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Validation d’un traitement pour la maladie de Parkinson chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour tester un peptide censé franchir la barrière qui protège le cerveau et freiner l'accumulation d'alpha-synucléine en cause dans la maladie de Parkinson, 40 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie de 30 à 40 minutes pour provoquer cette accumulation dans son cerveau, puis des injections sous la peau cinq jours par semaine pendant deux ou quatre semaines, et une ouverture du thorax lors de sa mise à mort, pour perfuser le cœur et fixer les tissus. Le porteur cite une douleur "modérée et transitoire" après la chirurgie et le stress de la contention lors des injections, et prévoit des "points d'alerte en amont des points limites" sans en donner les seuils. Sur le remplacement, il affirme qu'il "n'existe pas à ce jour d'alternatives à l'expérimentation animale" pour prouver l'efficacité et la sécurité du peptide, la démonstration de son "innocuité" exigeant selon lui un système immunitaire fonctionnel.
Objectifs
La plupart des molécules destinées à la thérapie de maladies neurodégénératives qui ont une efficacité in vivo n'atteignent pas leurs cibles parce qu'elles sont incapables de traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui protège le cerveau chez les vertébrés et même les invertébrés. L'une des stratégies non invasives les plus prometteuses pour l'administration de médicaments au système nerveux central (SNC) est l'utilisation de peptides qui traversent la BHE. Ces peptides sont capables d'améliorer le passage des composés à travers la BHE sans en altérer l'intégrité. Ils sont économiques, chimiquement polyvalents et non immunogènes selon des résultats déjà obtenus chez la souris saine. De plus, ces peptides combinent un ciblage sélectif et spécifique. Ils sont mieux adaptés que les petites molécules, ils présentent une faible toxicité et sont moins enclins à générer des mécanismes de résistance aux médicaments administrés de façon quotidienne à long terme. La maladie de Parkinson est reconnue comme la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente. Cette pathologie touche environ 1% de la population de plus de 60 ans. La prévalence de la maladie augmente avec l'âge. Le coût économique direct et indirect estimé par patient tourne autour de 100.000 euros. Les traitements existants ne sont pas curatifs et ont des effets secondaires importants. Il s'agit donc d'une pathologie qui nécessite de développer des nouvelles approches thérapeutiques. La thérapie ici proposée utilise les dernières avancées en termes d’ingénierie peptidique pour permettre une pénétrance de la BHE optimisée, et combine cela à une stratégie d’arrêt d’accumulation de la protéine alpha-synucléine qui est clé dans le développement de la maladie de Parkinson. On testera ainsi l’effet protecteur de peptides anti-agrégation d’alpha-synucléine embarqués dans une navette qui les aide à traverser le BHE et arriver au cerveau de la souris parkinsonienne après avoir été injectés sous la peau.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour soigner la maladie de Parkinson, les traitements non-invasifs actuels ne traitent que les symptômes et ont, à terme, des effets secondaires assez importants, menant certains patients à arrêter le traitement. C’est pour cette raison que des nouvelles thérapies non-invasives sont toujours nécessaires. Le traitement que nous proposons est un peptide thérapeutique qui bloque l’interaction entre deux protéines dérégulées dans cette pathologie, une phosphatase et une kinase, et empêche ainsi l’accumulation pathologique d’alpha-synucléine. Ceci devrait conduire à une modification significative de la progression de la maladie de Parkinson si le traitement est administré précocement après le diagnostic.
Procédures
Les souris adultes seront sujettes à une seule procédure chirurgicale (30-40min) pour induire l’accumulation d’alpha-synucléine dans le cerveau, puis à un traitement par administration du médicament 5 jours par semaine (5min/jour) pendant 2 ou 4 semaines selon les groupes expérimentaux. Les souris seront pesées toutes les semaines. Lors de d’euthanasie les animaux subiront une thoracotomie pour permettre une perfusion intracardiaque et fixation des tissus.
Impact sur les animaux
Délivrer l’alpha-synucléine dans le cerveau nécessite une chirurgie ce qui peut entrainer une douleur modérée et transitoire péri-opératoire. Le traitement par injection sous la peau journalière pendant 2 à 4 semaines peut entrainer également un stress de manipulation/contention de l’animal. Une pesée hebdomadaire sera effectuée pour contrôler la normalité de la courbe de poids tout au long de l’expérience.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour d’alternatives à l’expérimentation animale pour faire la preuve de concept d’efficacité et sécurité de notre thérapie/peptide. Il est nécessaire de prouver une efficacité de passage de la BHE en conditions physiologiques chez le modèle animal rongeur puis une bonne distribution dans les régions ciblées dans le cerveau. De même, la démonstration de l’innocuité du traitement impose la présence d’un système immunitaire fonctionnel ce qui est absente dans les cultures cellulaires. Cela justifie donc l’utilisation des modèles murins.
Réduction
Une simulation statistique précise a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu de la variabilité de la technique d’analyse prévue (histologie). Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les résultats que nous avons observés dans le passé lors d’expériences similaires menées dans le laboratoire.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi, fournissant une palette de stimulations cognitives et motrices pour les animaux, et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés qui vont du soutien nutritionnel adapté à l’administration de médicaments. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Le protocole d’anesthésie et d’analgésie de la procédure chirurgicale a été défini et validé par une équipe vétérinaire et est implémenté en routine dans le laboratoire avec des résultats satisfaisants. Les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation à l’arrivée dans l’animalerie, de récupération après chirurgie et d’adaptation à la manipulation pour traitement quotidien qui ont pour objectif de garantir des conditions physiologiques et d’assurer un minimum de souffrance et stress pendant le protocole. La surveillance rapprochée et la mise en place de points limites (et de points d’alerte en amont des points limites) permettent d’évaluer une perte de poids, une infection, un changement de comportement en lien avec une douleur/ nuisance liée aux interventions.
Choix des espèces
Les régions les plus touchées du cerveau des patients atteints de la maladie de Parkinson sont la substance noire, où résident les noyaux des neurones dopaminergiques, et le striatum où se trouvent leurs terminaisons. Les modèles invertébrés ne possèdent pas de striatum. Les souris envisagées dans ce projet permettent d’étudier les neurones ciblés dans leur environnement cérébral complexe. De la même façon, les peptides utilisés dans ce projet doivent traverser une BHE, ce qui est difficilement atteignable sur des cultures cellulaires. La maladie de Parkinson est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Pour cette raison, les animaux utilisés dans le protocole seront des animaux adultes avant le début de l’induction de l’agrégation d’alpha-synucléine et du traitement pour réduire ou empêcher son agrégation. De plus, l’innocuité du traitement et l’efficacité de passage à travers la BHE nécessite une physiopathologie adulte pour augmenter la fiabilité de la prédiction des résultats chez l’homme.
Evaluation de l’efficacité d’un candidat médicament, le masitinib dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de son impact sur la réponse inflammatoire à l’aide d’un modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE).
