Troubles nerveux
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude préclinique de la récupération fonctionnelle et de la plasticité cérébrale après accident vasculaire cérébral ischémique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, dont 960 individus en gravité sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine ou occlusion au chlorure de fer, suivi d'examens IRM et de tests moteurs, cognitifs et émotionnels répétés sur soixante jours. Le porteur décrit un affaiblissement de la patte, des douleurs post-opératoires et une mise à mort si la perte de poids dépasse 15 % ou si le score de douleur est trop élevé. Il rappelle que les traitements neuroprotecteurs efficaces chez l'animal ont échoué chez l'humain, tout en affirmant que les méthodes sans animaux n'apportent pas le même niveau d'information.
Objectifs
A l’échelle mondiale, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est l’une des causes majeures de décès, d’invalidité et de perte socioéconomique. Face à ce fardeau, le seul traitement pharmacologique approuvé consiste en l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Néanmoins, il existe des critères d’éligibilité stricts qui excluent une grande majorité des patients. Il est donc indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. Lors d’un AVC ischémique (i.e. dû à une occlusion vasculaire), le débit sanguin cérébral (DSC) diminue drastiquement et les tissus cérébraux alentours sont altérés de manière plus ou moins définitive. Selon différents facteurs tels que la durée et l’ampleur de la diminution du DSC, l’étendue de la lésion cérébrale et sa localisation, les handicaps résiduels post-AVC peuvent être de différentes natures (moteurs, cognitifs et/ou émotionnels) et extrêmement invalidants. Plusieurs agents thérapeutiques ont été développés et ont montré un bénéfice en termes de neuroprotection chez l’animal. Cependant, la transposition des effets neuroprotecteurs des modèles animaux à l’Homme reste un échec. En effet, alors que la récupération fonctionnelle est au cœur des préoccupations humaines, les études précliniques se sont principalement concentrées sur l’évaluation du volume de lésion cérébrale pour évaluer l’efficacité d’un traitement. Par ailleurs, l’’étude comportementale après un AVC chez les modèles expérimentaux est encore peu utilisée, incomplète voire inadaptée. En effet, la majorité des études ayant travaillé sur les déficits fonctionnels n’ont examiné que les déficits à court terme et particulièrement les déficits moteurs. L’objectif de ce projet consiste donc à caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la plasticité cérébrale et les déficits fonctionnels chroniques de l’accident vasculaire cérébral ischémique, afin de mettre au point de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de ces troubles.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de plasticité cérébrale et de récupération fonctionnelle après un AVC ischémique. Elle permettra également de proposer des pistes pour caractériser de nouvelles stratégies thérapeutiques en combinaison ou non avec le tPA, afin d’améliorer de manière optimale la récupération des patients.
Procédures
Chaque animal fera l'objet d'une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (15 minutes). 1 - Le modèle d'ischémie par injection de thrombine sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) (50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 2 - Le modèle d'ischémie par occlusion au chlorure de fer sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par IRM (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC ; 50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 3 - La totalité des animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleurs quelques heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée lors de l’AVC) qui disparait dans la première semaine après l’AVC. Une perte de poids, des douleurs post-opératoires ou un stress pourraient être observés les jours suivants. Lors des tests comportementaux, les animaux peuvent être soumis à un stress dû à la manipulation, l’isolement (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Les organes prélevés post mortem permettront de réaliser des analyses protéomiques et transcriptomiques.
Remplacement
Les expériences in vitro ou ex vivo ne permettent pas de mimer parfaitement la pathologie en raison de multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux central. De plus, les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information pour évaluer une récupération fonctionnelle et cognitive de manière longitudinale. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale, la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale. La physiologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés est prévue par une limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, et déterminée selon la sensibilité des méthodes utilisées et l’expertise nécessaire à la bonne réalisation des techniques. Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé grâce à nos expériences antérieures et selon les données disponibles dans la littérature. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel GraphPad Prism (version 9). Nous vérifierons en premier lieu si les échantillons suivent la loi normale (hypothèse gaussienne) à l’aide de tests de Shapiro-Wilk. Le cas échéant, des tests paramétriques seront utilisés (ANOVA suivi de tests post-hoc en cas de différence significative) ; dans le cas contraire, des tests non paramétriques seront réalisés (comparaisons intergroupes : test de Kruskal-Wallis suivi de tests U de Mann-Whitney en cas de différence significative ; comparaisons intragroupes : test de Friedman suivi de tests de Wilcoxon en cas de différence significative).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses, le bruit et la lumière selon le cycle. La température en salle d’expérimentation sera contrôlée et adaptée au bien-être des animaux. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs, soigneusement nettoyés et désinfectés. Au cours de l’intervention chirurgicale, les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil sera disposée de manière à avoir une partie sur un tapis chauffant, laissant le choix à l’animal de la température dans la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront mis à mort si une perte de poids de plus de 15 % est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose (petites maisons), des carrés de cotons et des paillettes seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront mis en place jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale suite à un AVC ischémique. Les souris C57BL/6 utilisées dans cette étude seront âgées de 8 semaines car cela correspond au stade de développement jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l’étude des AVC.
Etude de la cinétique de délivrance d’un immunosuppresseur pour la régénération des nerfs périphériques chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur expose chirurgicalement leur nerf sciatique pour y poser un implant libérant un immunosuppresseur, avec des mesures de l'activité électrique du nerf avant et après et un suivi pouvant aller jusqu'à douze mois. Il décrit une douleur post-opératoire transitoire liée à l'exposition du nerf, atténuée selon lui par l'anesthésie et l'analgésie. Ce projet valide un dispositif destiné à être implanté chez l'humain, et le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit les propriétés des "organes entiers".
Objectifs
Pour la réparation des nerfs périphériques, notre laboratoire développe de nouveaux systèmes, combinant des implants et des médicaments. Le développement de ces systèmes de réparation nécessite de caractériser la libération du médicament formulé. Ce projet permettra donc de caractériser in vivo la vitesse de libération d'un immunosuppresseur (molécule limitant l’action du système immunitaire, avec de potentielles propriétés de régénération des nerfs), pour des projets sur la régénération des nerfs périphériques. L'objectif est d'évaluer le profil de libération de cette molécule d’intérêt au niveau du nerf sciatique, depuis des implants, chez le rat. Cette évaluation sera réalisée pendant une période maximale de 12 mois (période de suivi des animaux après chirurgie), et permettra de caractériser nos implants contenant l'immunosuppresseur.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider au niveau préclinique la cinétique de libération locale d'un immunosuppresseur pour la régénération des nerfs périphériques. Ce projet fait partie de l’étape de recherche et validation de produits qui seront implantés dans le corps humain, qui permettra de réduire le risque pour le patient. Il nous est impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas d’animaux. Ce projet a donc pour but de mettre en évidence l’intérêt du développement d’un traitement local pour la régénération des nerfs.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure : Une mesure de l’activité électrique du nerf sciatique (électrophysiologie) sera effectuée en pré-opératoire au plus tôt 7 jours avant la chirurgie sous anesthésie de l’animal (durée de 20 à 40 minutes). Le jour de la chirurgie, après anesthésie et analgésie de l'animal, le nerf sciatique sera exposé. Ensuite, chaque animal recevra une application locale d’un implant contenant un immunosuppresseur. Certains animaux pourront recevoir un implant sans molécule thérapeutique sur le nerf sciatique de la patte arrière controlatérale. La durée de la procédure chirurgicale sera d’environ 20 à 40 minutes par animal. Des prélèvements sanguins et urinaires pourront être effectués le jour après la chirurgie et des prélèvements réguliers pourront être faits en fonction de la vitesse de relarguage de la molécule thérapeutique depuis l’implant (la durée de chaque geste est d’environ 1 minute). Le jour de l’euthanasie de l’animal, l’activité électrique du nerf sciatique sera mesurée au préalable sous anesthésie de l’animal (durée de 20 à 40 minutes).
Impact sur les animaux
Les risques anesthésiques sont les suivants : hypothermie (stress thermique) et assèchement de la cornée. Les risques infectieux sont, quant à eux, peu probables, compte tenu que la chirurgie est réalisée en conditions stériles. Concernant le risque hémorragique, celui-ci est également très limité, du fait qu’aucun vaisseau sanguin majeur ne sera sectionné. L’acte chirurgical engendrera une douleur transitoire en post-opératoire liée à l’exposition du nerf sciatique (qui ne sera pas sectionné) ainsi qu’à la pose de l’implant. L’acte chirurgical étant réalisé sous anesthésie générale, après injection sous-cutanée d’un analgésique et application locale (sur les muscles puis le nerf sciatique) d’un anesthésiant, cette douleur ne devrait pas être ressentie par l’animal pendant la chirurgie. Compte tenu de la forte activité de l'immunosuppresseur, les animaux pourraient manifester des signes de perte de poids, malaise, léthargie et/ou perte de poils, typiquement associés à l'administration systémique de cette molécule thérapeutique. De plus, les animaux seront surveillés pour tout signe de diarrhée et de déshydratation.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure car des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem.
