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Modèle animal de mouvements anormaux après privation en oxygène chez le rat – projet pilote
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Privés d'oxygène sous anesthésie pour reproduire le syndrome de Lance-Adams, ils subissent ensuite des stimulations sonores quotidiennes pendant quatre semaines et des injections de molécules anti-myocloniques, avant la mise à mort pour analyses. Le porteur reconnaît que la privation d'oxygène peut tuer certains animaux et provoquer des secousses gênant leur déplacement et leur alimentation, tout en rappelant que ces secousses ne sont pas jugées douloureuses chez l'humain. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne peut étudier la mort des neurones et présente ce projet pilote comme un préalable à des travaux ultérieurs.
Objectifs
Chez l’homme, l’arrêt brutal de l'oxygénation du cerveau (ou anoxie cérébrale) peut être liée à des causes variées comme un arrêt cardiaque ou une crise d’asthme très sévère. Chez les survivants, ce manque d’oxygène peut entraîner des problèmes neurologiques chroniques comme le syndrome de Lance-Adams (LAS). Le LAS est caractérisé par des secousses musculaires involontaires (qu’on appelle myoclonies) très importantes et qui ne sont pas qualifiées comme douloureuses par les patients. Elles apparaissent spontanément ou en réaction aux sons notamment. Elles rendent impossible la réalisation de nombreux gestes de la vie quotidienne : marcher, s’alimenter, se laver ou aller aux toilettes. Les patients reçoivent souvent de nombreux médicaments qui exposent à des effets secondaires parfois graves et aux risques d’interactions entre médicaments. Malheureusement, l'efficacité de ces médicaments est souvent insuffisante pour traiter les secousses musculaires du LAS. Les mécanismes à l'origine du LAS restent peu connus. A ce jour, le principal modèle animal de secousses musculaires induites par un manque d’oxygène (donc équivalent du LAS chez l’humain) existe chez le rat. Compte-tenu des limites de cet ancien modèle, l'objectif de notre projet pilote est donc de mettre au point un nouveau modèle animal de secousses musculaires après un manque d'oxygène reproduisant les caractéristiques du LAS chez l’Homme. Avec une procédure expérimentale plus simple, moins invasive et plus représentative du mécanisme du LAS chez l’humain, nous souhaitons identifier les divers paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un modèle fiable et reproductible tout en limitant la mortalité et la douleur chez l’animal, indispensable pour vérifier nos hypothèses concernant les mécanismes à l'origine du LAS.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints du syndrome de Lance-Adams (LAS) est aujourd’hui limitée avec des traitements globalement peu voire pas efficaces. L’amélioration de la prise en charge des patients passe avant tout par une meilleure compréhension des mécanismes aboutissant aux secousses involontaires (appelées myoclonies) du LAS. Cela repose donc notamment par l’exploitation des modèles animaux qui reproduisent cette pathologie. Comme évoqué précédemment, le principal modèle déjà publié de LAS a des points faibles. Nous souhaitons donc développer ce nouveau modèle de LAS chez le rongeur pour ensuite l’explorer finement afin d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes pathologiques du LAS. Les études animales déjà réalisées avec le modèle existant donnent des résultats assez hétérogènes. Chez l’homme, les études cliniques semblent indiquer que les secousses des patients avec un LAS pourraient provenir de l'écorce du cerveau appelée cortex. Dans notre groupe de patients atteints de LAS, les premiers résultats sont très en faveur d’une atteinte du cortex pouvant être à l'origine des secousses. Par ailleurs, certains neurones spécifiques du cortex sont très consommateurs d'oxygène. Le manque d'oxygène pourrait donc en priorité affecter le fonctionnement de ces neurones-là. Nous faisons donc l’hypothèse que les secousses musculaires du LAS sont, au moins en partie, dues à un souffrance de cette population de neurones au sein du cortex responsable des mouvements. A court terme, cette étude pilote permettra d’établir les différents paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un nouveau modèle animal de LAS. A long terme, le bénéfice de la mise en place de ce nouveau modèle sera d’approfondir, dans un projet ultérieur, les connaissances déjà acquises sur le LAS, en particulier par des méthodes électrophysiologiques et immunohistochimiques afin de tester notre hypothèse.
Procédures
Le protocole des stimulations auditives sera réalisé chez tous les animaux, pendant 45 secondes, une fois par jour tous les jours pendant la semaine précédant la procédure de privation en oxygène, puis une fois par jour tous les jours pendant les 4 semaines suivant la procédure de privation en oxygène. Ces stimulations auditives se feront chez des animaux vigiles. Le protocole de privation en oxygène sera réalisé à une seule reprise sur tous les animaux, entre 0et 10 minutes. Cette procédure se déroulera alors que les animaux seront anesthésiés et après injection de médicaments anti-douleur. Au cours de la procédure d’évaluation de la survenue des secousses pendant les semaines suivant le manque d’oxygène, des injections de molécules anti-épileptiques et anti-myocloniques (durée d’injection et temps de maintien : 1 minute) seront réalisées une fois pour chaque animal par voie intra-péritonéale.
Impact sur les animaux
Ce projet pilote va permettre d’évaluer les effets indésirables possibles de ce protocole expérimental. Le risque anesthésique est à prendre en considération. La mort des animaux au cours de la procédure de privation en oxygène est une possibilité expérimentale. Les secousses musculaires engendrées dans un délai de quelques jours après l’anoxie pourront entrainer des difficultés de déplacement pour les animaux ainsi que des difficultés d’alimentation. Il nous semble également important de rappeler que, chez l’humain, les myoclonies (secousses musculaires) ne sont pas considérées comme étant douloureuses.
Devenir
Les mêmes animaux sont impliqués dans les manipulations de privation en oxygène et d’évaluation des secousses musculaires. A l’issue de ces manipulations, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire, l’euthanasie étant requise pour réaliser des prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Certaines questions d’intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que des procédures alternatives existent, ni les processus aboutissant à la mort des neurones ni les processus favorisant l'apparition de crises d'épilepsie ou de secousses musculaires involontaires (myoclonies) ne peuvent être légitimement bien étudiés chez l’homme ou dans d’autres modèles non animaux. De plus, il n’est pas légitime de provoquer une crise d’épilepsie ou des myoclonies chez un patient pour des études scientifiques. Enfin, lors des expériences sur les animaux, l’environnement est mieux contrôlé et la qualité des données est nettement supérieure.
Réduction
Nous sommes sensibles au besoin d’utiliser le moins d’animaux possible et de diminuer la souffrance animale tout en respectant la rigueur scientifique. C’est dans cette objectif que nous conduisons cette étude pilote afin d’établir les paramètres du protocole permettant de réduire au maximum la mortalité du protocole donc le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum (100) pour produire une conclusion scientifique et statistique tenable. Une fois le modèle établi grâce à cette étude, nous calculerons plus précisément les différents indicateurs statistiques permettant d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une période d’une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. De façon à réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront maintenus au sein de groupes sociaux de plusieurs individus. Les conditions d’hébergement, incluant température, éclairage, bruit et espace ainsi que les conditions d’enrichissement de l’environnement, d’alimentation et soins si nécessaire, seront adaptées aux animaux et à leur âge. Un soin particulier sera apporté à la réduction de l’inconfort, de la douleur ou du stress des animaux. Un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation). Une période d’une semaine d’habituation à la manipulation humaine est respectée avant la réalisation de nos procédures. Avant le début de chaque expérience, une période d’acclimatation de 30 minutes sera observée au cours de laquelle les animaux, laissés dans leur cage, ne seront pas manipulés. Cela leur permettra de s’habituer à leur nouvel environnement et éviter toute forme de stress. Les animaux bénéficieront alors de nourriture et d’eau à volonté ainsi que d’un environnement enrichi à l’aide de tunnels. Pendant la procédure d’anoxie, les paramètres physiologiques (fréquence cardiaque et saturation en oxygène) seront surveillés constamment. Tout au long de la procédure expérimentale, des points limites adaptés ont été définis afin de limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce choisie pour ce projet. Les méthodes d’investigations électrophysiologiques et immunohistochimiques (qui seront utilisées dans un deuxième temps au cours d’un projet ultérieur) sont maîtrisées au laboratoire et ont déjà permis la publication d’études sur d’autres modèles d’anoxie et d'épilepsie réalisées sur des rats adultes. Par ailleurs, les études déjà publiées sur les modèles animaux de syndrome de Lance-Adams (LAS) précédemment citées ont été faites chez le rat. Nous allons utiliser des rats adultes entre 5 et 10 semaines de vie. Le LAS chez l’humain est en effet décrit uniquement chez des adultes. Par ailleurs, les études électrophysiologiques d’anoxie cérébrale et d’épilepsie réalisées dans l’équipe dans d’autres projets ont été faites chez des rats adultes. Ces mêmes techniques seront utilisées dans un deuxième temps sur un projet ultérieur.
