Troubles nerveux
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
18 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie du bout de la queue ou de l'oreille sous simple contention, geste que le porteur décrit comme une douleur légère avec un stress lié à l'immobilisation. Les souris sont gardées vivantes après le prélèvement, leur devenir dépendant ensuite du génotypage, sélection pour d'autres projets, maintien des colonies, ou mise à mort pour prélèvement de tissus ou faute d'usage. Il présente la biopsie comme la méthode la plus performante pour identifier les lignées modifiées et entretenir ces élevages.
Objectifs
Le laboratoire participe à plusieurs projets qui nécessitent le développement et l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés. Ce projet a pour objectif d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Chaque animal, identifié par tatouage aux doigts ou par injection de nanopuces, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie de bout de la queue ou d’oreille. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour différents projets de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) menés au laboratoire ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; - sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt.
Procédures
Une biopsie de la queue ou un bout d’oreille (durée : quelques secondes) est réalisée sur animal vigile puis déposé dans un microtube. Dans la très grande majorité des cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal. En cas de problème lié à l’analyse génétique de la biopsie, un deuxième prélèvement pourra être envisagé.
Impact sur les animaux
Les biopsies de queue ou d’oreille sont des gestes qui provoquent une douleur légère. L’animal est maintenu en contention pendant la biopsie ce qui représente une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet de recherche (inclus dans d'autres demandes d’autorisation de projet); b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont euthanasiés pour des prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont euthanasiés si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie de queue ou d’oreille pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. Les personnels de l’animalerie établissent, en concertation avec le responsable de la lignée, les plans d’élevage en amont, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux génotypés.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place.
Choix des espèces
Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines car les outils pour générer ces modèles sont bien connus et très efficaces. Le temps de génération d’une lignée est court (3 mois) et son élevage en laboratoire simple. Les biopsies sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 8 jours. L'essentiel des lignées sont génotypées à cet âge pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
3 613 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère, la plupart tuées à l'issue. Le modèle exprime une protéine humaine qui s'accumule dans le système nerveux et provoque une paralysie progressive, dont le porteur bloque l'apparition par antibiotique pendant l'élevage puis la laisse se développer pour tester des candidats médicaments. Les souris malades présentent perte de poids, atrophie musculaire et déficits moteurs, suivies par un score clinique jusqu'à leur mise à mort, les reproducteurs étant conservés pour la lignée. Le porteur qualifie le "besoin médical" d'"immense" et juge le modèle animal "indispensable et non substituable".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative neuromusculaire à évolution rapide qui conduit au décès des patients dans les 3 à 5 ans qui suivent le diagnostic. Elle se caractérise par une disparition progressive et irréversible des neurones moteurs (les cellules qui commandent les muscles), provoquant une perte progressive des capacités vitales par paralysie des muscles: locomotion, alimentation, respiration,… Bien que les recherches, réalisées ces dernières années, aient permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes mis en jeu au cours de l’évolution de la maladie, les origines de la maladie restent inconnues dans la plupart des cas. Il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Seuls deux composés (qui ralentissent modestement la progression de la maladie dans certains cas) ont été approuvés. Le besoin médical est donc immense et totalement insatisfait. Le modèle murin choisi dans ce projet exprime très fortement une protéine humaine qui va s’accumuler dans le système nerveux central et la moelle épinière. Cette accumulation va entraîner la mort des cellules nerveuses. Ce modèle reproduit la quasi-totalité des signes cliniques de la SLA à travers ses caractéristiques moléculaires - L’accumulation toxique de protéines dans les cellules nerveuses du cerveau et de la moelle épinière, est très représentatif des formes cliniques de SLA (plus de 90% des cas de SLA). - Les signes cliniques sont engendrés par la mort progressive des cellules nerveuses, induite par l’accumulation de protéine, et qui conduit un déficit moteur puis une paralysie musculaire.
Bénéfices attendus
A ce jour il n’existe aucun traitement curatif de la SLA. En parallèle de la prise en charge multidisciplinaire des patients pour diminuer et soulager les symptômes, il existe que deux molécules approuvées qui permettent, au mieux, de ralentir modestement la progression de la maladie. La SLA est une maladie multifactorielle et complexe, dont la plupart des mécanismes sont encore très mal connues. Ce projet permettra : - de mieux comprendre la physiopathologie de la SLA - de développer de nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de la SLA. - La mise en perspective des signes cliniques et des analyses moléculaires effectuées sur les prélèvements de sang permettra de comprendre les mécanismes complexes conduisant à la maladie.
Procédures
Durant l’élevage, tous les souriceaux seront identifiés avec un microtatouage au niveau des doigts puis analysés par génotypage via un prélèvement d’un petit bout de queue. Durant cette phase, aucun animal n’aura de signe clinique, ils seront tous en parfaite santé. Aucun autre prélèvement ne sera réalisé sur ces animaux. Pour l’évaluation des médicaments, les animaux présenteront les signes de la SLA (déficit moteur progressif) et par conséquent seront suivis de manière étroite et rigoureuse afin d’évaluer de manière objective mais non invasive l’évolution de la maladie : - Observation quotidienne des signes cliniques - Evaluation des capacités motrices hebdomadaires (force et endurance musculaire) Les candidats médicaments seront administrés soit par voie oral soit par voie intraveineuse en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques qui seront déterminées. Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. A l’issu de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Durant l’élevage, aucun animal ne développe de signes cliniques dommageables. En effet, le développement des signes cliniques est bloqué par un traitement antibiotique. Tous les animaux seront donc en parfaite santé. Durant la phase de test, les animaux présentent la quasi-totalité des signes cliniques de la SLA après l’arrêt de l’antibiotique : - Perte de poids progressive des animaux - Mort progressive des cellules nerveuses et perte des liaisons nerveuses avec les muscles qui se traduit par des déficiences motrices (tremblements, perte de la coordination des mouvements, pattes postérieurs qui se recroquevillent), une perte de poids et une atrophie musculaire. La toxicité et la tolérance des candidats médicaments seront préalablement déterminées dans des études de tolérance et de pharmacologie. Dans ce projet, aucun effet indésirable n’est donc attendu. Lorsque le produit est administré par voie oral, aucune nuisance n’est attendue. Lorsque le produit est administré par voie intraveineuse, la nuisance est uniquement liée à la piqûre. Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine à l’aide de capillaire, la nuisance est uniquement liée à la piqûre. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. La nuisance est uniquement liée à la piqûre lors d’injection de l’anesthésie par voie intrapéritonéale.
Devenir
A l'issue de la phase d’élevage : - Certains animaux seront utilisés comme reproducteurs pour maintenir la lignée. Les animaux surnuméraires seront euthanasiés. - Certains animaux ne pouvant pas développer la maladie à cause de leur patrimoine génétique seront utilisé dans le groupe contrôle pour les tests d’efficacité (195 animaux). Les animaux surnuméraires seront euthanasiés. - Les animaux développant les signes cliniques de la SLA seront utilisés pour les tests d’efficacité. A l'issue des tests d’efficacité, tous les animaux seront euthanasiés. Ils ne peuvent pas être réutilisés à cause de leur phénotype et l’issue fatale de la maladie.
Remplacement
Les candidats médicaments testés feront l’objet d’une sélection minutieuse avant leur utilisation. Les substances sont préalablement testées, caractérisées et auront fait la preuve de leur efficacité in vitro, avant d’être utilisé sur des animaux. Cependant, aucune étude vitro ou ex-vivo ne peut permettre de faire un lien entre les mutations génétiques, les mécanismes moléculaires et les signes cliniques. La SLA est une maladie multifactorielle complexe. Elle ne peut donc en aucun cas être réduite à une simple mutation ou à un simple mécanisme, le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour : •Etudier, analyser les paramètres physiologiques tels que la réponse immunitaire, le passage de la barrière hémato-encéphalique, l’évolution des biomarqueurs au cours de la maladie ou la correspondance avec les signes cliniques observés. •Valider l’effet thérapeutique sur le phénotype et en confirmer le mécanisme d’action chez l’animal vivant. •Mettre en perspective les effets moléculaires avec les signes cliniques observés et ainsi, comprendre les mécanismes conduisant à la maladie.
Réduction
La phase d’élevage va permettre la génération de souris qui développeront la SLA nécessaire à l’évaluation de l’efficacité des candidats médicaments. Pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux utilisé sera déterminé mathématiquement pour n’utiliser que le strict minimum d’animaux nécessaire mais néanmoins suffisant pour des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. D’après les calculs, le nombre d’animaux à utiliser est de 13 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux est inférieur aux effectifs communément utilisés (± 15 animaux par groupe) dans le cadre des recherches académiques ou dans les ou dans les laboratoires de recherche privés. Pour l’élevage, nous utiliserons la méthode proposée par les éleveurs agréés dans le but de déterminer de manière précise le nombre minimal nécessaire et suffisant de souris reproductrices à la conduite du projet et à la préservation de la lignée.