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 189 étant classées en souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par trois injections pour reproduire une paralysie progressive des muscles proche de la sclérose latérale amyotrophique, avec administration orale de masitinib jusqu'à 42 jours et tests moteurs hebdomadaires de force, coordination et endurance. Le porteur décrit un déficit moteur menant à des paralysies chroniques et une perte de poids, et indique qu'aucun animal ne pourra être réutilisé du fait de ces signes irréversibles. Il présente l'évaluation du masitinib comme "critique et nécessaire" pour renseigner les agences réglementaires et affirme que le modèle animal est "indispensable et non substituable".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative neuromusculaire qui conduit généralement au décès des patients dans les 3 à 5 ans qui suivent le diagnostic. Elle se caractérise par un déficit moteur puis une paralysie progressive des muscles (incapacité à marcher, manger, parler, respirer). Cette paralysie est dû à la mort progresse des cellules nerveuses dans le cerveau et dans la moelle épinière. La SLA est la plus fréquente des maladies du neurone moteur (2.7 cas/an pour 100 000 habitants en France). Il n’existe aucun traitement curatif à ce jour. Un seul traitement est approuvé en Europe, le Riluzole (Zentiva) qui ralenti modestement l’évolution fatidique de la maladie. Le besoin médical est donc urgent et critique. Le masitinib est une molécule qui un effet protecteur des neurones dans le système nerveux central et périphérique. Il actuellement est en dernière phase de développement clinique pour la SLA et la sclérose en plaque (SEP). Cette molécule a reçu la désignation de médicament orphelin dans la SLA à la fois de l’Agence Européenne du Médicament (EMA) et de la Food and Drug Administration américaine (FDA). En 2023, la FDA a validé une molécule appelée neurofilament comme marquer de l’efficacité d’un candidat médicament pour les maladies du système nerveux. Le but de ce projet est d’étudier l’impact du masitinib sur la libération de ces marqueurs comme le demande la FDA. De plus, la mise en perspective des signes cliniques et des analyses biomoléculaires effectués sur les prélèvements de sang permettra également de comprendre les mécanismes biologiques conduisant à la maladie. Le modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle le plus couramment utilisé pour étudier les maladies neurodégénératives telles que la SLA, SEP, la maladie de Huntington (HD),…. L’EAE a été choisi pour ces nombreuses similitudes avec la SLA: - Les signes cliniques : déficit moteur lié à la mort progressive des cellules nerveuses - Les mécanismes biologiques impliqués (comme l’inflammation) qui conduisent à la mort des motoneurones - Les marqueurs de la maladie tels que les neurofilaments demandés par les agences règlementaires.
Bénéfices attendus
Le masitinib est actuellement à la fin de sa phase de développement clinique dans plusieurs pathologies neurodégénératives dont la SLA, la SEP et la maladie d’Alzheimer. Il a d’ores et déjà reçu la désignation de médicament orphelin pour la SLA à la fois de l’EMA et de la FDA. En 2023, la FDA a validé l’application d’une molécule appelée neurofilament comme marqueurs des pathologies neuro-dégénératives. Ce marqueur est un point de terminaison nécessaire aux développements d’un candidat médicament. Il est donc aujourd’hui critique et nécessaire d’évaluer l’impact des nouvelles thérapies, dont le masitinib, sur le taux de neurofilament dans des modèles précliniques dédié à la SEP et la SLA. Les résultats de ce projet permettront donc de renseigner les agences réglementaires et ainsi d’accélérer la mise à disposition du masitinib aux patients, avant même l’achèvement des études cliniques en cours. Le masitinib pourrait ainsi devenir la première molécule thérapeutique dans le traitement de la SLA. Par ailleurs, la mise en perspective des modifications des signes cliniques avec les analyses biologiques des échantillons de sang permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de la molécule et potentiellement d’étendre son utilisation à d’autres pathologies (Parkinson et Huntington) qui partagent les mêmes marqueurs et certains mécanismes biologiques.
Procédures
Le modèle utilisé consiste à induire les signes cliniques en stimulant le système immunitaire. L’induction de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est effectuée en 3 injections : 1 injection en sous-cutanée et 2 injections en intrapéritonéale. Pour étudier l’action neuro-protectrice du masitinib, la molécule sera administrée par voie orale 1 fois par jour pendant au maximum 42 jours. Tout au long de la période expérimentale, les souris feront l’objet d’un suivi très étroit : - observations quotidiennes. - Enregistrement du poids et les observations cliniques au minimum 3 fois/semaine - Evaluation des capacités motrices (force, coordination, endurance) 1 fois par semaine Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. A l’issu de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont essentiellement liées au modèle EAE et les signes cliniques associés: - L’induction se fait par une injection d’un produit qui peut être irritant. En effet, le produit injecté induit une réaction inflammatoire désiré sur le même principe que la vaccination. Cette réaction peut générer une douleur modérée et transitoire (
Devenir
Le modèle d’EAE utilisé reproduit chez l’animal les signes cliniques de la SLA. Aucun animal ne pourra donc être réutilisé en raison de ces signes sévères, irréversibles et inévitables. A la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le masitinib est actuellement en phase final de développement clinique et a donc été caractérisé de manière très précise par des études préalables. Pourtant, aucune de ces études vitro ou ex-vivo n’a pu permettre d’étudier les liens entre les mutations génétiques, les mécanismes moléculaires et les signes cliniques. En effet, les maladies neurodégénératives comme la SLA sont des maladies multifactorielles et complexes. Ces maladies ne peuvent être réduites à une simple mutation ou à un simple mécanisme dans des cellules isolées. Le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour : •Analyser les paramètres biologiques tels que la réponse immunitaire, l’accès de la molécule au cerveau, l’évolution des marqueurs au cours du traitement comme le demande les agences règlementaires (FDA). •Valider l’effet du médicament sur les signes cliniques et donc confirmer le mécanisme d’action à l’échelle moléculaire.
Réduction
Le candidat médicament testé est le masitinib qui est actuellement en phase final de développement clinique. La toxicité de la molécule et les schémas de traitement sont donc parfaitement maîtrisés. Le nombre d’animaux utilisé sera donc réduit au strict minimum pour répondre à la problématique du projet. Le nombre d’animaux a été déterminé mathématiquement sur la base d’une méthode validé et consensuelle de façon à n’utiliser que le strict minimum d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. D’après les calculs, le nombre d’animaux à utiliser est de 13 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux par groupe est inférieur aux effectifs communément utilisés (± 15 animaux par groupe) dans le cadre des recherches académiques ou dans les laboratoires de recherche privés.
Raffinement
Pendant toute la durée du projet, les souris sont suivies quotidiennement, leur poids sera enregistré et les observations cliniques seront évaluées 3 fois par semaine. L’EAE est un modèle très utilisé et très bien décrit. Dans la majorité des publications, la progression de la maladie est évaluée sur la base des observations cliniques selon un scoring strict, validé et utilisé par l’ensemble de laboratoire utilisant ce modèle. Dans ce projet, nous allons utiliser plusieurs méthodes de mesures indépendantes (score + poids + 2 tests de performances musculaires) pour garantir une évaluation précise, quantitative et donc objective de l’évolution de la maladie. Le croisement des informations facilitera les analyses et permettra conclusion étayée par plusieurs variables. Cette analyse associée à la parfaite connaissance du modèle d’EAE, permettra de prévenir de manière plus précoce l’apparition des signes cliniques dommageable. De plus, une attention particulière sera prêtée à l’environnement local, étant donné que les animaux ayant contracté l’EAE présenteront des déficits moteurs significatifs. Les cages comporteront un sol en dur, une litière de sciure, des refuges et des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger. Des pellets mouillés (disposées sur le fond de la cage) et un complément alimentaire gélifié (riche en eau et en ions) seront apportés aux animaux pour faciliter la nutrition et à l’hydratation.
Choix des espèces
Le modèle d’EAE a été choisi par ce que c’est un modèle éprouvé et largement utilisé pour étudier les maladies neurodégénératives tel que la SLA, sclérose en plaque (SEP) ou encore la maladie de Huntington (HD). Pour étudier le masitinib, l’EAE a été choisi pour ces nombreuses similitudes avec la SLA: - Les signes cliniques: déficit moteur progressif menant à la paralysie des muscles - les mécanismes : inflammation du système nerveux central et périphérique qui entraîne la mort des cellules nerveuses - Les marqueurs de la maladie: neurofilament qui est désormais demandé par les agences règlementaires Le modèle d’EAE est développé et utilisé uniquement sur des souris. Ce modèle mime parfaitement la SLA et la SEP qui se développe très majoritairement chez les adultes. De plus, en termes de méthode, l’ensemble des publications indiquent qu’il faut utiliser des souris de 9-13 semaines lors de l’induction. Nous utiliserons par conséquent dans ce projet des souris adultes. Les animaux utilisés seront uniquement des femelles comme préconisé par la littérature scientifique. En effet, il existe une différence significative entre les 2 sexes. Les femelles sont beaucoup plus sensibles à l'induction que les mâles : - Le taux d’immunisation est supérieur chez la femelle que chez le mâle ce qui aura pour conséquence la réduction du nombre d’animaux dans ce projet. - Les signes cliniques sont plus marqués chez la femelle que chez le mâle, les effets seront donc plus marqué ce qui améliore la significativité des résultats.