Etude d’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans des modèles murin d’hyperthermie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour provoquer une hausse de température, elles sont soit contenues et isolées afin d'induire un stress, soit injectées de lipopolysaccharide déclenchant une inflammation, avec mesure de la température rectale, puis tuées pour prélever sang et cerveau. Le porteur indique que le lipopolysaccharide peut provoquer hypoactivité et perte de poids et que l'isolement dure jusqu'à 72 heures. Il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne permet d'évaluer l'hyperthermie induite par le stress ou l'inflammation.
Objectifs
Les troubles anxieux sont des troubles mentaux multifactoriels avec une étiologie complexe. Selon le DSM-V, les troubles anxieux comprennent le trouble anxieux généralisé, le trouble panique, les phobies et le trouble de stress post-traumatique. Ces troubles ont un impact sévère sur la qualité de vie et les traitements sont inconstamment efficaces et associés à des effets secondaires. Afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments sur l’hyperthermie, deux modèles animaux seront utilisés. Le premier modèle animal est celui reflétant l’anxiété anticipatrice : l'hyperthermie induite par le stress (SIH). La première utilisation du SIH dans la recherche sur l'anxiété a eu lieu après que l'on ait remarqué que le fait de retirer les souris une par une d'une cage où elles étaient logées en groupe augmentait la température corporelle de la dernière souris par rapport à la première. Par la suite, ce modèle a été affiné en hébergeant individuellement les animaux et la température rectale a été mesurée deux fois à 10 minutes d'intervalle. Cela a permis de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires par expérience. Ainsi, les effets reproductibles du SIH rendent ce modèle très approprié pour le criblage de nouveaux candidats médicaments. Par ailleurs, l’hyperthermie peut être également d’origine infectieuse. Pour cela, un second modèle par injection de Lipopolysaccharide (LPS), qui mime une réaction inflammatoire, sera utilisé. Chez l’homme, l’administration de médicament contre la fièvre (aspirine, paracétamol etc…) va réduire la température corporelle induite par l’infection. Cependant, ces traitements peuvent interagir avec d’autres médicaments. C’est le cas de l’Aspirine avec les anticoagulants et le paracétamol qui, quant à lui, est contre indiqué en cas d’insuffisance hépatocellulaire. Ainsi, ce second modèle d’hyperthermie peut être utile pour le développement de cible thérapeutique pour traiter cette problématique.
Bénéfices attendus
Depuis quelques années, il a été démontré que le stress/anxiété provoquait une hausse de la température corporelle. Ce phénomène est appelé "hyperthermie fonctionnelle". Celle-ci peut entraîner une augmentation de la température corporelle jusqu’à 41°C chez des personnes exposées à d’intenses événements émotionnels (comme par exemple les personnes souffrant d’anxiété généralisée, de trouble panique, de phobies et de troubles de stress post-traumatique). Dans notre premier modèle, la contention de l’animal engendre un stress/anxiété provoquant une augmentation de la température. Ce modèle est donc pertinent pour le développement de molécules contre l’anxiété/stress contrecarrant l’hyperthermie fonctionnelle. Le second modèle concerne l’hyperthermie d’origine infectieuse. Le plus connus et utilisé des traitements de l’hyperthermie chez l’homme est le paracétamol. Son efficacité clinique est variable et il est contre indiqué en cas d’insuffisance hépatocellulaire. Notre second modèle est donc pertinent pour le développement de candidat médicament pour traiter l’hyperthermie induite par une inflammation d’origine infectieuse.
Procédures
L’ensemble des animaux sera soumis aux interventions suivantes : (1) Des administrations sont réalisées sur animaux vigiles (moins d'une minute par administration). Les fréquences d'administration dépendent des caractéristiques pharmacologiques des produits (une à deux administrations par jours pendant un mois maximum) - (2) La température rectale est mesurée deux fois à 10 minutes d’intervalle (durée de l’acte moins d’une minute) - (3) La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont réalisés à la fin du test d’hyperthermie (après la seconde prise de température); juste avant la mise à mort de l’animal. Ces prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale profonde (anesthésie gazeuse sous isoflurane 2%). La durée totale pour réaliser ces prélèvements est d’environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables sont : (1) dans le premier modèle, la contention de l'animal engendre un stress chez celui-ci provoquant une augmentation de la température. Dans le second modèle, l’administration de LPS engendre une hyperthermie. Le LPS peut également induire chez la souris une hypoactivité et une baisse de masse corporelle durant les heures qui suivent l’injection. ; (2) Dans les deux modèles d’hyperthermie, les animaux sont logés individuellement durant 72h maximum ; et (3) lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. De par notre expérience, les effets indésirables sont rares car la toxicité des candidats médicaments est généralement testée en amont.
Devenir
Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux sont soumis à la fin de l’expérience (juste après la dernière prise de température) à un prélèvement sanguin et de cerveau.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer l’hyperthermie induite par un stress ou par l’administration de LPS. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d'une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux candidats médicaments, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d'assurer un nombre minimum d'animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale.
Raffinement
Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Toutes les expériences sont réalisées après une période d’acclimatation de 6 à 10 jours. Les animaux sont hébergés par 5 dans des cages transparentes. Une observation quotidienne sur des caractéristiques spécifiques (Physiologie clinique, aspect général, comportement...) est effectuée durant la période d’acclimatation et d’expérimentations.Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible grâce à l'observation et à l'appui d'une grille du bien-être animal) est mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer facilement les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur ces pathologies dans toute sa complexité. En effet, les animaux sont utiles pour modéliser la base biologique des troubles anxieux, du stress ainsi que l'inflammation. Ils sont donc nécéssaires pour évaluer l'efficacité des candidats médicaments. Dans ce projet, seuls les animaux adultes (entre 6 à 12 semaines au moment du test) seront utilisés car il n'a pas pour objectif d'étudier les effets du candidat médicament sur l'animal à d'autres stades de développement.
Cycle hormonal et déficits de reconnaissance chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
974 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Modèles génétiques de la maladie d'Alzheimer, elles subissent des frottis vaginaux, des tests de mémoire nommés, reconnaissance et association objet-place, des IRM répétées et, pour 114 d'entre elles, une ovariectomie, avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau. Le porteur soutient que le phénotype de ces souris n'est pas dommageable et que leurs déficits de mémoire n'affectent pas leur bien-être. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou cellulaire ne reproduit encore les processus cognitifs de façon fiable.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par des pertes de mémoire et par la pathologie tau et la pathologie amyloïde qui sont liées respectivement à des formes de la protéine tau et de la protéine amyloïde anormalement aggrégées dans le cerveau. L’APP est la protéine précurseur du peptide amyloïde. Les modèles rongeurs actuels surexpriment des gènes humains de l’APP avec des mutations rares provoquant la MA (formes familiales) et/ou des gènes mutés de tau qui ne sont pas associés à la MA mais qui provoquent une pathologie tau. La présence de pathologies tau et amyloïde chez ces animaux ont permis des progrès dans la compréhension de la MA, mais la surexpression de l’APP et/ou de tau provoque aussi d’autres effets qui ne se retrouvent pas dans la MA. Les souris double knock-in (dKI) AppNL F/MAPT évitent ces effets car elles ont un gène de l’APP humanisé avec deux mutations familiales humaines (Swedish et Iberian : AppNL,F) et le gène humain normal de tau (MAPT) au lieu des mêmes gènes chez la souris. En analysant la mémoire de nos souris dKI de l’âge de 2 à 6 mois, nous avons découvert que les femelles dKI ne parviennent plus à reconnaitre un objet après un délai de 24h (test RO24h) dès l’âge de 2 mois. De plus, elles n’ont pas de bons résultats dans un test de changement de la règle dans un labyrinthe, contrairement aux mâles dKI. Or ces deux tests dépendent du dialogue entre deux structures du cerveau, l’hippocampe (HC) et le cortex préfrontal (CPF). Ces résultats sont cohérents avec une étude montrant une altération de la connectivité HC-CPF plus marquée chez les femmes que chez les hommes en début de MA. Une perturbation des rythmes veille/sommeil, comme celle observée chez le patient, peut perturber le dialogue HC-CPF. A 4 mois, les dKI des deux sexes oublient rapidemment une association objet-place (OiP). Cette forme de mémoire dépend du dialogue HC-cortex entorhinal latéral (CEL). Elle est atteinte chez des personnes âgées des deux sexes et c’est un signe précurseur de la MA. En conclusion, chez les souris dKI de 4 mois, la voie CEL-HC semble affectée chez les deux sexes, tandis que les femelles semblent affectées en plus et plus tôt sur la voie HC-CPF. Les souris dKI sont les premières à montrer une perturbation aussi précoce et aussi proche de celle trouvée en phase préclinique des patientes développant une MA. Le but de ce projet est de comprendre l’origine de cette vulnérabilité féminine dans la pathologie Alzheimer.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est de mieux comprendre l’origine de la vulnérabilité féminine dans les premiers stades de la MA. Il est important d’explorer le rôle des oestrogènes car le développement de la MA a maints fois été attribué à la baisse marquée de production d’œstrogènes privant ainsi le cerveau d’un puissant neuroprotecteur contre les pathologies amyloïde et tau. Ici, nous analyserons chaque étape clé de l’implication des œstrogènes dans les processus de mémoire affectés chez les dKI femelles dès les premiers signes de la pathologie. Si nous découvrons une altération d’une ou plusieurs étapes, cela aidera à la compréhension de cette vulnérabilité féminine et révèlera des cibles intéressantes pour mettre au point des tests de diagnostique précoce et/ou de traitements adaptés à la femme. Cette démarche s’insère dans la statégie actuelle de développement d’une médecine personalisée. Le projet décrit ici ne représente que l’approche fondamentale développée dans un vaste. Ce programme inclue aussi des approches translationnelles en utilisant des techniques applicables à l’Homme : investigations en IRM (IRM fonctionnelle, tractographie, …), en électroencéphalographie à haute densité (EEGhd) et en biologie des rythmes (évaluation comportementale du fonctionnement de l’horloge circadienne). De plus, après adaptation et validation des tests de RO24h et OiP à l’Homme, ils pourront être intégrés dans des évaluations neuropsychologiques pour un dépistage. En conclusion, le programme dans son ensemble aborde certes les cibles neurobiologiques (présente saisine) qui seront utiles à long terme, mais il ouvre également des perspectives à moyen terme pour le développement d’outils de diagnostique par IRM, par EEGhd et par de nouveaux tests neuropsychologiques. Les résultats de notre étude bénéficieront d’abord à l’Homme puisque les souris ne développent pas la MA. Néanmoins, certains animaux de compagnie (chien, octodon) ou sauvages (microcèbe, ours blanc) développent une pathologie rappelant la MA avec pathologie amyloïdes et tau. Au mois deux de ces espèces (octodon ; microcèbe) possèdent un gène de risque génétique majeur pour la MA (APOE4). Chez l’Homme, l’APOE4 peut multiplier par 10 le risque de développer une MA. Il est donc tout à fait envisageable que les progrès réalisés dans le domaine de la MA en termes de dépistage et de traitement pourraient être adaptés à des pathologies proches chez l’animal, puis intégrée dans une approche vétérinaire.
