertilité. Ces animaux ne seront en effet plus utilisables dans le cadre du projet, et ne pourront pas non plus être recyclés dans d’autres projets du fait des potentiels biais expérimentaux induits par la période de reproduction active (effets des changements hormonaux chez les femelles et développement de l’agressivité envers les congénères chez les mâles). L’euthanasie interviendra par des méthodes adaptées et validées. Afin de minimiser le temps d’élevage en captivité, les animaux issus de ces accouplements dont le génotype n’est pas souhaité pour le projet seront euthanasiés immédiatement à l’issue de la procédure de génotypage par les mêmes méthodes. Le fond génétique de ces différentes lignées, qui peut diverger de celui des souches de souris initiales, ne permet pas la reutilisation des animaux pour d’autres projets afin d’éviter tout risque de biais expérimental dû au fond génétique.
Remplacement
Ce projet fait appel à des modèles de souris déjà caractérisés de la maladie d’Alzheimer. A l’heure actuelle, ce projet ne peut ni être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet les symptômes neurologiques cognitifs de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal, notamment dans les modèles génétiques murins. Par ailleurs, les modifications de l’activation microgliale qui surviennent au cours du vieillissement normal et pathologique ne peuvent pas être reproduit dans des modèles cellulaires 2D ou organoïdes. Enfin, l’étude des relations entre cellules gliales et neurodégénérescence requiert toute la complexité des réseaux neuronaux qui se mettent en place au cours de la maturation et du vieillissement du cerveau. Il est donc nécessaire de réaliser ce projet sur une espèce modèle mammifère comme la souris, présentant le plus possible de similitudes avec la physiologie humaine, c’est à dire possédant un cerveau complexe doté d’un système limbique permettant d’exprimer des comportements sophistiqués. De plus la proximité entre l’espèce humaine et la souris maximisera la pertinence des cibles thérapeutiques identifiées au cours de ce projet.
Réduction
Une simulation statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu des valeurs attendues en fonction des analyses pratiquées pour chaque procédure. Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les valeurs que nous avons observées dans le passé lors d’expériences utilisant des analyses similaires. Ainsi, nous prévoyons d’utiliser 1869 animaux lors des expériences qui seront menées pendant les 5 années de l’étude. Ce nombre maximum, qui comprend 66 groupes expérimentaux et 52 groupes témoins de référence qui seront étudiés tout au long des 5 années du projet, a été déterminé en fonction des expériences à réaliser pour pouvoir répondre à la question scientifique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans le projet nous prévoyons que les cohortes incluses dans les différentes procédures puissent être étudiées sur différents paramètres. Par exemple certains animaux seront utilisés à la fois pour des études transcriptomiques et histologiques.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie des procédures chirurgicales ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des échelles cliniques journalières, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux. L’état de santé des souriceaux sera surveillé de manière biquotidienne tout au long de la période de traitement périnatal. Leur état de forme sera évalué grâce à une grille de score permettant de définir le point limite au-delà duquel le traitement ne pourra être poursuivi pour l’animal en question. Les tests comportementaux seront précédés par une phase d’habituation à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences.
Choix des espèces
Choix de l’espèce modèle : L’objectif de ce projet est d’améliorer les connaissances sur la maladie d’Alzheimer afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. La région initialement et la plus gravement atteinte dans la MA est le système limbique (connu sous le nom de cerveau émotionnel) qui gère la mémoire et les émotions. Les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas de système limbique. Il est donc nécessaire de mener ce projet sur une espèce dotée d’un tel système, similaire à celui retrouvé dans l’espèce humaine. Les rongeurs, et la souris en particulier, possèdent un système limbique très proche de celui de l’espèce humaine. De plus, la grande proximité entre le génome de la souris et le génome humain assure une pertinence maximale des cibles thérapeutiques qui seront identifiées au cours de ce projet. Les souris qui seront utilisées reproduisent les différentes lésions anatomiques retrouvées dans le cerveau des patients atteints de MA. Elles présentent également des altérations cognitives (défauts de mémoire spatiale et de mémoire de travail) qui sont caractéristiques de la MA. Ces déficits peuvent être quantifiées par des tests comportementaux qui sont réalisés en routine au laboratoire. Choix du stade de développement étudié : Les administrations de cytokines seront réalisées à la période périnatale pour respecter le protocole d’activation microgliale à long terme largement validé et publié par nos collaborateurs. La MA se déclare la plupart du temps chez le sujet âgé, mais des déficits subtils apparaissent longtemps en amont du diagnostic. Nous étudierons donc les modèles animaux à un temps précoce et a un temps tardif pour refléter les effets observés en début et en fin du processus pathologique, soit entre 5 et 14 mois selon les différents modèles de MA qui seront étudiés au cours du projet.
Impact du blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA dans la pathologie de l’Accident Vasculaire Cérébrale (AVC).
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Soumises à une biopsie de la queue puis à l'induction d'un AVC ischémique ou hémorragique, 2 000 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit des pertes de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels ou cognitifs, avec mise à mort au-delà de 20 % du poids perdu ou d'un score supérieur à 7 sur l'échelle de grimace de la souris. Un groupe de 640 animaux cumule l'AVC provoqué et un diabète de type 1 servant de facteur de comorbidité. Le porteur affirme que ces procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et qu'aucune méthode sans animaux vivants n'apporterait le même niveau d'information.
Objectifs
Le tPA est une sérine protéase principalement connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des AVC ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques dont le développement cérébral, la plasticité synaptique, ainsi que dans des processus d’apprentissage et de mémoire. Grâce à ses différents domaines, le tPA interagit avec différents récepteurs tels que les N-methyl-D-aspartate (NMDAR). Cette interaction était impliquée dans certains processus physiologiques tels que la plasticité synaptique, la corticogenèse et pathologiques (AVC, sclérose en plaques/SEP, inflammation). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction tPA/NMDAR. Ainsi, l’objectif de ce projet est tout d’abord, d’évaluer l’impact du tPA endogène ou l’inhibition de son interaction avec le récepteur NMDA sur les lésions cérébrales, la réponse inflammatoire et la récupération fonctionnelle dans des modèles murins d’AVC ischémique ou hémorragique. De plus, il s’agit de démontrer l'effet ainsi que le potentiel thérapeutique de l’administration d’un anticorps monoclonal (le Glunomab®) dans ces modèles murins.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies où cette interaction joue un rôle crucial (AVC, SEP et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de cette interaction permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.