II : Approche thérapeutique pour lutter contre une maladie neurodégénérative : validation d’un candidat médicament
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
648 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour un modèle de maladie neurodégénérative, elles reçoivent un candidat médicament par mini-pompe implantée ou par régime alimentaire pendant jusqu'à dix mois, avec prélèvements sanguins mensuels et tests comportementaux impliquant isolement de 48 heures et jeûne de 24 heures. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable majeur ni perte d'autonomie liés au phénotype, et tue les animaux pour prélever leur cerveau. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit fidèlement les traits comportementaux de la maladie.
Objectifs
Notre projet vise à développer une thérapie contre une maladie neurodégénérative liée à un défaut génétique bien identifié responsable de nombreux dérèglements dans la physiologie des neurones. En utilisant un système in vitro innovant, nous avons identifié qu’une molécule était capable de restaurer un des défauts moléculaires dans les neurones d’un modèle souris de la maladie. Cette étude a permis de démontrer que le traitement améliore les défauts moteurs et cognitifs de l’animal après 1 mois de traitement. Cette première étude nous a également permis de caractériser précisément le mécanisme d’action cellulaire et moléculaire du candidat médicament. Le projet a pour objectif d’identifier un schéma de traitement transposable à l’homme confirmant l’intérêt thérapeutique du candidat médicament.
Bénéfices attendus
Nous cherchons à définir les bénéfices d’un traitement long terme chez des animaux à différents stades d’avancement de la maladie, reflétant la situation chez les patients et permettant de définir le meilleur schéma de traitement à envisager dans des études cliniques. En parallèle, nous travaillons à la caractérisation du mode et du mécanisme d’action moléculaire associé au candidat médicament. Ces études sont fondamentales pour la construction d’une stratégie clinique cohérente puisqu’elles nous permettront de décider s’il est pertinent ou non d’initier le traitement avant le développement des symptômes chez les patients, mais aussi de définir une durée de traitement et une posologie (dose, nombre prise par jour) adaptées.
Procédures
Une partie des animaux seront traités pendant un mois grâce à un dispositif vétérinaire assurant une délivrance continue de la molécule sans douleur ni atteinte du bien-être animal. L’installation de ce dispositif nécessitera une chirurgie sous-cutanée de 5 minutes maximum par animal. L’autre partie sera traitée grâce à un régime à façon spécialement formulé correspondant au régime habituel des animaux dans lequel la molécule est intégrée. Toutes les souris seront traitées avec le régime à façon sur une durée maximale de 10 mois. Pendant toute la durée du traitement, un prélèvement mensuel de sang (5min/animal) sera effectué après le début du régime afin de vérifier que le médicament est bien passé dans le sang (entre 3 et 10 prélèvements au total en fonction des groupes). Enfin, des tests comportementaux (tests de 30 min max hormis pour 1 test réalisé sur 48h) destinés à étudier l’effet du traitement sur les comportements anxio-depressif et locomoteurs des animaux seront effectués.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé dans cette étude est un modèle largement utilisé dont le phénotype évoluera avec l’âge, occasionnant l’apparition de symptômes cognitifs et moteurs qui sont uniquement décelés à l’aide de tests comportementaux fins conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnement pas de perte d’autonomie, et pas de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons donc pas à observer d’altérations significatives de la qualité de vie, ni de mort prématurée chez ces animaux dû au phénotype. Nous pouvons identifier 3 nuisances légères : 1/ une potentielle douleur de nature interventionnelle : induction potentielle d'une légère inflammation due à la mise en place d'une mini-pompe. 2/ une légère douleur due aux prélèvements sanguins mensuels. 3/ une gêne potentiellement attendue sur les animaux lors de l’expérimentation, à savoir l’induction d’un stress léger lors de certains tests comportementaux impliquant soit un isolement prolongé de 48h afin d’analyser l’activité et le métabolisme de l’animal, soit une mise à jeun de 24h afin d’analyser l’anxiété de l’animal.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études immunohistochimiques et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes du traitement.
Remplacement
Nous avons précédemment démontré sur un modèle cellulaire in vitro que le candidat médicament permettait de restaurer les défauts de transports neuronaux, caractéristiques de la maladie neurodégénérative que vous étudions. Ces résultats nous ont permis de démontrer le potentiel thérapeutique de notre molécule. L’étape actuelle consiste donc à démontrer que ces restaurations du transport neuronal se traduisent en amélioration des symptômes de la maladie. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle in vitro ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.
Réduction
La procédure 2 sera réalisée uniquement si la procédure 1 est validée. Dans nos deux axes d’étude, nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post- mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Pour chacun des axes, dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement lors de l‘analyse des données afin d’augmenter la puissance des tests statistiques. Dans notre étude visant à caractériser l’efficacité du traitement à long terme à différents stades d’évolution de la maladie, nous ne prévoyons pas de traiter avec notre composé les animaux sains. En effet, nous avons déjà testé précédemment l‘effet de notre composé sur un nombre réduit d’animaux sains et nous n‘avons observé aucune toxicité, et aucune altération du comportement. Cela permet donc d‘éliminer plusieurs conditions expérimentales, dans un principe de réduction du nombre total d‘animaux utilisés.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages de polycarbonate autoclavées, de dimension 192 mm x 170 mm x 421 mm (
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de notre pathologie d’intérêt. Pour cela, nous utilisons des souris issues de la transgénèse classique. Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la protéine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les maladies neurodégénératives se développent dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme. Le candidat médicament que nous développons est donc destiné à des adultes raison pour laquelle nous réalisons notre étude sur des animaux à l’âge adulte. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8 ou 12 mois car c’est à partir de 6 mois qu’ils commencent à développer des troubles moteurs et cognitifs observables en étude de comportement.
Détermination de la toxicocinétique d’un candidat médicament en vue de son utilisation clinique dans la lutte contre la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
52 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 36 en gravité sévère. Elles reçoivent chaque matin pendant onze jours, par voie orale, un candidat médicament contre la maladie de Huntington à doses croissantes, avec des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tuées pour examiner leurs organes et l'atteinte du cerveau, pour mesurer la toxicité du composé. Le porteur reconnaît qu'aux fortes doses la molécule peut provoquer une toxicité et des signes d'inconfort. Il affirme que les études de toxicité sont "obligatoirement" réalisées chez l'animal et constituent une "étape indispensable" avant tout médicament.
Objectifs
La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Un candidat médicament capable de réparer l’activité des neurones humains et de souris a été identifié. Il a été montré qu’un traitement sous cutané avec cette molécule permettait d’améliorer les troubles du mouvements et psychiatriques de la souris atteinte de la maladie de Huntington. Afin de développer un médicament pour les patients atteints de la maladie de Huntington à partir de cette molécule, nous allons dans ce projet : 1/ identifier les éventuels effets toxiques d’une prise répétée à différentes doses de la molécule et 2/ évaluer les effets de plusieurs doses d’administration. Cette molécule est un traitement potentiel pour la maladie de Huntington qui n’a jamais été utilisée auparavant et qui mérite d’être étudiée.
Bénéfices attendus
Il a été démontré que l'administration d’une seule dose de cette molécule avait un effet thérapeutique chez les souris atteintes de maladie de Huntington sans induire de toxicité. Afin de développer un traitement pour les malades, nous allons ici étudier l’effet de cette molécule administrée en dose répétée et voir quelles sont les meilleures doses répétées pour avoir un effet thérapeutique sans toxicité.