Remplacement
Des études in vitro ont déjà été réalisées. Malheureusement, ces études ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Par conséquent, ce projet in vivo a pour but de valider la cinétique de libération d'un immunosuppresseur depuis nos implants et permettra son développement optimal pour la régénération du nerf sciatique.
Réduction
Le nombre d’animaux (240) a été défini sur la base des études précédemment conduites en interne, pour lesquelles jusqu’à 10 animaux par groupe ont été considérés pour la chirurgie du nerf sciatique. Considérant que le nerf sciatique ne sera pas sectionné et que des analyses statistiques seront réalisées, il nous est indispensable de considérer un minimum de 5 animaux par groupe.
Raffinement
Le nombre d’animaux par cage (2 animaux) respectera la législation sur la protection des animaux de laboratoire. Les rats seront acclimatés au minimum 5 jours avant la chirurgie au sein de l’animalerie. Les rongeurs disposeront à volonté d’eau et d’aliments. Tous les animaux seront hébergés en portoirs ventilés et enrichis avec des maisons, des bâtons, du papier, des boules et/ou des os en plastique. La totalité des gestes expérimentaux sera pratiquée par du personnel qualifié. Les animaux recevront un traitement analgésique avant toute procédure chirurgicale qui se fera sous anesthésie générale. À la suite de la procédure chirurgicale, un traitement analgésique systématique sera administré. Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin d’évaluer de potentiels signes de mal-être. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. En cas d’atteinte des points limites : variation relative persistante du poids corporel supérieure ou égale à 20 pour cent par rapport au poids mesuré avant chirurgie (pesée quotidienne pendant 3 jours après chirurgie au maximum deux fois par semaine pour tous les animaux jusqu’à leur euthanasie. Une étiquette signalétique sera apposée sur les cages pour indiquer que le suivi du poids est assuré pour l’ensemble des animaux) ou dégradation de l’état général de l’animal), l’euthanasie de l’animal sera effectuée.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour évaluer la réparation des nerfs périphériques. De plus, la composition des tissus des humains et rongeurs est très similaire pour plusieurs organes. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l'étude. Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. Les animaux seront bagués sur l'oreille dès leur arrivée dans l'animalerie.
Evaluation de l’effet de composés dans un modèle de Schizophrénie induite par un traitement subchronique à la Phencyclidine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent 24 injections de phencyclidine, un psychostimulant censé reproduire des symptômes de schizophrénie, puis l'administration d'un composé à tester pendant jusqu'à 120 jours et jusqu'à 52 tests comportementaux mesurant leurs performances cognitives et locomotrices. Le porteur indique que ce traitement provoque une hyperlocomotion et des stéréotypies et que les tests peuvent induire un stress. Il affirme espérer "participer à la sélection de nouveaux traitements" et juge la souris impossible à remplacer, les réponses comportementales n'étant selon lui observables que chez l'animal vivant.
Objectifs
La schizophrénie est un trouble psychique sévère et chronique affectant environ 1% de la population âgée entre 15 et 30 ans. Cette maladie mentale est caractérisée par 3 catégories majeures de symptômes : les troubles cognitifs (attention, mémoire, fonction exécutive, vitesse de traitement de l’information), les symptômes positifs (différents types d’hallucination, par exemple visuelle, auditive, olfactive ou tactile et agitation) et les symptômes négatifs (anhédonie, manque d’énergie, perte de la volonté et d'initiative et isolement social). Certains symptômes de dépression sont également observés chez les patients atteints de la schizophrénie et il est difficile de faire la distinction entre les symptômes dépressifs et les symptômes négatifs. Le déclin cognitif est présent dès le stade précoce de la maladie et reste à ce jour difficile à traiter car les antipsychotiques actuels ont des effets très limités sur ce symptôme.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter la schizophrénie.
Procédures
Les animaux subiront 24 injections de PCP (Phencyclidine), un psychostimulant, sur une période de 12j, l’administration du composé à tester sur une durée maximale de 120j selon ses caractéristiques pharmacologiques ainsi qu’un maximum de 52 tests de comportement évaluant la performance cognitive ou locomotrice des animaux.
Impact sur les animaux
Les animaux étant soumis à un traitement par du PCP, ils vont subir certains effets de ce produit comme une hyperlocomotion et l’apparition de certaines stéréotypies. Bien que les tests proposés ne soient pas contraignants, ils peuvent, notamment le test d’interaction social, induire un stress léger chez les animaux. De plus l’administration répétée de composés (PCP et molécules à évaluer) induit un inconfort.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse du développement des troubles liés à la schizophrénie nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. Au regard de notre expertise et de la littérature, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 ou 15 animaux.Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux pourront être soumis à un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Des analyses statistiques finales seront réalisées.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et réaliser leur nid et un tunnel suspendu. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Nous avons choisi cette espèce pour plusieurs raisons : sa pertinence scientifique, sa fiabilité, sa prédictivité, sa reproductibilité et son énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques. A côté de cela, il faut noter que nous avons une très bonne expertise de l’utilisation des souris dans les tests utilisés mais aussi dans l’utilisation du PCP comme inducteur de symptôme de la schizophrénie. Etant donné que nous n’étudions pas une pathologie liée au vieillissement, qui affecte les jeunes adultes et que nous avons une longue expertise dans ce modèle en utilisant des animaux de 4 à 5 semaines au début du projet, nous allons continuer avec ce stade de développement. Etant donné que nous n’étudions pas une pathologie liée à l’âge et que nous avons une longue expertise dans ce modèle en utilisant des animaux de 4 à 5 semaines au début du projet, nous allons continuer avec ce stade de développement.
Impact de la chirurgie dans un modèle murin de maladies métaboliques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une fracture fermée du tibia, une résection de tissu adipeux, une perfusion dans les ventricules du cerveau et des tests comportementaux dont la nature n'est pas précisée, pour relier troubles cognitifs après une opération et obésité. Le porteur annonce des douleurs, une baisse de mobilité et une perte de poids après les chirurgies. Il affirme que l'approche intégrée in vivo est la seule à rendre compte du caractère systémique de ces dysfonctions.
Objectifs
L’objectif du projet est de mettre en évidence un lien entre dysfonctions cognitives post-opératoires et obésité. Afin d’étudier la réponse physiologique et systémique d’un organisme atteint d'obésité et une chirurgie, le modèle murin est le plus adapté à la compréhension des mécanismes et le plus transposable à la clinique. La démonstration et compréhension de ce lien permettra une translation a la clinique avec 1) une surveillance renforcée des patients obèses en pré et post-opératoire 2) la mise en place de mesures hygiéno-diététiques renforcées en prévention des chirurgies 3) l’utilisation de molécules pharmacologiques ciblées en pré et post-opératoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont doubles. Le premier, à court terme, est de pouvoir valider un modèle animal qui conjuguera dysfonctions métaboliques et troubles cognitifs post-opratoires. Ainsi, ce modèle nous permettra de valider l'hypothèse selon laquelle les troubles cognitifs post-opératoires (TCPO) peuvent être influencés par l'état métabolique de l'animal. A moyen et long terme, l'objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes sous-jaccents à l'origine d'une aggravation de la survenue du TCPO chez les individus obèses et/ou atteint de dysfonctions métaboliques et ainsi de permettre de proposer des stratégies therapeutiques et/ou préventives innovantes.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes pouvant apporter une nuissance - fracture fermée du tibia droit : cette procédure durera au minimum 1h et au maximum 14j - tests comportementaux pour évaluer les performances cognitives des animaux : cette procédure durera au maximum 3 jours - résection de tissu adipeux : cette procédure durera maximum 4 semaines - perfusion intracérébroventriculaire : cette procédure durera maximum 4 semaines
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances et/ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet: -stress des animaux au moment de leur réception -stress au moment des manipulations pour les tests de comportement. -douleur à court terme engendrée par les chirurgies. -baisse temporaire d’activité et de mobilité attendue avec les chirurgies. -perte de poids attendue consécutive à la chirurgie.- isolement/individualisation en cas d'aggressivité.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter les tissus et procéder à des analyses histologiques, biochimique, biologie moléculaire, cytométrie en flux. Ces études permettront de comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.
