Troubles nerveux

Opérés jusqu'à six heures pour recevoir un équipement d'enregistrement fixé sur le crâne et sous la peau, puis rendus parkinsoniens par des injections de neurotoxine pendant quatre mois, jusqu'à 6 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'étude de leur cerveau. Trois seulement devraient l'être, les trois autres n'étant commandés qu'en cas de problème. Après chaque injection de toxine, le singe est isolé 72 heures, et sa ration d'eau peut être restreinte pour le motiver lors des tests de mémoire et d'attention, en plus d'une tâche de vigilance jusqu'à deux heures par jour, trois jours sur sept, en cage ou sur une chaise pour primates. Le projet teste l'effet d'une lumière proche de l'infrarouge sur les troubles du sommeil, avec au moins dix tests de latence d'endormissement de trois heures dans chaque condition. Le porteur qualifie la chirurgie de "peu invasive" et prévoit une douleur post-opératoire qui peut durer jusqu'à une semaine.

Objectifs

Les troubles du sommeil sont très fréquents dans la population et leur fréquence augmente considérablement chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce projet vise à évaluer l’effet de la lumière proche de l’infrarouge appliquée de façon non invasive sur les troubles du sommeil et leur répercutions sur la qualité de l’éveil dans la maladie de Parkinson. Les expérimentations seront réalisées chez l’animal sain puis rendu parkinsonien. La lumière sera appliquée de deux façon différente : en aigue (effet thérapeutique) et en semi-chronique (effet préventif). Dans ces 2 cas, le protocole sera identique, seul le mode d’administration de la lumière sera différent.

Bénéfices attendus

Environ 70 pourcents des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent aussi de troubles du sommeil. Dans la population 1 français sur 3 souffrent d’un mauvais sommeil. Un trouble du sommeil retentit sur la qualité de l’éveil, la physiologie et l’activité des structures cérébrales, ainsi un meilleur sommeil contribuerait à considérablement améliorer la qualité de vie et la santé des sujets sains ou atteints de maladies neurologiques. Ce projet propose d’évaluer l’effet de la luminothérapie, appliquée de façon non invasive, sur les troubles du sommeil. Le contrôle des troubles du sommeil permettrait une meilleure prise en charge des patients atteints de la maladie de Parkinson et contribuerait à améliorer leur qualité de vie. Enfin, il apparait que les troubles du sommeil sont des facteurs aggravants dans les maladies neurodégénératives, ce projet permettrait aussi d’envisager la dimension neuroprotectrice du sommeil.

Procédures

Tout au long du projet, les animaux réaliseront une tâche comportementale de vigilance qui prendra au maximum 2h par jour, à heure fixe et 3j sur7. Elle se déroulera à l’état conscient dans la cage à laquelle ils sont habitués et sur une chaise pour primates, sur laquelle ils sont entrainés à aller. La chirurgie d’implantation sera peu invasive, et durera au maximum 6h. De l’équipement, pour des enregistrements de sommeil, sera placé sur le crâne et sous la peau. Des enregistrements de sommeil, sans fil, se feront dans la cage d’hébergement de l’animal sans manipulation. Un maximum de 10 nuits et de 10 jours de 12h pourra être enregistré dans chaque condition : animal sain, animal sain avec illumination la nuit, animal parkinsonien, animal parkinsonien avec illumination la nuit. Des tests de latence d’endormissement seront réalisés dans une cage de sieste, à laquelle ils sont habitués. Le test dure 3h et sera effectué au moins 10 fois dans chaque condition. Les animaux seront rendus parkinsoniens par des injections de neurotoxine. Après chaque injection les animaux seront isolés pendant 72h jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modéré et stable. Cette phase dure 4 mois. Les prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien seront réalisés sous une légère anesthésie et espacés de un mois pour le premier et deux mois pour le deuxième.

Impact sur les animaux

Si nécessaire, afin d’obtenir une motivation maximale de l’animal pour réaliser des tests de memoire et d'attention, un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place selon un protocole adapté à chaque animal et développé à partir de « Avis et recommandations sur le contrôle d'eau pour les protocoles scientifiques chez les primates non-humains », Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale, 2021. Cela permettra un maximum de motivation sans impact sur l'état de santé de l'animal. La chirurgie d’implantation peut engendrer une douleur post-opératoire suite à l’implantation du matériel d’enregistrement télémétrique. L’état de santé des animaux sera suivi avec attention et des traitements adaptés seront donnés en cas de douleur. Cet effet indésirable peut durer jusqu’à 1 semaine après l’implantation. Le test de la latence d’endormissement ne devrait pas induire d’effet indésirable chez les animaux car il se fera dans une cage de comportement à laquelle l’animal aura été habitué. Les expériences sur les rongeurs montrent que la luminothérapie ne crée pas de nuisances. Une évaluation de l’impact de la luminothérapie chez l’animal sain sera réalisée en début de projet et les paramètres de son application seront réglés à ce moment. Des injections de toxine engendreront un syndrome parkinsonien modéré présent jusqu’à la fin de l’étude . Lors de la période d’intoxication, les injections de toxine nécessiteront un isolement de 72h toutes les deux semaines pour ne pas contaminer ses congénères ainsi que le personnel. Ce syndrome sera surveillé et des traitements adaptés seront donnés en cas de détection de mal être de l’animal.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour constater l’effet de l’illumination sur le cerveau. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres seront commandés uniquement en cas de problème.

