Troubles nerveux

Isolés dans des cages individuelles dès l'âge de 20 jours et jusqu'à la fin des procédures, 302 rongeurs diurnes de l'espèce Arvicanthis ansorgei passent deux électrorétinogrammes sous anesthésie, avant et après la période d'adolescence où l'équipe teste l'effet de la lumière bleue la nuit. Le protocole prévoit aussi sept tests comportementaux que le texte ne nomme pas, 15 à 20 jours d'obscurité constante, deux injections dans l'œil sous anesthésie, l'une pour tracer les voies de la rétine au cerveau, l'autre pour détruire les cellules à mélanopsine, et une chirurgie du cerveau de 30 à 45 minutes suivie d'une injection dans l'abdomen. Avec ces procédures, d'un niveau de souffrance modéré, l'équipe veut vérifier si la lumière bleue nocturne à l'adolescence favorise des troubles du rythme, de l'humeur et de la cognition à l'âge adulte, effets qu'elle dit attendre, "objet même de la question". Tous sont tués à la fin pour prélever leur rétine et leur cerveau.

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 heures de l’environnement synchronise l’horloge biologique du cerveau. La lumière exerce à la fois des effets positifs et négatifs en fonction de ses caractéristiques (moment d’exposition, durée, intensité spectre, etc…). La littérature montre qu’une exposition aberrante à la lumière, c’est-à-dire une exposition la nuit notamment dans la région bleue du spectre, altère les rythmes de l’organisme, la cognition et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'Homme. Un candidat clé pour la médiation des effets de la lumière sont les cellules à mélanopsine localisées dans la rétine. En effet, la lumière pénètre dans l’organisme au travers la rétine, et est captée par un type de cellules particulier : les cellules photoréceptrices à mélanopsine. Ces cellules permettent la conversion du signal lumineux en un signal biochimique, transmissible alors à d’autres cellules. Ici, le signal sera transmis jusqu’aux structures du cerveau qui régulent les rythmes biologiques, l’humeur et la cognition. Les adolescents présentent un risque particulier à l’exposition nocturne à la lumière bleue car l'apparition de la plupart des maladies mentales surviennent avant l'âge de 25 ans et ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue la nuit pendant l'adolescence va contribuer au développement de troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l'âge adulte. Afin de vérifier cette hypothèse, notre étude sera réalisée sur un modèle de rongeur diurne : Arvicanthis ansorgei. (La physiologie de l’homme étant diurne, l’utilisation de cette espèce de rongeur est plus pertinente que les rongeurs habituellement utilisés en laboratoire telle que les rats ou les souris, ayant une physiologie nocturne). Les objectifs sont de déterminer : 1) Impact de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur le système circadien, l'humeur et la cognition à l'aide de différents tests comportementaux validés. 2) Conséquences de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur la rétine, son fonctionnement et ses projections vers le cerveau. 3) Caractérisations des effets de la lumière bleue dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine, régulant le système circadien, l'humeur et la cognition. Cette analyse multidimensionnelle, allant de la cellule au comportement de l’animal, aura des résultats déterminants aux niveaux fondamental et clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l’adolescence sur le développement des troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Les données obtenues permettront d’élaborer de nouvelles stratégies pour limiter les effets délétères d’une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents.

Procédures

Afin de définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte 4 types d'interventions. La première est appelée l'électrorétinographie (ERG) et permet d'évaluer la fonction visuelle. Le test est identique à celui pratiqué chez l'homme, sauf que l'animal doit être endormi le temps des enregistrements. Les tests durent environ 45-60 minutes, et auront lieu à deux reprises : un ERG avant l'exposition à la lumière en guise de contrôle, et un second après l'exposition à la lumière, pour évaluer son impact. Ensuite, les animaux seront soumis à 7 tests comportementaux validés permettant d'étudier l'effet de la lumière sur leur système circadien, l'humeur et la cognition. La durée d'un test est variable et dépend du nombre d'animaux à faire passer. (Environ 5 minutes pour un animal) Afin d'étudier l'implication des cellules à mélanopsine de la rétine dans la médiation des effets induits par la lumière, les animaux seront soumis à différentes injections oculaires : une injection comportant une molécule appelée "traceur" permettant de marquer les voies de projections allant de la rétine jusqu'au cerveau, et une seconde comportant deux autres types de molécules, permettant d'une part leur fixation spécifique aux cellules à mélanospine (épargnant toutes les autres), et d'autre part, leur destruction. Ces deux injections oculaires se feront sous anesthésie générale et analgésie. Enfin, afin de vérifier l'implication d'une structure cible du cerveau impliquée dans la régulationd e l'humeur et de la cognition, nous allons réaliser une chirurgie sur animaux anesthésiés, dans laquelle nous injecterons des molécules pharmacologique pour moduler l'activité de cette structure d'intérêt. La durée totale de la procédure varie entre 30 et 45 minutes. Après récupération de l'animal, un activateur de ces molécules sera administré par injection dans la cavité abdominale, et permettra de d'inhiber le type de neurone dans la structure d'intérêt.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances listées ci-dessous : 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien, visuel, de l’humeur et de la cognition (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs, hébergés habituellement en groupe. 3) Afin d’évaluer les paramètres de leur système circadien (horloge biologique), les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en obscurité constante est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien, ce qui n‘induira aucune nuisance chez l’animal. 4) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur et la cognition, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 5) Les animaux seront soumis à des anesthésies, des injections dans l'oeil, ainsi qu'à des chirurgies cérébrales susceptibles d’induire une douleur modérée, un risque infectieux et/ou inflammatoire, une perte de poids, etc. 6) Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…)