Remplacement
L’étude des dysfonctions métaboliques et cognitives, et l'analyse de leur déroulement, nécessite de prendre en compte le caractère systémique et la contribution relative des différents organes (circulation sanguine, cerveau, tissu adipeux), ce qui ne peut être réalisé que par une approche intégrée in vivo. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour les études de comportement sera au préalable calculé suite à la réalisation d’études pilotes nous permettant d’estimer le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance suffisante. Des travaux antérieurs montrent que le nombre d’animaux nécessaires aux études histologiques, biochimique, biologie moléculaire, cytométrie en flux est de 5 par groupes. Une partie de l’étude sera faite sur lignée de cellules de cerveau de souris afin de répondre à des questions ne nécessitant pas de réaliser de la culture primaire.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les cages sont passées en revue quotidiennement pour repérer les blessures éventuelles, comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés 1 fois par semaine. Les tests de comportement seront réalisés suite à une habituation des animaux aux expérimentateurs et au expériences afin de réduire le stress engendré. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur sont réalisées sous anesthésie chirurgicale et un analgésique est utilisé en parallèle de ces procédures.
Choix des espèces
Les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques, et constituent l’espèce mammifère la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables lors des procédures expérimentales/chirurgicales mises en oeuvre dans ce projet. La souche C57BL/6J réagit très bien aux régimes alimentaires déséquilibrés, nous maîtrisons ce modèle depuis de nombreuses années. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte, à partir de 8 semaines, pour ne pas interférer avec les mécanismes mis en jeu au cours du développement.
Evaluation de l’efficacité des ondes magnetiques sur l’ouverture de la barrière hématoencéphalique chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Six macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une ouverture de la barrière hématoencéphalique et l'injection d'un vecteur viral sous anesthésie, quatre prélèvements de sang et quatre de liquide céphalorachidien et deux IRM, le porteur signalant un risque d'œdème cérébral et de fuite de liquide provoquant maux de tête et signes neurologiques. Le projet relève en partie d'une prestation de service pour des entreprises, en vue d'essais cliniques humains. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'existe et que le primate est requis par l'agence du médicament pour la toxicologie réglementaire.
Objectifs
Notre equipe est impliquée dans le developpement d’approches de thérapies géniques innovantes dans le domaine des maladies neurodégénératives avec à la fois de la recherche et développement mais aussi de la prestation de service pour des entreprises. Ici nous voulons tester la capacités des vecteurs à permettre une expression significative dans les différentes zones du cerveau suite à un nouveau mode d’ouverture (confidentiel) de la barrière hématoencéphalique qui protège le cerveau des intrusions d’agents pathogènes et des virus, afin d’établir des voies d’administration non invasives de thérapie pour l’application en santé humaine. Au total le projet utilisera 6 primates maximum sur les 5 prochaines années repartis par groupe de 2 à 3 primates selon les doses de vecteurs administrées.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de faisabilité de l’ouverture de la barriere hématoencéphalique qui protège le cerveau par une nouvelle technologique. et nous nous attacherons à démontrer son efficacité couplée à l’administration de vecteurs viraux à but thérapeutique pour le ciblage du cerveau chez le PNH en vue de proposer des essais cliniques de phases I et II chez l’Homme et ainsi de disposer de toutes les données requises pour le dépôt d’un dossier à l’agence du médicament. La barrière hématoencéphalique est une protection du système nerveux central (SNC) des pathogènes et virus mais est pour la même raison une limite à l’atteinte efficace du SNC par les composés injectés en intraveineux.
Procédures
- une ouverture de la Barriere hématoencéphalique sur animal anesthésié et sous analgésie avec corticoides puis une injection Intraveineuse de vecteur adéno-associé sur l'animal sous anesthésie générale (durée 1h30) - 4 prélèvements sanguins, 4 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (durée du geste maximum 30min), sous anesthésie générale et analgésie. - 2 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale Dans ce projet, comme décrit précédemment, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien + IRM)
Impact sur les animaux
Une ouverture de la barriere hémato-encéphalique avec injection intraveineuse du traitement avec un risque anesthésique et un risque d’œdème cérébral lors de l’ouverture de barrière Plusieurs prélèvements de sang et de LCR avec un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques ) et la formation possibles d’hématomes - stress lié à la contention en cage pour la réalisation des injections (anesthésie, analgésie, antibiotique,…)
Devenir
A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études post-mortem des tissus et des organes et vérifier la distribution du vecteur médicament dans les organes afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de cette approche.
Remplacement
Les études in vitro pour valider la cible thérapeutique sont effectuées en amont de ce projet afin de valider l’utilisation de notre cible thérapeutique dans les modèles murins de la pathologie. À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle de culture ou de système cellulaire pour étudier l’efficacité de l’ouverture de barrière hématoencéphalique, encore moins pour évaluer l’efficacité de transduction consécutive à l’ouverture de cette barrière. Enfin, notre stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de nos vecteurs ont été réalisées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité, de toxicité, sur un modèle ayant un système nerveux plus développé que le rongeur et le plus pertinent pour reproduire ce qui se passera chez l’Humain est le primate non humain. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence francaise du médicament pour toute demande d’autorisation pour la réalisation d’étude clinique (chez l’homme).
Réduction
Il y a 6 animaux maximum sur ce projet, correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité des différentes approches avec des lots d’animaux allant de 2 à 3 animaux et un suivi 6 semaines post injection L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement, perchoir, échelle, hamac…). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie. l'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et les injections virales, permettra d’ éviter au maximum les inconforts. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Si un animal ne présente pas d'amélioration suite à une prise en charge vétérinaire, il sera euthanasié (avec avis vétérinaire) après avoir été anesthésié. Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, elles sont réalisées par du personnel formé et expérimenté́. Enfin, les étapes du suivi sont prévues pour optimiser le nombre d'anesthésies en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal), ponction lombaire, imagerie par résonnance magnétique
Choix des espèces
Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du macaque en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en termes de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur médicament dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole qui sera réalisé chez l’Homme. L'injection de vecteurs AAV chez le macaque est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance pour l’Homme d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́ compte tenu des patients ciblés par nos approches
Developpement d’une approche translationnelle de thérapie cognitive combinée dans des modèles murins de troubles cognitifs liés à l’âge
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 316 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent pendant six semaines un traitement par voie orale ou intranasale, subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes cérébrales, des séances d'IRM et de TEP, des prélèvements de sang et une restriction alimentaire, tout en étant laissées vieillir jusqu'à vingt-sept mois pour reproduire un déclin cognitif. Le porteur mentionne des tests comportementaux sans en préciser la nature, et reconnaît devoir accepter une détérioration physique liée à l'âge. Il affirme qu'il est "indispensable" de se reposer sur un modèle intégré et que le remplacement des souris n'est pas envisageable.
Objectifs
Le projet répond au besoin clinique de développer la stratégie thérapeutique optimale visant à modifier la trajectoire cognitive de patients souffrants de troubles neurocognitifs légers et à risque d'évoluer vers une démence (troubles neurocognitifs majeurs). En effet, selon les rapports cliniques récents environ 35% des patients âgés répondant aux critères de MCI (Mild cognitive impairment), c'est à dire souffrant de troubles neurocognitifs légers vont développer dans les 5 années qui suivent une démence. Malgré le développement de biomarqueurs pronostiques permettant d’identifier précocement les sujets les plus à risque de développer une démence, les stratégies thérapeutiques actuellement à notre disposition sont peu efficaces pour modifier la trajectoire cognitive de ces patients. Il apparait donc indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques combinées efficaces afin d’améliorer la prise en charge des patients à risque. Dans ce projet expérimental nous testerons plusieurs molécules pharmacologiques susceptibles de potentialiser les effets bénéfiques de l’entrainement cognitif afin de sélectionner la combinaison optimale apportant un bénéfice fonctionnel, comportemental et neurobiologique dans plusieurs modèles de troubles cognitifs liés à l'âge chez les souris mâles et femelles.
Bénéfices attendus
CCe projet permettra de valider l’aspect translationnel de notre démarche grâce à l’étude « preuve de concept » engagée en parallèle au sein de notre équipe de recherche clinique et dont nous nous sommes inspirés pour élaborer le design expérimental de ce travail. L’une des molécules pharmacologiques testées dans ce projet pré-clinique sera le méthylphénidate qui est le traitement administré dans l’étude clinique PACTE. Ceci permettra d’évaluer 1- la comparabilité de la réponse au traitement de nos modèles murins avec les données humaines, 2- la pertinence des marqueurs fonctionnels et 3- d’étudier les mécanismes neurobiologiques de plasticité susceptibles d’expliquer les effets bénéfiques sur la cognition. Fort de cette démarche, ce projet permettra de comparer les bénéfices thérapeutiques (en premier lieu cognitifs) apportés par les différentes stratégies et molécules testées et de sélectionner la meilleure combinaison thérapeutique qui aura prouvé son efficacité sur les différents modèles murins de troubles cognitifs i.e. lié à l’âge et combinant âge + facteur de risque métabolique. Il sera aussi question d’identifier et de valider des biomarqueurs de suivi thérapeutique radiologiques, électrophysiologiques et biologiques translationnels. Si les résultats sont favorables, ces éléments serviront de base à l’élaboration d’un nouvel essai clinique orienté qui fera suite à l’étude PACTE actuellement menée chez les volontaires sains âgés.