Remplacement

Le singe Macaque fascicularis, utilisé dans cette étude, est un animal qui présente une des structures cérébrales qui contrôlent le sommeil (le cortex, l’hypothalamus et le tronc cérébral) similaire à celles connues chez l'humain, ce qui sous-entend que les mêmes mécanismes se mettent en place au cours du sommeil chez ces 2 espèces. D’ailleurs, il présente un comportement de veille/sommeil similaire à celui des humains, avec un éveil diurne et une nuit organisée en au moins 7 cycles de sommeil. C’est aussi un modèle de choix dans cette étude car une intoxication avec une toxine permet de développer des troubles du mouvement et du sommeil similaires à ceux présents dans la maladie de Parkinson. Des résultats de la luminothérapie ont été publiés chez la souris et le rat, des essais cliniques très ciblés, pour une application invasive de la luminothérapie sont en cours, mais l’étude exhaustive des effets de la luminothérapie non invasive chez le primate non humain rendu parkinsonien sont nécessaires avant la mise sur le marché d’un tel dispositif pour les patients. A ce stade des avancées sur la luminothérapie, cette étude ne peut se faire qu’au niveau préclinique, donc chez le primate non humain, il nous est donc impossible de remplacer cet animal par un modèle rongeur, un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le recours à ces animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un dispositif thérapeutique utilisable par l’humain.

Réduction

C’est une étude longitudinale et préclinique dans laquelle l’animal est son propre contrôle, peu d’animaux seront donc nécessaires. La répétition des mesures dans les différents états (sain avec ou sans luminothérapie, parkinsonien avec ou sans luminothérapie) permettra d’évaluer l’impact de la luminothérapie avec un test statistique non paramétrique. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres sont prévus et seront commandés uniquement en cas de problème.

Raffinement

Durant et pendant la chirurgie, des analgésiques, des anesthésiques et des antibiotiques seront administrés aux animaux afin de supprimer les douleurs et de diminuer les risques d’infections. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques et des antibiotiques afin de réduire au maximum les douleurs et les risques d’infections. Lors de la phase d’intoxication à la toxine les animaux serons isolé pendant 72h toutes les deux semaines. Afin de diminuer le stress des animaux, un programme d’habituation aux conditions expérimentales est mis en place dans l’animalerie. Ces habituations consistent en des entrainements et se feront selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée. Un tableau de progression est utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assureront par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure expérimentale ainsi qu'un arbre décisionnel pour intervenir le plus rapidement possible pour limiter la souffrance animal sont mis en places.

Choix des espèces

Le primate non-humain fait partie des mammifères les plus proches de l’espèce humaine. Son anatomie cérébrale est très proche de celle du cerveau humain. Les Macaques fascicularis, qui ne constituent pas une espèce de primates menacée d’extinction, possèdent des circuits neuronaux proches de ceux de l’humain et permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil, ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui ont un rythme inversé avec des cycles plus courts. Il est possible de reproduire chez cet animal un syndrome parkinsonien similaire à celui observé chez les patients s'accompagnant de plus d'un trouble de sommeil comme chez le patient parkinsonien. Des adultes seront utilisés dans cette étude car les traitements à développer à la suite visent des patients adultes.

Des macaques adultes, voire âgés, se voient induire des symptômes de la maladie d'Alzheimer, puis reçoivent à travers le crâne, au moyen d'un casque, une lumière proche infrarouge censée protéger leurs neurones. 15 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une ou deux chirurgies d'environ six heures, 9 prélèvements sanguins, 9 prélèvements de liquide céphalo-rachidien, des tests comportementaux et une perfusion intracardiaque pour les analyses de leurs tissus. Ni la méthode d'induction des symptômes ni la nature des tests comportementaux ne sont précisées, et le porteur affirme qu'il n'attend "pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d'illumination ou l'induction des symptômes". Face aux difficultés d'approvisionnement, il dit avoir déclaré deux espèces de singes pour voir quel primate est "le plus facilement disponible pour effectuer l'étude dans les temps".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative, c’est-à-dire que la MA perturbe et endommage le bon fonctionnement des neurones jusqu’à entraîner la mort de ces cellules qui conduit à une perte progressive de la mémoire. Cette maladie touche de plus en plus de personnes et devient donc un problème de santé publique majeur au sein des pays développés. Dans les cerveaux des personnes atteintes de la MA, ils existent deux marqueurs neuro-pathologiques cérébrales, qui sont : les dépôts extracellulaires de petites protéines appelées amyloïde-β et les dépôts intracellulaires de protéines nommées Tau. Actuellement, il n’existe pas de traitement médicamenteux permettant de guérir de la maladie d’Alzheimer. Les traitements actuels ont une efficacité faible, inconstante et limitée dans le temps. Ils comportent un risque d’effets indésirables graves, augmentant avec la durée du traitement et n’enrayent pas la progression de la maladie. Une thérapeutique innovante par la lumière, la photobiomodulation, pourrait être une solution thérapeutique pour ralentir le développement de la maladie. Les effets de l’illumination proche infrarouge ont notamment été étudiés pour la maladie de Parkinson sur le plan préclinique (modèles primates et rongeurs), et ont donné des résultats très prometteurs de neuroprotection par la lumière. Ces résultats ont permis de démarrer un essai clinique en 2021 sur des patients parkinsoniens afin d’essayer de ralentir le développement de leur pathologie. Les mécanismes d’actions de la photobiomodulation semblent assez génériques (action sur un composé de la cellule, appelé mitochondrie), et pourrait être bénéfique pour d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie d’Alzheimer. Les régions cérébrales ciblées (cortex) étant plus en surface que pour la maladie de Parkinson (substance noire), la photobiomodulation sera administrée via un casque et les photons traverseront la boite crânienne pour atteindre le cortex. Notre projet nécessite l’utilisation de 15 primates non humains (PNH) et sera réalisé dans le plus strict respect de la règle des 3 R.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce nouveau projet sont une évaluation sur un modèle de primate non humain présentant des symptômes de la maladie d’Alzheimer, du bénéfice possible grâce à un traitement par photobiomodulation pour ralentir le développement de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une voir 2 interventions chirurgicales d’une durée moyenne de 6 heures - une phase de quarantaine et d’habituation - la photobiomodulation durant le temps déterminé par le groupe pilote - 9 prélèvements sanguins durant les procédures 2/4 et 3 - 9 prélèvements du liquide céphalo-rachidien durant les procédures 2 et 3 - des tests comportementaux - une perfusion intra-cardiaque afin d’effectuer des analyses immunohistochimique et biochimiques.