Raffinement
Pour l’élevage, les animaux seront hébergés en trio de reproducteurs. Dans cette procédure, aucun animal ne développe aucun signe dommageable car l’expression des signes cliniques est bloquée par un traitement antibiotique administré dans l’eau de boisson. Durant la phase de test d’efficacité, les animaux seront observés quotidiennement. Les observations cliniques seront évaluées selon un scoring strict et validé par un grand nombre de laboratoire. Afin de renforcer le suivi des signes cliniques, nous allons donc utiliser plusieurs méthodes de mesures indépendantes : - Score basé sur l’observation clinique - Poids qui reflète l’évolution de la maladie - Evaluation de la force musculaire qui permettra de détecter les signes de faiblesse musculaire et de paralysie - Evaluation de la coordination des membres et des performances motrices Ces mesures permettent de garantir une évaluation précise de l’évolution de la maladie. Le croisement des informations facilitera les analyses et d’étayer les conclusions par plusieurs variables. Cette analyse associée à la parfaite connaissance du modèle, permettra de prévenir de manière plus précoce l’apparition du phénotype dommageable. De plus, une attention particulière sera prêtée à l’environnement local, étant donné que les animaux ayant contracté la SLA présenteront des déficits moteurs significatifs. Les cages comporteront un sol en dur, une litière de sciure, des refuges et des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger. Des croquettes mouillées disposées sur le fond de la cage ainsi qu’une supplémentation en nourriture enrichie humide (complément alimentaire gélifié) sera apportée aux animaux pour faciliter la nutrition et l’hydratation.
Choix des espèces
Pour les maladies neurodégénératives, les signes cliniques dépendent essentiellement de la localisation des lésions (cerveau, moelle, …) et l’efficacité d’un médicament dépend de sa capacité à atteindre les lésions. Le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour évaluer l’efficacité d’un médicament notamment : -la capacité à accéder à la zone d’intérêt (comme franchir la barrière hémato-encéphalique pour accéder au cerveau) - son action au niveau moléculaire et son impact sur les signes cliniques observés. Le modèle animal de souris a été choisi à cause de ses similitudes avec la pathologie humaine : - Au niveau moléculaire : l’accumulation « toxique » d’une protéine humaine dans les neurones du cerveau et de la moelle qui représente, en clinique, 90% des cas de SLA - Signes cliniques: mort des cellules nerveuses de la moelle épinière et perte de la connexion musculaire qui a pour conséquence un déficit moteur progressif menant à la paralysie totale des muscles. Pour l’élevage, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’être en capacité de se reproduire. Pour les tests d’efficacité, nous cherchons à nous rapprocher au plus près du contexte physiopathologique de la maladie qui touche des adultes afin de pouvoir transposer nos résultats à l’Homme. Les animaux des 2 sexes seront utilisés. En effet, d’après les études ayant permis le développement du modèle, les mâles et les femelles développent des signes cliniques comparables, ils peuvent donc tout deux être inclus dans des analyses groupées.
Etude de l’excitabilité cérébrale par stimulation intracrânienne chez des souris libres de mouvement
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie d'implantation d'électrodes sous anesthésie, puis des stimulations cérébrales répétées sur animal éveillé et jusqu'à dix injections de molécules sur cinq à dix semaines, avec des prélèvements sanguins. L'objectif déclaré est de mettre au point des marqueurs de l'activité électrique du cerveau transposables entre la souris et l'humain pour l'optimisation de médicaments. Le porteur justifie le recours à l'animal par des "mécanismes physiopathologiques complexes" que des modèles cellulaires ou informatiques ne représenteraient pas.
Objectifs
L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des composés sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Cela signifie d’appréhender cette problématique par une approche consistant à utiliser les données existantes de la recherche clinique pour construire de nouvelles solutions de recherche préclinique et se baser sur des marqueurs biologiques des pathologies et des tests médicaux utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères montrant le fort potentiel translationnel de cette méthode et donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Dans ce projet, nous étudierons les activités électriques cérébrales spontanées et évoquées chez des animaux contrôles.
Bénéfices attendus
L’optimisation de nouveaux médicaments nécessite de développer des marqueurs et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ces marqueurs doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des souris. Nous cherchons à mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques sur ces animaux. Ces marqueurs biologiques applicables chez l’humain et le rongeur nous permettrons également de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Procédures
L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront tous soumis à des stimulations cérébrales répétées de faible intensité qui seront réalisées sur l’animal éveillé une à deux fois par semaine. Chaque session de stimulation durera entre 3 et 20 minutes au maximum. Au préalable de chacune de ces stimulations, une molécule pharmacologique pourra être administrée à l'ensemble des animaux. Des prélèvements sanguins sur animal éveillé pourront également être réalisés, tous les animaux du projet sont susceptibles d'étre soumis à ces prélèvements. Pour ces tests pharmacologiques, un maximum de 10 injections sur une période de 5 à 10 semaines par plan d’étude sera réalisé.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagères pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Lors de la stimulation cérébrale, malgré l’intensité faible utilisée, une réaction comportementale (immobilité, sursaut, clignement des yeux) pourra être induite dans de rares cas, notamment si l’implantation des électrodes est défectueuse. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées.
Devenir
Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électroencéphalographiques qui ne sont pas amovibles, les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires.
Remplacement
Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle adresse des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel).
Réduction
Dans le cas des études de test pharmacologique, chaque animal est son propre contrôle et sera utilisé pour tester différents candidats médicaments, permettant de limiter le nombre d’animaux nécessaire par groupe. Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre d’animaux a ainsi été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées.
Raffinement
Les souris qui entrent dans cette procédure ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Une injection d'analgésique sera faite avant la neurochirurgie et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages d’hébergement avec enrichissement (coton, maison en carton) pour limiter tout stress dû à l’environnement quotidien.
Choix des espèces
Dans ce projet nous utiliserons des souris. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques spontanées et évoquées. Ces similarités peuvent être utilisées pour le développement de nouveaux médicaments. La sélection de la souris est aussi basée sur des études précédemment réalisées. Les animaux sont âgés de minimum 9 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, les circuits électriques du cerveau sont matures.
TRAITEMENT DE LA DOULEUR REFRACTAIRE PAR STIMULATION ELECTRIQUE DU CINGULUM ANTERIEUR : étude des effets cliniques et des mécanismes d’action dans un modèle murin de douleur chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes intracérébrales et, pour la moitié, une ligature du nerf sciatique induisant une douleur neuropathique que le porteur indique ne pas soulager parce qu'elle est "l'objet de l'étude". Elles passent ensuite le test de la douleur Von Frey à six reprises et un test d'anxiété avec privation de nourriture pendant vingt-quatre heures. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de la stimulation cérébrale profonde utilisée chez des patients souffrant de douleurs chroniques rebelles.
Objectifs
Objectifs : Explorer chez la souris, dans un modèle de douleur chronique, l’action de la stimulation cérébrale profonde sur le plan électrophysiologique (activité́ électrique cérébrale), immunohistochimique (expression et localisation de molécules d'intérêts) et comportemental (tests de perception de la douleur et d'anxiété). Rationnel de l’étude : La douleur neuropathique chronique concerne 7% de la population française et la moitié de ces patients ne sont ni soulagés par les médicaments ni par les thérapies non médicamenteuses. Récemment, des patients souffrant de douleurs chroniques réfractaires ont été implantés par électrodes intracérébrales (technique chirurgicale qui existe de plus de 30 ans qui vise à implanter des électrodes dans des régions profondes du cerveau pour moduler électriquement l’activité́ de circuits neuronaux) dans le cortex cingulaire antérieur (structure cérébrale impliquée dans la notion de perception de douleur notamment son caractère émotionnel ) permettant une bonne amélioration des douleurs mais également aussi de la qualité́ de vie. Cette technique semble donc une thérapie prometteuse pour traiter ces douleurs rebelles invalidantes. Les mécanismes d’action de la stimulation du cortex cingulaire antérieur sont encore non étudiés et mal compris. Le but de cette étude est donc de comprendre ces mécanismes et pour cela nous aurons recours à un modèle murin de douleur chronique afin d’évaluer les effets par analyses histologiques, comportementales et électrophysiologiques. La compréhension de ces mécanismes permettrait également d’optimiser cette thérapie.
Bénéfices attendus
L’intérêt de cette étude est double : La première étant de comprendre les mécanismes de la stimulation cérébrale profonde (analyse des modifications biochimiques et électrophysiologiques). La deuxième étant qu’à partir des résultats obtenus par ces analyses, les structures cérébrales impliquées et modulées seront mieux identifiées. Ces modifications seront mises en corrélations avec les données obtenues en imagerie fonctionnelle chez l’humain, permettant de déterminer plus précisément une cible, des paramètres de stimulation, et la sélection des patients.
Procédures
Tous les animaux auront une chirurgie sous anesthésie générale, avec implantation d’électrodes de stimulation cérébrale profonde et d’électrodes d’enregistrement, puis une chirurgie au niveau de la patte droite, dont la moitié auront une ligature au niveau du nerf sciatique. La durée globale estimée est de 1h30. L’ensemble des souris subiront 6 fois le test de douleur (Von Frey) la durée sera d'une vingtaine de minutes environ avec acclimatation de 90 minutes. L’ensemble des souris suivront le test d’alimentation supprimée par la nouveauté́, il s’agit d’un test de comportement (c'est le seul test qui permet de vérifier l'état d'anxiété́ avec un rôle minimal de la locomotion, et donc d'éviter un biais dû à la douleur neuropathique induite dans la patte ligaturée). Les souris seront privées de nourriture 24 heures avant le test pour obtenir une motivation suffisante pendant le test, elles auront un accès libre à l'eau. Ce test sera réalisé́ 3 fois à 10, 12 et 14 semaines. Les enregistrements électrophysiologiques auront également lieux à 10, 12 et 14 semaines, avec une durée de 30 minutes à chaque session sur animal vigile et concerne toutes les souris.