Procédures
Sur 640 souris mâles et 480 souris femelles : Les souris recevront un traitement de 6 semaines selon une administration quotidiennement par voie orale ou intranasale dont le temps d’administration n’excèdera pas 5 min par animal. Concernant l’analyse comportementale les souris seront soumises à 3 séries d’évaluations d’une durée allant de 1 à 3 mois à raison de 30 min à 1h de test quotidien. L’entraînement cognitif sera quant à lui réalisé 3 fois par semaine pendant 6 semaines et ne durera pas plus d’une heure. L’examen d'imagerie cérébrale in vivo (IRM et TEP) sera réalisée à 3 temps et n’excèdera pas 1h15 par souris. Afin de mener les enregistrements EEG sur une partie des animaux, une chirurgie sera réalisée permettant l’implantation des électrodes. Celle-ci n’excèdera pas 45min par souris. Les enregistrements seront réalisés sur animaux vigiles au repos (acquisition de 24h) ou en cours de tâche comportementale (acquisition de 1h) grâce à un système d’enregistrement EEG sans fil (Neurologer, TSI). Ces enregistrements seront répétés 3 fois. Enfin sur l’ensemble des animaux, trois prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie, d’une durée maximale de 10min par souris.
Impact sur les animaux
Dans la perspective d’une utilisation clinique, les molécules pharmacologiques retenues dans ce projet sont connues pour leur bonne tolérance. Aucun effet indésirable n’est attendu. La combinaison avec l’entrainement cognitif n’est pas non plus problématique. Les voies d’administrations retenues pour ces molécules sont compatibles avec une prise chronique (via l’eau de boisson, la nourriture ou encore en intra-nasal). Une habituation à la contention préalable à l’induction du traitement sera réalisée pour l’administration intra-nasale afin de réduire le stress de l’animal. Lors de la chirurgie, nécessaire au positionnement des électrodes EEG, ou au cours des acquisitions en imagerie, l’induction et le maintien de l’anesthésie peut provoquer des détresses respiratoires et une hypothermie. Pour contrôler ces effets, nous veillerons sur l’état général des animaux pendant les procédures en contrôlant la température corporelle et la fréquence respiratoire. Si ces paramètres viennent à se dégrader rapidement nous mettrons fin à l'expérimentation. De même à l’issue de la chirurgie, au moindre comportement inhabituel d’un animal, nous procéderons à une surveillance plus stricte et en cas d'atteintes des points limites, nous procéderons à la mise à mort de l’animal. Concernant l’évaluation comportementale une habituation à la manipulation sera réalisée à l’arrivée des souris pour réduire le stress. La principale nuisance est la restriction alimentaire qui sera maintenue sur une période relativement longue (2 fois 2 mois espacés d’1 mois) afin de motiver les animaux dans les tâches de conditionnement opérant. Nous ne dépasserons pas une réduction de 10 % du poids corporel de référence afin de limiter l’impact sur les animaux âgés. Enfin les animaux seront confrontés aux effets du vieillissement sur l’organisme : perte de poids, une altération du pelage, une diminution de la mobilité etc. Nous serons donc contraints d’accepter un certain degré de détérioration physique lié à l’âge. Aussi, au fur et à mesure que les changements observés s'accumulent ou augmentent en "intensité", la fréquence de la surveillance augmente en conséquence. Au moindre comportement inhabituel et changements brutaux de l’intégrité physique d’un animal, nous procéderons à une surveillance plus stricte et en cas d'atteintes des points limites, nous procéderons à la mise à mort.
Devenir
L'ensemble de ces animaux seront évalués sur le plan comportementale et d'imagerie du vivant ou EEG avant leur mise à mort afin de permettre le prélèvement du cerveau pour en étudier les modifications au niveau cellulaire et moléculaire. Dans un souci de réduction du nombre d'animaux utilisés au cours de ce protocole, nous avons intégré dans la mesure du possible, les animaux a toutes les procédures mises en oeuvre dans ce projet.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche translationnelle assurant le lien entre la recherche fondamentale et la recherche clinique et permettant le transfert des connaissances vers des applications thérapeutiques au bénéfice du patient. Cherchant à évaluer le bénéfice comportemental et fonctionnel de stratégies thérapeutiques pro-cognitives, il est indispensable de se reposer sur un modèle intégré et le remplacement des souris par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce contexte. Toutefois l’ensemble des molécules pharmacologiques utilisées dans ce travail ont fait l’objet d’études préalables permettant de valider les propriétés recherchées pour cette étude.
Réduction
L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à cette étude requière un nombre total de 1316 animaux. Le nombre minimal d’animaux nécessaire a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats. Les animaux utilisés pour effectuer les tests comportementaux seront également utilisés pour les analyses d’imagerie ainsi que l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires. De même afin de limiter les animaux nécessaires à la mise au point du protocole, une étude préliminaire validant la faisabilité de l’ensemble des évaluations sera menée sur un petit nombre d’animaux avant d’élargir les effectifs. Les études statistiques seront réalisées à l’aide de tests paramétrique t test de student ou non paramétrique test de Mann whitney selon la normalité de la distribution déterminée selon le test de Shapiro Wilk. Pour les évaluations longitudinales une ANOVA à deux facteurs sera effectuée. Pour l’ensemble de ces analyses les différences seront significatives lorsque p
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.
Choix des espèces
Les souris sont des rongeurs faciles à manipuler, prenant moins de place dans une animalerie et demandant un entretien plus simple et plus économique que les rats. De plus, des projets précédents menés au laboratoire sur la souris ont permis d'établir les bases du projets actuels par l'étude de l'influence de l'âge sur les effets de médicaments psychotropes. L'utilisation de cette base de données pré-existante permettra de réduire le temps et le nombre d'animaux dédiés à la mise au point de ce projet. D’autre part le modèle de syndrome métabolique mis en place au laboratoire n’a été validé que chez les souris C57Bl6/j reconnues pour être particulièrement sensibles à un régime enrichi en gras. Enfin, nous disposons d’outils fiables et de protocoles bien validés pour l'évaluation comportementale et les analyses en imagerie chez la souris. Les modèles murins que nous souhaitons exploiter doivent présenter un déclin lié à l’âge c’est pourquoi l’ensemble des animaux diète normale ou diète enrichie seront utilisés à partir de 16 mois d’âge (âge où les premiers désordres comportementaux et notamment des altérations cognitives légères se manifestent) et suivies jusqu’à environ 27 mois. Pour autant les souris du modèle syndrome métabolique seront mises sous diète enrichie à partir de l’âge de 8 semaines, âge le plus couramment utilisé dans la littérature pour induire des troubles métaboliques chez ces souris
Etude de pharmacocinétique et de biodistribution aprés une administration intranasale chez le lapin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Neuf lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, six tués pour le prélèvement des tissus, les autres réutilisés ou renvoyés à l'élevage. Ils reçoivent une administration intranasale puis des prélèvements de sang sur animal vigile, maintenus dans une boîte de contention, pour mesurer la diffusion d'une molécule candidate contre les maladies d'Alzheimer et de Parkinson. Le porteur indique que la mise à mort passe par une électronarcose, choc électrique précédant l'exsanguination. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit la diffusion d'un produit dans le sang et les tissus et qu'il est "nécessaire" de recourir à l'animal dans son ensemble.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de déterminer les paramètres de biodistribution et les paramètres pharmacocinétiques d'un produit test dans le sang et d'évaluer la biodistribution dans les tissus aprés une administration intranasale.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques de la formulation test et d'évaluer la biodistribution de cette formulation au niveau tissulaire . L'objectif est de trouver une nouvelle molécule efficace contre les maladies d'Alzheimer / Parkinson.
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration intranasale. Deux pulvérisations par narine. Durée inférieure à la minute. Puis les animaux auront 1 prélèvement ( 6 animaux sur 9 concernés) ou 6 prélèvements de sang (3 animaux sur 9 concernés). Durée inférieure à la minute. Pour les administrations, prélèvements sanguin ou euthanasie les animaux seront contentionnés de manière manuelle ou dans une boite de contention. Durée de la contention entre 1 ou 2 minutes. Cela sera réalisé conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.