Procédures
Le traitement sera réalisé par voie orale tous les matins pendant 11 jours. Ce geste, d’une durée inférieure à 10 secondes, est bien toléré par l’animal. Un prélèvement sanguin sera réalisé à l'extrémité de la queue de l'animal à trois temps différents après gavage, le premier et le dernier jour du traitement. 30 secondes seront nécessaires au prélèvement sanguin et n’engendrera qu’un léger stress à l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris d’âge adulte. Le traitement sera administré oralement, voie d’administration obligatoire car c’est celle qui sera utilisée chez l’homme. La contention et l’administration orale peuvent engendrer un léger stress chez l’animal. Une toxicité induite par le traitement est possible aux fortes doses, se traduisant par des signes d’inconfort chez l’animal.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'observer l'aspect des différents organes après administration du traitement ainsi que de mesurer l’atteinte du cerveau par cette molécule.
Remplacement
Les études de toxicité sont obligatoirement réalisées chez l’animal. Elles sont une étape indispensable à la validation d’une molécule avant d’en envisager son utilisation comme médicament chez le patient. Notre étude permettra de documenter les éventuels effets toxiques de cette molécule et aidera à définir les doses répétées à utiliser.
Réduction
Pour cette procédure, nous limitons le nombre d’animaux au minimum afin de pouvoir réaliser des analyses quantifiables et reproductibles. Au final, les animaux seront répartis dans 13 groupes de 4 animaux. Ces effectifs seront suffisants pour calculer les valeurs de concentrations de la molécule dans le sang et pour doser les différents paramètres de toxicité. Également, cet effectif sera suffisant pour nous permettre d’écarter le risque de conclure à une toxicité macro ou micro qui serait due au hasard par des analyses statistiques.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages en respectant les normes en vigueur. Les cages sont équipées de litière (avec possibilité de faire un nid) et d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, le tout changé toutes les semaines. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement par gavage sera réalisé par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à préparer les études de toxicité réglementaires qui seront réalisées sur animaux adultes, notre étude sera également réalisée sur des animaux adultes.
Evaluation de l’efficacité de l’injection de vecteurs thérapeutiques et de l’utilisation des ultrasons focalisés dans un modèle d’épilepsie néonatale liée au gène Kcnq2.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation du gène Kcnq2 responsable d'une épilepsie, elles reçoivent dès un à cinq jours de vie des injections de vecteurs dans le cerveau, sous anesthésie par le froid pour les nouveau-nés, puis des ultrasons focalisés déclenchent des crises et des tests de comportement évaluent leur développement, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les crises spontanées peuvent conduire à la mort de l'animal et décrit la séparation précoce d'avec la mère. Il affirme que les cellules isolées ne reproduisent pas un "cerveau entier" et présente cette lignée comme le seul modèle disponible de la maladie.
Objectifs
Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie chez l'Homme. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises durant les tous premiers mois de vie (avant 3 mois) et est accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Actuellement, il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle porteuse d'un variant récurrent du gène KCNQ2 qui reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Nous parlerons d'une souris mutée hétérozygote pour Kcnq2. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester des approches thérapeutiques. Le projet comporte la stabulation d'animaux à phénotype dommageable, leur traitement par injection de vecteurs thérapeutiques et l'évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d'épilepsie et du comportement. Les vecteurs thérapeutiques seront délivrés dans le cerveau de souris mutées hétérozygotes pour Kcnq2 par des injections intracerébrales entre 1 et 5 jours post natal ou par voie veineuse dès 15 jours post-natal. L’injection des vecteurs thérapeutiques dès P15 sera couplée à l’utilisation de la technique de FUS (ultrasons) permettant de faciliter l'entrée des vecteurs dans le cerveau. Nous avons pour objectif d'identifier un traitement qui apportera un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèles devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible. Nous réaliserons des tests de comportement afin d'évaluer le neurodéveloppement de nos souris.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité de nouvelles thérapies dans un modèle unique d'encéphalopathie épileptique. Si un vecteur thérapeutique s'avère efficace pour diminuer les crises d'épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d'essai clinique dans l'espèce humaine avec les neuropédiatres collaborateurs de notre équipe.
Procédures
Dans ce modèle de souris, les interventions sont : - biopsie auriculaire pour identification et génotypage (maximum 5 minutes)- anesthésie pour réalisation des injections thérapeutiques (maxiumum 20 minutes) - anesthésie pour pose de puce RFID (maximum 20 minutes) - induction des crises d'épilepsie par ultrasons (une seule sois, habituation de 30 minutes et soumission aux ultrasons de maximum 40 s) - des tests de comportement : apprentissage, mémorisation et préférence sociale (selon les tests de comportement, la durée varie entre 1h et plusieurs blocks sur une semaine) - anesthésie profonde terminale (l’injection dure moins de 2 minutes)
Impact sur les animaux
Dans ce modèle de souris, les effets indésirables sont: - crises épileptiques spontanées conduisant à la mort de l'animal - séparation de la mère pour les nouveau-nés et les animaux de 15 jours pour l'injection et l'implantation de la puce pour les P15 - anesthésie sur glace pour les nouveau-nés avant injection et tatouage de la patte et à l'isoflurane chez les animaux de 15 jours avant injection ou implantation de la puce d'identification et avant perfusion terminale - biopsie auriculaire à l’aide d’un biopsy punch pour les animaux de 13 jours - injections thérapeutiques réalisées sous anesthésie- déclenchement des crises d'épilepsie par ultrasons - stress lié aux tests comportementaux - stress lié à la contention pour les injections avant perfusion et euthanasie des animaux de 15 jours
Devenir
Les animaux sont conservés pendant la durée de l'expérimentation (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques) puis mis à mort afin de prélever le cerveau pour réaliser des analyses immunohistologiques et biochimiques (transcriptomiques et protéomiques). D'autres organes tels que le foie seront également prélevés afin de réaliser des contrôles supplémentaires de notre expérimentation et dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Remplacement
Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l'Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les vecteurs thérapeutiques candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites. L'étude de l’impact d’un traitement par injection de vecteurs thérapeutiques sur les capacités d'apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l'animal vivant.
Réduction
Dans le but de permettre l’obtention de résultats significatifs à partir de nos recherches, chaque groupe de souris (traité ou placebo) doit être composé de 12 animaux. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les vecteurs thérapeutiques candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Par ailleurs nous prélevons le maximum d'organes (cerveau, foie, sang) sur la même souris afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
L'hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux. Ils sont hébergés, au maximum par 5, dans des cages avec enrichissements (dôme et bandelettes de carton), eau et nourriture ad libitum. La température, la luminosité, l'environnement sonore et l'hygrométrie sont contrôlés. Les animaux sont hébergés dans une pièce avec peu de passage. Une affiche sera positionnée sur la porte indiquant le caractère sensible des souris, en particulier pour l'exposition sonore. Le personnel animalier et les utilisateurs seront formés et s’assureront de ne pas faire de bruit aux alentours des cages. La pièce de stabulation est directement située en face de la pièce d’expérimentation. Le change et le suivi seront réalisés par des personnes sensibilisées à la spécificité de cette lignée. La méthode d'administration du traitement la moins contraignante sera utilisée dans le cadre du respect de la douleur éventuelle et du stress de l’animal. Les crises d'épilepsie spontanées ou induites par les ultrasons durent quelques secondes et induisent généralement le décès de l'animal. Si la crise intervient en présence d'un expérimentateur, une stimulation des pattes et un massage du corps de l'animal permet de le sauver. La mère des nouveau-nés sera conditionnée aux manipulations et exposée aux odeurs qu’elle risque de rencontrer pendant 7 à 10 jours avant la procédure. Nous réalisons une anesthésie profonde des animaux avant les injections ou l'implantation de la puce. Pour les animaux nouveau-nés, nous profitons de l'anesthésie pour les identifier avec de l’encre sous une des pattes pour les différencier. Nous ferons le génotypage a posteriori sur prélèvement post-mortem afin de moins perturber les nouveau-nés et la mère. Les animaux de 15 jours injectés seront génotypés par prélèvement d’un morceau d’oreille à 13 jours qui permet de les marquer. Les animaux injectés à un stade ultérieur seront génotypés lors du sevrage. Nous instillerons un anesthésique local sur l'œil injecté et un gel oculaire sur l'autre cornée. La profondeur de l’anesthésie sera attestée par une respiration profonde et régulière, une absence de réflexe de retrait et palpébral chez les souris de 15 jours. Les tests de comportement présentent une phase d’habituation. Nous réalisons une anesthésie profonde ou euthanasie avant tout prélèvement de tissu
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les injections de vecteurs thérapeutiques seront réalisées à différents stades : 2 groupes entre 1 et 15 jours post natal, deux groupes entre le sevrage et l'âge adulte - 1 à 5 jours post natal: pour un traitement en préventif - 15 jours post natal c’est-à-dire deux semaines avant l’apparition des premières crises - 30 jours post natal au moment des crises spontanées -90 jours post natal afin de voir si une injection tardive permet d’améliorer les capacités cognitives des souris
Effet de l’entrainement physique sur la santé cérébrale
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur un tapis pendant quatre à huit semaines pour induire une fatigue physique et mentale, puis subissent huit tests comportementaux non précisés, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau, afin de mettre au point un modèle de fatigue cognitive liée au sport. Le porteur reconnaît que l'entraînement fatigue les animaux et que les tests provoquent un stress modéré. Il indique que ce projet mené avec trois industriels servira ensuite à tester un extrait végétal, et affirme que le modèle "ne peut pas être développé in vitro".