Impact sur les animaux
Les effets possibles et directs de la chirurgie sont une difficulté dans les déplacements des animaux, une douleur, une perte de poids, stress et comportement anormal mais devrait rapidement disparaitre. Ensuite, dans les 10-15 jours suivant la ligature il y aura le développement de la douleur neuropathique, plus particulièrement une allodynie mécanique mais qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Les 2 tests comportementaux pourraient induire un stress et un comportement anormal pendant la période du test (notamment les 24h sans nourriture mais avec boisson) et devrait disparaitre après le test. La connexion pour faire les enregistrements électrophysiologiques pourrait induire un stress passager pendant la durée des enregistrements, mais notre expérience montre que les animaux s'habituent rapidement à l'appareillage
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En l’absence de système pouvant reproduire in vitro les interactions entre les les régions cérébrales et les effets biochimiques et électrophysiologiques propre à chacune de ces régions, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous pratiquons une gestion éthique de l’élevage qui nous permettra de ne pas générer d’animaux non utilisés. Nous utiliserons indifféremment les males et les femelles qui seront répartis dans les groupes expérimentaux. Chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire aux études statistiques. Les techniques chirurgicales et d’investigations sont bien maitrisées par les évaluateurs afin de ne pas avoir de pertes issues d’erreurs liées au manque d’expérience.
Raffinement
Afin de limiter les stress lors des tests comportementaux il sera effectué une habituation aux tests. Les surveillances régulières des animaux : tous les jours pendant 4 jours après la chirurgie puis 5 fois par semaine, nous permettront d’identifier les souris souffrantes, nous sacrifierons les souris qui atteindront le point limite. Les souris opérées auront une surveillance post opératoire avec soulagement antalgique post opératoire immédiat (buprenorphine 0,1 mg/kg ip), puis carprofen 40 mg/L pendant 3 jours dans l'eau de boisson. Une grille d’évaluation a été établie avec des points limites et des actions précises.
Choix des espèces
La souris est très utilisée dans les études fondamentales et comportementales. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante, son faible coût d’élevage et nous avons des locaux d’hébergements et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. La similitude de leur patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’homme. Nous utiliserons des souris adultes C57Bl/6J des 2 sexes qui sont des souris couramment utilisées pour évaluer des procédures chirurgicales et de douleurs. Le modèle de souris douloureux chronique par ligature du nerf sciatique de manière unilatérale est un modèle validé et très fréquementt utilisé pour évaluer l’efficacité d’un traitement antalgique. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes C57Bl/6J, d’âge minimum de 8 semaines (poids de la souris >20 grammes). Le choix de souris adultes est de pouvoir au maximum être en accord avec la réalité clinique (age adulte et maturation du système nerveux central) de manière que les souris puissent supporter les anesthésies et les chirurgies.
Prévenir la pathologie de type Alzheimer chez la souris par l’activité d’une protéine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie du cerveau de 20 minutes avec pose d'électrodes pendant une heure, quatre jours d'électroencéphalogramme enregistré jour et nuit, et des tests de comportement chaque mois pendant une semaine au plus : 918 souris, issues notamment de deux lignées présentées comme reproduisant la maladie d'Alzheimer, vont passer par ces étapes. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à l'issue par une dose létale d'anesthésique. L'équipe veut corriger par thérapie génique l'hyperexcitabilité du cerveau associée à la maladie, en faisant exprimer aux souris une protéine altérée chez les patients, et émet l'hypothèse que ce traitement pourra s'appliquer un jour à des personnes à risque, avant les premiers symptômes. Le texte ne nomme ni cette protéine, ni les deux lignées, ni les tests de mémoire, décrits seulement comme des séances d'une dizaine de minutes répétées trois fois, à côté d'une heure de déplacement libre dans une arène.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer demeure à ce jour incurable. Il y a une urgence à approfondir nos connaissances sur les mécanismes et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Parmi l’ensemble des symptômes retrouvés chez les patients, le plus connu est la perte de mémoire qui s’aggrave au cours du temps. Il y a une hyperexcitabilité du cerveau, fréquemment associé à de l'épilepsie qui aggravent la pathologie. Notre étude a pour objectif de développer une nouvelle stratégie thérapeutique afin de corriger cette hyperexcitabilité. Cette approche de thérapie génique pourrait être envisagée en clinique humaine. Nous induirons chez l'animal l'expression d'une protéine qui est altérée chez les patients,et nous analyserons l’activité cérébrale, et la mémoire. L’analyse des cerveaux permettra de mesurer l'efficacité sur les différents marqueurs de la pathologie.
Bénéfices attendus
Nous pourrons valider l’efficacité de la thérapie pour corriger l’hyperexcitabilité cérébrale dans le cadre de la maladie d’Alzheimer dans un but préventif ou curatif. Nous pourrons comparer aux techniques utilisées par d’autres laboratoires qui, ne sont pas envisageables en clinique humaine., Nous émettons l’hypothèse que notre thérapie génique pourra être effectuée sur les personnes à risque avant que les premiers symptômes ne se déclarent et que la pathologie ne soit trop avancée. Enfin, cette étude permettra de mieux connaître les mécanismes sous-jacents à l’hyperexcitabilité cérébrale présente dans la maladie d’Alzheimer
Procédures
les animaux auront 2 injections ( moins d'une minute) pour l'anesthésie et l' analgésie suivie d' une chirurgie cérébrale (durée 20 minutes) et en parallèle mise en place d'électrodes (1 heure). Les électroencéphalogrammes seront enregistrés 24h sur 24h pendant 4 jours sur les animaux se déplaçant librement. Les animaux seront testés en comportement tous les mois sur une durée maximum d'une semaine pour laisser un temps de repos entre 2 tests de comportement. Les tests durent environ 10 minutes et sont renouvelés 3 fois pour les tests de mémoire et pour l'étude des mouvements, la durée est d'une heure en libre circulation dans une arène. En fin de procédure les animaux seront euthanasiés sous analgésie avec une dose létale d'anesthésique.
Impact sur les animaux
Les tests de comportement peuvent engendrer un léger stress. Les chirurgies cérébrales peuvent engendrer des douleurs post-opératoires, une perte d’appétit menant à une perte de poids, ou encore à un stress de l’animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue chaque procédure
Remplacement
Notre étude portant sur l’hyperexcitabilité cérébrale, et ayant des mesures de mémoire et d’activités épileptiques, il est indispensable de travailler sur des modèles in vivo de la maladie d’Alzheimer. En effet, des lignées cellulaires ou des échantillons de cerveaux de patients ne nous permettrait pas de valider la stratégie thérapeutique que nous souhaitons développer.
Réduction
Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisqées précédemment au laboratoire. Nous avons également eu recours à notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique.
Raffinement
Nous avons planifié rigoureusement et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences réalisées précédemments au laboratoire montrent que les procédures expérimentales réalisées sous anesthésie et analgésie impactent peu le bien-être animal. Les effets post opératoires sont traités par une analgésie dès le réveil de l'animal et le lendemain de l'opération. De nombreux critères ont été mis en place afin de détecter/évaluer toute forme de détresse des animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécessaire
Choix des espèces
Nous choisissons de travailler avec la souris en raison des nombreuses simililtudes au niveau des processus physiologiques avec l’Homme. Par ailleurs, de nombreux modèles ont été développés afin de récapituler certains des changements pathologiques et cognitifs associés à la maladie d'ALzheimer. Notre étude comprend l’utilisation de deux modèles à des âges pour lesquels ils présentent des symptomes plus ou moins avancés Les animaux (mâles et femelles) utilisés sont âgés de 3 ou 5 mois au début du protocole. - 3 mois : correspond à l’âge où la pathologie commence à se déclarer au niveau cérébral de par la production de peptides amyloïdes. De plus, nos expériences réalisées précédemment au laboratoire démontrent une efficacité de notre thérapie à cet âge. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet préventif de notre traitement. - 5 mois : c’est un âge où la pathologie au niveau cérébrale est bien implantée et où les animaux présentent des déficits cognitifs. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet curatif de notre traitement.
Production des oligodendrocytes et de la myéline : voies de signalisation impliquées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1316 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une microchirurgie cérébrale ou des injections induisent la destruction de la myéline, avec une faiblesse des pattes quand la moelle épinière est visée, avant l'analyse des cerveaux post-mortem. L'objectif est d'identifier des molécules capables de régénérer la myéline dans la sclérose en plaques. Le porteur annonce une avancée "majeure" au conditionnel et affirme qu'aucune culture ne reflète ce processus dans un "organisme entier".