Procédures
Biopsie de queue faite vers 6 jours pour chaque animal (n=2000). Procédure 1 (n=640) : Modèle d’AVC. Procédure 2 (n=640) : Modèle d’AVC. Procédure 3 (n=640) : Modèle d’AVC accompagné d’un facteur de comorbidité (diabète de type 1). - J0 : Induction de l‘AVC +/- Traitements à 20 minutes ou 4 heures. -J0+6h : Evaluation de l’inflammation cérébrale par IRM. - J+1, J+5 : Evaluation du devenir cérébral (lésions, transformations hémorragiques, perméabilisation) post-AVC par IRM. - J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux. Procédure 4 (n=80) : Modèle d’AVC hémorragique. - J0 : Induction de l‘AVC hémorragique. - J+1, J+3 : Evaluation du volume de lésion hémorragique et de l’œdème, post-AVC par IRM. - J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : Biopsie de la queue (douleur légère de courte durée), une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines). Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires.
Mise en place et validation d’un dispositif de mesure de la prise alimentaire et de la motivation chez la souris, et utilisation du dispositif pour l’évaluation de l’effet de candidats médicaments.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour valider un distributeur automatique qui mesure la prise alimentaire et la motivation, puis tester des candidats médicaments contre les troubles du comportement alimentaire, 1 368 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles peuvent être isolées jusqu'à dix-sept jours et voient leur accès à la nourriture limité à huit heures par jour pendant neuf jours au maximum, ce que le porteur décrit lui-même comme une source de stress modéré. À l'issue, 600 d'entre elles seront transférées vers d'autres projets et les autres tuées, soit pour des prélèvements de sang et d'organes incompatibles avec la survie, soit à cause des effets indésirables des produits testés. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution, ou qu'elle ne suffirait pas, et que l'animal reste un "passage obligatoire" avant l'humain.
Objectifs
L'obésité et les troubles du comportement alimentaire tels que l'anoréxie, la boulimie, le binge eating (frénésie alimentaire), l'addiction alimentaire sont des pathologies de plus en plus fréquentes et concernent au total 17 % et 10 % de la population respectivement, elles sont dues notamment à la dérégulation de la prise alimentaire. Le projet a donc pour objectif l'étude de la prise alimentaire et ces modifications ainsi que l'exploration des processus psycho-neurobiologiques comme la motivation chez l'animal dans son environnement. Afin d'affiner et d'automatiser l'étude du comportement alimentaire, le projet utilisera un dispositif développé par des chercheurs de l'université de Washington et nommé FED3 (Feeding Experimentation Device 3).
Bénéfices attendus
A court terme, les bénéfices attendus sont l'utilisation d'un dispositif dans la mesure de la prise alimentaire et les données issues de ce projet permettront de passer à une phase d'évolution du dispositif. De plus, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif contre les troubles alimentaires et/ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques. A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les troubles du comportement alimentaire.
Procédures
Les animaux de ce projet pourront être administrés avec les composés à tester par différentes voies (-2 minutes par administration). Des prélèvements de sang sur animal vigile pourront être effectués (2 minutes par prélèvement). Et l'animal pourra être anesthésié en fin d'expérience pour les prélèvements terminaux de fluides corporels et tissus. Accès à la nourriture au moins 8h par jour sur une période de 9 jours maximum.
Impact sur les animaux
Les contentions des animaux vigiles pour administrer le produit, induire une anesthésie ou pour effectuer des prélèvements sanguins peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Les prélèvements sanguins induisent un stress léger et une douleur légère. L’isolement des animaux sur une période de 17 jours maximum pourra être source de stress. L'accès à la nourriture limité par jour peut induire un stress modéré.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou mise à mort des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s) ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les troubles du comportement alimentaire. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 12 / par groupe, à raison de 3 études apr an. L’analyse statistique sera adaptée au modèle. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur le comportement alimentaire, notamment dans l'obésité de par la reproductibilité des résultats obtenus donc leur robustesse. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Génération d’un modèle murin de Dégénérescence Cérébelleuse EU1 de 2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
59 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour le volet mené dans le premier des deux établissements de ce projet. Une chirurgie de 45 minutes ouvre un orifice d'un millimètre dans le crâne pour injecter dans le cervelet un vecteur produisant une molécule inflammatoire, puis cinq injections abdominales suppriment les cellules régulatrices de l'immunité. Le porteur indique un stress modéré lié aux manipulations répétées, une douleur post-opératoire possible sur la zone suturée et une perte de poids qui pourrait atteindre le point limite en cas de toxicité de la molécule. Il justifie le projet par la rareté des échantillons de patientes et affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet de satisfaire le remplacement.
Objectifs
La pathologie qui fait l’objet de cette étude est caractérisée par une dégénérescence des neurones du cervelet. Les symptômes associés sont des troubles de l’équilibre et de la coordination conduisant à un handicap sévère en quelques mois. Elle touche principalement des femmes atteintes d’un cancer gynécologique (ovaire, sein). Chez ces patientes, le système immunitaire normalement responsable de détruire la tumeur, s’attaque également aux neurones du cervelet et les détruisent. Le diagnostic est confirmé par la détection d’anticorps présents dans le sang et dans le cerveau dont la caractéristique est de reconnaître les neurones du cervelet ainsi que la tumeur des patientes. La théorie en vigueur suppose que la tumeur est responsable de l’activation du système immunitaire et par des mécanismes encore mal compris, le système immunitaire va également s’activer dans le cerveau et détruire les neurones du cervelet. Afin d’étudier les mécanismes à l’origine de la pathologie, le recours à un modèle animal est indispensable à cause de la rareté des échantillons disponibles auprès des patients. Ce modèle permettra des analyses plus approfondies depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. L’objectif est donc de développer un modèle de la maladie chez la souris qui soit au plus proche de la maladie humaine. A ce stade l’objet de cette demande d’autorisation est d’évaluer et valider 2 méthodologies qui seront employées pour modéliser la maladie chez la souris. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Grâce à la modélisation de la maladie chez la souris, l’identification des mécanismes qui conduisent à l’activation des défenses immunitaires contre les neurones du cervelet permettra à terme de développer une thérapie efficace pour guérir les femmes atteintes par la maladie.
Procédures
Interventions réalisées à l’EU1 : -En début de protocole une chirurgie d’environ 45 minutes est réalisée sous anesthésie et analgésie pour l’injection dans le cervelet, à travers un orifice minime d’un millimètre dans l’os cranien, d’un vecteur capable de faire sécréter une molécule inflammatoire localement par les cellules immunitaires. -Un prélèvement de sang est effectué en quelques secondes sur animal anesthésié avant mise à mort. -Cinq injections d’une molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité seront faites par voie abdominale sur 2 semaines à 3 jours d’intervalle. Intervention réalisée à l’EU2 : une injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral est réalisée sous analgésie et anesthésie profonde sans réveil.