Procédures
Procédure 1 modérée: 4 groupes de souris (de génotype et sexe différents, maximum 60 au total) sont mises dans des cages individuelles placées côte à côte sur une étagère munie de détecteur de mouvement (petites cellules de détection) pour mesurer leur activité locomotrice sur 4 jours. Malgré la proximité de leur congénères, cette séparation pourrait générer un stress modéré, mais transitoire. Les autres procédures P2 à P8 et P10 sont légères pour 800 souris. Elles comportent 1) la réalisation de frottis vaginaux sur les femelles (dépôt d’une goutte à l’entrée du vagin puis réaspiration), 2) la passation d’un ou deux tests d’exploration d’objet dans un environnement rendu familier par une habituation (10 min) préalable avec leur groupe social, et 3) les manipulations préalables à la mise à mort (dislocation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde). Aucune perte de poids, inactivité/mobilité réduite ou expression d’un comportement anormal n’est connu pour ces trois types de manipulations. dans la procédure 8, les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour effectuer un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. Seule la procédure 9 modérée concerne une chirurgie pour l'ovariectomie sur 114 souris.
Impact sur les animaux
Le suivi de lignée jusqu’à l’âge de 12 mois indique que le phénotype des souris dKI n’est pas dommageable : le succès reproducteur, le poids et l’occurrence d’anomalies comportementales ou physiologiques restent identiques entre les WT et les dKI. Leur fonds génétique C57BL/6J est entretenu par backcross pour éviter une dérive génétique. Par ailleurs, il faut préciser que ces souris ont été caractérisées dans des tests de mémoire et d’anxiété classiques et dans des tests hypersensibles à la pathologie Alzheimer. Les mâles et femelles dKI de 2 à 6 mois réussissent comme leurs témoins les tests classiques (test spatial en labyrinthe de Barnes, tests de reconnaissance d’objet et de place jusqu’à un délai de 3h). Même à 12 mois, il n’y a toujours pas de déficit dans ces tests. Entre 2 et 6 mois, le problème n’apparait que dans des tests hypersensibles : une performance moindre au premier jour du changement de règle dans un labyrinthe, un déficit marqué dans les tests d’association objet-place (test OiP), de mémoire du détail et pour un long délai de rappel (RO24h). En conclusion, les souris dKI présentent des problèmes légers de mémoire qui sont présents chez des personnes âgées déclarées cognitivement normales. Ces déficits ne sont donc pas de nature à affecter le bien-être des souris dKI par rapport à leurs témoins WT. Seules deux procédures pourraient induire un stress transitoire : la procédure 1 pour l’isolement en cage permettant de mesurer l’activité locomotrice individuelle sur 4 jours et la procédure 8 où les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. La procédure 9 impliquant une ovariectomie ne devrait pas affecter le bien-être avec les traitement analgésiques et précautions de manipulation prévues. La couverture analgésique, les soins et le suivi individuel des souris devrait permettre d'éviter toute souffrance ou de l'interrompre rapidement s'il y a complication.
Devenir
Le but du projet est de découvrir les altérations neuropathologiques impliquées dans le dimorphisme sexuel face à l’émergence d’une pathologie Alzheimer afin de mieux comprendre les causes de la vulnérabilité du cerveau des souris dKI femelles par rapport aux mâles. A part pour les mises au point de techniques, les cerveaux seront systématiquement recueillis et analysés afin de déterminer ces causes.
Remplacement
L'étude des animaux modèles de la MA est encore indispensable pour progresser dans la compréhension de cette pathologie. Il n'est pas encore possible actuellement de modéliser les processus cognitifs de façon fiable et complète dans un modèle in silico ou en culture cellulaire. Il est donc encore nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie et les performances cognitives.
Réduction
Pour étudier le lien entre les performances comportementales (mémoire et rythme circadien de l’activité locomotrice) et les données neuropathologiques obtenues par des approches histologiques ou biochimiques (P1 à P6, et P10), le nombre d’animaux sera au maximum de 15 animaux par groupe pour assurer l’efficacité des statistiques dans les tests comportementaux. Cet effectif est nécessaire en particulier dans notre modèle car nous testons des souris avec une pathologie débutante et des déficits subtils qui pourraient passer inaperçus si les groupes sont trop petits. La procédure 8 est une étude longitudinale d’animaux destinés à des analyses en IRM. Elle permet donc le suivi d'un même animal à trois âges pour étudier l’émergence et l’évolution de la pathologie ce qui permet une réduction du nombre d'animaux. Le nombre de souris sera au maximum de 35 animaux par groupes (4 groupes mâles et femelles des génotypes dKI et témoins WT) afin d’assurer l’efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables pour les données IRM et pour des analyses corrélatives avec les données comportementales et histopathologiques obtenues sur les mêmes animaux au sein de notre laboratoire. La procédure 9 fait appel à la technique d'ovariectomie pour tester l'origine cérébrale de la vulnérabilité des souris femelles dKI. Le risque de perte avec une opération chirurgicale est couvert en augmentant à 16 le nombre de souris par groupe. L’ensemble du projet requiert 974 souris.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’éléments d’enrichissement dans leur cage (matériel de construction du nid, un tube refuge et des boulettes de nourriture à manipuler), ainsi qu’un suivi quotidien de leur état général. Elles seront maintenues en groupe sociaux sauf pendant deux périodes de 10 minutes/jours pour chacun des tests de mémoire. Tous ces tests sont basés sur le comportement d’exploration spontanée de la souris dans un milieu adapté à l’espèce (lumière faible de 20 lux maximum et ambiance sonore atténuée à 45 dB). Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés est mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Trois nouvelles techniques de raffinement sont à mettre/mise en place au cours du projet. Elles concernent la manipulation/transport des souris, l’habituation à l’enceinte des tests de mémoire et une méthode non invasive de prélèvement pour le génotypage. Les souris sont d’ores et déjà transportées de la cage à l’enceinte de tests (et vice versa) grâce au tube refuge présent dans leur cage. L’habituation à l’enceinte des tests se fait depuis plus de 6 mois avec l’ensemble du groupe social de chaque cage. Le bien-être qui en résulte se reflète par une plus grande régularité dans la durée d’exploration des objets présents dans l’enceinte au cours des tests de mémoire réalisés ensuite en individuel. Enfin, la nouvelle méthode de prélèvement non invasive pour le génotypage à partir d’une pincée de poils (au lieu du punch d’oreille de 2 mm) est désormais appliqué en routine pour cette lignée.