Impact sur les animaux

Selon notre expérience et la littérature, les traitements ne seront pas douloureux et un stress pourrait s’observer lors des procédures. Afin de réduire ce stress, la première procédure consistera à habituer les animaux aux actes qui seront réalisés par la suite et de s’assurer de leur coopération. En ce qui concerne la douleur, tout point d’appel conduira à une évaluation conjointe par les membres de l’équipe projet, le vétérinaire et les membres du SBEA, de façon à décider du traitement à adapter ; une euthanasie précoce pourra être envisagée si nécessaire. Dans chaque procédure, nous avons détaillé les signes cliniques à considérer et les actions des expérimentateurs selon la situation.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Des études ont déjà été réalisées sur des modèles murins présentant des données très encourageantes et il est impossible de réaliser de telles expériences in vitro ou in silico. Le modèle primate non humain est maintenant indispensable avant de pouvoir passer à un essai clinique chez l’Homme. Une seule espèce de PNH sera utilisé pendant l’étude mais vu les difficultés d’approvisionnements, nous avons décidé de mettre deux espèces afin de voir quel PNH est le plus facilement disponible pour effectuer l’étude dans les temps.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au maximum tout en permettant une validité statistique des résultats. Si les tests préalables de mise en place sont probants, le nombre d’animaux prévus pour la phase de test sera réduit. Les animaux pilotes seront donc inclus dans l’étude des effets neuro-protecteurs et considérés comme contrôle.

Raffinement

afin de limiter au maximum le stress infligé aux animaux, ils seront préalablement habitués aux manipulations. Ils bénéficieront également d’une surveillance quotidienne, d’une médication adéquate lors de la chirurgie (anesthésique, anti-douleur et anti-inflammatoire) et tout signe anormal fera l’objet d’un signalement au chef de projet et au vétérinaire, afin que les animaux bénéficient aussitôt de soins adaptés. Une euthanasie précoce pourra être décidée en concertation avec l’équipe de recherche, la Structure Chargée du Bien Etre Animal et le vétérinaire si besoin. Les conditions d’hébergement des animaux respecteront strictement toutes les normes relatives au bien-être animal en vigueur. De plus, un enrichissement du milieu de vie des animaux utilisés pour les procédures de ce projet sera utilisé. D’après la littérature, nous n’attendons pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d’illumination ou l’induction des symptômes.

Choix des espèces

Le modèle primate non-humain (PNH) est le modèle le plus proche de l’humain. Les résultats obtenus permettront un transfert rapide à l’humain s’ils sont positifs. Pour l’étude nous allons bien sûr prendre une seule espèce de PNH mais les conditions sanitaires actuelles et la non validation du CEA d’obtenir des PNH d’origine asiatique induisent une pénurie d’approvisionnement des PNH et donc nous chercherons quel PNH est-il le plus simple à obtenir avec les âges voulus. Par la suite, on continuera exclusivement avec la même espèce. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes, voir âgés, afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux non impliqués dans la pathologie et pour que nous soyons le plus en adéquation avec la temporalité de la Maladie d’Alzheimer présente chez l’Homme.

348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jour de leur naissance, elles reçoivent une injection dans le cerveau, puis subissent à 21 jours un traumatisme crânien provoqué par un impact sous anesthésie, suivi de séries de tests comportementaux et d'IRM, avant d'être tuées par perfusion d'un fixateur. Le porteur présente ce modèle comme reproduisant un traumatisme crânien pédiatrique et renvoie les retombées thérapeutiques à un potentiel futur. Il affirme qu'"aucun modèle in vitro ou informatique" ne permet cette étude et que le projet "ne peut pas se passer de l'expérimentation animale".

Objectifs

Le projet que nous avons développé vise à étudier les changements qui se mettent en place au sein du cerveau à la suite d'un traumatisme crânien léger et qui contribuent aux atteintes comportementales à long terme. Ce projet unique va explorer le potentiel thérapeutique d’une protéine d’intérêt, la cavéoline, en étudiant son rôle protecteur dans le cerveau. Notre équipe utilisera un modèle léger de traumatisme crânien chez la souris, nous permettant d'étudier sur le long cours, à l'aide de tests comportementaux et d'outils d'imagerie innovants, les processus induits sur le système nerveux central avec une définition encore inaccessible chez l'homme. Ces processus chroniques seront étudiés par l’utilisation de souris ayant reçu une injection permettant l’augmentation de notre protéine d’intérêt. Suite à l’induction du traumatisme crânien, ces animaux seront soumis à une évaluation comportementale permettant d’évaluer leurs capacités locomotrices, leur niveau d’anxiété et leur mémoire et nous réaliserons également un suivi au cours du développement par imagerie IRM. Notre étude sur le rôle de cette protéine d’intérêt pourrait nous permettre d’établir la pertinence de cette protéine dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques innovantes.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine CAV1 (CAVéoline-1) représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.

Procédures

1. injection unique dans le cerveau le jour de naissance sous anesthésie générale courte (moins de 15 minutes) adaptée à ce stade de développement. Réalisé une seule fois. 2. trauma crânien léger juvénile (TC): 21 jours après leur naissance, les animaux subiront une anesthésie générale courte (5 minutes) pendant laquelle il recevront un impact léger au niveau du crâne. Animaux contrôles soumis uniquement à l’anesthésie générale. Réalisé une seule fois. 3. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes, 2 tests de coordination motrice d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux de 5 minutes et 2 tests d’apprentissage spatial qui nécessitent des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale s’étalera sur 2 semaines, avec 11 jours où l’animal sera testé sur une durée de 5 min par jour. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers, un jour après le dernier test comportemental. 5. Fixation du tissu cérébral. Anesthésie générale profonde et adaptée. Perfusion d’un fixateur pendant 5 minutes jusqu’à l’arrêt du cœur. Prélèvement des tissus.