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie chronique inflammatoire affectant le système nerveux central. Ses causes restent encore mal connues et ses manifestations cliniques sont la conséquence d'une destruction de la myéline (une enveloppe qui protège le prolongement émis par les neurones que l'on appelle l'axone) dans le cerveau et la moelle épinière. La maladie débute dans la grande majorité des cas chez l'adulte jeune, typiquement entre 20 et 40 ans, et se traduit par des troubles divers touchant par exemple la motricité ou la vision. Aucun traitement n'est actuellement disponible pour réparer la myéline détruite et donc éviter la progression de la maladie vers des troubles persistants. L'absence de réparation de la myéline implique vraisemblablement un défaut de communication entre les différentes populations de cellules présentes dans le tissu nerveux, à savoir les neurones, les cellules qui synthétisent la myéline et les cellules qui participent au processus inflammatoire. Afin de développer un traitement induisant la régénération de la myéline, nous allons analyser plusieurs protéines qui permettent de transmettre des signaux entre ces différentes populations de cellules. L'objectif final est d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient être considérées dans le futur pour le développement de nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
Le projet devrait permettre d'identifier une ou plusieurs petites molécules remyélinisantes, ce qui constituerait une avancée majeure dans le domaine des maladies démyélinisantes du système nerveux central et pourrait prévenir l'apparition de handicaps irréversibles et sévères notamment chez les patients atteints de sclérose en plaques. Le passage de la forme rémittente de cette maladie à sa forme progressive constitue en effet une évolution dramatique pour les patients. De plus, la démyélinisation du système nerveux central est aussi présente dans d'autres maladies neurodégénératives comme par exemple la maladie d'Alzheimer. Par conséquent, les petites molécules identifiées dans ce projet pourraient aussi être bénéfiques dans cette dernière pathologie pour laquelle une approche thérapeutique efficace manque cruellement.
Procédures
1 injection intra-péritonéale sera effectuée quotidiennement pendant 5 jours avant de réaliser soit une microchirurgie cérébrale d'une durée de 30 minutes sous anesthésie générale pour injecter la molécule induisant une démyélinisation dans le cerveau, soit 2 injections sous-cutanées et 2 injections intra-péritonéales sous anesthésie générale pour induire une démyélinisation de la moelle épinière. Les traitements par les petites molécules à l'étude nécessitent 1 administration orale ou intra-nasale quotidienne pendant 10 à 21 j ou bien une administration sous-cutanée tous les 2 jours pendant 14 jours. Un tatouage et une biopsie de la queue à l'âge de 9-10 jours sont effectués sur les animaux vigils.
Impact sur les animaux
Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées peuvent conduire à une douleur ou un petit hématome. La microchirurgie peut mener à une douleur transitoire et une gène au niveau de la suture de la peau qui termine l'acte chirurgical. Les administrations orales et intra-nasales peuvent conduire à une gène transitoire au moment de la réalisation du geste. Les animaux chez lesquels on induit une démyélinisation de la moelle épinière présentent une faiblesse au niveau des pattes.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures, puisque le projet est exclusivement destiné à analyser les cerveaux post-mortem.
Remplacement
Aucune culture cellulaire ou tissulaire ne peut refléter le processus de régénération de la myéline existant dans un organisme entier étant donné la complexité de ce processus qui fait intervenir 4 types de cellules neurales et un nombre considérable de populations de cellules immunitaires infiltrant le tissu nerveux.
Réduction
Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux utilisés en nous limitant au nombre strictement nécessaire pour déterminer l'existence de véritables différences entre les groupes d'animaux qui sont comparés. Notre expertise dans le domaine indique qu'en dessous de 8 animauxpar groupe pour les modèles mimant une destruction de la myéline cérébrale ou 10 animaux par groupe pour les modèles mimant la destruction de la myéline dans la moelle épinière, on ne peut pas apporter une conclusion définitive aux questions que nous nous posons. Des tests statistiques ont été utilisés pour valider le nombre d'animaux à utiliser et seront utilisés pour exploiter les résultats obtenus.
Raffinement
Les molécules à l'étude peuvent être administrées par diverses voies, mais nous choisissons les voies les moins invasives (orale et intra-nasale) ne nécessitant pas d'injection. La microchirurgie et les injections nécessaires pour induire la destruction de la myéline sont réalisées sous anesthésie générale par du personnel qui possède une grande habileté pour effectuer ces gestes. La période de réveil des animaux anesthésiés se passe sur un tapis chauffant. Les animaux sont observés tous les jours tout au long de l'expérimentation.
Choix des espèces
Tous les modèles de démyélinisation ont été mis au point chez la souris. Des animaux adultes âgés de 7 à 12 semaines sont utilisés afin de se placer dans des conditions d'animaux jeunes, puisque la sclérose en plaques comme la maladie de Charcot atteignent l'adulte jeune.
Développement et régulation du lignage oligodendrocytaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1388 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Des souris nouveau-nées reçoivent des injections répétées entre le troisième et le dixième jour de vie, avec une biopsie de la queue, et leurs mères gestantes sont gavées, avant l'analyse des cerveaux post-mortem. L'objectif est de caractériser la production d'oligodendrocytes dans des modèles d'autisme et de maladie de Charcot. Le porteur affirme qu'aucune culture ne reflète cette genèse dans un "organisme entier" et que les modèles de ces maladies "n'existent que chez la souris".
Objectifs
Le projet est destiné à caractériser, au moment de la naissance, la production des oligodendrocytes c'est à dire les cellules qui synthétisent dans le système nerveux central, la myéline, une enveloppe qui s'enroule autour des prolongements des neurones et qui est indispensable au bon fonctionnement de ces derniers. Il y a quatre objectifs majeurs : 1) Caractériser le rôle des signaux transmis par une protéine - appelée Smo et connue pour être essentielle à la mise en place du système nerveux central - dans la production des oligodendrocytes; 2) Visualiser les oligodendrocytes produits par des animaux génétiquement modifiés qui vont permettre de déterminer le lieu de naissance et le lieu de migration de différentes populations d’oligodendrocytes; 3) Déterminer quand débute la production anormale des oligodendrocytes dans deux modèles animaux de maladies humaines où la myéline est altérée : l'autisme et la maladie de Charcot; 4) Déterminer l’influence des hormones sexuelles mâles sur la production des différentes populations d’oligodendrocytes, ce qui est important à évaluer puisque l’autisme atteint préférentiellement les garçons.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de déterminer à quel âge les souriceaux utilisés comme modèles de ces maladies humaines commencent à présenter une production anormale d’oligodendrocytes et si les anomalies mises en évidence portent sur la quantité de cellules produites et/ou sur leur capacité à devenir des cellules synthétisant de la myéline. L'information sera importante pour déterminer à quel moment il conviendrait de mettre en place un traitement. Par ailleurs, nous identifierons les molécules possiblement responsables des anomalies observées. Ces molécules pourront dans le futur être utilisées pour développer de nouveaux traitements pour ces maladies que l’on ne sait pas traiter efficacement pour l'instant. Nous pourrons enfin déterminer si les anomalies sont différentes chez les mâles et les femelles ce qui pourrait amener à mettre en place des traitements différents en fonction du sexe considéré.
Procédures
Les souris femelles gestantes seront gavées une seule fois afin que la molécule injectée passe chez les nouveaux-nés. Le gavage dure 10 secondes. Certains nouveaux-nés recevront tous les 2 jours (entre l'âge de 3 et 10 jours après la naissance) une injection sous-cutanée de la petite molécule à tester. L'injection dure 10 secondes. Un tatouage et une biopsie de la queue à l'âge de 9-10 jours sont effectués sur les animaux vigils.
Impact sur les animaux
Une douleur peut exister au niveau du site d'injection des produits à administrer et au moment de la biopsie de la queue. Un stress, une difficulté respiratoire ou une difficulté à mettre bas peuvent éventuellement être associés au gavage des souris femelles.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des 4 procédures, puisque le projet est exclusivement destiné à analyser les cerveaux post-mortem.
Remplacement
La genèse de nouvelles cellules dans l’organisme vivant ne peut être pour l’instant reflétée dans son ensemble par des cultures de cellules étant donné la complexité de ces processus qui impliquent non seulement les cellules auxquelles nous nous intéressons - les oligodendrocytes - mais aussi les autres cellules du cerveau qui communiquent entre elles en permanence. Il en est de même de la synthèse de la myéline qui est aussi un processus particulièrement complexe dépendant de plusieurs types de cellules. Néanmoins nous avons précédemment acquis des données préliminaires en utilisant des oligodendendrocytes mis en culture en présence de petites fibres de verre mimant artificiellement l’axone des neurones. Les effets des signaux identifiés dans ces cultures de cellules doivent maintenant obligatoirement être vérifiés au niveau de l'organisme entier.
Réduction
Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux utilisés en nous limitant au nombre strictement nécessaire pour déterminer l'existence de véritables différences entre les groupes d'animaux qui sont comparés. Notre expertise dans le domaine indique qu'en dessous de 6 animaux par temps analysé et pour chaque sexe, on ne peut pas apporter une conclusion définitive aux questions que nous nous posons. Des tests statistiques sont utilisés pour valider le nombre d'animaux à utiliser et ensuite pour exploiter les résultats obtenus.
Raffinement
L'étude des maladies que nous souhaitons mener nécessite parfois l'administration aux mères des souriceaux que nous allons utiliser une molécule très souvent utilisée dans ce domaine de la recherche. L'administration se fait par voie orale et ne nécessite donc aucune injection. La molécule sera transférée aux petits de façon complètement indolore via l'allaitement. Cette administration orale tout comme les injections des anesthésiques sont réalisées par du personnel qui possède une grande habileté pour effectuer ces gestes. Des points limites suffisamment précoces ont été mis en place.