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière durant l’adolescence sur le système circadien, visuel, la cognition et l’humeur. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) et longitudinales (ERG) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification et baton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur l'espèce de rongeur Arvicanthis ansorgei. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères d'une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents (P20), afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'homme. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (P20) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur le système circadien, l’humeur et la cognition au stade adulte (P40).

201 souris vont être utilisées, dont 153 tuées à l'issue et 48 transférées vers d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracérébrale sous anesthésie, précédée pour certaines d'une biopsie de la queue, avec des risques chirurgicaux, d'hypothermie et de douleur. Le projet évalue une nanomolécule contre la neuro-inflammation d'une leucodystrophie infantile. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier l'effet sur un "cerveau entier" symptomatique.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (isolation de la gaine nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une dégradation très rapide dans les 6 mois suivant les premiers symptômes et un décès des patients dans les deux ans au maximum. De nos jours la majorité des patients atteints de leucodystrophie metachromatique sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités en présymptomatique mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques. Une composante particulière de la MLD est la neuro-inflammation que développe les patients et qui est présente aussi dans le modèle murin de la pathologie. Dans ce contexte, nous proposons de mener ce projet de recherche qui a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la neuro-inflammation chez les patients MLD symptomatiques. L’évaluation de l’efficacité de la thérapie sera conduite In vivo dans un modèle de souris préclinique de MLD déjà connu. Le bien-être animal sera surveillé tout au long du projet avec mise en place de critères précis d’interruption. Au total le projet utilisera 201 souris au maximum.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de concept de l’efficacité d’une nouvelle nanomolécule développé par un collaborateur sur la neuroinflammation dans un modèle symptomatique de la leucodystrophie métachromatique pour pouvoir par la suite proposer une mise à disposition chez les patients atteints de leucodystrophie métachromatique.

Procédures

Une partie des souriceaux produits pour nos lots expérimentaux auront un prélèvement de 2mm de queue pour génotypage, l'acte est réalisé une fois, sur animal vigile, et dure environ 1minute par animal. Les animaux des lots expérimentaux recevront une injection intracérébrale (durée 40min) sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront euthanasiés 5 ou 15jours après l’injection, par une methode reglementaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : - une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage - un risque cardio-respiratoire et hypothermique durant l’anesthésie - un risque chirurgical (anesthésie, hypothermie, déshydratation, hématome, douleur, non récupération de la vigilance,) lors de la procédure d’injection intracérébrale par stéréotaxie (craniotomie ciblée avec ouverture minime au site d’injection, d’un unique trou limité à un diamètre d’une aiguille 26G). - un stress de l'animal lors de la contention. La mutation génétique du modèle n’entraîne que des modifications motrices tardivement dans des conditions de tests comportementaux particuliers, l’animal paraitra avoir un comportement normal dans l’enceinte de sa cage.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux injectés seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données de d’efficacité. Les animaux d’élevage seront maintenus au cours du projet jusqu’à l’âge de 12 mois maximum. Les animaux supplementaires générés pourront etre transférés pour d'autres projets pour respecter le principe de réduction.