Impact sur les animaux
-Stress modéré induit par la manipulation répétée des animaux et leur contention -Une perte de poids engageant le point limite pourrait survenir dans le cas d’une toxicité de la molécule employée pour induire la suppression des cellules régulatrices de l’immunité. -stress lié à la contention pour réaliser le prélèvement de sang au niveau du sinus de l’oeil -douleur causée par les actes invasifs lors de la chirurgie sous anesthésie -Stress post-opératoire (physique, thermique, nutritionnel) et douleur potentielle sur la zone cutanée après suture. -Un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient être induits si l’inflammation est trop disséminée dans le cerveau. Elle devrait néanmoins rester localisée car l’injection est faite localement dans le cervelet et pas en intra-veineuse. -douleur causée par les actes invasifs nécessaires à l’injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral sous anesthésie profonde sans réveil
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Procédure N°1 : Les animaux seront mis à mort pour contrôler et analyser l’efficacité et la durée de la suppression des lymphocytes régulateurs de l’immunité. Procédure N°2 : Les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse du cervelet afin de valider la production intra-cérébelleuse d’une molécule pro-inflammatoire.
Remplacement
La maladie neurologique qui nous intéresse est caractérisée par la perte des neurones du cervelet et reste encore mal comprise. Les analyses possibles à partir des biopsies des patients sont très réduites de par la rareté de la maladie et concernent essentiellement les liquides biologiques (sérum, liquide céphalorachidien), et les tumeurs. Les biopsies de cerveau n’ont fourni que des informations sur la phase terminale de la maladie. Seul l’impact des anticorps sur le fonctionnement des neurones a pu être étudié sur coupe fraîche de cervelet de rat, mais l’effet observé n’est pas confirmé à l’échelle de l’animal. L’objectif de notre modèle est d’accéder aux mécanismes de la réponse immunitaire qui est dirigée initialement contre la tumeur pour en comprendre le rôle dans l’inflammation du système nerveux central. Aucun modèle cellulaire actuel ne permet de récapituler ces éléments de manière concomitante in vitro. Un modèle animal est donc indispensable pour atteindre nos objectifs et permettra une analyse complète depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance.
Réduction
Notre protocole vise à évaluer la fonctionnalité biologique de nos méthodologies et à déceler d’éventuels effets indésirables sur les capacités motrices de nos souris. En préambule, la qualité de 2 lots de molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité sera évaluée grâce à un effectif réduit à 6 animaux contrôles sans consommer inutilement l’effectif total prévu aux tests en cas de toxicité d’un lot. Pour assurer la significativité des résultats obtenus aux tests de motricité, un effectif minimum de 16 animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique de puissance pour chacune des 2 méthodologies. Avant la réalisation des tests de motricité, 3 ou 4 animaux supplémentaires devront être mis à mort à 3 moments clés pour réaliser les analyses biologiques et évaluer la fonctionnalité de la méthodologie employée. Ces moments clés ont été choisis sur la base des études publiées sur nos méthodologies et réduites au minimum sans compromettre le but visé en sus. De plus, les animaux employés aux tests de motricité serviront à un 4ème et dernier point d’analyse qui viendra compléter en terminal les 3 points d’analyse précédents. Ainsi aux 16 animaux précédemment mentionnés, s’ajoutent 12 animaux pour la 1ère méthodologie et 9 animaux pour la 2ème. Ainsi sont nécessaires au projet un total de 34 (6+16+12) et 25 (16+9) animaux, soit 59 animaux.
Raffinement
-Pour limiter le stress des animaux, les souris sont habituées quotidiennement à l’expérimentateur pendant une semaine avant le début de l’expérimentation (5 min par animal. -Une surveillance accrue du bien-être de l’animal grâce à un système de scorage permettra d‘anticiper la perte de poids, de la mobilité et du toilettage pour anticiper au maximum la survenue des points limites. -Une phase d’habituation aux tests de motricité est réalisée sur 4 jours. Une récompense type céréale est donnée en fin de test. Une cage refuge permet de réduire le stress de la traversée sur barre. Les appareils sont nettoyés pour éviter un stress lié à l’odeur des animaux précédents. - des animaux morts n’ayant subi aucune procédure expérimentale seront utilisés pour la mise au point des protocoles d’analyse avec des prélèvements effectués en post-mortem, et pour l’entrainement aux gestes de la chirurgie -Le prélèvement de sang dans le sinus de l'oeil est réalisé avant la mise à mort sous anesthésie gazeuse pour réduire le stress et la souffrance de l’animal. La chirurgie est réalisée sous analgésie sur animaux anesthésiés. Après induction de l’anesthésie, les griffes des animaux sont écourtées pour éviter les infections par grattage de la zone suturée en post-opératoire. Des soins post-opératoires sont appliqués : l’animal est placé dans une enceinte chauffée à une température de 36-38°C pour un réveil optimal en cage individuelle pendant 24h avec mise à disposition facilitée de nourriture (pâté de croquettes humidifiées) et de boisson (en gelée) renouvelées les 2 jours suivants, et avec du matériel de nidification neuf pour contrôler le maintien d’un comportement stéréotypé. L’injection d’analgésique sera répétée les jours suivant. Une surveillance du bien-être sera effectuée les heures suivant le réveil et quotidiennement les jours suivants grâce à une grille de scorage jusqu’à la cicatrisation, puis 2 fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. Selon l’évolution de la cicatrisation, on appliquera de la crème cicatryl ou dermaflon sur la zone suturée pendant 3 jours. En point final, tous les prélèvements seront effectués après la mise à mort.
Choix des espèces
La souris sera utilisée en raison de l’abondance de littérature sur ce modèle couramment utilisé pour l’étude des pathologies neurologiques. En effet, il s’agit d’une espèce dont l’architecture cérébrale est proche de l’architecture du cerveau humain. La souris est également un bon modèle car il existe un répertoire important de cellules cultivées au laboratoire capables de former une tumeur chez la souris. Il existe aussi de nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées, comme celle que nous utilisons pour manipuler le système immunitaire qui nous aidera à comprendre les mécanismes pathologiques responsables de la maladie. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 à 8 semaines car elles sont sexuellement matures et ont presque atteint leur taille définitive.
Evaluation de traitements dans un modèle de pause respiratoire suivant une crise d’épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Soumises chaque jour pendant quatre à sept jours à un bruit qui déclenche une crise d'épilepsie généralisée, 1 300 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Les crises tonico-cloniques provoquent des secousses et des raidissements musculaires que le porteur compare à "des crampes multiples", suivis d'une pause respiratoire pendant laquelle les souris sont placées sous respirateur. Elles sont testées entre 21 et 41 jours après leur naissance, soit dès le sevrage, et reçoivent en parallèle des candidats médicaments par voie orale ou par injection. Le porteur reconnaît que des cultures de neurones et des tranches de cerveau permettent de présélectionner les molécules, et écrit que ces procédures "ne permettent pas le maintien en vie des animaux dans de bonnes conditions".