Impact sur les animaux
Les animaux seront contenus dans une boîte à contention pour réaliser les administrations intranasales. La contention et les pulvérisations intranasales peuvent engendrer un stress pour l'animal. Des prélèvements de sang seront fait sur animal vigile au niveau des veines jugulaires et auriculaires. Les prélèvements de sang peuvent engendrer un stress liée au prélèvement en lui même et à la contention. Les prélèvements sanguins peuvent aussi engendrer de la douleur aux sites de prélèvements. La contention de l'animal pour l'électronarcose (choc électrique avant exsanguination) peut également être génératrice de stress.
Devenir
Dans ce projet, 12 animaux seront inclus 9 animaux seront administrés avec la formulation test, ces animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus afin d'évaluer les paramètres de biodistribution. 2 animaux seront utilisés pour valider la techique d'administration (administration d'un placebo (NaCl0.9%) uniquement) 1 animal de réserve sera utilisé pour générer de la matrice témoin
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang et dans les tissus il est donc nécessiare de recourir à l'animal dans son ensemble. Les essais de biodisponibilité in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet. Les objectifs de ce projet sont de savoir quelle quantité de produit va rejoindre la circulation sanguine et d'évaluer également la distribution du produit au niveau tissulaire.
Réduction
12 animaux seront inclus dans ce projet. 9 animaux seront administrés et 3 animaux spares sont prévus. 2 animaux seront utilisés pour valider la méthode d'administration par voie intranasale et le lapin supplémentaire sera utilisé si besoin ou pourra être utilisé pour générer de la matrice témoin. Les animaux seront réparti en 3 groupes de 3 animaux. 3 animaux par groupe est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats significatifs par rapport aux paramètres pharmacocinétiques et pour pouvoir estimer la biodisponibilité de la molécule testée dans les tissus.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en boxe collectif dés l'arrivée jusqu'à la fin de la phase animale. 4 boxes de 3 animaux. Cet hébergement collectif est nécessaire durant l'étude pour un contact visuel et olfactif entre congénères, surface suffisante de l'hébergement, milieu enrichi adapté à l'espèce (copeaux, cachette, buchette à ronger ..) Toutes les manipulations sur les animaux seront faites par un personnel formé, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Un suivi quotidien (et plusieurs fois par jour le jour des administrations) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général) plus particulièrement observation des mouvements de tête.
Choix des espèces
Le lapin est une espèce fréquemment utilisée en recheche pre-clinique pour le développement de médicaments destinés à l'homme et la taille de cet animal permet de le manipuler assez facilement. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes afin de ne pas avoir de pathologies liées au vieillissement .
Production in vivo d’un anticorps monoclonal dirigé contre un marqueur de l’hémostase destiné à l’industrie du diagnostic in vitro
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
34 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de pristane puis d'hybridomes qui déclenchent une tumeur et une accumulation de liquide d'ascite dans l'abdomen, décrite comme source de détresse, avant un prélèvement terminal. Le projet produit in vivo un anticorps monoclonal destiné à des kits de diagnostic industriels, le porteur affirmant que la production in vitro n'a pas été validée et concluant à une "nécessité incontournable". Le recours à 34 000 souris pour produire un anticorps par la méthode d'ascite ressort comme l'élément marquant de ce projet.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire in vivo chez la souris un anticorps monoclonal (Mab) ultra-spécifique d’un produit terminal de la dégradation de la fibrine. Ce Mab entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs IVD exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique et la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif.
Bénéfices attendus
L’obtention in vivo de cet anticorps monoclonal permettra le maintien de la production de kits de diagnostic essentiels à la définition d’un statut clinique. Cet anticorps entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs de diagnostic in vitro (IVD) exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique avec la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. Il est à noter que ces kits, ont joué un rôle clé dans la crise sanitaire liée à la maladie à coronavirus (COVID-19). Les instances scientifiques ont permis de définir un lien entre le taux du produit de dégradation de la fibrine dosé par les kits dépendant de cet anticorps et la gravité de la maladie COVID-19 (mauvais pronostic pour le patient).
Procédures
Mise en quarantaine des souris dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation Après respect d'une semaine de quarantaine, à J1 les souris reçoivent une injection d’un agent d’amorçage. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de cet agent est précédée 30 minutes avant par l’injection en sous-cutanée d’un antalgique. A J22, après expansion clonale, les hybridomes sont injectés en IP unique à raison de 4.106 cellules/souris. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. Suivi quotidien des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort sont euthanasiés et ponctionnés de manière éthique. Récupération unique et terminale d’ascite par paracentèse dès apparition. Injection IP ou SC, durée de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Chez l'animal, une douleur et une détresse peuvent résulter de l'injection intrapéritonéale (IP) de l'amorce (pristane), de l'inoculation IP des cellules tumorales, et de la croissance des cellules tumorales dans la cavité abdominale (effets primaires) sous forme de plaques péritonéales qui s'infiltrent dans la paroi abdominale ou les organes abdominaux. Plus précisément, il semble que l'injection par voie IP produit un niveau de détresse modéré; on décrit que la production d'ascite et la croissance de tumeurs causent de la souffrance chez les patients humains. De plus, les changements pathophysiologiques et pathologiques complexes peuvent provoquer une détresse chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont concernés, les souris sont toutes euthanasiées en fin de protocole. L’ensemble des animaux inclus dans un cycle de production sont euthanasiés avant paracentèse.
Remplacement
L’alternative la plus logique pour la production de cet anticorps serait une production in vitro. Malheureusement, à ce jour, l’anticorps n’a pu être caractérisé techniquement et validé cliniquement que sur des lots issus de production en condition in vivo. L’ensemble des résultats concernant la capacité de certains clones à produire in vitro les mêmes anticorps selon le même cahier des charges requis pour les dispositifs IVD concernés, démontre la nécessité incontournable de poursuivre la production de ce Mab en condition in vivo (incapacité des hybridomes à tolérer un transfert en extension d’échelles notamment de rendement de production et ou de qualité fonctionnelles des anticorps obtenus). Les besoins de santé publique de ces dispositifs IVD exploitant cet anticorps, et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. La société nous demandant de réaliser des productions d'anticorps in vivo, est consciente de l’aspect éthique de l’expérimentation animale et s'engage à ne recourir à la production in vivo que dans des cas de stricte nécessité. En parallèle, de ce protocole, les essais de passage en in vitro se poursuivront notamment via la mise en œuvre d’essai de tris des clones présentant les taux de sécrétion d’immunoglobulines les plus élevés. Il est également à noter que pour les nouvelles versions de cette gamme de produit, les anticorps utilisés seront fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro » (développement en cours)
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire. Nous pourrons nous baser sur l’expérience acquise sur les anciens protocoles réalisés sur ces clones. L’utilisation de souris anciennes reproductrices permet également de ne pas utiliser d’animaux jeunes spécifiques au projet, mais d'utiliser des souris qui étaient vouées à être euthanasiées. Les expériences de sélection des clones possédant les meilleures capacités de sécrétion, devraient permettre à minima de réduire le nombre d’animaux engagés par protocole. La dernière demande d’autorisation concernait 21000 souris par an, la nouvelle demande impliquerait 17000 individus annuellement, soit une diminution d’environ 19%. A ce jour 1 souris permet la réalisation de 1400 tests.
Raffinement
Les recommandations (issue de CNREEA et parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris seront appliquées. L’unique paracentèse sera réalisée après euthanasie de l’animal, afin de limiter les manipulations de l’animal toujours sources de stress. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de l’agent d’amorçage est précédée 30 minutes avant par l’injection d’un antalgique. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 2 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion…) et signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 3 niveaux : normal, souffrance légère mise en œuvre d’antalgies à envisager, souffrance sévère arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les animaux bénéficient d'un hébergement, d’un environnement, d'une certaine liberté de mouvement, de nourriture, d'eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Afin de faciliter la sociabilité des souris, elles ne sont pas isolées dans une cage et des objets d'enrichissement sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont euthanasiés et prélevés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore.
Choix des espèces
Les hybridomes concernés ont été obtenus par fusion de splénocytes de souris et de myélome de souris, selon la méthode de Milstein et al (1975). Les clones obtenus n’ont jamais pu être produits autrement que chez la souris. Le Mab obtenu et validé dans les dispositifs IVD concernés, est un Mab obtenu et produit chez la souris. Les souris doivent être de même souche (syngéniques) à la fois pour l'immunisation en vue de la création du clone d'hybridome et pour la production subséquente de Mab, de sorte que les tissus utilisés soient histocompatibles. Les souris Balb/c représentent le meilleur choix puisque les cellules myélomateuses parentales employées dans le processus de fusion proviennent de cette souche. Les souris utilisées préalablement pour la reproduction présentent l’avantage pour la production de l'ascite parce que leur musculature abdominale a déjà été étirée (Falkenburg, 1998). Les animaux utilisés sont de préférence des femelles adultes Balb/C (anciennes reproductrices), car elles présentent une prédisposition physiologique favorisant une dilatation de leur paroi abdominale en diminuant le risque de compression d‘organe (respect des 3R).