Impact sur les animaux

Notre modèle repose sur une injection dans le cerveau à la naissance sous anesthésie très courte. Ce geste peut entraîner une réduction de la température du corps ou un retard de croissance. De plus, nous utiliserons un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Les conséquences possibles incluent des altérations d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de mobilité, d’anxiété ou de douleur. Chaque série comportementale peut entraîner du stress et de la fatigue. L’anesthésie réalisée lors de l’imagerie par IRM peut aussi entraîner une dépression respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure, soit 348 animaux. Ceci est nécessaire pour les analyses en immunohistochimie et par imagerie IRM qui complèteront et seront essentielles à cette étude.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données scientifiques permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Le projet concerne 348 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes lors des tests comportementaux / IRM.

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. La procédure chirurgicale d’injection stéréotaxique chez le nouveau-né sera réalisée avec des protocoles d’anesthésie et d'analgésie permettant de supprimer toute douleur durant et après la procédure. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Le bien-être des animaux sera assuré par des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. Dans ce projet, les souris seront injectées en intracérébral le jour de la naissance afin de permettre une transfection robuste 3 semaines plus tard. Les traumatismes crâniens seront donc réalisés sur des souris juvéniles à 21 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à moyen terme.

60 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une étude à l'autre puis tués pour des analyses ex vivo. Chaque animal peut subir une chirurgie du cerveau de deux à quatre heures, l'implantation d'électrodes, l'administration de vecteurs viraux, jusqu'à dix prélèvements de sang en 24 à 48 heures, des ponctions de liquide céphalorachidien et des séances quotidiennes en chaise de contention, avec injection d'harmaline pour provoquer des troubles moteurs. Le porteur teste de nouvelles électrodes de stimulation cérébrale profonde et des vecteurs de thérapie génique dans un cadre de prestation commerciale. Il justifie le recours au primate en invoquant que l'"éthique spéciste actuelle" interdit ces approches invasives chez l'humain.

Objectifs

La stimulation cérébrale profonde (DBS) est une procédure neurochirurgicale pratiquée chez les personnes souffrant de troubles du mouvement notamment dans la maladie de Parkinson (MP). La stimulation interfère avec les signaux pathologiques dans le cerveau pour restaurer les fonctions motrices normales. Cette thérapie a été reconnue comme sûre et efficace pour l'amélioration des symptômes chez les patients atteints de MP tel que les tremblements, rigidité ou autres fluctuations motrices. Cette méthodologie a été une évolution technique majeure pour le traitement de la MP et l’intervention chirurgicale est maintenant explorée également pour d'autres conditions, comme l'épilepsie et la dépression. Ceci explique le développement permanent de nouvelles sondes DBS capables d'enregistrer l'activité cérébrale dans les structures cibles afin de contribuer au développement de nouvelles thérapies chez les patients atteints d’autres affections neurologiques. D’un autre côté, de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique pourraient également bénéficier aux patients atteints de ces affections. Cette approche utilise des virus modifiés ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. On parle alors de vecteurs viraux ou non viraux (peptides, anticorps...) ou plus génériquement d’inocula. Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces vecteurs tout comme la DBS reste l’approche chirurgicale par stéréotaxie. Si la validation de nouvelles sondes DBS passent par des enregistrements des signaux, la mesure des effets des inocula se fait par des analyses biochimiques sur des prélèvements biologiques puis cellulaires après mise à mort. Les études précliniques nécessitent de valider ces outils (sondes pour la DBS ou inocula) chez le primate non humain (PNH). Le projet a donc pour objectif de valider d’une part de nouveaux vecteurs qu’ils soient porteurs d’une molécule «contrôle» ou de protéines d’intérêt à visée thérapeutique et d’autre part de nouvelles sondes DBS chez le PNH.

Bénéfices attendus

Les animaux sont soumis aux différentes étapes décrites dans la procédure. - Prélèvements sanguins sur animal anesthésié ou vigile (10 min), fréquence max en 24/48 h = 10 prélèvements et volume max sur une semaine entre 5 à 7 ml/kg / semaine - Prélèvements LCR, sur animal anesthésié, 1 ml max sur un mois (10 min) - Imagerie (3 heures) sur animal anesthésié - Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour l'implantation, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administration d'inoculum sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). - Traitement prophylaxique par gavage (fréquence variable, max 2 fois par jour) sur animal vigile pour une durée entre une semaine et 10 jours. Ceci afin de conserver un score inférieur à 5 sur l’«Échelle d'évaluation du bien-être PNH» - Tache en chaise avec enregistrements électrophysiologiques et/ou stimulation (séances quotidiennes de 1-2h, sur jour ouvré pendant toute la durée du projet) sur animal vigile en absence ou en présence de fluctuations motrices (induites par l’harmaline, max 1 fois par semaine).

Procédures

Les animaux sont soumis aux différentes étapes décrites dans la procédure. - Prélèvements sanguins sur animal anesthésié ou vigile (10 min), fréquence max en 24/48 h = 10 prélèvements et volume max sur une semaine entre 5 à 7 ml/kg / semaine - Prélèvements LCR, sur animal anesthésié, 1 ml max sur un mois (10 min) - Imagerie (3 heures) sur animal anesthésié - Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour l'implantation, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administration d'inoculum sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). - Traitement prophylaxique par gavage (fréquence variable, max 2 fois par jour) sur animal vigile. - Tache comportementale en chaise avec enregistrements électrophysiologiques et/ou stimulation (séances quotidiennes de 1-2h, sur jour ouvré pendant toute la durée du projet) sur animal vigile en absence ou en présence de fluctuations motrices (induites par l’harmaline, max 1 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. Pour l’aspect comportemental : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique d’harmaline entrainant les fluctuations motrices. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie, hématome, douleur possible. Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport. Bien que les vecteurs viraux soient réputés pour leur faible toxicité, une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de les détecter.