Objectifs
L'objectif du projet consiste à évaluer de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les pauses respiratoires induites par une crise épileptique, à l'origine de nombreux décès. Ce phénomène est aussi appelé mort subite inattendue et inexpliquée en épilepsie et est la cause de décès la plus courante liée à l'épilepsie. Les crises généralisées de type tonico-clonique correspondent à des décharges électriques anormales au niveau cérébral (où les 2 hémisphères sont touchés). Les convulsions cloniques sont des secousses musculaires incontrôlées alors que les convulsions toniques correspondent à un raidissement et une contraction soudaine des muscles du corps et des membres inférieurs et supérieurs accompagnés d'une pause respiratoire temporaire ou définitive. La cause exacte de survenue d'une mort subite suite à une épilepsie n'est actuellement pas connue mais elle pourrait être liée à une insuffisance cardiaque, aux difficultés respiratoires et aux lésions cérébrales consécutives à une crise tonico-clonique. A l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour augmenter l'espérance de vie des patients.
Bénéfices attendus
Les bénéfices recherchés sont le développement de médicaments destinés à sauver des vies pour les patients épileptiques et montrant une pharmaco-resistance. Les modèles de pause respiratoire suite à une crise généralisée sont recommandés pour identifier et tester l'efficacité de nouveaux candidats médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour augmenter l'espérance de vie des patients épileptiques.
Procédures
Pour chaque procédure décrite, les candidats médicaments seront administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Les rongeurs seront soumis à un stimulus sonore d'une durée maximale de 60 secondes chez la souris pendant 4 à 7 jours (avec une stimulation par jour). En cas de pause respiratoire, les animaux seront placés sous assistante respiratoire pendant 120 secondes jusqu'à la reprise naturelle de la respiration. Un prélèvement de sang pourra être réalisé sous anesthésie, juste avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, l'induction de crise par un stimulus sonore induit un stress physique chez les rongeurs, également retrouvé chez les patients lors de la survenue d'une crise épileptique. Des douleurs peuvent être également associées à l'apparition de mouvements involontaires saccadés ou un raidissement des membres/du corps (douleurs qui peuvent ressembler à des crampes multiples). La survenue de crises tonico-cloniques peut induire une pause respiratoire, d'un maximum de quelques secondes, qui sera assistée par un respirateur approprié. L'administration de nouveaux candidats médicaments doit se faire par voie systémique (i.v., i.p. ou s.c.) ou orale pour conserver une bonne comparabilité avec les futures études cliniques chez l'homme. Ces interventions peuvent générer un stress transitoire (non répété) lié à la contention et une légère douleur comparable à l'introduction d'une l'aiguille selon l'art et la pratique vétérinaire. Il n'est pas attendue de douleur ou souffrance spécifique par les candidats médicaments eux-mêmes.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience ils auront été soumis à plusieurs stimulations sonores et plusieurs crises épileptiques suivies d'une pause respiratoire. Ces procédures ne permettent pas le maintien en vie des animaux dans de bonnes conditions.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives in silico ou in vitro permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et les paramètres physiologiques (reprise rapide de la respiration après une pause respiratoire par exemple).
Réduction
Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude avec une analyse statistique appropriée en fonction des variables analysées. Dans certains projets, il est possible de tester plusieurs composés et doses dans une même expérience. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux contrôles et le nombre d'animaux testés avec une substance connue.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. La phase de sensibilisation à une pause respiratoire sera évaluée lors de la mise en place du modèle et sera réduite à son minimum (si possible 3 jours de sensibilisation) pour limiter les nuisances chez l'animal. Lors de chaque test, l'animal sera placé sous respirateur, quelques secondes après observation de la pause respiratoire. Pour réaliser un prélèvement de sang, les animaux seront placés sous anesthésie (avec procédure analgésique si approprié).
Choix des espèces
Les modèles d'arrêt respiratoire suite à une crise d'épilepsie sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur. La plupart des modèles sont basés sur l'induction de crises audiogènes chez des souches de souris connues pour leur sensibilité à développer une crise lors d'un bruit ou chez des souris transgéniques montrant des crises de manière spontanée. Les souris sont testés immédiatement après sevrage sur une durée maximum de 20 jours (entre 21 et 41 jours après leur naissance).
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Conservation des espèces
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 25000
300 000 rongeurs vont être utilisés, 275 000 souris et 25 000 rats, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour, en plus du tatouage d'identification, et les lignées entretenues peuvent porter un phénotype dommageable dont le porteur admet ne pas toujours connaître l'impact avant caractérisation. À l'issue, les animaux sont soit expédiés, soit tués, le porteur précisant qu'ils "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. L'objet du projet est de fournir des rongeurs génétiquement modifiés à des laboratoires, activité présentée comme un bénéfice en soi puisqu'elle améliore la "qualité génétique, sanitaire et zootechnique" des animaux livrés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la caractérisation et/ou l’élevage de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des traits physiologiques spécifiques, et parfois pathologiques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes ou encore la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent, ou de queue) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie de taille réduite peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Enfin, certaines lignées transgéniques sont induites par une hormone. Pour induire cette mutation d’intérêt, une injection de l’hormone pourra également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 300 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Expression d’un phénotype dommageable et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques ou stress exprimé pendant l’évaluation Bien Etre Animal. Douleur et stress associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum, oreille ou queue) en plus d’une identification. Douleur et stress associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress et perte de poids dûs aux contentions. Douleur, stress et perte de poids dûs à l'injection du ligand.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).
Raffinement
Les observations par le personnel technique permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en faisant appel aux techniciens qualifiés et compétents et au vétérinaire. Si un point d’intervention est atteint, le technicien met en place un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal , l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les normes éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l’animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5j après la fécondation.
Génération d’un modèle murin de Dégénérescence Cérébelleuse EU2 de 2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
Opérées du crâne pendant 45 minutes pour recevoir dans le cervelet un vecteur qui y fait sécréter une molécule inflammatoire, 59 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent cinq injections abdominales d'une molécule supprimant les cellules régulatrices de l'immunité, un prélèvement de sang dans le sinus de l'œil, puis une injection cardiaque de fixateur sous anesthésie profonde sans réveil. Le porteur indique qu'une perte de poids atteignant le point limite pourrait survenir si cette molécule se révèle toxique, et qu'un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient apparaître si l'inflammation se disséminait dans le cerveau. Les tests de motricité sont précisés, avec traversée sur barre, cage refuge et récompense en fin de test, et le porteur conclut qu'un modèle animal est "indispensable" faute d'échantillons de patientes en nombre suffisant.