Remplacement

À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro pour étudier l’effet thérapeutique de ce composé sur un cerveau entier symptomatique. Ce composé a déjà été validé dans plusieurs pathologies par nos collaborateurs. Choisir la souris permet de collecter des données d’intérêt en terme d’efficacité dans ce modèle particulierement car il reproduit la neuroinflammation développée chez les patients.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en maintenant des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 12 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 201 souris sera nécessaire pour l’évaluation de l’effet du composé dans ce projet. De façon général nos résultats seront analysés statistiquement avec un seuil de 5 pourcent.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, La procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et des soins adaptés. Les animaux seront hébergés par 3 à 5 souris par cage ventilée au maximum, si nécessaire en cas d’agressivité de mâles les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge) avec des maisonnettes rajoutées dans ce cas en plus de l’enrichissement classique. En terme de raffinement pour les croisements nous privilégions aussi les croisement entre homozygotes qui ne nécessitent pas de prélèvements pour le génotypage. Au moment de l'euthanasie, un sédatif sera administré à l'animal avant d'injecter le composé euthanasiant. La chirurgie réalisée au cours de ce projet sera faite sous anesthesie générale et locale, avec un protocole d’analgesie et un suivi quotidien post opératoire. . Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. La lignée que nous utilisons dans ce projet développe des modifications motrices après l’âge de 18 mois, ainsi afin d’éviter l’apparition de ces signes nous euthanasierons nos animaux avant l’âge de 16 mois.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la leucodystrophie métachromatique (MLD) et surtout pour évaluer l’effet thérapeutique d’une nanomolécule. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car il s’agit de la seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu de MLD déficient. Ce modèle génétiquement modifié est très proche de ce que l’on retrouve chez les patients. Les souris seront utilisées entre 12 et 15 mois pour les traitements à un stade symptomatique.

648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de maladie neurodégénérative, elles reçoivent un candidat médicament pendant plusieurs mois, par une pompe posée sous la peau ou un régime spécifique, avec des prélèvements sanguins mensuels et des tests comportementaux imposant isolement et jeûne. Le projet cherche à définir un schéma de traitement transposable à l'humain. Le porteur qualifie les atteintes de "nuisances légères" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les traits comportementaux de la maladie.

Objectifs

Notre projet vise à développer une thérapie contre une maladie neurodégénérative liée à un défaut génétique bien identifié, et responsable de nombreux dérèglements physiologiques et moléculaires dans les neurones. En utilisant un système in vitro innovant, nous avons identifié qu’une molécule était capable de restaurer un des défauts moléculaires dans les neurones d’un modèle souris de la maladie. Cette étude a permis de démontrer que le traitement améliore les défauts moteurs et cognitifs de l’animal après 1 mois de traitement. Cette première étude nous a également permis de caractériser précisément le mécanisme d’action cellulaire et moléculaire du candidat médicament. Le projet, divisé en 2 procédures, a pour objectif d’identifier un schéma de traitement transposable à l’homme confirmant l’intérêt thérapeutique du candidat médicament.

Bénéfices attendus

Grâce à un système in vitro innovant, nous avons mis en évidence qu’une molécule était capable de restaurer un des défauts moléculaires dans les neurones de souris et de patients atteints par notre pathologie d’intérêt. Nous avons démontré avec des premiers résultats preuve de concept l’intérêt thérapeutique de la molécule dans un modèle souris mimant notre pathologie d’intérêt. Nous cherchons maintenant à définir les bénéfices d’un traitement long terme chez des animaux à différents stades d’avancement de la maladie, reflétant la situation chez les patients et permettant de définir le meilleur schéma de traitement à envisager dans des études cliniques. En parallèle, nous travaillons à la caractérisation du mode et du mécanisme d’action moléculaire associé au candidat médicament. Ces études sont fondamentales pour la construction d’une stratégie clinique cohérente puisqu’elles nous permettront de décider s’il est pertinent ou non d’initier le traitement avant le développement des symptômes chez les patients, mais aussi de définir une durée de traitement et une posologie (dose, nombre prise par jour) adaptées.

Procédures

Une partie des animaux seront traités pendant un mois grâce à un dispositif vétérinaire assurant une délivrance continue de la molécule sans douleur ni atteinte du bien-être animal. L’installation de ce dispositif nécessitera une chirurgie sous-cutanée de 5 minutes maximum par animal. L’autre partie sera traitée grâce à un régime à façon spécialement formulé correspondant au régime habituel des animaux dans lequel la molécule est intégrée. Toutes les souris seront traitées avec le régime à façon sur une durée maximale de 10 mois. Pendant toute la durée du traitement, un prélèvement mensuel de sang (5min/animal) sera effectué après le début du régime afin de vérifier que le médicament est bien passé dans le sang (entre 3 et 10 prélèvements au total en fonction des groupes). Enfin, des tests comportementaux (tests de 30 min max hormis pour 1 test réalisé sur 48h) destinés à étudier l’effet du traitement sur les comportements anxio-depressif et locomoteurs des animaux seront effectués.