Choix des espèces
Les modèles des maladies qui nous intéressent n'existent que chez la souris. De plus, dans cette espèce, le production des oligodendrocytes et celle de la myéline sont comparables à ce que l'on sait de ces processus chez l'humain. Les stades du développement post-natal précoce 3, 7, 10, 15, 21 et 30 jours utilisés dans le projet correspondent à des stades critiques au cours de la production des oligodendrocytes et de la myéline qui entoure les axones. Au-delà de 30 jours la production de myéline est terminée dans la grande majorité des régions du système nerveux central qui doivent être myélinisées.
Oligodendrogenèse, myélinisation et cellules souches
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère alors qu'elles incluent une microchirurgie cérébrale destinée à injecter une molécule qui détruit la myéline. S'y ajoutent des injections intra-péritonéales quotidiennes pendant cinq jours, l'implantation d'une mini-pompe sous la peau ou des injections répétées, et une biopsie de la queue sur animal vigile. L'objectif est de caractériser les progéniteurs neuraux susceptibles de réparer la myéline dans la sclérose en plaques. Le porteur affirme qu'aucune culture ne reflète cette genèse cellulaire dans un "organisme entier", les molécules prometteuses ayant été présélectionnées in vitro.
Objectifs
Dans le système nerveux central, le prolongement majeur des neurones que l’on appelle l’axone est entouré d’une gaine de lipides ou myéline’ qui permet d’optimiser la réponse du neurone et participe au fonctionnement correct des différents tissus et organes du corps humain. Les maladies qui détruisent la myéline dans le système nerveux central sont dites démyélinisantes. La plus commune est la sclérose en plaques (SEP) qui atteint une majorité d'adultes jeunes entre 20 et 40 ans. Les troubles neurologiques associés touchent diverses fonctions comme la motricité, la sensibilité, la vision. Une régénération spontanée de la myéline détruite existe au cours des premières étapes de la maladie, mais le processus finit par s’épuiser conduisant à des handicaps irréversibles. Les traitements actuellement disponibles permettent de réduire l'inflammation déclenchée par le système de défense de l’organisme contre les agressions extérieures, mais aucun ne favorise la régénération de la myéline indispensable dans la phase évolutive de la maladie. Deux sources de cellules sont à l’origine de nouvelles cellules capables de produire la myéline, encore appelées oligodendrocytes. Ces deux sources de cellules portent le nom de progéniteurs neuraux et progéniteurs péri-lésionnels. Elles naissent dans des régions distinctes du tissu nerveux chez le rongeur et existent aussi chez l’humain. Les progéniteurs neuraux sont beaucoup moins caractérisés que les progéniteurs péri-lésionnels. Dès la naissance et jusqu’à l’âge adulte, ils naissent dans une région du cerveau que l’on appelle la zone sous-ventriculaire (ZSV). Il est donc indispensable de bien les caractériser dès leur apparition étant donné leur importance dans la réparation de la myéline détruite au cours de la SEP. Le projet comporte 3 objectifs principaux : Objectif 1 : Caractérisation des propriétés des progéniteurs neuraux dans des conditions physiologiques en comparaison de conditions de destruction de la myéline ; Objectif 2 : Etude de la production des progéniteurs neuraux chez des animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas certaines protéines impliquées dans ce processus ; Objectif 3 : Activation de la production de ces progéniteurs par des molécules chimiques préalablement sélectionnées en utilisant des cultures de cellules.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’identifier quel stade de maturation des progéniteurs neuraux il serait intéressant de cibler afin de pallier un défaut de production de myéline suite à une démyélinisation pathologique. Il permettra aussi de déterminer si des molécules préalablement identifiées en utilisant des cultures cellulaires ont une activité de régénération de la myéline dans le contexte inflammatoire qui accompagne classiquement la démyélinisation du système nerveux central que ce soit dans les modèles animaux ou chez l’humain.
Procédures
1 injection intra-péritonéale sera effectuée quotidiennement pendant 5 jours avant une microchirurgie cérébrale d'une durée de 30 minutes, réalisée sous anesthésie générale afin d'injecter la molécule induisant la démyélinisation. Selon les molécules à tester, une mini-pompe sera implantée sous la peau du dos des animaux afin de délivrer les molécules pendant 15 jours ou alternativement 1 injection intramusculaire sera effectuée tous les 4 jours pendant 3 semaines. Un tatouage et une biopsie de la queue à l'âge de 9-10 jours sont effectués sur les animaux vigils
Impact sur les animaux
Une douleur locale peut exister après les injections intra-péritonéales et intra-musculaires ainsi qu'à la biopsie de la queue. Une gène peut être associée à l'implantation sous-cutanée de la micropompe délivrant les molécules à tester ainsi qu'au niveau de la suture de la peau après la microchirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés dans chacune des deux procédures utilisées dans ce projet.
Remplacement
La genèse de nouvelles cellules dans l’organisme vivant ne peut être reflétée dans son ensemble par des cultures de cellules étant donné la complexité des processus impliquant non seulement les types cellulaires autres que les oligodendrocytes, mais aussi l’environnement des cellulaes. Néanmoins, les cultures cellulaires nous ont d’ores et déjà permis de sélectionner les molécules chimiques les plus prometteuses que nous devons maintenant valider dans un organisme entier. Ceci limite donc le nombre de molécules à évaluer chez l'animal.
Réduction
Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux utilisés en regroupant toutes les analyses histologiques que nous devons réaliser afin d'obtenir un maximum de résultats sur chaque animal et en partageant les tissus avec nos collaborateurs pour les analyses que nous ne maitrisons pas. Les nombres d'animaux utilisés sont issus de notre expertise dans le domaine donc de nos expériences précédentes.
Raffinement
Les modèles de démyélinisation que nous utiliserons dans ce projet sont ceux dont nous avons l’expertise depuis des années. Nos protocoles ont été optimisés et permettent d'induire des démyélinisations très reproductibles évitant d'avoir à augmenter le nombre d'animaux et ne produisant pas de trouble de la motricité. Lorsque nécessaire, nous utilisons des aiguilles extrêmement fines et spécifiquement mises à disposition de la communauté scientifique pour réaliser des injections chez la souris. Des tapis chauffants permettent d’accompagner le réveil des animaux anesthésiés.
Choix des espèces
La grande majorité des lignées transgéniques actuellement disponibles sont des lignées murines. De plus, les modèles de démyélinisation sont aussi pour la plupart développés chez la souris. Des animaux adultes âgés de 7 à 14 semaines sont utilisés afin de se placer dans des conditions d'animaux jeunes, puisque la sclérose en plaques atteint l'adulte jeune.
étude de l’effet d’une thérapie génique contre l’accumulation de l’alpha synucléine chez le primate non-humain
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
50 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un vecteur de thérapie génique, parfois par une chirurgie cérébrale de cinq heures, puis subit des séances répétées d'imagerie sous anesthésie avant l'euthanasie pour analyse des tissus. L'objectif est d'obtenir une "preuve de concept" avant un essai clinique contre la maladie de Parkinson. Le porteur justifie le recours au macaque par la taille de son cerveau et sa proximité immunitaire avec l'humain, et affirme que ni les cultures ni le rongeur ne sont "prédictifs".
Objectifs
La maladie de Parkinson, fait partie d’un groupe de maladies du cerveau dont la signature est l’accumulation anormale d’une protéine l’alpha-synucléine (α-syn). A l’état normal, α-syn régule le trafic et la libération des neurotransmetteurs qui sont essentiels pour la communication entre neurones. Son accumulation excessive et en forme insoluble, contribue à l’apparition d’agrégats multi-protéiques qui encombrent les neurones et empêchent leur bon fonctionnement. Une stratégie thérapeutique contre cette accumulation et agrégation d’α-syn est de réduire sa quantité dans les tissus ou des molécules intermédiaires (ARN messager, ou ARNm) nécessaires à sa production. Des essais cliniques sont déjà en cours sur des patients atteints de la maladie de Parkinson pour évaluer l’efficacité de cette stratégie. Cependant, ces approches laissent la protéine et/ou ARNm s’accumuler jusqu’à qu’ils rencontrent une molécule qui les élimine. Ce processus engorge à terme la machinerie cellulaire et il serait plus efficace de réduire l’expression du gène directement, c’est-à-dire d’agir en amont de la production d’ARNm et de protéines. Grâce à une technologie d’édition du génome qui est inductible et réversible, nous proposons de tester une nouvelle approche pour réduire partiellement la quantité d’α-syn produite de novo. Des résultats obtenus chez le rongeur montrent que l’approche est efficace et bien tolérée. Il s’agit maintenant d’étoffer ces données et de mettre à l’échelle le traitement dans une espèce plus proche de l’humain en termes de taille et organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau, et par rapport au système immunitaire. Les expériences proposées dans un modèle primate non-humain permettront ainsi d’établir si la réduction partielle de l’expression du gène est efficace et bien tolérée. Pour ceci, il faut réaliser la mise à l’échelle du traitement chez le gros animal et étudier différentes voies d’administration, en comparant l’effet de la thérapie génique après injection du vecteur thérapeutique directement dans le cerveau, dans le compartiment de liquide céphalorachidien, ou dans le compartiment sanguin. Toutes les voies d’administration citées sont utilisées chez l’humain et sont donc pertinentes pour le traitement des patients atteints de la maladie de Parkinson. Dans un souci de raffinement, la voie moins invasive donnant une efficacité satisfaisante chez le primate non humain sera privilégiée pour la translation de cette thérapie en clinique.