Objectifs
La pathologie qui fait l’objet de cette étude est caractérisée par une dégénérescence des neurones du cervelet. Les symptômes associés sont des troubles de l’équilibre et de la coordination conduisant à un handicap sévère en quelques mois. Elle touche principalement des femmes atteintes d’un cancer gynécologique (ovaire, sein). Chez ces patientes, le système immunitaire normalement responsable de détruire la tumeur, s’attaque également aux neurones du cervelet et les détruisent. Le diagnostic est confirmé par la détection d’anticorps présents dans le sang et dans le cerveau dont la caractéristique est de reconnaître les neurones du cervelet ainsi que la tumeur des patientes. La théorie en vigueur suppose que la tumeur est responsable de l’activation du système immunitaire et par des mécanismes encore mal compris, le système immunitaire va également s’activer dans le cerveau et détruire les neurones du cervelet. Afin d’étudier les mécanismes à l’origine de la pathologie, le recours à un modèle animal est indispensable à cause de la rareté des échantillons disponibles auprès des patients. Ce modèle permettra des analyses plus approfondies depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. L’objectif est donc de développer un modèle de la maladie chez la souris qui soit au plus proche de la maladie humaine. A ce stade l’objet de cette demande d’autorisation est d’évaluer et valider 2 méthodologies qui seront employées pour modéliser la maladie chez la souris. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Grâce à la modélisation de la maladie chez la souris, l’identification des mécanismes qui conduisent à l’activation des défenses immunitaires contre les neurones du cervelet permettra à terme de développer une thérapie efficace pour guérir les femmes atteintes par la maladie.
Procédures
Interventions réalisées à l’EU1 : -En début de protocole une chirurgie d’environ 45 minutes est réalisée sous anesthésie et analgésie pour l’injection dans le cervelet, à travers un orifice minime d’un millimètre dans l’os cranien, d’un vecteur capable de faire sécréter une molécule inflammatoire localement par les cellules immunitaires. -Un prélèvement de sang est effectué en quelques secondes sur animal anesthésié avant mise à mort. -Cinq injections d’une molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité seront faites par voie abdominale sur 2 semaines à 3 jours d’intervalle. Intervention réalisée à l’EU2 : une injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral est réalisée sous analgésie et anesthésie profonde sans réveil.
Impact sur les animaux
-Stress modéré induit par la manipulation répétée des animaux et leur contention -Une perte de poids engageant le point limite pourrait survenir dans le cas d’une toxicité de la molécule employée pour induire la suppression des cellules régulatrices de l’immunité. -stress lié à la contention pour réaliser le prélèvement de sang au niveau du sinus de l’oeil -douleur causée par les actes invasifs lors de la chirurgie sous anesthésie -Stress post-opératoire (physique, thermique, nutritionnel) et douleur potentielle sur la zone cutanée après suture. -Un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient être induits si l’inflammation est trop disséminée dans le cerveau. Elle devrait néanmoins rester localisée car l’injection est faite localement dans le cervelet et pas en intra-veineuse. -douleur causée par les actes invasifs nécessaires à l’injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral sous anesthésie profonde sans réveil
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Procédure N°1 : Les animaux seront mis à mort pour contrôler et analyser l’efficacité et la durée de la suppression des lymphocytes régulateurs de l’immunité. Procédure N°2 : Les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse du cervelet afin de valider la production intra-cérébelleuse d’une molécule pro-inflammatoire.
Remplacement
La maladie neurologique qui nous intéresse est caractérisée par la perte des neurones du cervelet et reste encore mal comprise. Les analyses possibles à partir des biopsies des patients sont très réduites de par la rareté de la maladie et concernent essentiellement les liquides biologiques (sérum, liquide céphalorachidien), et les tumeurs. Les biopsies de cerveau n’ont fourni que des informations sur la phase terminale de la maladie. Seul l’impact des anticorps sur le fonctionnement des neurones a pu être étudié sur coupe fraîche de cervelet de rat, mais l’effet observé n’est pas confirmé à l’échelle de l’animal. L’objectif de notre modèle est d’accéder aux mécanismes de la réponse immunitaire qui est dirigée initialement contre la tumeur pour en comprendre le rôle dans l’inflammation du système nerveux central. Aucun modèle cellulaire actuel ne permet de récapituler ces éléments de manière concomitante in vitro. Un modèle animal est donc indispensable pour atteindre nos objectifs et permettra une analyse complète depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance.
Réduction
Notre protocole vise à évaluer la fonctionnalité biologique de nos méthodologies et à déceler d’éventuels effets indésirables sur les capacités motrices de nos souris. En préambule, la qualité de 2 lots de molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité sera évaluée grâce à un effectif réduit à 6 animaux contrôles sans consommer inutilement l’effectif total prévu aux tests en cas de toxicité d’un lot. Pour assurer la significativité des résultats obtenus aux tests de motricité, un effectif minimum de 16 animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique de puissance pour chacune des 2 méthodologies. Avant la réalisation des tests de motricité, 3 ou 4 animaux supplémentaires devront être mis à mort à 3 moments clés pour réaliser les analyses biologiques et évaluer la fonctionnalité de la méthodologie employée. Ces moments clés ont été choisis sur la base des études publiées sur nos méthodologies et réduites au minimum sans compromettre le but visé en sus. De plus, les animaux employés aux tests de motricité serviront à un 4ème et dernier point d’analyse qui viendra compléter en terminal les 3 points d’analyse précédents. Ainsi aux 16 animaux précédemment mentionnés, s’ajoutent 12 animaux pour la 1ère méthodologie et 9 animaux pour la 2ème. Ainsi sont nécessaires au projet un total de 34 (6+16+12) et 25 (16+9) animaux, soit 59 animaux.