Objectifs
L'exercice intense et répété est associé à une fatigue cognitive. Un des objectifs des industriels est de développer des compléments alimentaires qui réduisent la fatigue cognitive associée à la pratique sportive intense et régulière. Ainsi, ce projet s’inscrit dans le cadre d’un partenariat entre 2 laboratoires académiques et 3 industriels afin de démontrer l’efficacité d’un extrait végétal sur les performances cognitives et la fatigue après un entrainement physique intense chez la souris ainsi que les mécanismes d’action. Cette partie de projet dont il est question dans cette demande d'autorisation de projet (DAP) vise à développer un modèle d’entrainement physique en utilisant un tapis de courses qui induit une fatigue physique et mentale. La suite de ce projet (qui sera soumis dans une autre DAP) sera de déterminer si la supplémentation nutritionnelle avec l’extrait végétal améliore ces états.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif de mettre en place au laboratoire le modèle d’entrainement physique chez la souris afin de tester, par la suite, dans une autre DAP, l’effet d’extraits végétaux sur les paramètres mesurés dans ce projet. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de recherche portant sur la nutrition préventive et personnalisée. Les résultats attendus sont donc une amélioration des symptômes de troubles de la fatigue chez les souris et une amélioration des comportements anxieux et cognitifs. L'objectif général de ce projet est de valider l'efficacité d'un complément alimentaire en vue de réduire la fatigue cognitive associée à la pratique sportive intense et répétée.
Procédures
Les animaux réaliseront un entrainement physique pendant 4 ou 8 semaines après lequel ils effectueront 8 tests comportementaux qui durent au maximum 10 minutes afin d'évaluer leur fatigue physique ou mentale.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux induiront des stress modérés aux animaux le temps de ces dits tests qui ne durent pas plus de 10 minutes. L'entrainement physique des animaux induira une fatigue.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer le cerveau et réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Le modèle d’entrainement physique ne peut pas être développé in vitro. L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives et de la fatigue ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au mieux en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. D’après les études scientifiques sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 10 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.
Raffinement
Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique et sédation avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. Les tapis de course que nous avons acquis insufflent de l’air pour encourager les animaux à courir et n’induisent pas de choc électrique comme la majorité des tapis utilisés. L’hébergement se fera à 5 souris/cage et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. Les expérimentateurs et soigneurs sont titulaires de leur certificat d’expérimentation animale niveau concepteur et/ou opérateur. Les expérimentateurs travaillent avec des animaux depuis de nombreuses années et sont très fortement sensibilisés au sujet du bien-être animal de par leur thématique de recherche (stress, anxiété, bien-être cérébral) et de par le travail de la cellule SBEA. La SBEA procède à des contrôles réguliers de respect des procédures et de bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. La souris est un mammifère comme l’Homme, avec des cycles de reproduction rapides. Il est largement utilisé dans le champ de la cognition, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec les études antérieures. C’est un animal sur lequel les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. L'objectif du projet est d'améliorer la fatigue cognitive de sportifs adultes. Les souris mâles et femelles arriveront à l’animalerie à l’âge adulte (3 mois).
Impact des récepteurs sérotoninergiques 5-HT7 sur la neuroinflammation dans un modèle de sclérose en plaque chez la souris : étude d’imagerie.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Témoins ou privées d'un récepteur, elles subissent trois séances d'imagerie cérébrale d'environ une heure sous anesthésie, avec pose d'un cathéter caudal et injection d'un radiotraceur, avant d'être tuées par surdosage pour prélever leur cerveau, afin d'étudier le rôle de récepteurs sérotoninergiques dans la neuroinflammation d'un modèle de sclérose en plaques. Le porteur indique qu'un produit ajouté à l'alimentation peut faire perdre 11 à 15 % du poids corporel les premières semaines, et signale un possible stress, une hypothermie légère et des hématomes. Il annonce une nouvelle piste thérapeutique au conditionnel et au long terme, et affirme que seules des études chez l'animal vivant reproduisent cette complexité.
Objectifs
Le projet porte sur la découverte de nouveaux traitements de la sclérose en plaque (SEP). Comme dans un grand nombre de maladies neurologiques, la SEP est associée à un processus inflammatoire à l’origine d’un déséquilibre des interactions entre les cellules du système nerveux central (SNC) et périphérique (SNP). Le projet est focalisé sur un neurotransmetteur (messager chimique permettant aux cellules nerveuses de communiquer avec d’autres cellules) majeur du SNC qui est aussi impliqué dans la communication avec le SNP. Ce neurotransmetteur agit en se liant sur différents récepteurs exprimés par les cellules, dont le rôle précis est encore mal élucidé. L’hypothèse innovante de notre projet est que des récepteurs sont impliqués dans les mécanismes inflammatoires associés au système neurotransmission. L’objectif général est de mieux comprendre ces mécanismes et d’ouvrir une nouvelle piste thérapeutique pour les maladies neuroinflammatoires dont la SEP, avec un médicament qui, via un effet sur ces récepteurs, permettra de moduler le processus d’inflammation dans le cerveau (neuroinflammation, NI). Pour cela, nous allons explorer cette NI en utilisant une méthode d’imagerie in vivo parfaitement validée dans le laboratoire, dans un modèle connu de SEP chez la souris. Ce modèle sera mis en œuvre chez des souris témoins et des souris n’exprimant pas le récepteur. L’hypothèse est que la NI induite dans le modèle sera exacerbée chez les souris transgéniques par rapport aux souris Témoins. Les résultats de cette étude nous permettra, dans une étape suivante du projet, d’évaluer les effets de nouveaux composés agissant sur ces récepteurs.
Bénéfices attendus
La finalité du projet est d’apporter de nouvelles connaissances dans le domaine des neurosciences et plus particulièrement celui des maladies neuroinflammatoires. Le bénéfice attendu à court terme est de mieux comprendre le rôle des récepteurs dans les mécanismes de neuroinflammation associés à une affection telle que la SEP. A plus long terme, il est de faire émerger une nouvelle piste thérapeutique pour la SEP, maladie neurodégénérative qui touche plus de 110 000 personnes en France, affecte le cerveau, la moëlle épinière et les nerfs optiques, et pour laquelle aucun traitement permettant de la guérir n’est actutellement disponible.