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé dans cette étude est un modèle largement utilisé dont le phénotype évoluera avec l’âge, occasionnant l’apparition de symptômes cognitifs et moteurs qui sont uniquement décelés à l’aide de tests comportementaux fins conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnement pas de perte d’autonomie, et pas de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons donc pas à observer d’altérations significatives de la qualité de vie, ni de mort prématurée chez ces animaux dû au phénotype. Nous pouvons identifier 3 nuisances légères : 1/ une potentielle douleur de nature interventionnelle : induction potentielle d'une légère inflammation due à la mise en place d'une mini-pompe. 2/ une légère douleur due aux prélèvements sanguins mensuels. 3/ une gêne potentiellement attendue sur les animaux lors de l’expérimentation, à savoir l’induction d’un stress léger lors de certains tests comportementaux impliquant soit un isolement prolongé de 48h afin d’analyser l’activité et le métabolisme de l’animal, soit une mise à jeun de 24h afin d’analyser l’anxiété de l’animal.

Devenir

​​La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études immunohistochimiques et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes du traitement.​

Remplacement

Nous avons précédemment démontré sur un modèle cellulaire in vitro que le candidat médicament permettait de restaurer les défauts de transports neuronaux, caractéristiques de la maladie neurodégénérative que nous étudions. Ces résultats nous ont permis de démontrer le potentiel thérapeutique de notre molécule. L’étape actuelle consiste donc à démontrer que ces restaurations du transport neuronal se traduisent en amélioration des symptômes de la maladie. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle in vitro ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.

Réduction

La procédure 2 sera réalisée uniquement si la procédure 1 est validée. Dans nos deux axes d’étude, nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post- mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Pour chacun des axes, dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement lors de l‘analyse des données afin d’augmenter la puissance des tests statistiques. Dans notre étude visant à caractériser l’efficacité du traitement à long terme à différents stades d’évolution de la maladie, nous ne prévoyons pas de traiter avec notre composé les animaux sains. En effet, nous avons déjà testé précédemment l‘effet de notre composé sur un nombre réduit d’animaux sains et nous n‘avons observé aucune toxicité, et aucune altération du comportement. Cela permet donc d‘éliminer plusieurs conditions expérimentales, dans un principe de réduction du nombre total d‘animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les cages seront équipées d’une litière stérile et d’un enrichissement permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard ou contenant le traitement, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec enrichissement et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Lors de la pose de mini-pompes sous-cutanées, la chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue pendant et après l’opération (administration d’analgésique et procédure sur tapis chauffant). Un supplément d'alimentation hypercalorique et hydratée fourni par l'animalerie sera ajouté lors du temps de récupération. Bien que la chirurgie soit peu invasive et très rapide (5 min), des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place. La formulation du régime à façon présente l’avantage majeur de ne pas avoir à manipuler les animaux pour les traiter limitant grandement le stress classiquement associé aux autres voies d’administration. L’état de santé des animaux sera surveillé pendant toute la durée de l’étude. Après la chirurgie, la surveillance sera renforcée dans les heures suivant le réveil et le poids des animaux sera évalué chaque jour durant une semaine pour s’assurer que les souris récupèrent bien de la chirurgie.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de notre pathologie d’intérêt. Pour cela, nous utilisons des souris issues de la transgénèse classique. Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la protéine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les maladies neurodégénératives se développent dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme. Le candidat médicament que nous développons est donc destiné à des adultes raison pour laquelle nous réalisons notre étude sur des animaux à l’âge adulte. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8 ou 12 mois car c’est à partir de 6 mois qu’ils commencent à développer des troubles moteurs et cognitifs observables en étude de comportement.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une section chirurgicale du nerf facial suivie de la pose d'un conduit de régénération, ce qui provoque une paralysie faciale durant au moins un mois, avant une seconde anesthésie sans réveil pour prélever le nerf. Le projet évalue la capacité d'un conduit issu du cordon ombilical à réparer le nerf facial. Le porteur indique un risque de douleur, d'inflammation et d'abcès, et présente le rat comme un "modèle privilégié" en raison de sa proximité anatomique avec l'humain.

Objectifs

Le nerf facial (NF) est responsable de la motricité de l’hémiface correspondante. Il joue un rôle majeur fonctionnel dont l’atteinte est responsable d’une paralysie faciale entrainant des séquelles précoces (fonctionnelles et esthétique) et tardives (contractures musculaires, syndromes sécrétoires…). A ce jour, plusieurs techniques chirurgicales de réhabilitation sont utilisées dont le but est la récupération motrice des muscles de la face via une réinnervation après remise en continuité nerveuse. On peut citer les sutures péri nerveuses directes ou l’autogreffe de nerf périphérique. L'objectif est d'évaluer la capacité d'un conduit issu du cordon ombilical à permettre une régénération nerveuse du nerf facial.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus sont une récupération de la fonction faciale la plus optimale, dont l’analyse est basée sur des critères objectifs, grâce à la stimulation de la régénération nerveuse par conduit de régénération nerveuse issu de vaisseaux ombilicaux. L’objectif est d’obtenir des résultats sur le rat avant d’élaborer un programme de recherche clinique sur l’Homme.