Raffinement
-Pour limiter le stress des animaux, les souris sont habituées quotidiennement à l’expérimentateur pendant une semaine avant le début de l’expérimentation (5 min par animal. -Une surveillance accrue du bien-être de l’animal grâce à un système de scorage permettra d‘anticiper la perte de poids, de la mobilité et du toilettage pour anticiper au maximum la survenue des points limites. -Une phase d’habituation aux tests de motricité est réalisée sur 4 jours. Une récompense type céréale est donnée en fin de test. Une cage refuge permet de réduire le stress de la traversée sur barre. Les appareils sont nettoyés pour éviter un stress lié à l’odeur des animaux précédents. - des animaux morts n’ayant subi aucune procédure expérimentale seront utilisés pour la mise au point des protocoles d’analyse avec des prélèvements effectués en post-mortem, et pour l’entrainement aux gestes de la chirurgie -Le prélèvement de sang dans le sinus de l'oeil est réalisé avant la mise à mort sous anesthésie gazeuse pour réduire le stress et la souffrance de l’animal. La chirurgie est réalisée sous analgésie sur animaux anesthésiés. Après induction de l’anesthésie, les griffes des animaux sont écourtées pour éviter les infections par grattage de la zone suturée en post-opératoire. Des soins post-opératoires sont appliqués : l’animal est placé dans une enceinte chauffée à une température de 36-38°C pour un réveil optimal en cage individuelle pendant 24h avec mise à disposition facilitée de nourriture (pâté de croquettes humidifiées) et de boisson (en gelée) renouvelées les 2 jours suivants, et avec du matériel de nidification neuf pour contrôler le maintien d’un comportement stéréotypé. L’injection d’analgésique sera répétée les jours suivant. Une surveillance du bien-être sera effectuée les heures suivant le réveil et quotidiennement les jours suivants grâce à une grille de scorage jusqu’à la cicatrisation, puis 2 fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. Selon l’évolution de la cicatrisation, on appliquera de la crème cicatryl ou dermaflon sur la zone suturée pendant 3 jours. En point final, tous les prélèvements seront effectués après la mise à mort.
Choix des espèces
La souris sera utilisée en raison de l’abondance de littérature sur ce modèle couramment utilisé pour l’étude des pathologies neurologiques. En effet, il s’agit d’une espèce dont l’architecture cérébrale est proche de l’architecture du cerveau humain. La souris est également un bon modèle car il existe un répertoire important de cellules cultivées au laboratoire capables de former une tumeur chez la souris. Il existe aussi de nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées, comme celle que nous utilisons pour manipuler le système immunitaire qui nous aidera à comprendre les mécanismes pathologiques responsables de la maladie. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 à 8 semaines car elles sont sexuellement matures et ont presque atteint leur taille définitive.
Localisation des zones épileptiques via la quantification de glucose et de glutamate par la technique IRM CEST.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
128 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses histologiques du cerveau. Certaines subissent une chirurgie d'environ une heure pour recevoir une injection dans l'hippocampe, d'autres, porteuses de la mutation du syndrome de Dravet, sont exposées à 43 degrés pour déclencher des crises d'épilepsie, puis toutes passent quatre séances d'IRM sous anesthésie pouvant atteindre quatre heures. Le porteur indique que ces inductions peuvent entraîner des douleurs et une perte de poids, et que les anesthésies répétées peuvent fragiliser les animaux. Il écrit qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le fonctionnement du cerveau et qu'il n'a donc "pas d'autre choix", l'objectif restant de calibrer une méthode d'IRM avant un éventuel passage chez l'humain.
Objectifs
L’épilepsie est une maladie neurologique courante, et malgré les multiples molécules antiépileptiques disponibles, environ 30% des patients présentent une résistance aux médicaments. La chirurgie cérébrale visant à enlever les zones épileptogènes (ZE) est une thérapie efficace pour un grand nombre de ces patients mais nécessite une identification précise de ces ZE, caractérisées par une excitation neuronale accrue. La stéréo-encéphalographie, technique d’enregistrement des activités intracérébrales à l’aide d’électrodes implantées à l'intérieur du cerveau, est à ce jour la méthode de choix utilisée pour l’exploration des ZE. Cependant, cette technique présente des limites de par son caractère invasif et son échantillonnage limité du volume cérébral à l'aide des électrodes. L’amélioration de la localisation des ZE et la cartographie des altérations fonctionnelles cérébrales restent un besoin non satisfait. Des techniques permettant une évaluation précise de ces altérations permettraient d'approfondir notre connaissance de la maladie. Une approche IRM alternative a été mise au point pour aider à localiser les ZE par quantification du glucose et du glutamate. Malheureusement, la validation d'un protocole clinique robuste n'a pas encore été effectuée. L’objectif de ce projet est donc de faire progresser l'utilisation de l'IRM pour localiser les ZE dans des modèles animaux et pouvoir par la suite l’appliquer chez l’homme et ainsi leur permettre d’avoir accès au traitement chirurgical.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de faire progresser l'utilisation de l'IRM de nouvelle génération pour localiser les ZE dans des modèles animaux d’épilepsie. Si nous arrivons effectivement à calibrer chez la souris cette nouvelle méthodologie IRM alors c’est un grand espoir pour un passage en clinique, ce qui facilitera la prise en charge de tous les patients qui nécessitent une chirurgie cérébrale.
Procédures
Les souris que nous utiliserons seront anesthésiées pendant quelques minutes pour la pose d'un cathéter à demeure. Ensuite, certaines souris subiront une intervention chirurgicale pour induire l'épilepsie ou bien les souris modèle du syndrome de Dravet (une pathologie génétique qui provoque des crises d’épilepsie graves chez l’enfant) seront exposées à 43 degrés pendant quelques minutes pour induire des crises d'epilepsie. Les chirurgies seront d’environ 1 heure et les inductions des crises pour le modèle du syndrome de Dravet quelques minutes. Pendant toute la durée du protocole, les souris subiront quatre examens IRM pour lesquels elles devront être anesthésiées. Ces scanners n’excéderont pas un par semaine. La durée des séances d’IRM sera de 4 heures maximum.
Impact sur les animaux
Les inductions du phénotype épileptique, que ce soit par des injections intra-hippocampiques de substance pro-épilepsie ou bien par hyperthermie, ainsi que les chirurgies nécessaires pour placer un cathéter da façon pérenne, pourront entraîner des douleurs et/ou une perte de poids dans les jours suivants l’expérimentation. Les souris modèles du syndrome de Dravet sont prédisposées à l'épilepsie, mais seulement si elles sont exposées à des hyperthermies de manière répétée. Dans le cas contraire, il s'agit de souris que l'on peut considérer comme non malades. L’anesthésie mise en place lors du protocole d’acquisition IRM pourra fragiliser les animaux induisant une modification du comportement et/ou une perte de poids. L'anesthésie est nécessaire pour éviter à l'animal le stress de la position contraignante et pour éviter tout mouvement qui invaliderait les acquisitions IRM.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer des analyses histologiques du cerveau avec la réalisation notamment de marquages histologiques de coupes de cerveau pour caractériser leurs propriétés moléculaires. Les analyses ex vivo sont nécessaires pour confirmer que les ZE indiquées par l'IRM sont bien des ZE.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro du fonctionnement normal ou pathologique du cerveau ainsi que de son organisation anatomique, tissulaire et cellulaire. Pour mettre au point une nouvelle méthode de diagnostic d’épilepsie, nous n’avons pas d’autre choix que de recourir à des modèles animaux de l’épilepsie. Notre choix s’est porté sur deux modèles animaux très couramment utilisés. La souris constitue un modèle adapté pour les expériences proposées, où le couplage entre neurones et vaisseaux sanguins complètement fonctionnels est requis pour investiguer les effets des crises. De plus, un des modèles utilisés est issus de lignées génétiquement modifiées ayant la même mutation génétique que les patients.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux a été soigneusement calculée sur la base d'études similaires déjà publiées, afin de minimiser leur taille. Comme les analyses basées sur l'IRM visent à identifier les régions du cerveau responsables des crises d'épilepsie, si nous obtenons de bons résultats dans la localisation, nous n'utiliserons pas la totalité du nombre d'animaux prévu. De plus, un examen minutieux de la littérature scientifique qui sera publiée pendant ce projet permettra d'éviter d'éventuelles expériences redondantes.