Evaluation par microscopie intravitale des effets de la Photobiomodulation sur l’inflammation chronique et aiguë suivant un traumatisme de la moelle épinière
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes reçoivent l'implantation d'une fenêtre vitrée dans la colonne vertébrale, et 420 d'entre elles une section partielle de la moelle épinière qui provoque une paralysie postérieure temporaire, avec difficultés à s'alimenter et à vider la vessie. Le porteur teste ensuite un traitement par lumière et compare la récupération à celle de 300 souris non lésées, avec des prélèvements sanguins deux fois par semaine et une mise à mort par perfusion intracardiaque. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou in silico ne rend compte de la complexité du traumatisme médullaire, les bénéfices annoncés restant formulés au conditionnel.
Objectifs
Ce projet mettra en place un modèle murin de traumatisme médullaire permettant de clarifier les mécanismes neuroinflammatoires régulés par ce traitement, en vue d'accélérer et maximiser la récupération fonctionnelle. Il s'agit donc non seulement d'un enjeu de recherche fondamentale mais aussi de recherche cliniquement applicable.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’évaluer le traitement par photobiomodulation en fonction d’une application précoce, tardive ou combinée et de comparer l’évolution des densités cellulaires et de la récupération sensori-motrice post-traumatique avec celles observées pour des animaux lésés mais non traités. Ainsi nous pensons pouvoir mettre en évidence un effet anti-inflammtoire et neuroprotecteur de la PBM appliquée en phase aiguë immédiatement après le traumatisme et pendant 5 jours consécutifs. Nous pensons également pouvoir mettre en évidence un effet neurotrophique et neuro-régénératif de la PBM dans les phases chroniques grâce à une action directe sur la microglie après exposition brève pendant 5 jours à compter de la 5ème semaine post-traumatique. Si tel est le cas, la combinaison de ces deux protocoles thérapeutiques permettra d’amplifier les effets positifs de la lumière et d’accélérer, sinon de maximiser, la récupération fonctionnelle post-traumatique.
Procédures
Sur cinq ans, la totalité des 720 animaux seront soumis à une chirurgie pour implanter une fenêtre vitrée spinale permettant de réaliser des expériences de microscopie intravitale longitudinale sous anesthésie. L’implantation d’une fenêtre vitrée n’induit pas de nuisance majeure pour la locomotion et le comportement de l’animal non lésé. 420 souris seront de plus soumises à une transection partielle de moelle épinière thoracique (hémisection) de laquelle elles récupèrent spontanément au bout de 6 à 7 semaines en l’absence de traitement. 92% de ces animaux traumatisés recevront un traitement de 6 min de photobiomodulation quotidienne appliquée pour 5 jours consécutifs soit immédiatement au moment du traumatisme, soit un mois après, soit combiné (immédiat et un mois après). La durée des expériences sera limitée à 60 jours post-trauma. La réponse au traitement de ces animaux sera comparée à celle de 300 animaux non lésés. Les sessions d’imagerie intravitale ne sont pas douloureuses, ni destructives. Sur tous les animaux, la réponse musculaire réflexe sera évaluée 2 fois par semaine sous anesthésie volatile légère grâce à des enregistrements électromyographiques de la contraction musculaire induite par stimulation du nerf tibial. Sous anesthésie gazeuse également, des prélèvements sanguins seront réalisés 2 fois par semaine à raison de 50 µl par prélèvement sans dépasser un volume maximum équivalent à 7,5% de la volémie totale de nos animaux chaque semaine. Ces prélèvements n'auront lieu qu'après reprise du poids initial de l'animal. Tous les animaux seront mis à mort dans les 60 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/CSF nécessaires aux études et caractérisations post-mortem.
Impact sur les animaux
Les différentes techniques d'exploration utilisées dans ce projet sont suceptibles d'engendrer les nuisances suivantes : anesthesie, implantation de fenetre vitrée spinale, lésion de moelle épinière, gêne locomotrice : paralysie temporaire unilaterale postérieure pouvant occasionner une difficulté à la prise alimentaire, risque éventuel de difficulté de la vidange de la vessie peut-être observé dans les premiers jours, traitement quotidien par photobiomodulation non invasive, l'hébergement en cage individuelle, stress et/ou douleur, prélèvements sanguins. Des électrodes adhésives sont proposées en lieu et place d’électrodes implantées. Prelevement LCR par citerne et perfusion intracardiaque.
Devenir
Tous les animaux (720) seront euthanasiés dans les 60 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem.
Remplacement
Les pathologies neurodégénératives et traumatismes médullaires sont des processus complexes impliquant l’interaction entre de très nombreux organes et systèmes physiologiques (nerveux, immunitaire, endocrinien, cardiovaculaire… ) qu’il est nécessaire d’analyser et de comprendre. Aucun modèle cellulaire ou aucun modèle in silico ne sont aujourd’hui en mesure de rendre compte de cette complexité. L'importance de l'interaction entre les axones, la myeline, les vaisseaux sanguins et les autres types cellulaires (microglie et astrocyte) rend la mise en place d'un système in vitro reproduisant toutes les composantes trop complexe et n'est pas envisageable. Le modèle d’hémisection est nécessaire pour permettre de tirer des conclusions sur les mécanismes de récupération fonctionnelle. La procédure de thérapie par photobiomodulation dans notre modèle est une étude pré-clinique visant à ouvrir la voie à des essais cliniques pour des applications dans le traitement du traumatisme de moelle sachant que celle-ci est dors et déjà appliquée sur l'humain dans le cadre d'études cliniques pour le traitement de la maladie d'Alzheimer et des contusions cérébrales chez les sportifs. Dans notre cas, un des critères principaux de l'effet du traitement est l'évolution des capacités motrices, avec et sans traitement, au cours du temps. Cette étude ne pourrait donc pas etre réalisée autre que in-vivo.
Réduction
Sur la base de nos travaux passés, les lots d’animaux sont dimensionnés au minimum pour s’assurer de la significativité statistique des quantifications in vivo et sur tranches en utilisant le test statisitque dédié aux petits échantillons. Ce test nous a permis de définir le nombre d'animaux requis pour l'étude. Ainsi il est nécessaire de réaliser la quantification in vivo pour 8 animaux par groupe à J60. Compte tenu d’une probabilité d’environ 70% d’obtenir une fenêtre claire sur deux mois post-traumatiques suivant l’expertise des expérimentateurs chirurgiens, il est prévu d’utiliser 12 animaux par groupe pour les expériences intravitales. Les expériences d’imagerie sur coupes histologiques sont moins bruitées et permettent de moyenner l’analyse sur un plus grand volume de tissus pour obtenir des résultats moins variables. Le nombre d’animaux nécessaires à chaque temps est donc de 3 au lieu de 8 in vivo. Afin de couvrir les 6 temps d’intérêts, 18 animaux seront nécessaires par groupe pour réaliser les expériences d’immunohistochimie. Le nombre de 720 animaux a donc été établi afin d'avoir un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe permettant d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences avec significativité statistique. Le modèle souris est choisi en raison de sa très bonne récupération spontanée suite à un traumatisme de moelle, récupération que nous souhaitons accélérer par une prise en charge thérapeutique de type clinique tout en étudiant dans le même temps l’implication du système immunitaire. Les mêmes animaux et les mêmes données servent ainsi à la recherche fondamentale ET à la recherche applicative.
Raffinement
Reception et adaptation de 7 jours. Après induction à l'isoflurane, injection de buprénorphine, les animaux sont anesthésiés avec injection intrapéritonéale d'une solution de kétamine et xylazine; ces doses sont augmentées de 50% avant la perfusion intracardiaque pour anesthésie profonde pré-opératoire et mis sur un tapis chauffant. Les yeux sont oints de gel hydratant, une infiltration de lidocaine est appliquée avant toute incision. Après laminectomie, Une injection sous-cutanée d'une solution d'anti-inflammatoires, dexamethasone et rimadyl, est réalisée le jour de la chirurgie puis tous les deux jours pendant 10 jours. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles respectant la surface minimale requise, avec objet d’enrichissement de l’environnement (dômes en carton ou en plexiglas ou encore coton). un accès non limité à la nourriture et l’eau, un cycle de 12h jour et 12 nuit, une température et une humidité contrôlées. Les animaux sont visités tous les jours par des personnes compétentes dans le domaine de l’expérimentation et du bien-être animal comme attesté par les autorités référentes. Pour s'assurer de la bonne vidange de la vessie le bas du ventre de chaque animal est palpé 2 fois par jours. Dans le cas éventuel où la vessie ne se viderait pas, nous appliquons des massages jusqu'a vidange de celle ci. Du gel sucré énergétique est mis à disposition au fond de la cage pendant la procédure afin de s’assurer que l’animal a les apports énergétiques dont il a besoin. Le recours à l’anesthésie a lieu aussi souvent que nécessaire pour limiter le stress ou la douleur inhérentes aux manipulations requises pour les prélèvements ou les sessions d’imagerie. Les animaux sont pesés quotidiennement les 5 premiers jours avec pour poids de référence le poids avant la procédure chirurgicale. Une variation de plus de 20% pendant plus de 3 jours, malgré la supplémentation sous-cutanée en solution sucrée, sera considérée comme un point limite. Les procédures choisies s seront accompagnées d'un suivi rigoureux des signes cliniques (score de douleur: Grimace scal Langford et al). La mise a mort de l'animal sera effectuée s'il atteint son point d'arrêt.