Devenir

A la fin du projet les animaux pourront être réutilisés un autre projet et ceci conformément à l’article 16 de la directive européenne 2010/63 EU, et après avis favorable du vétérinaire référent. Cela concerne les cas où les études n’impliquent pas de prélèvement de tissus et de contrôle post-mortem. Ainsi si une étude de sévérité légère ou modérée ne se termine pas sur un prélèvement de tissus, l'animal pourra être ré-utilisé dans une nouvelle étude. En tout état de cause, l'ensemble des animaux à la fin du projet seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité pré-clinique de service. Il recourt exclusivement à l’utilisation du primate non-humain (PNH), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs); 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. Dans bien des cas par exemple les immunothérapies testées ne peuvent interagir qu’avec des tissus provenant de PNH, ce qui impose souvent l’utilisation du modèle primate.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques ou le développement de nouveaux dispositifs médicaux (ici électrodes de stimulation/enregistrement) avec un nombre estimé de 3 études par an, comprenant 4 animaux maximum par étude, soit un total de 60 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 4 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Les inocula auront été testés préalablement in vitro ou chez le petit animal (rongeur) par nos clients pour déterminer les doses à utiliser et s’affranchir d’éventuels effets toxiques nécessitant un apport supplémentaire d’animaux. Dans le cadre d’une étude de validation de dispositif médical (électrode), la chirurgie implantatoire peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée et l’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal, et sont réalisé sur animaux sédatés. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le PNH a été retenu car (i) les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique ; (ii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du porc et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Adultes afin que de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

1500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant huit semaines, elles subissent chaque jour un stress de contention, olfactif, social, environnemental ou une perturbation de leur rythme circadien, pour reproduire un état dépressif et tester des molécules. Le porteur présente le projet comme une prestation offerte à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques pour la validation in vivo de leurs molécules, et prévoit de tuer les souris par dislocation cervicale afin d'analyser leur intestin et leur cerveau. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet de reproduire l'état dépressif.

Objectifs

Aujourd’hui, la recherche sur la dépression est entravée par la complexité des facteurs induisant cette maladie. Par ailleurs, il est connu que le stress chronique imprévisible (CUS), assimilé à la dépression, est un modèle de fragilisation de la barrière intestinale. Ce modèle CUS validé par la communauté scientifique chez la souris, permet la découverte de nouvelles molécules (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) agissant sur le système digestif afin de diminuer la dépression. Notre objectif est donc d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, une validation in vivo de leur molécule (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) et montrer qu'elle peut être un traitement antidépresseur. La dépression affecte environ 12% des hommes et presque 20% des femmes. Ces chiffres n’ont cessé d’augmenter depuis les années 70 ce qui en fera la pathologie la plus coûteuse d’ici 2030 selon l’OMS. Les traitements actuels sont insuffisants puisqu’il existe un risque de récidive de l’ordre de 50% au bout de 6 mois d’arrêt de traitement. De plus, jusqu’à 80% des suicides sont le fait d’individus dépressifs. Par ailleurs, la recherche sur la dépression est entravée par les effets indésirables de certains antidépresseurs (troubles du sommeil etc) ainsi que par la complexité des facteurs induisant cette maladie (sociaux, psychologiques et biologiques). Ainsi, la pathologie de la dépression est un problème majeur de santé publique qui nécessite de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Il est connu que les antidépresseurs ont de nombreux effets indésirables (troubles du sommeil par exemple). De plus, de nombreuses études ont démontré, lors d’études précliniques et cliniques, qu'à la dépression est associée une altération de la fonction de barrière intestinale ainsi qu'une dysbiose du microbiote intestinal. La découverte de nouvelles molécules agissant sur le système digestif est donc considérée comme une avancée thérapeutique majeure pour traiter le syndrome dépressif.

Procédures

Les différents types d'intervention se feront sur animal vigile uniquement. Parmi 60 souris, 10 représentent le groupe contrôle (sans intervention) appelé G1. Pour développer un stress chronique et imprévisible chez la souris (e.g dépression), des stress différents vont être utilisés sur les 8 semaines de protocole de stress (CUS). Un seul stress par jour va être appliqué à l'animal pendant 8 semaines. Les différents types de stress sont des stress de contention, stress olfactifs, stress sociaux, stress environnementaux, et une perturbation du rythme circadien. Le groupe G2 subira ces stress pendant 8 semaines. Le groupe G3 subira le protocole de stress pendant 8 semaines associé à un traitement antidépresseur connu. Les souris du groupe G4 subiront également les protocoles de stress associés à un traitement à tester (probiotique, prébiotiques par exemple).

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu sur le groupe contrôle (non-CUS - G1). Les souris des groupes CUS (G2, G3 et G4) seront soumises à un stress, une fois par jours pendant 8 semaines consécutives. Sur la durée, les animaux soumis à différents stress présenteront un pelage moins bien entretenu sans présenter de blessure ni d’anomalies physiques graves. Le groupe G3 aura en plus un traitement antidépresseur. Ce groupe devrait avoir un aspect du poil bien entretenu. Ce traitement antidépresseur chez la souris n'est pas connu pour engendrer d'effet indésirable quelconque. Les souris du groupes G4 qui seront traitées avec des molécules à tester seront des molécules de type probiotiques ou prébiotiques ou compléments alimentaires ne faisant pas l'objet d'une quelconque dangerosité pour l'animal.

Devenir

Les souris seront ensuite euthanasiées par dislocation cervicale afin d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques. De plus en post mortem, l'analyse de marqueurs spécifiques d'un état dépressif sera effectuée sur différentes parties du cerveau.

Remplacement

Pour identifier des probiotiques ou molécules capables de diminuer la dépression, nous avons besoin d’individus vivants en contact ou non avec des agents stressants détaillés dans les procédures. En effet, l’état dépressif implique un contexte psychosocial, physique et physiologique particulier et leur combinaison est essentielle à son installation. De plus notre projet implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Malheureusement aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible pour répondre à la problématique posée.

Réduction

Le modèle de stress chronique imprévisible ou CUS est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris C57BL/6J est un modèle de référence dans l’étude des désordres psychiques comme la dépression. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, notre protocole de stress a été soumis à une veille bibliographique minutieuse et validé par différents spécialistes du secteur. Les effectifs ont été optimisés afin d’assurer la reproductibilité de nos résultats tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Les stress pris individuellement peuvent être qualifiés de léger, en raison de leur brièveté. L'accumulation de ces stress qualifie cette procédure de modérée. C'est pourquoi la surveillance des animaux et surtout leur comportement seront observés avec une grande vigilance. Les conditions d’élevage des animaux non stressés seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Une surveillance quotidienne de chaque souris sera effectuée. La préhension des souris s'effectuera avec une nouvelle technique "main en coupe" permettant de limiter au maximum le stress de l'animal en dehors des procédures expérimentales de stress.