Raffinement
Tous les animaux seront surveillés au quotidien par les zootechniciens et, si nécessaire, par le vétérinaire, tout au long de la procédure. Si une souffrance est observée, l'animal sera pris en charge, en fonction de son état, par de l'analgésie ou bien une sortie d'expérimentation. Des critères précis ont été établis, en accord avec le vétérinaire de l’installation, pour évaluer le bien-être des animaux selon une grille de score établissant des points limites. Pendant les interventions chirurgicales les souris sont anesthésiées et reçoivent un analgésique ainsi que des injections d’anesthétiques locales. Pour le suivi post chirurgie d’injection intra-hippocampique ainsi que pour le suivi post induction par hyperthermie des souris, là aussi des critères ont été établis en accord avec le vétérinaire pour évaluer l’état de l’animal. Si l’un des critères n’était pas respecté, alors une prise en charge adaptée sera mise en place, allant de l’analgésie jusqu’à une sortie possible d’expérimentation.
Choix des espèces
Les souris sont très couramment utilisées en recherche sur l’épilepsie. La littérature fournit des preuves de la fiabilité des approches in vivo pour l'évaluation des modifications patho-physiologiques des tissus et de la réponse à des traitements antiépileptiques. Les animaux seront des adultes âgés de 6-10 semaines, l'âge idéal d'induction de l'épilepsie. La préférence pour l'induction du phénotype à l'âge adulte est due aux risques inhérents de mortalité chez les souris plus jeunes. Des études antérieures ont montré des phénotypes très similaires induits à différents âges.
Effet du traitement de l’activateur de Sirt1 sur la pathologie CblG dans 2 lignées de souris ayant chacune une déficience en Méthionine synthase dans une organe cible (cerveau et cœur). EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
324 souris seront tuées et 36 gardées pour entretenir les lignées, dans un projet qui teste le resvératrol contre une maladie génétique rare, la maladie CblG, à un niveau de souffrance modéré. Le gavage commence avant leur naissance, sur les mères gestantes, et se poursuit jusqu'au sevrage. Les souriceaux passent ensuite un examen d'imagerie sous anesthésie ou des tests comportementaux que le porteur qualifie de non douloureux, parmi lesquels un test de suspension, un test d'acuité visuelle et un labyrinthe aquatique. Les mises à mort sont programmées à 21 jours, 8 semaines et 6 mois, et les souris surnuméraires dépourvues de la mutation sont tuées dès le sevrage ou utilisées pour des dissections de formation.
Objectifs
La maladie CblG (Cobalamine G) est une maladie rare, moins d’un enfant sur 1.000.000 de naissances est atteint. La maladie se manifeste en général dès la naissance, mais des formes tardives (adolescence ou âge adulte) ont été décrites. Dans la plupart des cas, les patients présentent un retard du développement, des manifestations neurologiques (crises convulsives, encéphalopathie, hypotonie, troubles psychiatriques), anémie, mais les patients peuvent présenter des anomalies dans d’autres organes comme le cœur (malformation) ou le foie. La maladie peut être diagnostiquée dès la naissance grâce à la détection dans le sang d’une concentration élevée de la molécule nommée l’homocystéine et une diminution de la molécule nommée méthionine. Actuellement, le traitement est basé sur des injections quotidiennes de vitamine B12 associées à une supplémentation en méthionine afin de réduire la concentration d’Homocystéine et augmenter celle de la méthionine. Bien que ces traitements permettent l’amélioration des symptômes cliniques, ils sont inefficaces en qui concerne les troubles neurologiques. Un nouveau traitement impliquant la sirtuine Sirt1 pourrait être une nouvelle piste. Sirt1 est une protéine qui participe au bon fonctionnement de l'organisme (notamment le métabolisme central) dans plusieurs organes dont le cœur et le cerveau, elle exerce des effets protecteurs contre le stress cellulaire et l'inflammation. L’objectif de ce projet est de démontrer, sur le cœur ou le cerveau, l’efficacité du traitement avec un activateur de Sirt1 (resvératrol) chez un modèle de souris reproduisant cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation de Resvératrol comme activateur de Sirt1 est efficace dans la prévention et le traitement des manifestations neurologiques et cardiaques de la maladie CblG. De plus, ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans chaque organe atteint, coeur ou cerveau, grâce à l’utilisation de 2 types de souris génétiquement modifiées, ayant une protéine MTR déficiente (cause de la maladie) spécifiquement au niveau du coeur ou du cerveau.
Procédures
Les souris femelles gestantes seront traitées quotidiennement par gavage avec le Resvératrol ou le placebo dès le 8ème jour de gestation jusqu’au sevrage : un tiers des souriceaux subira un examen d’imagerie non invasif à l'âge de 20 jours, un autre tiers à 6 mois tandis que le dernier tiers sera soumis à des tests comportementaux non douloureux (3x16 animaux). Pour évaluer la fonction cardiaque nous testerons la force, l'agilité et le niveau d’exploration libre des souris par un test de suspension et un test du champ ouvert. Et pour l’étude du cerveau, nous réaliserons un test d’acuité visuelle, de tests de reconnaissance d'odeur et un labyrinthe aquatique pour tester les capacités de mémorisation.