Procédures
L'imagerie durera environ 1h11, cette étude sera réalisée sous anesthésie générale, 3 fois sur chaque l’animal à trois âges différents. Les animaux seront soumis à la mise en place d’un cathéter à la veine caudale sous anesthésie générale, la durée est de 10 min. Les souris recevront une injection en intra-veineuse d'un radiotraceur d'une durée d'une minute et seront ensuite imagées pendant 60 min. L'étape suivante sera réalisée par surdosage d'anesthesie. A la suite de la constatation de l'arrêt des battements cardiaques, la chirurgie sera réalisée sur tous les animaux, elle durera 10 min.
Impact sur les animaux
Les explorations seront réalisées chez des souris témoins et trangéniques. Nuisances liés à l'administration d'une produit pharmacologique dans l'alimentation : les données connues indiquent une possible légère perte de poids. Dans une publication scientifique, il a été décrit que les animaux recevant une prise alimentaire avec le produit pharmacologique peut entraîner une diminution significative du poids corporel de 11 à 15% au cours des 5 premières semaines de traitement, avec un retour à la non significativité la 6ème semaine . Dans une publicartion scientifique plus récente utilisant les mêmes conditions expérimentales, il est mentionné qu’aucune souris n’est morte durant la période de traitement pour les souris transgéniques. Aucune différence en terme de développement, croissance, température corporelle, reproduction, fonctionnement neurologique n’a été décrite chez les souris transgéniques vs souris témoins. Nuisances liées à l'imagerie: possible stress lié à la manipulation des animaux, légère hypothermie induite par l'anesthésie générale et possibilité d'hématome suite au placement du cathéter poyur les souris trangéniques et témoins.
Devenir
Quarante huit heures après la 3ème séquence d’imagerie, tous les animaux seront mis à mort et leur cerveau prélevé afin de réaliser des études d’immuniohistochimie sur coupes.
Remplacement
Au cours d’une affection neurologique telle que la sclérose en plaque, les processus neuroinflammatoires résultent d’interactions complexes entre différents types cellulaires (neurones, cellules gliales) et moléculaires (libérations d’un grand nombre de facteurs chimiques), et sont intriquement liés au fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (interface cerveau/circulation sanguine). Seules des études chez l’animal vivant peuvent reproduire cette compléxité. De plus, la méthode d’imagerie que nous allons utiliser l’est également chez l’humain (même traceur radioactif), d’où une transposition plus facile des résultats que nous obtiendrons.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmmoins dicté par les groupes expérimentaux réquis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. Ainsi, chaque animal sera exploré par imagerie 3 fois au cours de sa vie. Nous prévoyons de réaliser les protocoles d’imagerie dans 2 séries expérimentales qui ne comporteront que des mâles ou que des femelles. En effet, le sexe semble être un facteur à prendre en compte dans ce projet car : - Il est connu que la SEP affecte deux à trois fois plus de femmes que d’hommes . Dans le modèle, on trouve des informations variées, indiquant une démyélinisation identique chez les mâles et les femelles , mais aussi une réponse fonctionnelle différente en fonction du sexe . Nous explorerons ainsi 2 groupes d’animaux / sexe, soit 15 mâles + 10 femelles transgéniques et 15 mâles + 10 femelles témoins, (afin d’assurer un minimum de 8 animaux à exploiter, par exemple en cas d’échec de l’injection intra-veineuse du traceur ou de mort au cours de l’imagerie). Les résultats seront analysés en utilisant des test stastiques appropriés.
Raffinement
Après la phase d’acclimatation, les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les souris seront observées une à 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort. Pour l’imagerie, les animaux auront une anesthésie gazeuse. Une protection occulaire sera appliquée pendant toute la durée de l’imagerie. L’animal sera maintenu durant toute l’expérimentation sur un tapis chauffant. Nous assurerons une surveillance continue du rythme respiratoire et de la température corporelle de l’animal et le surveillerons jusqu’à son réveil complet.
Choix des espèces
- La souris est un modèle de choix car les mécanismes inflammatoires responsables des dysfonctionnements neurologiques sont très similaires à ceux présents chez l’humain. - Le récepteur étudié est présent dans les deux espèces. - Le modèle de SEP que nous utiliserons est largement décrit et validé dans la littérature. - La taille du cerveau de la souris est compatible avec la résolution spatiale de la caméra microTEP (environ 1 mm). Nous utilisons des souris d'age adulte car : - la SEP touche une population adulte - le modèle étudié est déjà décrit à ce stade de la vie chez la souris
Evaluation des effets de nouvelles entités pharmacologiques sur le comportement agressif chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 1 000 tuées à l'issue et 2 000 réutilisées dans d'autres projets. Une partie, les "Résidents", est isolée jusqu'à dix semaines, tandis que les "Intrus" sont placés à répétition dans leur cage pour déclencher des confrontations, avec administration de composés jusqu'à quatre semaines, afin de tester des molécules sur l'agressivité. Le porteur reconnaît que l'isolement prolongé peut provoquer une "angoisse modérée" et que la contention et les injections induisent stress et brève douleur. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode de substitution" suffisante et présente la souris comme l'espèce la plus adaptée.
Objectifs
L’agressivité est un comportement humain ou animal qui se manifeste par de la violence envers autrui ou soi-même. Il s’agit d’un instinct biologique normal (défense, rivalité entre mâles pour la reproduction…) tant qu’il est canalisé mais l’agressivité peu devenir pathologique lorsqu’elle n’est plus maitrisée et être associée à différents troubles mentaux (paranoïa, trouble explosif intermittent, schizophrénie…). S’il existe des traitements possibles contre les diverses manifestations de l’agressivité (antipsychotiques, anti dépresseurs…) ces derniers présentent cependant de nombreuses limites (efficacité limitée, effets secondaires…). Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de nouvelles molécules synthétisées ou acquises au sein du laboratoire dans un modèle comportemental chez la souris permettant de mimer le symptôme de l’agressivité chez l’homme. Ce projet implique l’obtention de données comportementales chez l’animal nécessaires pour envisager la poursuite de développement de produits pharmacologiques chez l’humain.
Bénéfices attendus
A court terme, il s’agira de démontrer à l’aide de données précliniques l’efficacité potentielle de nouveaux produits pharmacologiques : les procédures mises en œuvre permettront de mesurer la capacité des molécules à moduler le comportement agressif de souris dans un test visant à cibler le comportement agressif humain, de les comparer et ainsi de choisir la meilleure selon des critères de sélection pour l’application thérapeutique choisie. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l’animal indispensables au processus de développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests chez l’Homme.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations dont la voie (orale, intrapéritonéale, sous-cutanée) , la fréquence d’administration (aigüe ou chronique, dans ce cas 2 administrations/jour max) ainsi que la durée (période maximale de 4 semaines) seront adaptées en fonction des objectifs de recherches. Les délais d'administration avant les phase de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration, une courte contention (
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les animaux recevront des administrations de composés avant les évaluations comportementales. Il est possible que la courte contention alors nécessaire (
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Certains animaux, les animaux Intrus, pourront cependant être réutilisés pour d’autres projets en fonction des objectifs de recherche si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée. La décision sera prise par le responsable projet (une personne compétente désignée par lui) ou le vétérinaire
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur le comportement agressif dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. Il n’existe à ce jour pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet c’est pourquoi l’utilisation de modèles in vivo est indispensable avant toute administration à l’homme, la souris étant ici l'espèce la plus adaptée.
Réduction
Un effectif minimum et suffisant de 10 animaux par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques. En fin de procédure, les animaux (en particulier les Intrus) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant toute expérimentation. Tout au long des études, les animaux sont hébergés en groupe (nombre maximal défini par la règlementation en cours) ou en cage individuelle selon les besoins de la procédure dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, Sizzle pad pour nidification…). Le change des cages se fait 1 à 2 fois par semaine. Les animaux sont observés chaque jour, et font l’objet d’un suivi par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-être Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. En cas d’atteinte d’un des points limites, l’animal est écarté de l'étude pour subir les soins essentiels ou être euthanasié si nécessaire. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et dispositif expérimental, phase de familiarisation aux manipulations, administrations…).