Procédures

La procédure prévoit une première intervention de 45 minutes consistant en une section/résection chirurgicale du nerf facial et interposition d'un conduit de régénération nerveuse entre les deux sections de nerfs par suture directe sous anesthésie générale. Les rats seront ensuite réveillés et surveillés quotidiennement à l'animalerie avec accès libre à l'eau et la nourriture pour une durée de 8 semaines pour les 20 premiers et une durée de 16 semaines pour les suivants (nombre calculé sur la base de la 1ère phase d'expérimentation). Une seconde anesthésie générale permettra la réalisation de tests evaluant la récupération de la fonction du nerf facial. Le nerf facial régénéré sera ensuite prélevé pour analyse. Les rats seront ensuite euthanasiés, au cours de la même anesthésie générale.

Impact sur les animaux

- Anesthésie générale d'une durée de 45min nécessaire pour l'exposition du nerf facial, sa section et sa réparation. - Isolement des animaux pendant 3h après l'intervention pendant le temps du réveil et afin d'éviter toute mutilation de la cicatrice avec un congénère avant d'être remis à 2 par cage. - Paralysie faciale du rameau buccal du nerf facial induite par la procédure d'une durée minimale d'un mois, et dont la rapidité de récupération sera évaluée. - En cas de trouble de la cicatrisation de l'incision de la joue, les conséquences pourront être une douleur et un état inflammatoire local (rougeur, oedème, suintement, chaleur local), et pouvant aller jusqu'à l'abcès local.

Devenir

A l'issu de la première intervention, les animaux seront maintenus en vie et hébergés dans l'animalerie avec libre accès à l'eau et la nourriture. Cette période est nécessaire afin d'évaluer la récupération clinique de la fonction faciale au cours du temps par un score de mouvement des vibrisses. A la fin de la procédure, une anesthésie générale sans réveil sera réalisée puisque le prélèvement du nerf est nécessaire aux analyses histologiques.

Remplacement

Le principe de remplacement a été utilisé pour mettre au point la technique opératoire de suture du conduit de régénération sur le nerf facial. Ces conduits ont été utilisés et manipulés au préalable pour vérifier leur capacité de résistance aux fils de suture via des expérimentations préliminaires sur fil de silicone. La composition optimale de l'hydrogel a pu être déterminé au préalable afin d'éviter des échecs au cours des procédures chirurgicales sur les animaux. Afin d'évaluer la régénération nerveuse d'un point de vue fonctionnel clinique (score de mouvement des vibrisses), electrophysiologiques (enregistrement de l'activité nerveuse) et histologique (sur prélèvement complet de nerf), le modèle animal est nécessaire. Le rat est choisi du fait de sa proximité anatomique avec l'Homme concernant le nerf facial.

Réduction

Le principe de réduction est utilisé via la réalisation d'un protocole Go-no Go. En effet, à l'issue du premier "round" de 20 animaux, si une condition est jugée d'emblée innefficace, elle ne sera pas réutilisée lors du second "round", et le nombre de sujets nécessaires aura pu être calculé afin d'utiliser le nombre de rat minimal. Par ailleurs, les deux rameaux buccaux du nerf facial seront utilisés afin de réduire le nombre d'animaux utilisé. Une section et suture directe "enveloppée" par le conduit sera réalisée du côté droit. Une résection de 4mm de nerf facial et suture du conduit aux deux extrémités libres du nerf sera réalisée du côté gauche.

Raffinement

L'expérimentation sera réalisée dans le respects des textes réglementaires relatifs à la protection et à l'utilisation des animaux de laboratoire. Le projet s'inscrit dans une démarche éthique suivant la règle des 3R en optimisant les conditions de vie, d'hébergement et de soins des animaux. En post-opératoire immédiat les animaux seront isolés 3h le temps du réveil et afin d'éviter toute mutilation de la plaie opératoire avec un congénère. Puis, pour leur bien-être, les animaux opérés seront remis à deux par cage. Les soins prodigués aux animaux ainsi que les conditions d'hébergement (température, dimension cage, luminosité, bruit, enrichissement...) seront conformes à l'arrêté du 1er fevrier 2013 fixant les conditions d'hébergement des animaux utilisés à des fins scientifiques. Une évaluation des points limites selon l'échelle validée et transmise au comité éthique sera effectuée à 3h, 12h, 24h, 36h et 48h puis de manière quotidienne durant toute la durée de l'expérimentation. Un score supérieur ou égal à 7 implique la mise à mort de l'animal afin d'éviter toute souffrance inutile. Pour chaque rat, une analgésie locale en sous cutanée sera réalisée durant l'intervention puis en post opératoire toutes les 4h durant 5 jours.