Bénéfices attendus
Les données déjà obtenues dans des modèles rongeurs de la maladie de Parkinson montrent bien que la réduction de la quantité de protéines ou d’ARNm de l’α-syn a un effet bénéfique. Ce projet vise à établir pour la première fois chez le primate non-humain l’effet d’une thérapie qui réduit partiellement l’expression du gène de l’α-syn en vue de son utilisation chez le patient atteint de la maladie de Parkinson. Notre approche devrait éviter d’encombrer et perturber la machinerie cellulaire, et limiter le risque d’engorgement empêchant l’élimination des produits accumulés et causant une inflammation chronique autour des neurones, où ils s’accumulent. Les données acquises pendant le projet permettront d’établir les meilleurs paramètres d’administration chez le patient, ce qui constitue une preuve de concept essentielle avant de démarrer un essai clinique.
Procédures
Le protocole expérimental comporte 4-5 séances de prélèvements sous anesthésie (~30 min) avant et après administration de la thérapie. L’imagerie IRM non-invasive, sera utilisée pour observer l’anatomie du cerveau et la présence d’inflammation (4-5 fois 1-2H). De même, 4-5 séances d’imagerie TEP (4H max) seront délivrées en respectant 3 semaines d’écart entre les examens. Une seule délivrance de thérapie est prévue par animal et sa durée sera de 1H à 6H selon la voie. L’euthanasie en fin de protocole sera nécessaire pour prélever les organes et tissus et les analyser, afin de comparer les résultats aux mesures fonctionnelles et anatomiques acquises par imagerie IRM et TEP, et ainsi valider les résultats d’innocuité et efficacité. Toutes ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale en prenant en compte l’inconfort, la douleur lors des chirurgies et le suivi de l’état général des animaux comme le poids, la mobilité et la sociabilité avec les congénères.
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles suite à la délivrance du traitement par chirurgie sont une infection au niveau de l’incision de la peau (5-7 jours maximum avec prise en charge par un traitement antibiotique), une douleur au niveau de l’incision (2-3 jours post-incision avec prise en charge par un traitement analgésique), perte de poids (2 jours post-chirurgie avec prise en charge par un soutien alimentaire). Toute modification du comportement moteur ou social des animaux hébergés en groupe social sera noté et notifié au vétérinaire.
Devenir
Suite à des données prometteuses obtenues chez le rongeur, et dans l’optique d’obtenir une preuve de concept de l’efficacité et la sureté d’une stratégie de thérapie génique pour la maladie de Parkinson chez une espèce fonctionnellement et immunitairement proche de l’Homme, il est nécessaire d’analyser les tissus après euthanasie pour obtenir des mesures concrètes et reproductibles. En effet, le cadre règlementaire pour transposer une thérapie en clinique chez l’humain impose une vérification directe de la distribution dans l’organisme du vecteur viral et une évaluation de sa capacité à induire une réponse immunitaire. Ces données sont inaccessibles chez le patient humain et le recours à l’animal reste nécessaire. Ainsi, la présence du vecteur viral et de la protéine surexprimée seront mesurées et cartographiées dans le système nerveux central et les organes périphériques à l’aide de techniques biochimiques ou histopathologiques.
Remplacement
Le recours à l’animal est nécessaire, aucun milieu de culture, organoïde ou système synthétique, ne permettant aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale du cerveau au point de prédire la biodistribution d’un agent thérapeutique, ou de comparer cette distribution en fonction des voies d’administration utilisées. Le rongeur, vu la petite taille de son cerveau, n’est pas pertinent pour informer correctement le design clinique de l’administration de cette approche, c’est-à-dire le nombre d’injections et la concentration de l’agent thérapeutique à utiliser pour couvrir une région du cerveau. La taille et la structure du cerveau du primate non-humain – en rapport avec la résolution intrinsèque des équipements d’imagerie existants – permettent aussi des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées chez les patients et impossibles chez le rongeur par exemple. Par ailleurs, la réaction du système immunitaire suite à la surexpression d’une protéine exogène doit aussi être évaluée dans un modèle animal proche de l’Homme pour augmenter sa valeur prédictive. Il est possible de dépister ces effets grâce à des examens d’imagerie et de confirmer ces résultats par analyse immunohistochimique des marqueurs d’inflammation post-mortem. Le protocole expérimental pourra être révisé pour éviter une réaction immunitaire, en modulant des paramètres d’administration comme la concentration et le volume de l’agent thérapeutique, sa répartition par site d’injection et l’administration d’un traitement anti-inflammatoire. Tous ces éléments pourront être utilisés pour mettre au point les protocoles de délivrance et de suivi chez le patient.
Réduction
Une veille de la littérature démontre que ces expériences n’ont pas été déjà réalisées et que le nombre d’animaux choisi, en tenant compte de l’espèce, est pertinent puisqu’il a déjà permis de mettre en évidence des effets thérapeutiques dans d’autres études. De plus, le laboratoire dispose d’une solide expérience dans le design d’expériences d’évaluation thérapeutique chez le primate non-humain et du nombre d’individus nécessaires par groupe expérimental pour conclure sur des effets pertinents et prédictifs chez l’humain. Un suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives comme l’imagerie permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet thérapeutique significatif, en évitant l’euthanasie pour une confirmation histologique à différents temps.
Raffinement
Une seule séance par individu est prévue pour délivrer les vecteurs viraux. La durée et le caractère invasif de la procédure de délivrance seront variables entre les groupes expérimentaux, selon qu’il s’agira d’une simple injection (~1h) ou une chirurgie pour délivrance dans le cerveau (~5h). Un suivi d’observation journalière sera mis en place les deux premières semaines après administration pour vérifier l’absence de réaction aigue (réaction cutanée locale, gonflement, rougeur, infection). Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie locale et systémique le jour de l’intervention et, dans le cas de la chirurgie, dans les deux jours qui suivront. D’après l’expérience du laboratoire, grâce à ces protocoles, les chirurgies ne modifient pas le comportement de l’animal ni sa prise de nourriture, même dans les 48 heures post-intervention. De plus, un suivi du poids sera réalisé toutes les semaines durant toute la durée de l’expérience. Le comportement sera évalué une fois par semaine pendant toute la durée du protocole à l’aide d’une grille prenant en compte différents critères, dont la présence ou absence d’un penchement de la tête, la difficulté de déplacement à cause d’un membre inférieur ou supérieur, les rotations, la prostration, l’apparence du pelage, la prise de nourriture fournie par l’expérimentateur (motricité fine et apathie).
Choix des espèces
Des études préalables chez le rongeur montrent que la réduction de l’expression de la protéine aSyn est suffisante pour modifier ou empêcher le développement de la maladie de Parkinson. Notre projet vise à réduire partiellement l’α-syn au niveau de l’ADN. Le développement clinique de l’approche demande d’étudier la biodistribution et la sureté de cette thérapie dans un modèle bien connu et proche de l’homme en termes d’organisation anatomo-fonctionnel cérébrale et d’immunologie. Ni les modèles in vitro ni les modèles rongeurs ne sont prédictifs du fait de la petite taille du cerveau et des différences au niveau du système immunitaire, et c’est pourquoi nous avons fait appel au modèle macaque. En effet, des études comparatives entre rats, primates et humains montrent que le nombre de cellules dopaminergiques dans la substance noire est de 12.7x10e3, 203x10e3 et 382x10e3 respectivement ce qui illustre la pertinence de l’espèce de choix. Animaux adultes dans la perspective de l’application clinique chez des patients atteints de la maladie de Parkinson et dans le but de s'éloigner d'une plasticité trop importante observée chez l'enfant et le jeune adulte et qui pourrait entrainer la mise en jeu de mécanismes adaptatifs de compensation.
Evaluation de probiotiques dans un modèle préclinique de maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 224 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 504 étant classés en souffrance sévère. Un modèle de maladie de Parkinson leur est induit, puis ils subissent des gavages quotidiens jusqu'à huit semaines, des tests moteurs et cognitifs et un isolement à jeun pour mesurer le transit intestinal, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique attendre perte de poids, troubles moteurs, cognitifs et gastro-intestinaux liés au modèle. Il conclut qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit l'ensemble des symptômes et qu'il est "nécessaire" de travailler sur un "organisme entier".