Choix des espèces
La souris est déjà largement caractérisée d’un point de vue comportemental et neurochimique et possède un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez la souris et les caractéristiques du comportement humain. C'est l'espèce animale la plus pertinente et couramment utilisée pour évaluer les effets de substances sur l’agressivité. Les animaux sont utilisés au stade adulte. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l’animal à d’autres stades de développement. De plus, le test d’agressivité décrit dans ce projet est classiquement réalisé dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités motrices et cognitives fonctionnelles.
Optimisation du ciblage par injection intracérébrale d’un produit de contraste couplé à un vecteur thérapeutique sur primate non humain pour augmenter l’efficacité du traitement des maladies neurodégénératives.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
14 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'environ quatre heures couplée à une IRM, huit prélèvements sanguins, sept ponctions lombaires, six IRM et quatre électromyogrammes, pour comparer deux méthodes d'injection intracérébrale d'un vecteur de thérapie génique visant la maladie de Huntington. Le porteur décrit les nuisances possibles, douleur crânienne, gêne à la cicatrice, hématomes gênant la mobilité et appréhension envers les expérimentateurs après chaque intervention. Il présente l'usage du primate comme "primordial" pour valider la procédure avant l'humain, au motif que son cerveau se rapproche du cerveau humain.
Objectifs
Certains virus (les AAV : Adeno-Associated virus = Virus associés aux Adénovirus) sont très efficaces pour transporter et exprimer des gènes d’intérêts dans des parties précises du système nerveux central, en particulier dans le cerveau. L’utilisation de ces virus non pathogènes et déja testés dans le cadre de traitements thérapeutiques pour d'autres maladies neurodégénératives constitue une approche de choix pour la maladie de Huntington. Le but de cette étude est multiple. Dans un premier temps elle permettra de tester la possibilité d’une injection au cours d’une séance d’imagerie par résonance Magnétique (IRM) permettant de pouvoir suivre en direct l’évolution, la diffusion de notre injection. Grace à cette étude nous pourrons également comparer la précision de nos injections au niveau de nos sites d’injection, en utilisant deux méthodes d’administration (injection avec produit de contraste comparé à injection avec système de guidage informatique). Enfin cette étude nous permettra d’évaluer la toxicité de l’utilisation du produit de contraste et de comparer la diffusion de ce produit avec la diffusion de notre vecteur médicament. Toutes ces informations nous permettront d’évaluer : •la diffusion de notre médicament dans l’organisme •les zones d’expressions de notre médicament dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Les benefices attendus pour ce projet sont : - La détermination de la méthode d’injection optimale - La détermination du volume d’injection optimal - Les informations de diffusion du médicament dans l’organisme - La possibilité de trouver des indicateurs biologiques de la maladie. Le but global de l'étude étant de soutenir la demande d'un essai clinique (chez l’homme) pour les patients souffrant de la maladie de Huntington.
Procédures
Dans ce projet tous les gestes techniques sont réalisés sous anesthésie générale et sous analgésie. Une même anesthésie permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + Ponction lombaire + Electromyographie (EMG) ou Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) selon les temps d’intérets de l’étude). - Une procédure chirurgicale (environ 4h) couplé à une IRM - 8 prélèvements sanguins, 7 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (prise de sang (5 minutes), prélèvement de LCR (10 minutes), - 6 examens Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 1h30) - 4 Electromyogramme (EMG) (maximum 30min).
Impact sur les animaux
les nuisances possibles pour l'animal sont : - une douleur possible au niveau de la zone crânienne suite à l’intervention chirurgicale, - une gêne au niveau de la cicatrice due à une douleur ou à des démangeaisons lors de la cicatrisation, - une gêne au déplacement suite aux prélèvements de sang et de LCR qui peuvent de temps en temps induire des hématomes pouvant gêner temporairement la mobilité des primates, - une légère douleur liée au prélèvement de LCR, - une gêne au déplacement lors de la remise en cage suite à l’anesthésie (déséquilibre, faible tonus musculaire), -une gene musculaire possible suite à la stimulation électrique pour la réalisation des EMG, - une légère hypothermie lors de la remise en cage (l’animal étant constamment réchauffé pendant l’intervention, le fait de le remettre en cage stoppe cet apport de chaleur complémentaire), - une difficulté d’alimentation post opératoire dû à de possible reflux gastriques, - une appréhension ou méfiance des animaux vis-à-vis des expérimentateurs suite à chaque intervention.
Devenir
A la fin du projet soit 6 mois apres l'injection, les animaux seront euthanasiés pour permettre les études histologiques et de biodistribution composant l'etude et permettant de déterminer la méthode d’injection optimale de notre traitement de thérapie génique.
Remplacement
Toutes les études possibles sans utilisation d’animaux ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des vecteurs médicaments. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme fait l'obligation d'une étude sur son efficacité, sa toxicité et des réactions du corps sur un autre modèle animal que le rongeur, de plus grande taille (ici le primate) pour affiner avant la transposition chez l’Homme. Notre projet a pour but de valider une procédure opératoire en vue d’une application prochaine à l’Homme. L’utilisation du primate est donc primordiale pour valider celle-ci sur un modèle gros animal présentant des caractéristiques structurelles du cerveau proche des caractéristiques humaines.
Réduction
14 animaux au total: 6 animaux pour l’étude de faisabilité (2 doses) 8 animaux pour l’étude de toxicité (2 doses): 3 animaux par dose de médicament-vecteur (2 doses différentes) et 2 animaux controles, c’est-à-dire injecté avec une substance ne contenant pas de médicament-vecteur (2 volumes différents). C’est le minimum pour une étude statistique permettant de repondre à l'objectif du projet. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.
Raffinement
Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, Les animaux sont hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie, l'utilisation de buprénorphine pour les ponctions lombaires pour éviter tout inconfort et enfin des antibiotiques lors de la chirurgie. L'administration intracérébrale d'AAV (Adéno Associated Virus=Virus associé aux Adénovirus) est parfaitement tolérée. Les prises de sang et ponctions lombaires (avec les mêmes volumes et fréquence que décrite dans ce projet) sont menées en routine sur tous les animaux suivis par l'équipe et ne génèrent pas d'effet néfaste sur les animaux. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Si un animal ne présentait pas d'amélioration dans le suivi, il sera euthanasié avec avis vétérinaire.Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement)les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté notamment la chirurgie d’administration intracérébrale réalisée par un neurochirurgien expert de la technique. Enfin, le nombre d'anesthésie est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la même anesthésie.
Choix des espèces
La capacité des vecteurs médicaments à pénétrer dans un organe donné et y faire exprimer un gène thérapeutique permettant de soigner les maladies est dépendante de l'espèce. Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisé et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Les organes du primate non humain en particulier le cerveau, se rapprochent le plus de celui chez l’homme en termes de structure anatomique. L’administration du médicament vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole qui sera réalisé chez l’homme (nombre de sites, volumes, débit, nombre de particules). L'injection de médicament-vecteur chez le primate est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 2 ans et 15 ans selon la disponibilité en élevage, nous avons besoin d'individus avec un cerveau complètement développé.
REALISATION DE TESTS DE TOXICITE ANORMALE CHEZ LE RONGEUR
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Cochons d'Inde : 5000
16 250 souris et cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent une injection unique d'un produit pharmaceutique, déjà commercialisé ou nouveau, par voie intraveineuse, intrapéritonéale, orale ou sous-cutanée, pour un test réglementaire dit de toxicité anormale. Le porteur affirme s'attendre à prouver l'"innocuité" du produit et écrit qu'aucune mortalité ni signe clinique n'est attendu, alors qu'il déclare 5 625 souris en gravité sévère. Sur le remplacement, il indique qu'il n'existe "pas d'équivalent in vitro" et que ce test devient obligatoire dès qu'il figure au dossier d'autorisation de mise sur le marché.