Choix des espèces
A ce jour, les modèles animaux de la MA ont essentiellement été créés chez la souris, même s'il existe des modèles chez la drosophile et d'autres espèces. Nous avons un modèle de souris qui est en rupture par rapport aux modèles précédents, car il n’a pas les effets secondaires dûs à la surexpression des protéines clé. Il présente une différence entre les deux sexes dans l'apparition des premiers troubles de la mémoire qui ressemble à celle trouvée au stade préclinique de la MA, c'est-à-dire 5 à 10 ans avant le premier diagnostic. Toutes les souris seront sur un fonds génétique C57BL/6J. Dans toutes les procédures sauf une, les souris seront utilisées entre 1 et 4 mois (jeunes adultes) car c’est l’âge où apparaissent les premiers déficits de mémoire dans ce modèle de maladie d’Alzheimer. Dans la procédure 8, les souris atteindront l'âge de 12 mois pour analyser leur neuropathologie lorsqu’elle devient manifeste (plaques amyloïdes notamment).
Validation d’un dispositif de mesure de la prise alimentaire et de la motivation chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Elles sont entraînées à un distributeur automatique de nourriture puis, pour certaines, reçoivent une injection de lipopolysaccharide déclenchant une inflammation ou subissent un régime hypercalorique de six à sept semaines, avec des périodes d'isolement en cage. Le porteur décrit ces atteintes comme modérées et transitoires, alors que le projet est déclaré en gravité sévère. Il présente l'étude, menée avec une entreprise privée, comme devant à terme améliorer le bien-être des animaux non-humains dans ses recherches futures.
Objectifs
Les dérégulations de la prise alimentaire sous-tendent certaines conditions médicales comme l’obésité ou les troubles du comportement alimentaire (anorexie, boulimie, binge eating, addiction alimentaire). Dans ce contexte, nous nous intéressons en particulier aux modulations de la prise alimentaire par l’axe microbiote-intestin-cerveau dans des modèles murins. Outre la mesure de la prise alimentaire totale, la compréhension des troubles du comportement alimentaire nécessite d’explorer également des processus psycho-neurobiologiques comme la motivation. Ces processus peuvent être analysés chez le rongeur à travers la réalisation de tâches opérantes. Ainsi, dans une volonté d’affiner et d’automatiser les outils permettant l’étude du comportement alimentaire dans ces modèles, nous souhaitons tester un système embarqué permettant i) une mesure automatique de la prise alimentaire et ii) de tester le comportement opérant des animaux dans leurs cages d’hébergement. Ce système permet à la fois de mesurer la prise alimentaire au sein des cages d’hébergement avec une haute résolution temporelle et de mesurer la motivation alimentaire par le biais du comportement opérant. Ainsi les objectifs de ce projet sont : 1- Tester la fiabilité et la sensibilité du dispositif pour la mesure de la prise alimentaire 2- Mesurer des désordres motivationnels dans une tâche de comportement opérant dans deux modèles animaux. Cette étude sera réalisée sur des souris consanguines immunocompétentes. Afin d’examiner un potentiel effet dépendant du sexe, nous réaliserons cette étude sur des individus mâles et femelles. Cette étude correspond à la première phase d’un projet en collaboration avec une entreprise privée. Le but de ce projet est de faire évoluer le système notamment pour permettre une utilisation autorisant l’hébergement des animaux en groupe. Ainsi, les résultats issus de ce projet sont nécessaires afin de passer à la phase suivante qui permettra d’améliorer le dispositif et d’avoir un impact positif sur le bien-être des animaux lors de nos études futures.
Bénéfices attendus
Les données issues de ce projet permettront de passer à une phase d’évolution du dispositif dans son design pour permettre notamment une utilisation autorisant l’hébergement en groupe. Scientifiquement, les analyses post-mortem envisagées (histologie, biologie moléculaire) contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux sous-jacents et à établir de futurs protocoles expérimentaux. Ce projet contribuera également à alimenter la collaboration avec une entreprise dans le développement du médicament et permettra éventuellement de tester des molécules en développement pour des indications de troubles du comportement alimentaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à des entraînements à utiliser un dispositif embarqué qui leur permettre de s'alimenter d'une part (durée : env. 2 semaines). D'autre part une partie des souris seront entraînées à utiliser ce dispositif pour réaliser des tâches opérantes (durée : env. 1 semaine). Certaines souris recevront une administration unique de lipopolysaccharides ou seront exposées 6-7 semaines à un régime riche en lipides pour induire des désordres motivationnels.
Impact sur les animaux
Les procédures contiennent des périodes d’hébergement en individuel. L’hébergement en individuel peut engendrer un stress chez la souris. L’hébergement en individuel dans ce projet a été limité au maximum et durera au maximum 2 semaines. Un surenrichissement des cages sera proposé. Dans une des procédures, certains animaux seront injectés avec du LPS. Cet agent induit une réaction inflammatoire systémique pouvant être objectivée à travers des signes cliniques. Les modalités d’administration choisies altèrent modérément l’état clinique de l’animal et conduisent à une résolution de la réponse moléculaire pro-inflammatoire en moins de 9h. Dans une des procédures, certains animaux seront exposés à un régime hypercalorique. La prise chronique sur des temps longs (>8 semaines) d’un aliment hypercalorique riche en lipides (HFD) conduit à une prise de poids, des perturbations métaboliques et des mofifications de l’activité locomotrice et potentiellement de l’humeur. La période d’exposition à ce régime dans notre projet (6-7 semaines) perturbera le métabolisme des animaux (hyperlipidémie, résistance à l’insuline) mais n’altérera pas drastiquement, à ce stade, la qualité de vie des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
Cette étude vise à tester un distributeur alimentaire pour souris dans le but de faire évoluer le système notamment pour permettre une utilisation autorisant l’hébergement des animaux en groupe. Elle nécessite donc l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de vérifier la fiabilité et la sensibilité du dispositif pour la mesure de la prise alimentaire et de mesurer des désordres motivationnels dans deux modèles animaux. Plus précisément, des tests statistiques permettant une analyse de l’effet de traitements entre plusieurs groupes et/ou l’effet sexe des animaux lors de mesures répétées seront employés ; des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des données seront utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés soit en groupe, soit en individuel. Les cages d’hébergement contiendront un objet leur permettant de se mettre à l’abri, des carrés de cotons ou des sticks de papier pour réaliser leur nid. Pour les animaux hébergés en individuel, un surenrichissement par rapport aux individus hébergés en groupe sera prévu. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. Le bon fonctionnement et chargement des dispositifs distributeur d'aliments sera vérifié régulièrement voire quotidiennement (lors de l’apport d’aliment uniquement par le dispositif). Le design de la procédure comportementale a été conçu pour assurer la validité des données obtenues tout en limitant la durée de l’hébergement individuel au minimum.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). De plus, le dispositif testé a été conçu pour la souris. Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.
Approches physiopathologiques et thérapeutiques du syndrome de Sanfilippo B EU 3/3
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Modèles du syndrome de Sanfilippo B, une maladie neurodégénérative pédiatrique, elles passent des séances d'IRM d'une heure sous anesthésie, puis sont tuées par prélèvement intracardiaque à 2, 5 ou 9 mois pour mesurer le fer cérébral. Le porteur présente l'IRM comme non invasive et le prélèvement intracardiaque terminal comme la nuisance la plus importante du projet. Il affirme qu'à ce stade le recours à l'animal est "inévitable" pour confirmer les résultats obtenus sur cellules.
Objectifs
Le projet financé est une étude préclinique de thérapie génique intraveineuse pour le syndrome de Sanfilippo B. Ce syndrome est une pathologie neurodégénérative pédiatrique touchant 1 enfant sur 200 000 et pour lequel il n’y a aucune thérapie aujourd’hui. Ce syndrome est dû à la déficience d’une enzyme lysosomale impliquée dans la dégradation d’un glycosaminoglycane, l’héparane sulfate. Cette déficience conduit à l’accumulation de ce substrat qui présente une toxicité majeure pour les cellules du système nerveux central. Nous souhaitons, à travers cette étude, pouvoir proposer un essai clinique par thérapie génique permettant d’apporter l’enzyme déficitaire (N-acétylglucosaminidase). L'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet, sera de vérifier s'il est possible de détecter de façon reproductible et fiable des variations de susceptibilités magnétiques caractéristiques de la teneur en fer (Fe) dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux sans mise à mort des animaux comme c’est le cas pour les méthodes classiques de mesures post-mortem. L'IRM est un outil important pour le diagnostic in vivo des pathologies ainsi que pour suivre au cours du temps la réponse à différents traitements ou procédures chirurgicales. La durée maximale des acquisitions sera d’une heure par animal.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de l’étude physiopathologique, l'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet, sera de mesurer des valeurs de susceptibilités magnétiques T2* dans le cerveau des animaux. Ces mesures permettront de comparer la teneur en Fe dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux. L’accumulation de fer ou non dans le cerveau est un marqueur de validation de l’efficacité du traitement de nos souris en préclinique. A terme, cette mesure IRM pourrait remplacer les mesures faites post-mortem et devrait donc nous permettre de réduire le nombre d'animaux mis en œuvre pour mesurer la quantité de fer dans les tissus et permettre de suivre l'évolution au cours du temps de la teneur en fer de différents organes d'intérêt dans un même animal renforçant ainsi la valeur statistique des résultats.