Choix des espèces

La souris C57BL/6J est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux. La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux (pas d'induction de la dépression à cet âge), de ce fait les animaux auront à minima 8 semaines (âge adulte).

3069 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une neurotoxine leur est injectée dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique pour reproduire un comportement de type narcoleptique, puis leur activité est enregistrée en isolement individuel pendant 48 heures avant la chirurgie et 21 jours après, avant l'administration quotidienne d'un candidat médicament pendant 23 jours. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, perte de poids et posture voûtée, et que les rats sont tués pour prélever leur cerveau. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer le cycle circadien dans la narcolepsie et que le recours à l'animal est 'nécessaire'.

Objectifs

La narcolepsie est une maladie chronique rare et non curable survenant le plus souvent dans l’enfance et l’adolescence. Ce trouble du sommeil est caractérisé par un sommeil nocturne de qualité médiocre, une somnolence diurne excessive et des endormissements irrépressibles pouvant survenir à tout moment de la journée, même en pleine activité, généralement avec des épisodes soudains et passagers de faiblesse musculaire. Des études ont montré qu’une injection d’une neurotoxine dans le cerveau, chez le rat, induisait un comportement de sommeil de type narcoleptique. Le rat est un animal nocturne présentant une activité locomotrice qui est 4 à 5 fois plus élevée pendant la phase nocturne que pendant la phase diurne. L’activité circadienne est donc un indice fiable du cycle de sommeil/éveil. De ce fait, une diminution de l’activité durant la phase nocturne est un indicateur d’une augmentation du sommeil c’est-à-dire d’un comportement de sommeil de type narcoleptique. L’objectif de ce projet est (1) d’examiner si une injection bilatérale d’une neurotoxine dans le cerveau induit un comportement de sommeil de type narcoleptique chez le rat et (2) dans le cas où l’injection de la neurotoxine entraîne une perturbation de l’activité circadienne pendant la phase nocturne, d’examiner l’efficacité de candidats médicaments sur ces perturbations préalablement observées. Actuellement, aucun traitement curatif n’existe. Il subsiste cependant la possibilité de traitements médicamenteux pour traiter par exemple la somnolence diurne excessive. Cependant, ces traitements ne traitent pas la cause mais seulement les symptômes et ils sont de plus inconstamment efficaces et parfois associés à des effets secondaires. Ce modèle est donc pertinent pour le développement de cibles thérapeutiques pouvant améliorer la qualité de vie des patients atteints de narcolepsie.

Bénéfices attendus

La narcolepsie est une maladie neurologique chronique rare, débutant le plus souvent dans l’enfance et l’adolescence et provoqué par une perte des neurones synthétisant la protéine hypocrétine. Elle se caractérise par un sommeil nocturne de qualité médiocre, d’une somnolence diurne excessive et des endormissements irrépressibles pouvant survenir à tout moment de la journée, même en pleine activité, généralement avec des épisodes soudains et passagers de faiblesse musculaire (cataplexie). Il existe actuellement peu de médicaments pour améliorer les symptômes de la narcolepsie. De plus, les traitements ne traitent pas la cause mais seulement les symptômes et ils sont de plus inconstamment efficaces et parfois associés à des effets secondaires. Ainsi ce modèle est pertinent pour le développement de cibles thérapeutiques pouvant améliorer la qualité de vie des patients atteints de narcolepsie.

Procédures

1- Avant l’injection bilatérale dans le cerveau, le rythme circadien des animaux est étudié de façon individuelle, dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 48 heures. 2- Les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale (injection d’une neurotoxine dans le cerveau) qui dure dans sa totalité environ une heure (de l'anesthésie jusqu'au réveil). 3- Après l’injection bilatérale de la neurotoxine dans le cerveau, le rythme circadien est étudié sur chaque animal de façon individuelle dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 21 jours consécutifs. 4- L’effet d'un candidat médicament sur la perturbation de l'activité circadienne induite par l’injection bilatérale de la neurotoxine dans le cerveau est étudié. Selon le groupe, les animaux reçoivent une administration par jour soit d'une solution saline soit du candidat médicament (durée totale du traitement 23 jours - durée du geste moins d’une minute). 5- A la fin de l’expérience, les animaux sont mis à mort. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale profonde (soit anesthésie gazeuse soit anesthésie par injection).Puis le cerveau de l’animal est prélevé post-mortem et des coupes histologiques sont réalisées sur le cerveau pour des analyses immunohistochimiques. Dans sa totalité, l'intervention dure en moyenne 40 minutes.

Impact sur les animaux

(1) Chirurgie : l’injection bilatérale stéréotaxique d’une neurotoxine dans le cerveau. Le type de douleur attendue est uniquement de la douleur lié à la chirurgie stéréotaxique. En cas de douleurs, on remarquera chez l’animal : la présence de porphyrine (pigment rouge autour des yeux et du nez), une diminution des mouvements, une perte de poids et une posture voutée ; (2) Administration de candidats médicaments. Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. De par notre expérience, les effets indésirables sont rares car la toxicité des candidats médicaments est généralement testée en amont avec des doses croissantes de la molécule ; et (3) L’isolement des animaux. Avant l’injection bilatéral, dans le cerveau, le rythme circadien est étudié sur chaque animal de façon individuelle (un animal par enceinte) dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 48h. Après l’injection bilatérale de la neurotoxine, dans le cerveau, le rythme circadien est étudié sur chaque animal de façon individuel (un animal par enceinte) dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 21 jours consécutifs.