Choix des espèces

L’anatomie du nerf facial du rat est comparable à celle de l’Homme. Par ailleurs, le rat possède un nerf facial de taille relativement importante compte tenu de sa taille, facilitant les procédures chirurgicales. L'accessibilité de ce nerf, chirurgicalement, est aisée puisque la branche buccale est située sous le tissu cutané. La paralysie engendrée par la section de la branche buccale du nerf facial n'empêche pas le rat de se nourir et est facilement évaluable cliniquement par le mouvement des vibrisses. Ce modèle animal en fait un modèle privilégié des travaux de recherche de la régénération nerveuse.

1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau pour implanter des électrodes et injecter des virus, puis des enregistrements de leurs neurones pendant l'éveil et le sommeil, pour étudier un récepteur au glutamate. Le porteur indique que les souris implantées sont maintenues isolées, une autre souris pouvant endommager les électrodes, et signale une douleur post-opératoire de 48 heures et des risques liés à l'anesthésie. Il renvoie au long terme les retombées, des traitements des troubles anxieux liés au sommeil, et affirme qu'aucune alternative au rongeur ne préserve un réseau neuronal intact.

Objectifs

La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté à ce projet par rapport au projet principal déjà autorisé. Le projet a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux, à la fois dans un cadre physiologique et pathologique. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à l’activation et au dialogue de différentes structures du cerveau durant la veille et le sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l’activités des neurones chez des souris libres de leurs mouvements et endormies.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.

Procédures

Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones ; 2) injection de virus ; 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui permet les prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes est réalisés sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : Chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement (stress modéré) ; 2 transports entre les établissements utilisateurs (source de stress)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Elle sera pratiquée au sein de l'établissement d'origine des animaux. Il s'agit d'un projet déjà autorisé, réalisé sur deux établissements et n'ajoutant aucun animal supplémentaire.

Remplacement

Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.

Réduction

Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 1360 animaux : dont 1120 impliqués sur ce site.

Raffinement

Après leur réception, les animaux sont habitués à l’animalerie de l’Institut pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés seront maintenus en isolation: la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal et ne permettant pas de récolter des données. Le maintien en isolation permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Les animaux non-implantés servent de groupe contrôle et doivent donc être logés dans les mêmes conditions que les animaux implantés. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’isolement les animaux sont maintenus dans des cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Afin de garantir la taille minimale réglementaire au sein d'un compartiment une fois la cloison installée, les cages utilisées sont des cages prévues pour des rats. Pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes et facilitera l’accès à la nourriture. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une construction de lego sera mise en-dessous du biberon d’eau pour réduire la hauteur et faciliter l’accès à l’eau. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur (utilisation de l’échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.

4 800 animaux, 2 400 souris et 2 400 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés par voie orale ou par injection, puis sont soumis à un test d'évitement passif où ils subissent jusqu'à cinq stimulus aversifs, un stimulus douloureux servant à créer une mémoire de peur. Le porteur teste des molécules ciblant le système nerveux central pour la mémoire et l'impulsivité, et précise que les animaux ne seront pas réutilisés pour ne pas biaiser les résultats. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit pour un comportement "aussi complexe et intégré que la mémoire".

Objectifs

La mémoire émotionnelle correspond à la mémoire d'un évènement ayant suscité une émotion. De nombreuses pathologies sont associées à une altération de cette mémoire émotionnelle (schizophrénie, alzheimer, syndrome de stress post traumatique) et il est nécessaire de passer par des modèles animaux afin d'évaluer de nouvelles pistes thérapeutiques. Chez le rongeur c'est la mémoire de peur qui est classiquement évaluée comme modèle de mémoire émotionnelle humaine, c'est une émotion très conservée entre les espèces car indispensable à la survie. Cette mémoire émotionnelle s'acquière très facilement et souvent en un seul essai chez le rongeur. Une des activités de notre centre de recherche est de développer de nouveaux composés ayant pour cible le système nerveux central et des pathologies associées. C'est pourquoi l'objectif de ce projet va être d'évaluer les effets de nouvelles molécules et de molécules de référence sur des animaux dans un dispositif d'évitement passif qui permet de tester la mémoire basée sur l'association entre un environnement et un stimulus aversif. Ce dispositif va permettre également d'évaluer l'impulsivité excessive que peuvent présenter certains modèles animaux. Ainsi le second objectif de ce projet sera de mesurer les effets de nouveaux composés ciblant le système nerveux central sur une impulsivité exacerbée que l'on retrouve dans des pathologies du type trouble de l'hyperactivité et déficit de l'attention.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'identifier et de caractériser de nouvelles molécules afin d'apporter les données précliniques nécessaires avant de passer au stade de développement clinique. A moyen - long terme ces données scientifiques permettront de développer de nouveaux candidats médicaments permettant de traiter certaines pathologies à l'origine de déficits de mémoire (schizophrénie par exemple) ou de troubles de l'impulsivité (syndrome d'hyperactivité et de déficit de l'attention par exemple).