Objectifs
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui représente un problème majeur de santé publique. Son diagnostic clinique repose sur des symptômes moteurs : rigidité, tremblements, altération des réflexes posturaux et bradykinésie. Il existe de nombreuses autres complications dues à cette maladie : troubles cognitifs et sensoriels, douleurs, troubles du sommeil par exemple. Quatre-vingts pour cent des patients atteints de la maladie de Parkinson ont également des troubles gastro-intestinaux, qui précèdent généralement l’apparition des troubles moteurs, et qui empirent avec la progression de la maladie. Il s’agit généralement de constipation, mais aussi de reflux ou de gastroparésie. L’étiologie de la maladie de Parkinson reste mal connue même si l’on sait que des facteurs environnementaux tels que l’exposition à des pesticides favorisent son développement. Le modèle de maladie de Parkinson induit par l’administration de roténone (pesticide) chez le rongeur est très documenté. Ce modèle induit des lésions comparables à celles retrouvées chez les malades : troubles moteurs, perte de neurones dopaminergiques, et accumulation d’α-synucléine. De plus, il a été montré que la roténone induit des symptômes gastro-intestinaux et une altération du microbiote intestinal chez le rat. Des études précliniques montrent que les probiotiques pourraient avoir un effet bénéfique dans les différents symptômes de la maladie de Parkinson. Le projet ici proposé s’articule en 2 étapes : la première consiste à développer un modèle préclinique de la maladie de Parkinson chez le rat via une administration par voie orale de roténone, la seconde consiste à tester les effets potentiellement bénéfiques de probiotiques avec ou sans substances pharmacologiques sur ce modèle.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité de probiotiques associés ou non avec des substances pharmacologiques sur les symptômes neurologiques et gastro-intestinaux induits par la maladie de Parkinson. Cette maladie touche environ 1% de la population de plus de 60 ans et représente un problème majeur de santé publique, d’autant plus que son incidence croît en raison du vieillissement de la population. Les traitements actuels ont une efficacité qui ne perdure pas dans le temps avec de nombreux effets secondaires, il est donc important de développer de nouveaux traitements.
Procédures
Les traitements nécessiteront des gavages quotidiens sur animaux vigiles. Ceux-ci seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l'animal et avec des sondes souples pour limiter les irritations et auront lieu pendant 8 semaines maximum. Des test comportementaux qui évaluent les performances motrices et cognitives seront également réalisés sur des animaux vigiles. Ceux ci auront lieu pendant une semaine maximum et pourront varier entre 2 et 15 minutes. Enfin, certains animaux pourront être mis à jeun et isolés quelques heures afin d’évaluer le temps de transit intestinal.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, différents symptômes sont attendus puisqu’il s’agit de reproduire les symptômes de la maladie de Parkinson décrits dans la littérature scientifique : perte de poids, troubles moteurs, cognitifs et troubles gastro-intestinaux. Certains traitements nécessiteront des gavages quotidiens sur animaux vigiles. Ceux-ci seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l'animal et avec des sondes souples pour limiter les irritations et auront lieu pendant 8 semaines maximum. Un stress dû à l’isolement des animaux lors de la mesure du temps de transit peut également avoir lieu.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes pour des études histologiques.
Remplacement
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative complexe avec des symptômes qui touchent différents organes. Les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire l’ensemble des symptômes de cette maladie, il est donc nécessaire de travailler sur un organisme entier.
Réduction
La variabilité des réponses aux effets d’un traitement donné par voie orale chez le rongeur justifie une taille minimale de groupe de 12 animaux par condition expérimentale. Un effectif inférieur exposerait à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus par une analyse de la variance. En cas de résultat significatif, les différences entre chaque groupe et le groupe contrôle seront explorées à l’aide d’un test de comparaisons multiples adapté.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies. Les administrations par voie orale seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté, à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations. Les symptômes moteurs induits par un traitement à la roténone seront évalués quotidiennement, et un raffinement de l’hébergement sera mise en place si ceux-ci sont importants (e.g. croquettes posées sur le sol de la cage ou la mise à disposition d’aliment semi-liquide pour faciliter la prise alimentaire). Les animaux seront observés attentivement en respectant les points limites mis en place. Ils seront mis à mort en cas de dépassement des points limites mis en place pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse.
Choix des espèces
Après une étude de la littérature scientifique, les rongeurs sont des modèles fréquemment décrits. Le rat a été choisi car les quantités de fèces qu'il génère sont plus importantes que chez les souris, ce qui permet de limiter le nombre d'animaux utilisés. Etant donné les modèles décrits dans la littérature, des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures.
Evaluation d’un composé dans un modèle de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie induisant un modèle de maladie de Parkinson, jusqu'à 168 administrations d'un composé selon les voies et jusqu'à 49 tests comportementaux neuropsychologiques. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, inflammation, infection et perte de poids, et que les troubles induits altèrent la locomotion et la démarche. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est disponible et que les animaux ne peuvent être réutilisés du fait de substances aux effets inconnus à long terme.
Objectifs
La maladie de Parkinson touche 1% de la population âgée de plus de 60 ans et 4% de la population des personnes de plus de 80 ans. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative du système nerveux central qui progressivement entraine des troubles moteurs (tremblements, rigidité musculaire, impossibilité ou ralentissement des mouvements). Comme d’autres maladies neurodégénératives, il n’y a pas de traitement capable de stopper ou de guérir la maladie. Les traitements qui existent sont purement symptomatiques. Toutefois, les traitements existants entrainent des effets secondaires sérieux tels que dyskinésie (mouvements anormaux involontaires), désorientation et confusion. Plusieurs voies de recherche sont en cours pour le traitement de la maladie de Parkinson et incluent par exemple la thérapie génique, la greffe de neurones et le traitement par des molécules neuroprotectrices. Un des modèles animaux le plus utilisé dans la recherche sur la maladie de Parkinson est basé sur une lésion unilatérale et sélective par injection d’une neurotoxine dans le cerveau. Cette injection affecte chez le rat la même zone cérébrale que celle endommagée chez les patients atteints de la maladie de Parkinson et permet ainsi de mimer certains de leurs symptômes. Ce projet a pour objectif d’étudier l’effet de diverses molécules sur le modèle de rat hémi-parkinsonien afin de sélectionner de nouveaux composés pour les essais cliniques.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de mettre en évidence des molécules qui n’ont pas d’effets secondaires sur les animaux et qui permettraient de palier en partie ou totalement aux troubles moteurs et cognitifs de la maladie de Parkinson. Nous testerons aussi sur ce modèle des molécules en phase clinique pour la maladie de Parkinson, afin de mieux appréhender sa prédictivité.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale (20-30 min) sous anesthésie, l’administration, du composé à tester sur animal vigile (sauf pour l’administration intraveineuse qui est faite sous anesthésie) pour une durée maximale de 12 semaines selon ses caractéristiques pharmacologiques ainsi qu’un maximum de 49 tests de comportement neuropsychologiques (moins de 10 min chacun) sur animaux vigiles. En considérant un début de traitement des animaux en J0, le composé sera donné au maximum 168 fois par voie per os, sous-cutanés ou intrapéritonéale ou 84 fois par administrations intra-nasales ou intramusculaires ou encore 10 fois par intraveineuse. A savoir une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Pour le reste des administrations, la durée est de moins de 30 second en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. En parallèle des tests de comportement, des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon les tests et la voie d'administration choisie, les animaux pourront subir de 1 à 44 prélèvements sanguins sur la période de 12 semaines en ne dépassant pas les recommandations. Les prélèvements de sang dure 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, l’intervention chirurgicale peut induire une douleur transitoire, des signes d’inflammation, d’infection et une perte de poids. De plus les troubles induits peuvent gêner les animaux dans leur vie quotidienne : locomotion réduite et démarche altérée. Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des nuisances au niveau des sites d’administration et de prélèvement : comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration et/ou un phénomène de mâchonnement ou une fausse route (pour le gavage). Un stress lié aux différentes manipulations et tests comportementaux peut également apparaitre.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Le développement de la maladie de Parkinson et ses symptômes sont des phénomènes complexes qui mettent en jeu plusieurs acteurs (différentes zones cérébrales, muscle, …) et différents processus, actuellement aucune méthode de remplacement n’est disponible pour étudier la problématique du présent projet. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses biochimiques ou histologiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués de 12 à 20 animaux. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Des analyses statistiques finales seront réalisées.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. La chirurgie est effectuée sous anesthésie générale, en présence de traitements antalgiques avec une aide au maintien de la température corporelle de l’animal (tapis chauffant) et en garantissant la stérilité de l’intervention. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé, les animaux recevront un antalgique pour prendre en charge leur douleur. De plus les animaux reçoivent de la nourriture en gel pour faciliter leur récupération post-chirurgicale et de la nourriture en granulé est déposée sur la litière. Le poids corporel des animaux sera suivi. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien-Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. A côté de cela, il faut noter que nous avons une longue expertise de l’utilisation des rats dans ce modèle de la maladie de Parkinson. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (environ 200-250g au moment de la chirurgie). Ce choix est basé sur le fait que la pathologie est induite par chirurgie et ne dépend donc pas de l’âge des animaux. De plus les jeunes adultes supportent mieux les interventions chirurgicales, ce qui nous permet de réduire les risques liés à la chirurgie, de leur assurer une récupération plus rapide et de meilleure qualité.
Anomalies rétiniennes dans le syndrome DYRK1A
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Modifiées pour reproduire le syndrome DYRK1A, elles subissent des imageries rétiniennes et une électrorétinographie sous anesthésie, avec pose d'électrodes, puis sont tuées avant réveil pour prélever cerveau et rétines. Le porteur présente les imageries comme sans contact et indique que la principale gêne tient au stress du transfert et à l'anesthésie. Il écarte le poisson zèbre, porteur de deux gènes proches, et conclut que la souris est l'espèce "la mieux adaptée".