Choix des espèces
Nous utilisons la microscopie de fluorescence intravitale. Il est donc nécessaire d’étudier des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents. Nous disposons d’une lignée unique, établie et caractérisée depuis plusieurs années par notre équipe et dans laquelle les populations cellulaires d’intérêt sont génétiquement marquées de différentes couleurs. Le phénotype de ces cellules est aujourd’hui très bien caractérisé par nos travaux précédents. Ceci évite de perdre des animaux en mise au point de protocole. Dans le cadre du traumatisme de moelle, la souris démontre une très bonne récupération spontanée tout en impliquant des processus physiologiques fortement similaires à ceux rencontrés chez l’humain : neurodégénération et repousse de colatérales d’axones, angiogénèse et recrutement de cellules inflammatoires, gliose réactionnelle… Les observations sont donc facilement transférables au contexte clinique. Les vastes connaissances actuelles sur l’organisation de la moelle épinière chez la souris et sur son comportement en font un modèle pré-clinique de choix dans lequel les signes de douleur ou souffrance sont aisément détectables et interprétables. Tous les animaux seront de animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observée chez les patients traumatisés médullaire. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement, tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux. Les deux sexes seront utilisés pour rendre compte de la diversité des cas observés chez les patients lésés médullaires.
Mécanismes des récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement chez la souris 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau, implantation d'électrodes de deux à six heures et injection de virus, suivies d'enregistrements de l'activité neuronale et de tests de mesure de l'anxiété et de la peur. Le porteur décrit une recherche fondamentale sur des récepteurs au glutamate et affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour préserver un réseau neuronal intact chez le rongeur. Les applications thérapeutiques pour les troubles anxieux sont annoncées à long terme, l'euthanasie servant à des analyses histologiques post-mortem.
Objectifs
Le projet, qui se déroulera dans deux établissements, a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs au glutamate étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement, dans un cadre physiologique et pathologique. Il s’agira notamment de comprendre l’importance de ces récepteurs dans la formation et la stabilisation des souvenirs associant un contexte à une émotion donnée et leur implication dans les comportements liés à l'anxiété. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à la réactivation et la coordination de plusieurs structures cérébrales pendant l'exécution et la consolidation des souvenirs aversifs dépendante du sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements in vivo chez des souris libres de leurs mouvements et endormies. L'identification des processus de formation de souvenirs émotionnels est essentielle pour comprendre comment ces processus sont affectés dans la maladie. Ce projet devrait permettre des avancées scientifiques sur les mécanismes et la diversité des récepteurs du glutamate, sur la régulation des signalisations neuronales et des fonctions cérébrales et comportementales associées. Notre travail ouvrira de nombreuses perspectives tant avec des implications importantes sur notre compréhension de la neurotransmission et le développement de nouveaux agents protecteurs contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Ainsi des retombées sont attendues tant dans le domaine fondamental qu’appliqué (développement de nouvelles stratégies thérapeutiques).
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ces troubles touchent environ 15 à 20 % de la population à un moment ou un autre de leur vie. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr) avec ou sans comportement (1h maxi / jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) comportement (mesure de l’anxiété ou de la peur), 2) injection de virus + comportement, 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones + comportement. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui, selon les besoins, pourra permettre des prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes (hors enregistrement de l’activité neuronale et comportement) est réalisés sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement nécessaire à la préservation des électrodes implantées (stress modéré) ; comportement (stress modéré).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem).
Remplacement
Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 2104 animaux.
Raffinement
Après leur réception, les animaux sont habitués aux expérimentateurs par une manipulation bienveillante pendant 5jrs (5min) de manière à réduire le stress lors des procédures. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes ou individuellement et disposeront d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur, les animaux seront exclus du protocole. Les procédures comportementales sont modérément aversives et brèves et n'induisent pas d'angoisse sur le long-terme.
Choix des espèces
Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage la qualifient comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Nous utiliserons des souris non génétiquement modifiées et des souris génétiquement modifiées dans le cadre de ce projet. Ces souris se développent normalement et ont un comportement général sans anomalies évidentes. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Induction de la pathologie TDP-43 chez des souris à partir de protéines pathologiques issues du système nerveux central de patients atteints de Sclérose Latérale Amyotrophique sporadique.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque semaine pendant huit semaines une injection intrathécale de protéines pathologiques prélevées sur des patients atteints de la maladie de Charcot, pour tenter de reproduire la maladie, et subissent des tests de motricité, de force musculaire et de curiosité. Le porteur indique que les souris pourraient développer une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive, un point limite portant sur la fonction motrice déclenchant alors la mise à mort. Il affirme qu'il est "indispensable" de générer un modèle de la forme sporadique, inexistant à ce jour, aucune alternative cellulaire ne permettant selon lui d'étudier la propagation de la protéine.
Objectifs
La maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative qui touche les neurones du cerveau et de la moelle épinière responsables du mouvement. La maladie débute en moyenne à l’âge de 60 ans et est responsable d’une paralysie progressive, de troubles de la parole et de la déglutition, et de difficultés respiratoires aboutissant au décès en 2 à 5 ans. Il n’existe à ce jour aucun traitement de la maladie, et la recherche sur la maladie de Charcot a été marquée ces 20 dernières années par une multitude d’essais thérapeutiques négatifs. Ces résultats sont en grande partie liés à la faible connaissance des mécanismes à l’origine de la maladie, et à l’absence de modèles animaux fiables. Deux formes de la maladie existent, les formes héréditaires causées par des mutations génétiques représentent moins de 10% des patients, et les formes dites sporadiques qui représentent plus de 90% des patients et pour lesquelles l’origine de la maladie est inconnue. Un acteur semble toutefois jouer un rôle central dans la maladie : une protéine appelée TDP-43, qui s’accumule de manière anormale dans les neurones des patients atteints de la maladie. Parallèlement, cette protéine semble jouer un rôle dans la propagation de la maladie au sein du système nerveux en se propageant de neurone en neurone. Malgré les avancées réalisées dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la maladie ces dernières années, l’absence de modèle animal reproduisant la maladie est une limite majeure. Des modèles animaux portant les mutations génétiques responsables de formes familiales existent mais ne représentent que moins de 10% des patients. Il est donc indispensable de générer de nouveaux modèles représentatifs des 90% des patients atteints de la forme sporadique pour avancer dans la compréhension de la maladie et faire émerger de nouvelles pistes thérapeutiques. L’objectif du projet est de répondre à l’absence de modèles animaux fiables dans la recherche sur la maladie de Charcot en générant un modèle animal de la forme sporadique (inexistant à ce jour limitant les progrès de la recherche) pour permettre la compréhension des mécanismes impliqués et appliquer des stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Si les souris développent une pathologie similaire à la maladie de Charcot chez l’Homme, alors elle pourra être étudiée sur un modèle fiable de la maladie pour identifier les mécanismes impliqués afin de mieux comprendre l'origine et la propagation de la maladie, et enfin permettre d’identifier de nouvelle cible thérapeutique.
Procédures
Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. Au total, 36 souris subiront une injection intrathécale par semaine pendant 8 semaines (équivalence de la ponction lombaire chez l’Homme) sous anesthésie générale courte avec anesthésie locale. L’anesthésie générale et l’injection durent en moyenne 10 minutes. La procédure démarre par deux semaines d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, ainsi que l’habituation aux tests comportementaux qui seront réalisés. Une semaine après chaque injection, et avant l’injection suivante, les animaux subiront des tests comportementaux et cognitifs. Ces tests sont au nombre de 3 et visent respectivement à évaluer la motricité, la force musculaire et la curiosité. La durée de ces tests est d’environ 30 minutes par souris (3 tests différents de 10 min chacuns avec des temps de récupération entre chaque). Un mois après la dernière injection, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem et études biochimiques et d’imagerie.