Procédures
L'IRM est une procédure d'imagerie in vivo, non invasive et atraumatique. La totalité de la procédure étant menée sous anesthésie volatile (1h maximum), les animaux ne subissent que le stress dû à la préhension avant induction de l'anesthésie. Le réveil post-anesthésique est la seconde étape critique, les animaux restent sous surveillance pendant toute la phase de réveil.
Impact sur les animaux
L'IRM est une technique non invasive d'imagerie qui n'entraine aucune douleur chez les animaux. Les signes vitaux (respiration, fréquence cardiaque et température) sont contrôlés tout au long des manipulations afin de garantir le suivi du bien-être des animaux. La procédure est cependant susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans la cage d'induction de l'anesthésie. Le prélèvement intracardiaque que subiront les animaux au moment de leur mise à mort (sans réveil) est la nuisance la plus importante du projet, elle est cependant indispensable pour réaliser dans des conditions optimales la mesure de teneur en fer intra-tissulaire de référence.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue des délais 2, 5 ou 9 mois de vie suivant une technique réglementaire qui permettra de pouvoir obtenir des prélèvements de qualité tout en protégeant l'animal de la douleur.
Remplacement
Une modélisation intégrée est nécessaire pour valider les études in vitro. Les animaux sont utilisés en fin d’étude afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Les études sont systématiquement optimisées (quantité de vecteurs, temps de traitement et nombre d’animaux) d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. Même si le traitement est administré en injection intraveineuse, il est réalisé par un personnel compétent.
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Nous allons utiliser des tests statistiques afin de comparer les groupes. Les tests sont réalisés avec un logiciel de statistique. Nous utiliserons des groupes de 10 souris par expérience et nous répéterons les expériences à 3 âges différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo. L'IRM étant une technique d'exploration non invasive, elle permet le suivi longitudinal des lots d'animaux mis en œuvre ce qui participe à la réduction globale.
Raffinement
Cette procédure expérimentale a pour objectif d'évaluer la possibilité de remplacer une procédure post-mortem (mesure de la teneur en fer dans les tissus prélevés) par une procédure non invasive, in vivo qui permettra de suivre une même cohorte au cours du temps dans un but de raffinement (suivi du même animal pour s'affranchir de la variabilité interindividuelle et réduction du nombre de lots d'animaux nécessaire pour assurer ce suivi longitudinal selon la procédure classique). Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Nous nous attachons à ne pas laisser un animal seul dans une cage (groupes sociaux de 5 individus maximum par cage). Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Lors des expériences d’imagerie, les animaux sont anesthésiés à l’isoflurane (gaz vecteur O2) dès le début de la procédure pour réduire leur stress et éviter tout mouvement au cours de l’exploration IRM. La cellule d’imagerie dans laquelle est maintenue la souris est thermo régulée. Pendant la phase de réveil, la cage est également placée sur tapis chauffant et reste sous contrôle visuel jusqu’au réveil complet de l’animal. Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus est un modèle animal adapté aux pathologies de surcharge lysosomale. L’application de la politique de réduction mise en place permet d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer d’un minimum d’animal un maximum d’information. De plus la formation des personnes habilitées à manipuler les animaux et la diffusion par ces personnes de leur savoir dans des conditions appropriées (temps de formation respecté) permet de réaliser nos expérimentations animales dans le respect de l’animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Il est nécessaire d’utiliser les souris à partir de d'âge de 2 mois afin de pouvoir comparer les résultats avec ceux obtenus dans nos précédentes études et celles décrites dans la littérature.
Etude de l’interaction des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique avec les lymphocytes
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 150 étant classées en gravité sévère. Une pathologie neuro-inflammatoire est induite par injection intra-péritonéale et 100 souris chimères subissent une irradiation, pour étudier le passage des lymphocytes dans le système nerveux central. Le porteur indique que les souris malades présentent perte de poids et troubles moteurs, et mentionne des tests comportementaux sans préciser lesquels. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne fournit de résultats exploitables et décrit son modèle comme "unique".
Objectifs
L'objectif de notre projet est d'étudier les interactions entre les lymphocytes et les cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique afin de cerner les mécanismes et particularités permettant un passage des lymphocytes dans le système nerveux central et le rôle de ce passage en condition physiologiques et pathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de mieux comprendre les interactions entre système immunitaire et système nerveux central, en condition physiologique afin de comprendre les conséquences de ces interactions en terme de susceptibilité aux infections, aux maladies auto-immunes mais aussi dans le cadre du vieillissement et des pathologies neurodégénratives. En conditions pathologiques, les modèles développés, in vitro et in vivo permettent de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Procédures
Une pathologie neurologique inflammatoire sera induite par injection intra péritonéale unique chez certains animaux, pathologie qui pourra être surveillée pour étude entre 2 jours et 90 jours. Certains animaux seront des modèles de souris chimères et subiront une irradiation (100 souris) unique de 6 minutes et 36 secondes.
Impact sur les animaux
Une pathologie neurologique est attendue lors de l'étude de la condition pathologique. Dans ce cas les souris présentent des signes cliniques (perte de poids, troubles moteurs) et immunologiques qui seront alors surveillés.
Devenir
Au total l'ensemble des animaux sera mis à mort afin de pouvoir quantifier et étudier l'infiltrat lymphocytaire dans le système nerveux central.
Remplacement
L’étude de l’implication des cellules endothéliales dans la migration des lymphocytes dans le système nerveux central via la reconnaissance de l’antigène, nécessite des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées telles que l’activation et la différenciation lymphocytaire in vivo, la migration cellulaire, l’entrée et l’activation dans le tissu cible. Il n’existe pas actuellement des méthodes alternatives à ces études in vivo pour l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents des pathologies humaines. Notre modèle d’étude unique permet d’obtenir des informations nouvelles et importantes concernant les affections neuro-inflammatoires.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé d'après les conditions minimales nécessaires à une puissance statistique permettant d'établir des conclusions statistiques recevables. Les animaux de ces procédures étant utilisés pour des expérimentations in vivo ou in vitro pour générer des cultures primaires, le nombre peu difficilement être réduit. Cependant, la nouvelle version de ce protocole intègre une révision à la baisse des effectifs estimés en raison des premiers résultats d'étude sur les lymphocytes CD4 ayant mis en lumière des difficultés techniques non résolvables à l'heure actuelle. L'ensemble des organes étudiés sont prelevés chez les souris (système nerveux central mais aussi rate, ganglions, et tube digestif) afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
Les animaux inclus dans les procédures en condition pathologiques ou dans la procédure chimère auront une surveillance accrue afin d'identifier rapidement tout signe de souffrance anormale induisant son exclusion de la procédure et sa mise à mort. Les points limites à surveiller identifiés sont : Activité extrême (grattage ou léchage anormal) - Posture (courbée ou prostrée) - Aspect (perte de poids, déshydratation, poil hérissé, taches) - Absence de toilettage et diminution de l’appétit - Respiration anormale (rythme et mouvement) - Stéréotypies et hyperactivité (démangeaisons, léchage) - Présence d’anomalie (blessure, inflammation). Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie après une anesthésie gazeuse par isoflurane. Les animaux seront au maximum 5 par cage et auront un enrigissement permettant une stimulation de leurs comportements naturels et l'amélioration de leur bien être selon les recommandations en cours dans l'établissement utilisateur. Lors du suivi par test comportemental, les animaux auront une période d'entrainement progressive de 3 jours avant de débuter les tests comportementaux mesurés.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines (maladies infectieuses, maladies inflammatoires) comme en témoigne les nombreuses références bibliographiques. Notre modèle, floxé, a été développé dans cette espèce et aucune autre espèce d’animaux possédant ce transgène n’est disponible. De plus, l’utilisation de la souris permet une compatibilité cellulaire avec les autres modèles murins développés. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Adultes entre 6 et 16 semaines d’âge car nous avons besoin d'animaux adultes qui ont un développement des systèmes immunitaire et nerveux central complet pour nos expériences. Seule la procédure 1 pour l'induction du modèle est réalisée plus tôt.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
Issues de couples reproducteurs commerciaux, les souris de ce projet appartiennent à une lignée transgénique de la maladie d'Alzheimer décrite par le porteur comme à "phénotype dommageable", dont les défauts neuropathologiques apparaissent dès six semaines. 1 327 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la déclaration en comptant 929 en souffrance modérée et 398 en souffrance sévère. Les souris traitées reçoivent une seule injection de vecteur viral, soit dans la veine derrière l'œil sous cinq minutes d'anesthésie, soit dans le cerveau par une ouverture du crâne sous 90 à 120 minutes d'anesthésie, puis passent un test d'alternance spontanée et un test d'apprentissage et de mémoire non nommé, avant un prélèvement de liquide céphalo-rachidien et de sang sous anesthésie, sans réveil. Sur le remplacement, le porteur affirme que le recours aux souris est "essentiel" et précise que les animaux non-humains utilisés sont "nés et élevés en captivité dans des élevages agrées".