Impact sur les animaux
Bien qu’elle ne soit pas douloureuse, la procédure de gavage est désagréable pour les souris. Elle peut entrainer un léger stress physique lié à la contention de l'animal. Ce stress va inéluctablement diminuer suite à l'habituation des souris, sur les manipulations répétées par le manipulateur. L'inconfort à l'introduction de la sonde se verra lui aussi diminuer de jour en jour au fil du protocole. Ce geste technique sera effectué par un zootechnicien expérimenté qui prend toutes les mesures nécessaires pour limiter la souffrance animale en pratiquant un geste rapide et sûr. De plus, la prise de poids étant effectuée 3 fois par semaine, les pertes de poids éventuelles, mais peu probables, seront un indicateur de signe de mal-être chez les animaux. La procédure de TEP sera intégralement réalisée par une équipe technique qualifiée dans un environ dédiée à ce type d’analyse, et les animaux seront plongés sous anesthésie durant toute la procédure. Malgré cela, cette étape pourrait déclencher un stress post-anesthésie.
Devenir
Maintien : Les souris surnuméraires présentant la modification génétique d'intérêt pour le maintien de la lignée seront conservées dès le sevrage. Mise à mort : A la fin de l’ensemble des procédures, toutes souris soumises à l'imagerie médicale ou aux tests comportementaux seront mises à mort à l’âge de 21 jours (48 souris), 8 semaines (48 souris) ou 6 mois (48 souris). De même, les souris génétiquement modifiées surnuméraires présentant d'intérêt pour la recherche seront également mises à mort à l'âge de 6 mois pour dissection et analyses biochimiques et histopathologiques. Les souris surnuméraires ne présentant pas la modification génétique pour le maintien de la lignée seront mises à mort dès le sevrage ou pourront servir à des formations internes (dissections et microdissections).
Remplacement
tôt dans la vie, laissant penser qu’un traitement précoce chez le nouveau-né ou même pendant la grossesse pourrait diminuer les manifestations cliniques chez le nouveau-né. Des études in-vitro ont déjà été menées sur des biopsies de la peau des patients, démontrant l’efficacité des activateurs de la protéine SIRT1 pour palier à la déficience de la protéine MTR. Cependant, ces études sont faites sur des sur biopsie de la peau de patients atteints par la maladie. Cependant les cellules de la peau ne reflètent pas la spécificité des organes atteints. C’est pourquoi, afin de valider l’efficacité du traitement par resvératrol, il est indispensable tester les effets sur les organes atteints par la maladie, nous souhaitons utiliser des animaux avec une déficience de la protéine MTR dans le cerveau et cœur (mère et progéniture). Pendant cette étude, des expérimentations non invasives seront réalisées chez la progéniture (imagerie cardiaque) pour mieux comprendre les conséquences de la carence en vitamine B12 dans chaque organe étudié, et une épreuve d’effort pour comprendre pourquoi les souris meurent à un âge précoce si la défaut est au niveau du cœur, et des tests comportementaux d'observation et non douloureux seront menés en parallèle pour savoir si un traitement réduit les manifestations neurologiques. L’ensemble des résultats sera étudié par informatique pour créer un modèle de « souris personnalisée » capable de prédire ce qui se passe dans l’organisme de la souris en cas de dérégulation ou de traitement, permettant ainsi de remplacer toute autre utilisation de souris dans certaines expérimentations, ou de limiter le nombre d’expérimentations grâce à ce modèle.
Réduction
Pour évaluer l’efficacité du Resvératrol sur la protéine Sirt-1 chez les patients CblG qui ont des troubles sévères dans différents organes essentiels tels que le cerveau ou le cœur, nous souhaitons utiliser 2 lignées de souris transgéniques qui expriment la maladie dans ces 2 organes cibles, et les étudier à 3 périodes différentes de la vie (sevrage à 21 jours, maturité sexuelle à 8 semaines et début du vieillissement à 6 mois). Afin d’assurer une étude statistique fiable nous inclurons 16 animaux par groupe d’étude, pour chaque tranche d’âge. Ces souris transgéniques seront traitées quotidiennement avec le médicament (ou placebo) par gavage durant la gestation jusqu’à la veille de la mise à mort, puis durant la lactation à partir de 2 jours post-naissance et jusqu’à l’âge de 21 jours. Ce projet nécessitera 72 femelles dont la moitié sera accouplée à 12 mâles portant la mutation au cerveau, et l’autre moitié à 12 mâles porteurs de la mutation au cœur Ce nombre d’accouplements est suffisant pour produire tous les animaux descendants nécessaires à la poursuite du projet. 360 animaux descendants seront nécessaires car l’étude est divisée en 3 groupes d’animaux traités avec le médicament ou son placebo et analysés à plusieurs stades du développement : - Groupe malade au niveau du cœur : 96 souris dont 48 sont traitées avec le médicament et 48 avec le placebo, et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois. - Groupe malade au niveau du cerveau : 96 souris, distribuées de la même manière que les souris malades au niveau du coeur. - Groupe témoin non malade : 96 souris traitées avec le placebo et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois, et dont la moitié sera utilisée comme groupe témoin “Cœur” et l’autre moitié comme groupe témoin “cerveau” Étant donné le type de données (variables continues), les effectifs (N>5), le nombre de groupes comparés (n>2) et l'indépendance des échantillons, nous aurons le nombre indispensable de souris qui nous permettra faire des statistiques et arriver à avoir de conclusions de notre travail. Par ailleurs, toutes les données issues de nos expérimentations seront modélisées en tenant en compte du phénotype, des résultats des études fonctionnelles et du traitement. Cette modélisation nous permettra d’aborder l’ensemble de résultats obtenus et de réduire au maximum le nombre de souris étudiées.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle agréée respectant les paramètres pour les conditions de vie des souris (hygrométrie, température…). Les souris seront hébergées en groupe dans la même cage (4/cage), auront un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et bénéficieront d’objets pour l’enrichissement (bouts de bois, carton, mouchoir…). Toutes les procédures seront réalisées par des personnels entraînés et qualifiés pour ce type d’étude. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Choix des espèces
La souris génétiquement modifiée est le seul modèle disponible de mutation tissu-spécifique permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. Il n'existe pas de modèle animal autre que la souris génétiquement modifiée permettant l'étude de cette maladie. Les animaux impliqués dans ce projet seront étudiés à plusieurs périodes de la vie telles que le sevrage (21 jours), la maturité sexuelle (8 semaines) et le début du vieillissement (6 mois) car ce sont des périodes charnières dans le déclenchement de la maladie CblG chez l’homme. Le traitement par Resvératrol sera effectué quotidiennement par gavage de la mère gestante (40 mg/kg/j) à partir de 9 jours après le début de la gestation (E9) jusqu’au sevrage. Différentes procédures expérimentales seront mises en œuvre (tests comportementaux, tests d’effort, imagerie à J20 ou 6 mois). A l’issue de chaque période clé du protocole, une partie des animaux sera mise à mort pour procéder aux analyses biochimiques et histopathologiques.