Procédures

Les animaux vont recevoir une administration aigüe par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire de molécules à tester. Lors des tests de comportement les animaux pourront être exposés au plus à 5 stimulus aversifs d'une durée maximale de 3 secondes.

Impact sur les animaux

Deux effets indésirables principaux sont attendus sur les animaux : -le stress lié à la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur sur le site de l'injection intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée. -la douleur passagère liée aux stimulus aversifs de courte durée (1-3s) et répétés maximum 5 fois.

Devenir

Les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d'autres projets et seront mis à mort à l'issue des 2 procédures. En effet l'objectif du projet étant de travailler sur les mécanisme de mémoire et/ou d'impulsivité, toute réutilisation des animaux dans d'autres études comportementales pourrait être biaisée par les tests précédemment réalisés.

Remplacement

Ce projet ayant pour but de tester l'action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire émotionnelle à court ou long terme ou sur l'impulsivité, il est nécessaire de passer par des modèles animaux. En effet, l'évaluation d'un comportement aussi complexe et intégré que la mémoire mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée que sur un animal vigile. Il n'existe pas à ce jour de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

En raison de la variabilité liée aux études comportementales, un effectif de 12 animaux est nécessaire afin d'obtenir un traitement statistique des résultats satisfaisant. Ces analyses statistiques, réalisées à l'aide d'un logiciel spécifique (Graphpad Prism) nous permettront de nous assurer de la réalité et de la reproductibilité d'éventuelles différences observées entre plusieurs groupe ayant reçu différentes molécules à tester. Les tests de plusieurs molécules ou plusieurs doses d'une même molécule pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un seul groupe recevant une molécule de référence.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie centrale (température et hygrométrie contrôlées) groupés par 3 ou 4 par cage. Une période de 5 jours d'acclimatation après livraison est prévue avant toute expérimentation. Tout au long des études les animaux sont hébergés dans des cages adaptées à l'espèce avec la présence d'enrichissement de milieu (tunnel, igloo, bandes de papier pour nidification, briques de bois à ronger....) et avec accès à l'eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), une fiche de contrôle du bien-être animal comprenant 30 critères est renseignée chaque semaine. Si plus de trois critères ne sont pas satisfaits sans possibilité d'action correctrice, alors l'animal est exclu du protocole et mis à mort si nécessaire. Les membres de la structure bien-être animal effectuent une observation mensuelle de tous les animaux.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont largement caractérisés d'un point de vue comportemental. Ce sont deux espèces très classiquement utilisés et décrites dans la littérature concernant les tests d'évaluation de la mémoire émotionnelle, les protocoles sont très bien établis. Le rat et la souris ont un système nerveux central suffisamment évolué pour envisager une extrapolation à l'homme de certains résultats. En effet, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire chez l'humain. De plus, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d'avoir des effectifs suffisants permettant d'obtenir des résultats statistique robustes : conditions d'hébergements en animalerie raisonnables, quantités limités de nouveaux composés à synthétiser par la chimie. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte ou jeune adulte chez la souris comme chez le rat. En effet dans la littérature, les tests de mémoire sont classiquement décrits sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitives et d'attention fonctionnelles. Eventuellement, des animaux plus âgés pourront être utilisés pour tester l'effet de nouveaux composés sur le vieillissement et le déclin de la mémoire associé.

3 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracérébrale de virus, de toxine ou de fractions issues de patients, jusqu'à deux chirurgies, puis un traitement administré une à deux fois par jour pendant un maximum de trente semaines, avec prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien. Le porteur décrit une activité préclinique de service destinée à tester des composés, et renvoie le bénéfice à une "meilleure compréhension" et à l'identification de traitements. Il affirme que la souris a un système nerveux "identique" à celui de l'homme et conclut que le recours à l'animal vivant est "nécessaire".