Objectifs
Aucun traitement n'étant aujourd'hui en mesure de combattre de façon efficace la progression des maladies neurodégénératives, nous avons pour objectif de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Comment ? En nous tournant vers la thérapie génique, qui consiste à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau dans le but de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans la maladie d'Alzheimer (MA) dans un modèle murin de la maladie. Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié (AAV Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) permettant de délivrer l’ADN au cœur même des cellules. Cependant, dans l’optique d’une application clinique chez l’Homme, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux AAV modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Les objectifs de l’étude sont : 1) Démontrer la fonctionnalité de l’AAV et donc de confirmer l’efficacité thérapeutique de l’administration intracérébrale. 2) Comparer l’efficacité thérapeutique de deux AAV par administration intracérébrale ou intraveineuse. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec phénotype dommageable seront utilisés. Ils seront issus de couples reproducteurs commerciaux. Les animaux seront injectées une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (90-120 minutes sous anesthésie gazeuse avec injection d'analgésique en pré-opératoire, application d'analgésique sur le site incisé et injection d'analgésique en post-opératoire). Des études comportementales (consistant à évaluer l’alternance spontanée, l’apprentissage et la mémoire des souris) seront réalisées afin d’évaluer les effets des vecteurs injectés sur les déficits cognitifs. Le test mesurant l’alternance spontanée sera réalisé en une session d'une journée. Le test mesurant l’apprentissage et la mémoire comprend des sessions d'entrainement de 4 à 8 jours, puis un test effectué en une journée, juste après la session d'entrainement. Le jour d'euthanasie, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien et sanguin sera réalisé (45 minutes) sous anesthésie après injection d’un anti-douleur. Ces prélèvements sont réalisés juste avant l’euthanasie des animaux (sans réveil après les actes).
Impact sur les animaux
Parmis les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1)Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro-orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adeéno-associés) pourrait être observée (5 à 7% du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées soient déjà évaluées in vitro dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris.7) un stress lié à la manipulation de des animaux lors des tests comportements
Devenir
l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des actes prévues que ce soit pour l’élevage (sans prélèvement) de la lignée ou à l’issue des procédures (avec prélèvement pour analyse).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (1327) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. La taille des effectifs a donc été établie grâce à un calcul de puissance. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, les tests de comportement et les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires post-mortem seront dans la mesure du possible réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Les différents paramètres (comportementaux, biochimiques, histologiques, etc) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des demandes/exigences expérimentales.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection locale d’analgésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection. Une surveillance particulière de l’œil sera faite en post opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. Le geste de l’injection intraveineuse est maitrisé par l’applicateur. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. De plus, les tests comportementaux étant réalisés de façon hebdomadaire sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux jeunes adultes (souris : 4-8 semaines) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques ou intraveineuses de manière précoce (4-8 semaines) afin de maximiser les effets bénéfiques du traitement sur la neuropathologie et le comportement).
Etude des conséquences de l’inactivation et de la surexpression de gènes impliqués dans des maladies neurodeveloppementales
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
15 946 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie au cours de laquelle l'utérus est exposé et chaque embryon transpercé par un capillaire de verre avant l'application d'un courant électrique, technique d'électroporation in utero destinée à modifier l'expression de gènes dans le cerveau en développement. Les femelles sont tuées pour collecter embryons et nouveau-nés, ces derniers subissant une injection dans le cerveau ou une perfusion intracardiaque terminale, tous étant tués pour prélever les cerveaux. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et conclut à la nécessité de la souris.
Objectifs
Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Chez certains patients avec des maladies du développement cortical, il existe des mutations dans des gènes qui montrent une forte probabilité d’être la cause de la maladie. Ces pathologies sont associées aussi bien à des défauts de prolifération, de migration et de différenciation neuronale. Comprendre les mécanismes par lesquels la mutation entraine la pathologie est essentiel pour faciliter le diganostic d’autres maladies et envisager un traitement. Pour comprendre ce qu’il se passe dans les neurones, nous allons adopter une approche génétique visant à modifier l’expression ou la fonction des molécules étudiées. Nous utiliserons l’électroporation in utero chez la souris. Cette technique permet l’introduction de matériel génétique contrôle et muté dans les cellules progénitrices de la zone ventriculaire du cerveau en développement, permettant donc l’étude de la structure, de la fonction et du développement du système nerveux central. Elle offre l’avantage d’un contrôle spatio-temporel de la délivrance d’ADN, permet des études de perte et de gain de fonction et est simple, rapide et efficace. On pourra ainsi étudier l’effet d’un gène : # sur la prolifération : électroporation au stade embryonnaire (un seul stade par gène selon le pic d’expression du gène étudié) et analyse du devenir des cellules modifiées 1 ou 2 jours plus tard. Dans ce cadre, les mères recevront une ou deux injection(s) nous permettant des analyses de données plus fines# sur la migration des neurones : électroporation au stade embryonnaire et analyse du devenir des cellules modifiées 3 ou 4 jours après # sur la différenciation et la connectivité neuronale en introduisant le gène d’intérêt au stade embryonnaire et en analysant 2, 4, 8 ou 21 jours après la naissance .
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de comprendre la fonction de protéines ou d'autres molécules impliqués dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels leur déplétion ou surexpression conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées pour les patients. En effet, notre collaboration avec des cliniciens nous permet de tester par cette approche des variants retrouvés chez des patients présentant des maladies du développement du cerveau. Comprendre les mécanismes peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.
Procédures
Les femelles gestantes vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, pour une durée de 1 à 10 secondes pour chaque embryon). La durée totale de la chirurgie n'exèdera pas 45 minutes ( en moyenne 25 minutes pour un chirurgien expérimenté). Un courant électrique sera appliqué sur la paroi utérine, en 5 pulses de 50 ms espacés de 1 seconde (temps total entre 5 et 6 secondes par embryon). Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. Certaines recevront une ou deux injections (5 secondes) 1-2 jours après la chirurgie. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (entre 1 et 10 secondes). Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes) puis d’un anesthésique (environ 5 secondes) avant de subir une chirurgie de perfusion intracardiaque terminale sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
La barrière cutanée des femelles gestantes donc rompue en plusieurs endroits (site d'injection dans le dos entre les omoplates, aiguille très fine, cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait privées de congénères pendant quelques jours de convalescence. Certaines recevront une ou deux injections sous cutanées 1-2 jours après la chirurgie, pouvant entrainer un stress et d'autre(s) rupture(s) le la barrière cutanée. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin aux stades embryonnaires ainsi que l'application d'un courant électrique sur leur tête. Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique puis d’un anesthésique (pouvant entrainer du stress) avant de subir une chirurgie terminale de perfusion intracardiaque.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons ou dès collecte des nouveaux nés. Les embryons ou nouveaux nés sont mis à mort pour collecter les cerveaux.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.
Réduction
Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Les experiences (prolifération, migration, maturation) seront choisies en fonction de la nature du gène étudié, son profil d’expression et du phénotype observé chez les patients. Aussi toutes les expériences ne seront pas systèmatiquement éffectuées. Seules celles relevantes seront faites. En ce qui concerne les études post-natales, et afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris, nous avons adapté nos croisements pour obtenir des souris moins agressives et meilleures nourrices. La bonne maitrise de la technique chirurgicale acquise par l’équipe tout au long de ces dernières années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (40-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous prévoyons aussi dans cette étude 10 femelles gestantes pour la formation de nouveaux expérimentateurs afin de nous assurer de leur succès et d’un bon taux de survie.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Avant le début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d'analgésique 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la deshydratation. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relais de l’analgésique pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. 1) Etude de la prolifération : Femelles adultes gestantes de 13 jours ou 14, stades auxquels la proliferation des progeniteurs est à son maximum. Le choix du stade se fera en fonction du profil d’expression deu gène d’intérêt (un seul stade sera retenu pour les expériences, celui avec le pic d’expression de la protéine d’intérêt) : l’électroporation du matériel génétique d’intérêt en même temps qu’un marqueur fluorescent permettra de suivre la prolifération de ces cellules. Analyse à 14 ou 15 jours de gestation, stade d’étude de la prolifération cellulaire. 2) Etude de la migration cellulaire : Femelles adultes gestantes de 13,5, 14,5 ou 15,5 jours, stades auxquels les neurones migrent le long de la glie pour atteindre leur localisation finale. L’electroporation à ces trois stades permettra de visulaiser la migration de types neuronaux diffèrents (nés à chacun de ces stades). Analyse à 18,5 jours de gestation pour les visualiser grâce à un marqueur fluorescent électroporé en même temps que le matériel génétique à étudier. 3) Etude de la maturation neuronale et connectivité : femelles adultes gestantes de 15,5 jours (stade auquel les neurones callosaux sont générés). L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’intégrer le gène à étudier uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à 2, 4 et à 8 jours après la naissance respectivement et le branchement des axones à 21 jours post-natals, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer ces différentes étapes.