Impact sur les animaux
Une procédure modérée telle que l’injection intrathécale entraine peu de douleur car cette procédure est réalisée sous anesthésie générale avec anesthésie locale sur la zone de l’injection, et que les animaux recevront une injection d’analgésique pour couvrir une éventuelle douleur post-injection. Les animaux sont surveillés au réveil, et dans les premières heures suivant l’injection puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée et des antalgiques setont administrés si toutefois une douleur est décelée. L’injection de protéines pathologiques ayant pour but de créer un modèle de la maladie, les animaux seront également surveillés quotidiennement. D’après notre expérience, pas ou peu de signes de mal être sont attendus car la maladie de Charcot chez l’Homme n’entraîne pas de troubles cognitifs ni de dépression, mais ces symptômes seront tout de même surveillés. En revanche, si notre modèle permet d’induire des symptômes semblables à la maladie chez l'Homme, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive (entrainant une perte de poids). Pour ces raisons, nous suivrons l’apparition de symptômes éventuels à travers la surveillance quotidienne des animaux, la pesée bihebdomadaire à partir des premiers symptômes, ainsi que par l’utilisation de tests hebdomadaires d’évaluation de la fonction motrice des animaux. La grille de score des points limite s’attarde notamment sur la fonction motrice des animaux de façon à ce qu’ils soient euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement et donc de s’alimenter et de boire correctement. Enfin, les tests comportementaux réalisés pouvant engendrer un stress lié à l’isolement et à la contention des souris, une habituation 15 jours avant le début de la procédure sera réalisée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des 2 procédures pour exploration de la propagation de la maladie par des études biochimiques et histologiques.
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de la protéine TDP-43 dans l’induction et la propagation de la maladie de Charcot. En effet la maladie met en jeu l’organisme entier et plus particulièrement le système nerveux central (cerveau et moelle épinière). Les modèles cellulaires ne permettent d’évaluer le mode d’action qu’au niveau moléculaire et cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe ou à l’organisme entier. Aussi, il n’existe pas de modélisation mathématique ou d’alternatives non animales dans ce domaine.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, 36 animaux au maximum seront nécessaires à ce projet : 3 groupes de 12 animaux (groupe expérimental, contrôle sain, contrôle négatif), dans chaque groupe se distinguent 2 sous-groupes en fonction de la destinée des animaux (6 animaux pour analyses biochimiques et 6 animaux pour analyses histologiques), et chaque sous-groupe est constitué de 50% de souris mâles et 50% de souris femelles. Ainsi 36 animaux sont nécessaires pour avoir minimum 3 réplicas par sous-groupe et par sexe. De plus, un groupe de souris sera utilisé pour mettre au point le protocole de mise à mort et de dissection permettant ainsi d’améliorer le protocole et de diminuer le nombre d’animaux utilisés par lots car moins de perte étant donné que le personnel sera formé. Ce groupe de souris utilisera des animaux de l’animalerie n’ayant pas les caractéristiques qui sont voués à être sacrifiés dans tous les cas.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animaux (4 souris par cage car ce sont des animaux sociaux), et les animaux évolueront dans un environnement enrichi (cabane, coton, rouleau de sopalin, etc…). Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalerie. La douleur susceptible d’être induite par les injections sera limitée car elles seront réalisées sous anesthésie générale courte et accompagnée d’une anesthésie locale par précaution. Les animaux seront surveillés au réveil, et dans les premières heures suivant l’injection puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée grâce à une grille de score. L’injection a pour but de créer un modèle pathologique modéré. En revanche, si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive. Pour ces raisons, nous suivrons l’apparition de symptômes éventuels à travers la surveillance quotidienne des animaux, ainsi que par l’utilisation d’une grille de score et de points limites adaptés. La grille de score s’attarde notamment sur la fonction motrice des animaux de façon à ce qu’ils soient euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement. Par ailleurs, si moins de 8 injections sont nécessaires à l’induction de la pathologie elles seront réduites au strict minimum. Aussi, les tests comportementaux pouvant engendrer un stress lié à l’isolement, une habituation 15 jours avant le début des tests sera réalisée. Par ailleurs, un groupe de souris sera prévu pour mettre au point le protocole d'injections, de dissection/expérimentation. Ce groupe utiliseras des animaux de l’animalerie n’ayant pas les bons génotypes qui sont voués à être sacrifiés dans tous les cas. Ceci contribue à réduire le nombre d’animaux dans les autres groupes et permet une meilleure utilisation des animaux dans un soucis de réduction et de raffinement.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour l’étude des maladies humaines car l’organisation de son ADN et l’expression de ses gènes sont similaires à celles de l’Homme. La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacent à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle facile à entretenir, bien décrit et documenté. C’est un modèle utilisé dans le monde entier permettant ainsi de comparer les résultats entre les laboratoires de recherches. Les souris seront âgées d’environ 4 mois, l’âge moyen pour avoir des animaux adultes et mature car la maladie de Charcot est une maladie qui touche des adultes.
Evaluation sur souris saines de gels pour l’administration sous-cutanée prolongée d’un peptide pour les pathologies neurodégénératives
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
396 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un gel en sous-cutané sous anesthésie puis subissent des contentions et jusqu'à trente-sept séances d'imagerie sous anesthésie sur vingt-huit jours, pour évaluer la libération prolongée d'un peptide destiné aux maladies neurodégénératives. Les bénéfices annoncés pour le confort des patients sont renvoyés au court terme pour la preuve de concept et au long terme pour une application. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives" reproduisant la complexité d'un environnement sous-cutané.
Objectifs
Depuis quelques années, une nouvelle classe d'actifs thérapeutiques (des petites protéines) a atteint le marché. Nous travaillerons dans ce projet avec un nouveau candidat prometteur pour les pathologies neurodégénératives. Cependant, son utilisation est freinée par son manque de stabilité dans l'organisme et son élimination rapide ce qui entraine des administrations fréquentes ou à dose élevée afin d’atteindre un effet thérapeutique suffisante. Cette stratégie d’administration souffre de plusieurs défauts tels qu’un inconfort pour le patient résultant en un mauvais suivi des traitements, ou la nécessité d’injections fréquentes à l’hôpital par un personnel qualifié augmentant ainsi le coût du traitement. L’objectif de ce projet est de proposer une nouvelle formulation de cet actif permettant une administration prolongée par voie sous-cutanée plus attractive que la voie intraveineuse et plus confortable pour le patient ainsi que le praticien. Dans ce contexte, nous avons récemment formulé une famille de gels biodégradables et biocompatibles permettant une libération prolongée de l'actif sur plusieurs heures in vitro. L’objectif du projet est d’établir une preuve de concept de l’intérêt des gels pour une libération prolongée de l'actif. Ce projet permettra d’évaluer sur souris saine la biodégradabilité et la biocompatibilité des gels développés et de valider la libération prolongée de l'actif.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra d’établir une preuve de concept de l’intérêt des gels développés et de sélectionner les formulations les plus prometteuses pour une libération contrôlée et prolongée d'une petite protéine prometteuse pour les pathologies neurodégénératives (diminution des symptômes ou de l'avancées des maladies). L’objectif à long terme de ce projet d’étendre l’étude à d’autres protéines et donc de proposer un système de délivrance des petites protéines implantable en sous-cutané afin d’améliorer le confort de vie des patients tout en réduisant le coût global des traitements.
Procédures
Contention lors des déplacements (
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir plusieurs gestes tels que des contentions, des anesthésies, des piqures pour des administrations sous-cutanées qui vont engendrer des douleurs et du stress. Pour l'une des procédures, l’accumulation de ces gestes entraînera une nuisance globale modérée sur les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour permettre des analyses ex vivo.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Des études in vitro ont déjà été réalisées mais ne permettent pas de reproduire toutes les conditions représentant la complexité d'un environnement sous-cutané. Le modèle animal est donc nécessaire pour évaluer la libération sous-cutanée des actifs piégés dans les gels ainsi que la biodistribution des gels dans le temps. Ces études auront lieu uniquement sur souris saines.
Réduction
L’emploi d'un système d'imagerie du petit animal permet un suivi dans le temps pour chaque animal et permet ainsi de réduire le nombre d’animal pour le projet. Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente. Le projet se compose de 3 phases et le nombre total d'animaux pourra être diminué en fonction des résultats obtenus lors de chaque phase.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe pour maintenir une interaction entre individus dans des cages enrichies. Le protocole expérimental prend en compte l’impact sur le stress et la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance et stress animal.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec des souris pour lesquelles de nombreux protocoles sont établis et des études ont déjà réalisée avec le peptide et des gels similaires. Seules des souris femelles (8-10 semaines en début de procédure) seront utilisées dans cette étude