Objectifs

Les maladies neurologiques se définissent par un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique. Elles revêtent plusieurs formes et touchent un nombre important de personne dans le monde. L’origine de ces maladies est encore mal comprise et les traitements actuels visant à soulager les symptômes ne sont pas optimaux.  Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel.  Pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation de différents modèles murins de maladies neurologiques qui permettent d’en reproduire les symptômes afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements et de comprendre leurs mécanismes d’action via l'observation de l'activité neuronale en temps réel. Ces modèles sont générés soit par injection intracérébrale de virus, de toxine ou de fraction protéique purifiée issus de patients soit par un traitement systémique via une neurotoxine. Elles peuvent concerner des souris normales et des souris transgéniques. Aucune de ces lignées transgéniques ne montre de phénotype dommageable. Les approches mises en œuvre sont une chirurgie intracérébrale et l’administration chronique d’un traitement. Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets d’un traitement chronique à différentes doses sur la composante comportementale et cellulaire. La mesure des effets des traitements se fait par des analyses biochimiques et cellulaires sur les cerveaux et les tissus biologiques prélevés après la mise à mort des animaux. Des prélèvements de sang pourront aussi être réalisés tout au long du traitement.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Les expérimentations sont essentiellement menées sur l’animal. La génération de modèle expérimentaux de maladie neurologique chez la souris est donc nécessaire afin de tester différents composés thérapeutiques. Le bénéfice attendu est l'identification de nouveaux outils thérapeutiques.

Procédures

Les animaux subiront au maximum deux procédures chirurgicales d’une durée maximale d'une heure, ces chirurgies seront espacées de minimum 2 semaines. L'administration de traitement (30 secondes) pourra être réalisée une à deux fois par jour pour une durée de 1 jour et au maximum de 30 semaines. Prélèvements sanguins à la queue (1 minute) sur l'animal vigile (1 prélèvement/semaine ou par mois selon la durée de l'étude). Prélèvements de liquide dans lequel baignent le cerveau et la moelle épinière (1 prélèvement à la fin de l'étude, durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection de virus entraine peu de nuisances chez l’animal. L’injection de toxines entraine un suivi spécifique. Les injections peuvent entrainer une perte de poids et une diminution de la mobilité. L’implantation nécessite un suivi spécifique, la pose de ciment afin de maintenir l’implant peut être douloureux les premiers jours. Les maladies neurologiques peuvent induire un déclin cognitif et des altérations motrices modérées. Aucune des lignées transgéniques utilisées ne montre de phénotype dommageable. Si l’administration de traitement entraine des effets indésirables, le traitement sera interrompu et l’animal surveillé.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de souris pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme. -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif à terme est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire pour reproduire les symptômes de la maladie en vue de tester des nouveaux traitements. D’autre part, l’étude du cerveau sur animal en mouvement, nécessite le recours à l’animal vivant.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Afin de réduire le nombre d’animaux, une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum de 14 animaux par groupe soit 70 souris par étude incluant les groupes expérimentaux (4 doses différentes de composé) et leur contrôle. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le LCR (liquide céphalorachidien), le sang et les organes. L’utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R. En effet, tous les animaux transgéniques produits seront utilisés. L’analyse de l’activité neuronale in vivo nous permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés, chaque animal étant son propre contrôle. Des analyses statistiques seront effectuées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (3 à 5 par cage). Mesures précoces : le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée via une pesée hebdomadaire. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « à surveiller ». Cette fiche est close quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, des traitements vétérinaires si nécessaire. Raffinement des procédures : les chirurgies sont réalisées sous anesthésie avec administration d’analgésique et d’anesthésique local permettant de réduire la douleur et l’angoisse des animaux. Un suivi post opératoire spécifique de 3 à 5 jours (dépendant de la gravité de la procédure) est mis en place avec une pesée quotidienne et l’observation de critères de bien être. Chaque critère est scoré. Des mesures spécifiques peuvent être prises : si l’animal manque de tonus, une injection intrapéritonéale de solution saline sera réalisée. En cas de plaies celles-ci seront nettoyées et désinfectées. Si malgré ces soins, les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, une décision de mise à mort est prise par l’expérimentateur. Si l’animal a bien récupéré, un suivi visuel journalier et une pesée hebdomadaire seront effectués. Administration du traitement : les administrations sont réalisées quotidiennement et les animaux sont habitués à la contention. Pour le traitement induisant des mouvements involontaires anormaux, nous utiliserons une litière en cellulose peu irritante et plus douce afin d’éviter d’éventuels problèmes d’irritations aux pattes et à la queue. Si le traitement provoque des effets indésirables, le traitement peut être interrompu et l’animal surveillé.  

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est identique à celui de l’homme. Ces modèles ont un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus, l’injection de toxine ou de virus dans le cerveau est bien établie dans notre équipe et les travaux sur la souris sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. L’utilisation de la souris permet également de générer des modèles transgéniques pertinents et bien caractérisés permettant de tester des candidats médicaments pour différentes pathologies. Les maladies neurologiques apparaissent préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 6 semaines jusqu'à l'âge adulte. En effet, à cet âge on peut considérer que le système nerveux central a atteint sa pleine maturité.