Devenir

A la fin de l’expérience, les animaux sont mis à mort. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale (soit anesthésie gazeuse, soit anesthésie par injection). Le cerveau de l’animal est ensuite prélevé post-mortem et des coupes histologiques sont réalisées sur le cerveau pour des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucune méthode alternative permettant d’évaluer le cycle circadien dans la narcolepsie. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Etant donné la variabilité probable, 11 animaux par groupe au maximum sont prévus dans ce projet pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable – tout en prenant en compte le bien-être animal. Cet effectif correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Pour chacune des étapes, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Toutes les expériences sont réalisées après une période d’acclimatation de 14 jours. Les animaux sont hébergés par deux dans des cages transparentes de type III contenant de la litière et des enrichissements (matériel de nidification : sizzle dri kraft et brique de peuplier) afin de réduire le stress. Ils sont quotidiennement observés par des techniciens/ingénieurs formés et attentifs. Les soins pré et post opératoires sont les suivants : (1) Trente minutes avant l’acte chirurgical, les animaux reçoivent une administration sous-cutanée d’un analgésique puis ils sont anesthésiés (anesthésie gazeuse) ; (2) Durant l’acte chirurgical, les animaux ont un soutien thermique (couverture chauffante) de façon à éviter l’hypothermie et du gel oculaire stérile est également déposé sur les yeux des animaux, formant une couche protectrice, une humidification et une lubrification de la surface cornéenne de l’œil et (3) juste après la chirurgie, les animaux reçoivent une administration sous-cutanée d’un anti-inflammatoire et une administration sous-cutanée d’une solution saline (1ml). Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. La cage d’hébergement est placée sur une plaque chauffante jusqu’au réveil de l’animal. Par ailleurs, lors des soins post- opératoires, les animaux reçoivent une administration sous-cutanée d’un anti-inflammatoire pendant 2 à 5 jours (selon leur état général), comme indiqué dans la formation réglementaire en chirurgie expérimentale, pour garantir le bien-être animal. Ici, le type de douleur attendue est uniquement de la douleur lié à la chirurgie stéréotaxique. Les animaux sont également pesés et leur état général est évalué durant toute la durée de l’expérience, selon notre grille de surveillance, pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. Par ailleurs, le rat est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer facilement les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. 5 semaines au moment de la chirurgie. Dans ce projet, seuls des animaux adultes seront utilisés car il n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

100 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections de vecteurs de thérapie génique dans le cerveau ou en intraveineuse, suivies de chirurgies sous anesthésie, d'examens IRM, d'électromyogrammes et de multiples prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien. Le porteur indique des risques d'arrêt cardiaque, de fuite de liquide céphalorachidien, d'hématomes et de douleurs postopératoires, et prévoit de tuer tous les animaux pour analyser leurs organes. Il justifie le recours au macaque par la proximité de son cerveau avec celui de l'humain et par le caractère réglementaire de l'étude avant un essai clinique.

Objectifs

Dans ce projet notre objectif sera d’évaluer la biodistribution, la tolérance et l’efficacité de thérapies géniques dans le domaine des maladies neurodégénératives. Ces thérapies consisteront en l’injection de gènes dans différentes régions du cerveau variant en fonction de la pathologie d’intérêt (maladie de charcot, Alzheimer, Parkinson, Huntington, Ataxie, etc).

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’obtenir toutes les données précliniques d’efficacité, de tolérance et de toxicité de l’utilisation d’une thérapie génique fondée sur l’injection intracérébrale ou intraveineuse de vecteurs Adéno- Associés (AAV) sur un modèle animal extrêmement proche de l’être humain afin de pouvoir proposer sur les différentes pathologies d’intérêt, un traitement et sa mise en place, au cours d’un essai clinique chez l’Homme, dans les prochaines années.

Procédures

- Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : injection intracérébrale de vecteurs suivi d’une imagerie par résonance magnétique post-opératoire immédiate (durée globale environ (5h)) ou une injection intraveineuse de 45min max - 6 à 8 prélèvements sanguins maximum respectivement pour les études à court et long terme , 5 à 7 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (durée du geste maximum 30min) respectivement pour les primates participants aux études à court et long terme, sous anesthésie générale et analgésie. - 4 à 6 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale respectivement pour les primates participants aux études à court et long terme pour l’injection intracérébrale-3 à 5 électromyogrammes (EMG) (environ 10min) sous anesthésie générale respectivement pour les primates participants aux études à court et long terme Dans ce projet, comme décrit précédemment, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien + IRM + EMG selon les temps d’intérêt de l'étude).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont: - Une chirurgie sous anesthésie générale ou une injection intraveineuse avec un risque anesthésique (dépression respiratoire, arrêt cardiaque), un risque de contamination post opératoire et de douleurs post opératoires (pour l’injection intracérébrale) - Plusieurs prélèvements de sang et de liquide cephalo rachidien (LCR) sous anesthésie générale avec un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques) et la formation possible d’hématomes, l’anémie transitoire d’une dizaine de jours -La réalisation d’un electromyogramme qui nécessite d’être fait sous anesthésie générale pour des raisons de contention et de bonne réalisation sur un animal sauvage - stress lié aux Injections intra-musculaire avec contention en cage pour le suivi (anesthésies, analgésiques, immunomodulateurs, antibiotiques) - potentiellement des douleurs post opératoires pour la chirurgie

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études post-mortem des tissus et des organes et vérifier la distribution du vecteur médicament dans les organes afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de cette approche.

Remplacement

Les études in vitro pour valider la cible thérapeutique sont effectuées en amont de ce projet afin de valider l’utilisation de notre cible thérapeutique dans les modèles murins de la pathologie. Enfin, notre stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de nos vecteurs ont été réalisées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité, de toxicité, sur un modèle ayant un système nerveux plus développé que le rongeur et le plus pertinent pour reproduire ce qui se passera chez l’Humain, est le primate non humain. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence francaise du médicament pour toute demande d’autorisation pour la réalisation d’étude clinique (chez l’homme).