Objectifs
Si l’augmentation d’expression d’un des gènes du chromosome 21 humain est considérée comme la cause de nombreux symptômes affectant les sujets atteints de trisomie 21, la diminution de son expression / de l'activité de la protéine codée par ce gène induit également des défauts de développement et de fonctionnement du système nerveux central. Le syndrome associé, initialement appelé MRD7, pour Retard Mental autosomal Dominant de type 7, a récemment été renommé syndrome DYRK1A. Il combine une déficience intellectuelle, une microcéphalie, des crises épileptiques et des troubles du spectre autistique. Trisomie 21 et syndrome DYRK1A sont également associés à des symptômes ophtalmologiques. Parmi eux, un épaississement rétinien a été observé chez les sujets trisomiques, et est retrouvé dans les modèles rongeurs. Aucune étude structurelle n’a encore été publiée en ce qui concerne les patients atteinst du syndrome DYRK1A, mais une pâleur du nerf optique a été rapportée. Elle pourrait être causée par un amincissement de la rétine, comme celui qui a été observé dans un modèle murin de la maladie. Dans ce dernier, une des deux copies du gène a été inactivée, ce qui conduit à une baisse d’expression de la protéine de 50%. Or chez les patients, on retrouve de nombreuses mutations ponctuelles n’affectant pas forcément le niveau d’expression de la protéine, ce qui peut influencer les symptômes – il y a de plus en plus d’indications que la quantité de protéine peut influencer sa répartition dans les cellules et/ou la répartition des protéines avec lesquelles elle interagit. Nous proposons donc d’étudier les conséquences de plusieurs mutations identifiées chez les patients, à travers la caractérisation ophtalmologique de modèles murins dans lesquels ces mutations ont été introduites.
Bénéfices attendus
Les données moléculaires disponibles pour certaines des mutations identifiées chez les patients atteints du syndrome DYRK1A laissent envisager des conséquences hétérogènes sur l’activité et/ou la stabilités des protéines mutées. Au niveau clinique, si nous mettons en évidence que ces différentes mutations conduisent à des changements rétiniens distincts et facilement détectables chez les patients, notamment à travers un examen rapide et non invasif (imagerie sans contact), on peut escompter une prédiction plus précise des conséquences de mutations nouvellement identifiées et donc une prise en charge adaptée plus précoce. Au niveau fondamental, disposer de données structurelles et fonctionnelles globales sur les rétines des différents modèles aidera à déterminer sur lesquels porter en premier nos efforts pour identifier l’impact sur les différentes populations neuronales de la rétine, une partie du système nerveux central dont la structure fine et régulière facilite les approches histologiques et fonctionnelles.
Procédures
La totalité des animaux (192) sera examiné par deux techniques d’imagerie rétinienne sans contact, la tomographie par cohérence optique (OCT) et le fond d’œil, qui sont complémentaires. Ces deux modalités seront pratiquées, après dilatation des pupilles (application d’une goutte de mydriatique par œil) sur une même anesthésie gazeuse (maximum de 15 minutes), destinée à obtenir l’immobilité durant l’examen. Deux tiers des animaux (128) seront examinés par électrorétinographie, qui permet d’évaluer la fonctionnalité de la rétine (durée de l’examen < 30 minutes). Après dilatation de la pupille, les animaux seront endormis par une injection intrapéritonéale d’anesthésique. Des électrodes de référence sous-cutanées seront insérées au niveau des joues et de la base de la queue, et des électrodes DTL (fins filaments souples conducteurs) placées sur les cornées. Pour les différents examens, les animaux seront placés sur des coussins chauffants pour maintenir leur température corporelle, et du gel ophtalmique appliquée sur les cornées pour les maintenir hydratée.
Impact sur les animaux
Les deux modalités d’imagerie, toutes deux sans contact, sont réalisées sur une courte anesthésie gazeuse (15 minutes au maximum), utilisée uniquement afin d’obtenir l’immobilité de l’animal. La seule nuisance en découlant est donc le stress lié au transfert de la souris de sa cage d’hébergement à la cage d’induction et l’exposition au gaz anesthésiant. L’euthanasie étant effectuée avant le réveil, la seule nuisance associée à l’électrorétinographie découle également de l’anesthésie (contention et injection intra-péritonéale).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort avant leur sortie d’anesthésie, soit à l’issue de l’imagerie (64), soit à l’issu de l’électrorétinographie (128), pour prélever cerveau et rétines pour les études histologiques ou moléculaires.
Remplacement
Il est impossible à l’heure actuelle d’obtenir une rétine complète in vitro. Obtenir des données structurelles et fonctionnelles facilement transposables à la clinique ne peut se faire que sur des modèles vertébrés, l’œil de invertébrés étant très différent dans son organisation. Le poisson zèbre ne peut être considéré ici, car il existe chez cette espèce deux orthologues de notre gène d’intérêt, ce qui rend délicat de reproduire l’impact d’une perte d’une copie ou de mutations ponctuelles. Le modèle murin hétérozygote est par contre bien caractérisé et reproduit de nombreux symptômes des patients atteints du syndrome DYRK1A. De plus, plusieurs lignées portant des mutations ponctuelles sont d’ores et déjà disponibles. La souris nous semble donc l’animal modèle le mieux adapté pour mener à bien le présent projet.
Réduction
Au cours d’une étude précédente portant sur des groupes de 12 mâles, nous avions constaté, chez les souris n’ayant qu’une copie fonctionnelle de notre gène d’intérêt, un net amincissement de la rétine ainsi qu’une réduction du nombre des vaisseaux sanguins, et un léger allongement des segments externes, effet miroir de ce que nous avons observé chez des souris ayant trois copies de ce gène. Un effectif de 12 mâles et 12 femelles par génotype permettrait de confirmer ces observations en ayant autant de femelles que de mâles pour chacun des génotypes, et de pouvoir détecter des variations d’amplitude des différents effets entre mutants. Nous n’avons encore effectué aucun enregistrement avec l’équipement électrorétinographique qui vient d’être récupéré auprès d’un autre laboratoire. En absence de données nous permettant d’estimer la dispersion des mesures dans nos conditions d’enregistrement, nous nous orientons vers les effectifs classiquement utilisés pour les études électrorétinographiques, avec 8 souris par génotype et par sexe. Afin de tirer au mieux parti des données acquises, nous utiliserons un test statistique permettant de considérer séparément les mesures obtenues sur les deux yeux d’un même animal, plutôt que leur moyenne, afin d'augmenter la puissance statistique.
Raffinement
Les animaux seront stabulés avec l’enrichissement classiquement utilisé dans notre animalerie (matériel de nidification). Les tests consistent en deux modalités d’imagerie non invasive (OCT et fond d’œil), ainsi que des enregistrements électrorétinographiques. Les deux premières procédures seront effectuées sur une même anesthésie gazeuse (15 minutes au maximum) afin d’obtenir l’immobilité de l’animal. Du gel ophtalmologique sera appliqué sur les deux cornées dès que l’animal sera endormi, ainsi qu’à la fin de la séance d’imagerie, afin d’éviter tout desséchement cornéen. L’animal sera placé sur un coussin chauffant pendant l’imagerie et jusqu’à son réveil, qui intervient très rapidement après une anesthésie courte comme ici. L’électrorétinographie nécessite une anesthésie plus longue et sans mouvements oculaires pouvant nuire à la stabilité des enregistrements, comme parfois observés sous isoflurane. Les animaux seront donc anesthésiés à travers l’injection intra-péritonéal d’un mélange de kétamine et de médétomidine, et maintenus sur un coussin chauffant avec du gel ophtalmique appliqué sur les deux cornées. Des électrodes DTL (fins filaments souples) seront préférés aux anneaux d’or souvent utilisés chez l’animal. Les animaux seront euthanasiés avant leur réveil par dislocation cervicale soit à la fin de l’imagerie (4 animaux par génotype et par sexe), soit après les enregistrements électrorétinographiques (8 animaux par génotype et par sexe).
Choix des espèces
Obtenir des données structurelles et fonctionnelles sur la rétine, facilement transposables à la clinique humaine, ne peut se faire que sur des modèles vertébrés, l’œil de invertébrés étant très différent dans son organisation. Parmi les espèces dans lesquelles l’inactivation ou la mutation ponctuelle d’un gène peuvent être facilement obtenues, le poisson zèbre ne peut être retenu, car il possède deux autres gènes très proches du gène d’intérêt, rendant délicat la modélisation d’une perte de copie ou d’une mutation ponctuelle de ce gène. Le modèle murin hétérozygote est par contre bien caractérisé et reproduit de nombreux symptômes des patients atteints du syndrome DYRK1A. Plusieurs lignées avec des mutations ponctuelles sont déjà disponibles. La souris nous semble donc l’animal modèle le mieux adapté pour mener à bien le présent projet. Les souris devant être sacrifiées à 8 semaines pour des prélèvements histologiques, l’évaluation ophtalmologique sera réalisée au cours de la 8ème semaine, les animaux étant euthanasiés avant le réveil de l’anesthésie. A cet âge, la morphologie de la rétine est bien établie et les réponses électrorétinographiques stables.