Objectifs
L’objectif de ce test est de détecter une éventuelle toxicité d’un produit pharmaceutique, après son administration aux animaux. Les produits administrés aux animaux sont des produits pharmaceutiques déjà sur le marché ou nouvellement produits. Nous recherchons par ce test une toxicité anormale, c’est-à-dire que nous nous attendons à prouver l’innocuité du produit. A noter que ce test est réalisé en respect des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments à des patients. Le test de toxicité anormale sur rongeurs est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques.
Procédures
Administration par injection intraveineuse, sur souris uniquement : volume maximum 0,5 ml / souris, Administration par injection intrapéritonéale : volume maximum 1 ml / souris et 5 ml / cobaye, Administration par voie orale : volume maximum 1 ml / souris et 25 ml / cobaye, Administration sous-cutanée pour les cobayes : volume maximal 10 ml. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Des injections uniques sont prévues dans les deux procédures de ce projet.
Impact sur les animaux
Les tests sont réalisés sur des produits pharmaceutiques fabriqués selon les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF). Ce test est à visée libératoire – c’est un test requis pour la mise à disposition de certains médicaments aux patients. La mortalité d’un animal ou l’apparition d’un signe clinique sur celui-ci n’est donc pas attendue sur ce type de test libératoire. Les principales nuisances pour l’animal sont : Douleur et stress liés à l’administration des produits pharmaceutiques (par injection IP, IV, SC ou gavage), Stress lié à la contention, Tous signes cliniques potentiels faisant suite à la toxicité anormale, L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés par inhalation d’une concentration progressive de CO2 en fin de protocole ou en cas d'atteinte de points limites (sauf pour la procédure 1). La réutilisation des animaux pour un autre test de toxicité anormal n’est pas possible car cela pourrait interférer avec le résultat de ce second test.
Remplacement
Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : Il n’existe pas aujourd’hui d’équivalent in vitro au test de toxicité anormale. Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM du produit pharmaceutique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal requis par les pharmacopées et les demandes réglementaires (e.g. dossiers d’Autorisation de Mise sur le Marché – AMM). Si l’intervalle de poids requis pour réaliser le test est faible, deux animaux supplémentaires peuvent être commandés. Ce cas peut se présenter par exemple en cas de retest selon la pharmacopée Russe ; il est demandé l’utilisation de 5 souris pesant entre 19 et 21 grammes le jour de l’injection. La marge de poids étant faible, 1 animal supplémentaire sera commandé.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant toute la durée du protocole Les souris disposent d’un enrichissement de type enviro-dri, spécialement conçue pour améliorer l'activité de construction de nids afin de pouvoir se cacher. Les cobayes disposent d’un enrichissement de type tunnel afin de pouvoir se distraire et se cacher. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse. Une observation quotidienne est réalisée : elle consiste à vérifier l’état clinique des animaux, leur alimentation et leur boisson. En cas de point limite observé, l’animal est euthanasié (sauf pour la procédure 1).
Choix des espèces
Espèces décrites dans les Pharmacopées pour le test de toxicité anormale. Les critères de sélection des animaux sont décrits par les Pharmacopées, ou les dossiers d’AMM : - Entre 17g et 30g au début du protocole pour les souris - Entre 200g et 400g au début du protocole pour les cobayes
Programme d’immunisation de poules pour la génération d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.
Procédures
5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole
Raffinement
Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).
Choix des espèces
La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.
Evaluation des effets de nouvelles entités pharmacologiques sur l’état d’anxiété et/ou l’activité compulsive chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 4800
12 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie des animaux témoins étant réutilisée dans d'autres projets et le reste tué. Ils reçoivent des composés par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée, puis sont soumis à l'un de cinq tests comportementaux mesurant l'anxiété, avec parfois une mise à jeun jusqu'à vingt heures et un isolement sans eau ni nourriture jusqu'à quarante minutes, pour évaluer de nouvelles molécules anxiolytiques. Le porteur estime les atteintes limitées à un stress et une brève douleur d'injection. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit et juge le rat et la souris "les espèces les plus adaptées" avant tout passage chez l'humain.
Objectifs
Les troubles anxieux constituent une maladie psychique chronique fréquente et souvent invalidante qui s’exprime sous plusieurs formes chez l’homme (anxiété généralisée, phobies, trouble panique, troubles obsessionnels compulsifs…). Ils touchent environ 21% de la population générale sur la vie entière et peuvent être associés à de nombreux facteurs de comorbidité (prise d’alcool, troubles dépressifs…). Si les antidépresseurs et les anxiolytiques sont généralement employés dans les traitements des troubles anxieux, ces derniers présentent cependant de nombreuses limites (efficacité limitée, effets secondaires…). Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de nouveaux produit synthétisés ou acquis au sein du laboratoire dans des modèles comportementaux chez le rongeur permettant de mimer le trouble anxieux et le comportement compulsif chez l’homme. Il s’agira de mesurer la capacité de composés à agir sur l’activité anxieuse et/ou compulsive chez le rat ou la souris pour poursuivre de développement de ces nouvelles molécules en phase clinique chez l’humain.
Bénéfices attendus
A court terme, il s’agira de démontrer à l’aide de données chez l’animal l’efficacité potentielle de nouveaux produits pharmacologiques : les procédures mises en œuvre permettront de mesurer la capacité de nouvelles molécules vis-à-vis du comportement anxieux de rongeurs, de les comparer et ainsi de choisir la meilleure selon des critères de sélection pour l’application thérapeutique ciblée. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests chez l’Homme.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations dont la voie (orale, intrapéritonéale, sous-cutanée) ainsi que la fréquence d’administration (aigüe ou chronique, dans ce cas 2 administrations/jour max) seront adaptées en fonction des objectifs de recherches. Les animaux seront soumis à un seul des 5 tests de la procédure de ce projet. Chacun des tests a pour objectif de mesurer l'anxiété des animaux et d'évaluer le potentiel de candidats médicaments à moduler cette anxiété. La durée de chaque test sera de 5 minutes à 30 minutes. Les délais d'administration avant les phases de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration, une courte contention (
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les animaux recevront des administrations de composés avant les évaluations comportementales. Il est possible que la courte contention alors nécessaire (
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Certains animaux, les animaux contrôles, pourront cependant être réutilisés pour d’autres projets en fonction des objectifs de recherche si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée. La décision sera prise par le responsable projet (une personne compétente désignée par lui) ou le vétérinaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur le comportement anxieux dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. Il n’existe à ce jour pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet c’est pourquoi l’utilisation de modèles in vivo est indispensable avant toute administration à l’homme, rat et souris étant ici les espèces les plus adaptées.
Réduction
Un effectif minimum et suffisant de 12 animaux par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques. En fin de procédure, les animaux (en particulier les contrôles) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.
Raffinement
Les animaux (rats, souris) sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant toute expérimentation. Tout au long des études, les animaux sont hébergés en groupe (nombre maximal défini par la règlementation en cours) dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, Sizzle pad pour nidification…). Le change des cages se fait 1 à 2 fois par semaine. Les animaux sont observés chaque jour, et font l’objet d’un suivi SBEA (Structure Bien-être Animal) par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-être Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. En cas d’atteinte d’un des points limites, l’animal est écarté de l'étude pour subir les soins essentiels ou être euthanasié si nécessaire. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et dispositif expérimental, phase de familiarisation aux manipulations, administrations…).
Choix des espèces
Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques du comportement humain. Ce sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets de substances sur l’anxiété et/ou l’activité compulsive. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l’animal à d’autres stades de développement. De plus, les tests d’anxiété/activité compulsive décrits dans ce projet sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités motrices et cognitives fonctionnelles.