Développement post-natal de la souche KI-L178A : Impact physiopathologique du blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 240 tuées sans réveil et le reste dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré. Issues d'une lignée génétiquement modifiée bloquant l'interaction entre le tPA et un récepteur cérébral, elles sont caractérisées du stade nouveau-né à l'âge adulte par des tests sensorimoteurs, cognitifs et émotionnels, une partie subissant la pose d'un cathéter et un amincissement du crâne pour l'imagerie du couplage neurovasculaire. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels, l'objet restant de comprendre le rôle physiologique de cette interaction. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" des procédures et l'impossibilité de les remplacer.
Objectifs
L'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une sérine protéase, connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques. Le tPA est connu pour interagir avec différents récepteurs et que l'interaction entre le tPA et un récepteur d'intérêt (tPA/NMDAR) était impliquée dans certains processus physiologiques et pathologiques (AVC, processus inflammatoires). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction du tPA avec ce récepteur d'intérêt. Ainsi, dans ce projet, nous allons caractériser phénotypiquement ces souris et leurs contrôles en conditions physiologiques au cours du développement (des stades post-nataux jusqu’au stade adulte) et évaluer l’impact du blocage de cette interaction sur l’unité neurovasculaire, par l’étude du couplage neurovasculaire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’interaction entre le tPA et notre récepteur d'intérêt dans des processus physiologiques.
Procédures
1-Prélevements : La totalité des animaux seront mise à mort pour prélèvement des organes (n=240, durée de la procédure : 15 minutes). 2/3- Comportements : La totalité des animaux seront soumis (selon les groupes établis) à l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; n=240, durée de la procédure : 30minutes/tests). 4-Couplage Neurovasculaire : Chaque animal fera l'objet d’une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (n=120, durée de la procédure : 15 minutes). Puis le modèle de couplage neurovasculaire sera réalisé (n=120, durée de la procédure : 1 heure). Après un amincissement du crâne, un train de stimulation des vibrisses sera effectué sous imagerie (fUS ou Doppler/Speckle).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’évaluation du couplage neurovasculaire, les souris seront sous anesthésie générale (isoflurane 2% O2/N2O 30/70 puis médétomidine à 0,1 mg/kg) et sous anesthésie locale (Xylocaine 5%, nébuliseur). Les yeux des souris seront couverts (vitamine A en gel et gel oculaire) afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les procédure 1 et 2 concernent une évaluation développementale de l’influence du blocage de l’interaction du tPA avec les NMDAR chez les animaux, à savoir des stades P0, P3, P5, P15, P30 et P60. Concernant les autres procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires.
Test d’une nouvelle génération de vecteurs pour la Sclérose Latérale Amyotrophique liée aux mutations SOD1 chez un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 460, modéré pour 130 et sévère pour 130. Issues d'une lignée transgénique qui développe une sclérose latérale amyotrophique, elles perdent du poids vers 90 jours puis se paralysent jusqu'à la mort vers 130 jours, une partie étant suivie jusqu'à ce point limite. Elles reçoivent une injection dans la moelle épinière et une injection dans le cerveau, puis des prélèvements sanguins et des tests moteurs répétés, pour tester des vecteurs de thérapie génique visant à réduire la protéine SOD1 toxique. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'existe et que le modèle murin est "indispensable".
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie qui se traduit par la perte des motoneurones (cellules de la moelle épinière) et conduit à la paralysie puis au décès des patients dans un délai de 5 ans après le diagnostic. La maladie se présente sous forme sporadique (90% des cas) ou héréditaire (10%). 20% de la forme héréditaire sont dus à une mutation dans le gène SOD1 et sont à l'origine d'une accumulation de la protéine correspondante dans les cellules, entrainant toxicité et mort cellulaire. C’est sur cette forme de la pathologie que notre projet est focalisé. A l'heure actuelle il n’existe pas de traitements efficace chez l’Homme. L’étude sera réalisée sur une souche de souris transgéniques qui est le modèle le plus communément utilisé dans l’étude de cette maladie car les animaux développent les même symptômes que les patients. Ces animaux déclarent les premiers symptômes à 90 jours, puis leur état général se dégrade jusqu’à la mort à 130 jours environ. Ayant démontré l’efficacité d'une thérapie génique dans la SLA, nous avons maintenant pour but d’optimiser cette thérapie génique en testant l'efficacité d'une nouvelle génération de vecteurs, afin de diminuer la dose de vecteur à injecter (ce qui permettrait de réduire les effets secondaires tels qu’une réaction immunitaire, une toxicité…) tout en gardant l’efficacité du premier produit testé.
Bénéfices attendus
Ce projet mené à terme nous permettra de constater l'efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur l'augmentation de la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes, avec pour objectif à long terme, de proposer un traitement dans le cadre de thérapies géniques dans la Sclérose Latérle Amyotrophique chez l'homme. Il n’existe actuellement aucun traitement dans cette maladie
Procédures
Les souris élevées pour ce projet sont susceptibles de développer un phénotype dommageable caractérisé par une perte de poids vers 90 jours puis une atteinte musculaire conduisant à la paralysie (vers 120 jours) puis la mort de l'animal. Un prélèvement de queue sera réalisé sur ses souris vigiles afin de vérifier si elles sont ou non porteuses du gène qui nous intéresse. Une anesthésie locale sera réalisée par immersion de la queue de l'animal dans de l'éthanol refroidi. Ce geste ne nécessite que quelques secondes. 4 différentes interventions auront lieu au cours des différentes procédures dont 2 sur souris anesthésiée et 2 sur souris vigiles ; une unique injection intramoelle à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 15 minutes, une unique injection intracérébroventriculaire à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 30 minutes, des prélèvements de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sur souris vigiles, tous les 20 jours de J40 jusqu’au point limite. 1 minute suffit pour réaliser ce geste et, sur souris vigiles, tests comportementaux (pesée, test de force musculaire, neuroscore et test de coordination motrice) une fois par semaine de J50 jusqu’au point limite. Le temps total pour réaliser ces tests comportementaux n’excède pas 20 minutes par souris ; le neuroscore et la pesée sont réalisés l’un après l’autre avec une durée totale d’environ 1min, suivi par le griptest, qui nécessite moins de 5 minutes pour les 3 mesures. Pour finir, le rotarod a une durée totale inférieure à 10 minutes avec 2 mesures (de 2minutes maximum) avec 5 minutes de repos entre les 2. Concernant l'euthanasie, les animaux pour lesquels des prélèvements seront réalisés seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte qui se caractérise par une dégénérescence progressive des motoneurones. Elle provoque une paralysie progressive de l'ensemble des muscles. Les souris utilisées pour la survie présenteront donc des signes de dégénérescence comme la paralysie des pattes et/ou du bassin. Cela entrainera des difficultés pour se déplacer, s'hydrater et s'alimenter. Les différentes procédures réalisées chez l’animal (intramoelle, injection intracérébroventriculaire) sont à même d’entraîner une douleur post-opératoire. Le prélèvement caudal ainsi que les prélèvements sanguins peuvent également être une source de stress et de douleur de courte durée. Les différents tests fonctionnels réalisés chez la souris (pesée, neuroscore, test de force musculaire, test de coordination motrice et neuroscore) peuvent également entraîner un stress chez l’animal.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés selon la méthode justifiée pour chaque procédure afin de prélever tous les organes nécessaires à la réalisation des analyses biochimiques et histologiques prévues dans notre étude. Ces prélèvements sont réalisés post-mortem et nécessite donc l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle cellulaire n’existe pour pouvoir mener une étude pré-clinique dans la Sclérole Latérale Amyotrophique. Le modèle animal est indispensable pour optimiser et développer notre approche de thérapie génique pour cette maladie. Ce modèle, particulièrement bien caractérisé, nous permettra de quantifier l’efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes.
Réduction
Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé, les groupes seront constitués du nombre minimal nécessaire à une interprétation statistique viable. Si possible, les études seront réalisées sur des animaux du même sexe, afin, encore une fois, d'utilisé un nombre minimal d'animaux. Les animaux ne répondant pas aux exigences pour l’étude (porteur ou non de la maladie) seront systématiquement proposés pour d’autres études déjà validées. De plus sur chaque animal utilisé un maximum d’échantillons biologiques sera prélevé pour parer à toute nouvelle analyse à effectuer. Ce qui nous donne : 45 femelles SOD impliqué pour la procédure 2, 35 femelles B6SJL pour la procédure 3, 50 femelles SOD pour la procédure 4 et 65 mâles et 65 femelles SOD pour la procédure 5. Pour la procédure 1, il y aura également 16 mâles reproducteurs ainsi que 380 animaux non inclus en protocole mais nécessaire pour générer les souris en protocole ainsi que 64 souris supplémentaires pour garantir le bon nombre de souris au phénotype attendu, ce qui nous donne un nombre total de 720 souris.