Réduction

Il y a 100 animaux maximum sur ce projet, correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité des différentes approches avec des lots d’animaux allant de 2 pour une étude d’évaluation de diffusion et d’expression à 12 pour une étude de toxicité. Le temps de l’étude (suivi longitudinal) peut varier entre 6 semaines et 6 mois post injection. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié. Selon le nombre d’animaux inclus par étude cela peut représenter de 10 à 50 projets

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement, perchoir, échelle, hamac…). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie. L'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et les injections virales, permettra d’éviter au maximum les inconforts. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Si un animal ne présente pas d'amélioration suite à une prise en charge vétérinaire, il sera euthanasié (avec avis vétérinaire) après avoir été anesthésié. Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, elles sont réalisées par du personnel formé et expérimenté́. Enfin, les étapes du suivi sont prévues pour optimiser le nombre d'anesthésies en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal), ponction lombaire, imagerie par résonance magnétique et Electromyogramme (EMG) si besoin en fonction des étapes du suivi) au sein de la même anesthésie générale. Les prélèvements, les examens type EMG ne sont réalisés que lorsqu'ils sont nécessaires au suivi planifié, il se peut que certaines études contractualisées avec nos collaborateurs demandent moins de prise de sang ou ne nécessitent pas la réalisation d'EMG, il y aura alors moins d'actes pratiqués sur les animaux que le schéma maximal décrit ici

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du macaque en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en termes de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur médicament dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres (volume de vecteur à injecter, vitesse d’injection etc) du protocole qui sera réalisé chez l’Homme. L'injection de vecteurs adeno associés chez le macaque est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance pour l’Homme d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́ compte tenu des patients ciblés par nos approches

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène Kcnq2 reproduisant une épilepsie infantile, elles reçoivent jusqu'à vingt molécules candidates par gavage, injection ou alimentation, certaines étant implantées d'une puce sous anesthésie, et le porteur indique que des crises spontanées peuvent provoquer leur mort. Le système nerveux central est prélevé en fin de procédure. Le porteur revendique un modèle "premier et seul" disponible pour tester des traitements sur "organisme entier", les bénéfices pour les enfants restant renvoyés à une éventuelle demande d'essai clinique.

Objectifs

Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie dans l'espèce humaine. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises survenant durant les tous premiers mois de vie (avant l'âge de 3 mois). Cette activité épileptique est accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle knock-in porteuse d'un variant récurrent du gène KCNQ2 (T274M). La souris hétérozygote pour ce variant reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Ce modèle permet de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de tester des approches thérapeutiques sur organisme entier dans un contexte valide par rapport à la pathologie humaine. Le projet comporte la stabulation d'animaux à phénotype dommageable, leur traitement par des candidats médicaments et l'évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d'épilepsie et des capacités cognitives. A l'heure actuelle, il existe des molécules qui vont atténuer les crises d'épilepsie chez les enfants présentant une épilepsie liée au gène KCNQ2 (par exemple la carbamazépine). La multiplicité des traitements subis par ces enfants et leur hétérogénéité (clinique et génétique) ne permet cependant pas d'établir clairement si les traitements efficaces sur les crises le sont aussi sur le développement neurologique. Il s'agit pourtant d'une question essentielle. Pour l'ensemble de ce projet, nous envisageons de tester 20 molécules. Nous avons pour objectif d'identifier des molécules qui apporteront un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèle devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans un modèle unique d'encéphalopathie épileptique. Si un candidat médicament s'avère efficace pour diminuer les crises d'épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d'essai clinique dans l'espèce humaine.

Procédures

Traitements pharmacologiques par l'alimentation, par gavage ou injection intrapéritonéale en fonction des candidats médicaments. Traitements aigus (1 à 3 jours) ou chroniques (entre P25 et P90) en fonction de la pharmacocinétique des composés testés. Les animaux qui passent dans le test LMT seront anesthésiés et implantés avec une puce RFID. Prélèvements sanguins en fin de protocole pour estimer la biodisponibilité des composés ou de leurs métabolites et confirmer l'exposition.

Impact sur les animaux

Etant donné que les molécules administrées sont censées avoir un effet antiépileptique, nous attendons une amélioration du phénoptype des animaux (moins de crises, meilleures capacités d'apprentissage). Aucun effet indésirable particulier n'est attendu. Dans le pire des cas, les candidats médicaments n'auront pas d'efficacité. S'ils aggravent le phénotype (voir suivi des animaux ci-dessous), les traitements seront alors immédiatement interrompus. Dans ce modèle, il est également possible que les animaux présentent une crise spontannée conduisant à la mort de l'animal.

Devenir

Les animaux sont conservés pendant la durée de la procédure (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques, prélèvement sanguin) puis euthanasiés en fin de procédure afin de prélever le système nerveux central pour réaliser des analyses histologiques, transcriptomiques et protéomiques.

Remplacement

Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l'Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les médicaments candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de modèles iPS avant d'en préciser les caractères de d'efficacité et de toxicité éventuelle. L'étude des capacités d'apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l'animal vivant.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera optimisé et calculé de façon à ce que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats s'ils doivent être utilisés ultérieurement pour justifier un essai clinique pédiatrique.

Raffinement

L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées dans des cages de 530cm2 (5 souris maximum), avec 2 enrichissement différents (dôme et bandelettes de cartons), eau et nourriture ad libitum. La méthode d'administration des traitements la moins contraignante possible sera utilisée (dans les croquettes servant d'alimentation à chaque fois que cela est possible). Nous réalisons une anesthésie profonde des animaux avant l'implantation des puces RFID. Des points limite clairs sont définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu'ils atteindront les critères d'interruption.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les souris seront traitées au moment où apparaissent les crises d'épilepsie spontanées dans ce modèle et uniquement chez des animaux sevrés (entre P25 et P30). La suppression des crises d'épilepsie est le premier critère de jugement d'efficacité de la molécule testée. Le traitement pourra se poursuivre quotidiennement jusqu'à P90 où l'évaluation finale de leur comportement sera effectuée (tests d'apprentissage et mémorisation). Dans l'espèce humaine, la maladie est sporadique (sans histoire familiale) et n'est donc détectée chez un nourrisson qu'au moment où les premières crises apparaissent. Nous nous placerons donc dans ce même cas de figure avec les animaux modèles étudiés ici, traités au moment où leur pathologie se manifeste.