Raffinement
Les animaux seront regroupés par groupe de 6 animaux du même sexe au maximum. Si des bagarres entre mâles sont observées, ceux-ci seront séparés immédiatement. Dans chaque cage un enrichissement sera apporté sous forme de papier craft pour la confection des nids, voir avec des abris en carton si besoin. Lors des injections, un anesthésiant adéquat sera utilisé et la qualité de l'anesthésie testée avant de procéder aux expérimentations et une analgésie adapté apporté si nécessaire. Enfin chaque animal sera suivi quotidiennement de sa naissance à sa mort et un contrôle du poids réalisé une fois par semaine avant l'apparition des symptômes de la maladie et autant de fois que nécessaire après l'apparition des symptômes afin de contrôler précisément les points limites qui, une fois atteint, entraineront automatiquement l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance excessive. De plus pour minimiser le stress des animaux, ceux-ci seront manipulés tout au long de l’expérimentation par un nombre limité de personne pour créer une habituation souris/manipulateur. De plus, les souris seront hébergées dans une salle réservée à notre équipe, ce qui limitera les venues dans la pièce et donc, le stress des animaux. Il est à noter qu’un soin particulier sera apporté aux animaux commençant à développer la maladie pour leur faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Ainsi des croquettes ou de la bouillie pourront être placés directement dans la cage, ainsi que de l’hydrogel en cas de besoin. Quelque soit la procédure, en cas de douleur aigue, les animaux seront immédiatement euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les modèles animaux les plus communément utilisés pour les projets de thérapie génique pour le traitement de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) sont des lignées murines. Dans notre projet nous utiliserons le modèle murin transgénique pour la SLA. Ce modèle reproduit les principaux symptômes de la SLA et est par conséquent adapté pour évaluer l’efficacité de nos traitements sur la forme génétique de la maladie. Les animaux présentent des symptômes à partir de 90 jours (perte de poids) due à une accumulation de la protéine SOD1 entrainant une paralysie progressive à partir de 115 jours et la mort des animaux à 130 jours. Les animaux seront injectés à l’âge de 50 jours. Ce stade correspond à des animaux adultes pré-symptomatiques pour lesquels l’accumulation de la protéine toxique SOD est déjà commencée. Ce stade est idéal pour mimer un traitement puisque la pathologie est déjà présente et décelable (biochimie) mais les conséquences ne sont pas encore irréversibles.
Cartographie fonctionnelle et spatiale du tPA endogène au cerveau, en conditions normales ou ischémiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 10 tuées sans réveil. Une lignée génétiquement modifiée rend le tPA cérébral fluorescent, et une partie des souris subit un accident vasculaire cérébral provoqué au laboratoire, suivi d'une imagerie à trois, six, douze et vingt-quatre heures avant le prélèvement du cerveau. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires, une détresse et des déficits fonctionnels, l'objet étant de cartographier l'origine cellulaire de cette protéase. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours à la souris et l'absence de méthode de remplacement.
Objectifs
L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase clé du système fibrinolytique sanguin. Par ses propriétés, le tPA est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est aussi un élément clef dans le système nerveux central (SNC), mais l’élucidation des sources cellulaires de tPA est limitée par un manque d’outils de détection fiable. Cette question est pourtant majeure, pour comprendre comment le tPA favorise ou limite les fonctions et la survie neuronale. L’objectif de cette première étude est de mieux comprendre l’origine cellulaire et les fonctions du tPA dans le SNC par des approches ex vivo/in vivo en se basant sur un nouvel outil original d’étude : une souris génétiquement modifiée, qui d’une part exprime le tPA (associé à une protéine fluorescente) pour le rendre détectable, et d’autre part permet de déléter spécifiquement celui-ci dans les cellules du SNC sans altérer son expression dans les autres compartiments. Cette lignée de souris sera utilisée pour des études histologiques et fonctionnelles, en conditions physiologiques ou dans un modèle d’AVC ischémique développé au laboratoire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles pour comprendre le rôle complexe d’un acteur clef de la physiopathologie cérébrale. Cette meilleure compréhension permettra d’identifier des cibles thérapeutiques pour la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique.
Procédures
Procédure 1 : Prélèvement sous anesthésie (sans réveil). Procédure 2 : - Chirurgie sous anesthésie ; évaluation des lésions cérébrales et des transformations hémorragiques par imagerie cérébrale : J+3h, J+6h, J+12h, J+24h. - Prélèvement sous anesthésie (sans réveil)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : une perte de poids/arrêt de la prise alimentaire et de boisson, des douleurs post-opératoires, des signes de détresse, du stress, des déficits fonctionnels.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser autant que possible le nombre minimal d’animaux adéquat, afin de correspondre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible. Les tests statistiques utilisés pour les résultats de l’étude comprendront des tests non-paramétriques (Test de Kruskal-Wallis, suivi du test post-hoc de Dunn’s) ou un t-test si la distribution des échantillons suit une loi normale (Shapiro-Wilk).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Etude de la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
92 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Elles reçoivent une injection intraveineuse d'une protéase fluorescente, le tPA recombinant, avant un prélèvement de liquide cérébro-spinal, un prélèvement de sang intra-cardiaque et l'extraction du cerveau, une partie servant d'abord à un apprentissage de la pose de cathéter. L'objet est de comprendre si les plexus choroïdes participent à la maturation du BDNF, les retombées pour les patients victimes d'accident vasculaire cérébral ou de sclérose en plaques restant renvoyées à un horizon thérapeutique lointain. Le porteur affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours aux souris et l'impossibilité d'un remplacement.
Objectifs
Les plexus choroïdes, structures cérébrales dont le principal rôle est de produire le liquide cérébro-spinal (LCS), sont aussi capables de sécréter de nombreux facteurs neurotrophiques dont le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Le BDNF existe sous sa forme précurseur (pro-BDNF) ou, après protéolyse, mature (mBDNF). Malgré leur localisation parfois commune, le mBDNF et le pro-BDNF se distinguent parfois dans leurs (dys)fonctions neurologiques. Différentes protéases semblent capables de réaliser la maturation du pro-BDNF en mBDNF, notamment l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le tPA est une protéase synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour favoriser la fibrinolyse, grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Il est également sécrété par les neurones et par d’autres types cellulaires du système nerveux, tels que les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Par ses propriétés fibrinolytiques, le tPA recombinant (rtPA) est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. En plus de participer à la maturation du BDNF, l’ARNm (acide ribonucléique messager) du tPA est parfois retrouvé dans les mêmes régions cérébrales que celui du BDNF. De plus, le tPA et le BDNF sont présents dans les mêmes vésicules au niveau des neurones, co-transportés et co-libérés par les dendrites neuronales. Le tPA a précédemment été identifié dans les plexus choroïdes, suggérant également une synthèse endogène de cette protéase dans ces structures. De plus, le tPA vasculaire peut être transporté par des vésicules à travers les plexus choroïdes. Ainsi l’objectif de cette étude est de determiner si les plexus choroïdes peuvent être une zone de maturation et de libération de BDNF et si le tPA (endogène ou exogène) est un acteur de la maturation et/ou de la sécrétion de BDNF dans le LCS par des approches in vivo chez des souris entièrement déficientes en tPA (tPANull) et des souris contrôles (tPAWT).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales sur la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes et sa modulation potentielle par le tPA à des fins thérapeutiques. En effet, une meilleure compréhension de la maturation du BDNF nous aidera d’une part à évaluer le potentiel effet du tPA vasculaire, et d’autre part, à envisager d’améliorer les performances de patients dans des conditions pathologiques, par le couple pro/m-BDNF.
Procédures
L'unique procédure réalisée, consistera en une injection intraveineuse de tPA recombinant couplé à un fluorochrome chez des souris entièrement déficientes en tPA et des souris contrôles, pour suivre son passage du compartiment vasculaire vers le parenchyme cérébral et détecter sa présence en immunohistochimie à différents temps. De même, du LCS et du sang seront prélevés pour réaliser diverses études protéiques et transcriptomiques. - Souris Swiss : phase d’apprentissage (Pose d’un cathéter veineux et prélèvement intra-cisternal de LCS). - Souris contrôles : injection I.V saline ou rtPA. - Souris déficiente : injection I.V saline ou rtPA. Mise à mort des souris de la phase d’apprentissage, immédiatement après le prélèvement intra-cisternal. Mise à mort des souris contrôles/déficientes à différents temps post injection : +10 minutes, à +30 minutes et à +60 minutes. Pour chaque animal : un prélèvement de LCS sera effectué, puis un prélèvement de sang en intra-cardiaque et enfin le cerveau sera extrait.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour cette procédure sans réveil : du stress lié à la manipulation des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, la procédure expérimentale décrite dans ce projet a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront pesés tous les jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques suivant l’approche chirurgicale. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’ensemble des procédures, les souris seront sous anesthésie générale (et sous anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir leur déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature.