Troubles nerveux
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- Diagnostic des maladies
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- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
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- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Crises épileptiques induites par un stimulus externe
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2220
10 620 rongeurs, 8 400 souris et 2 220 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit un candidat médicament puis une stimulation électrique ou sonore déclenchant une crise d'épilepsie, certains après implantation d'une canule dans le cerveau sous anesthésie, pour tester des molécules antiépileptiques. Le porteur indique que la crise tonico-clonique provoquée peut aller jusqu'à l'arrêt respiratoire, les animaux étant tués juste après la convulsion ou en fin de test car les procédures ne permettent pas de les maintenir en vie dans de bonnes conditions. Il reconnaît des alternatives in vitro pour présélectionner les molécules mais affirme la nécessité du modèle animal pour l'étape finale.
Objectifs
L'objectif du projet consiste à évaluer de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les épilepsies généralisées ou partielles. A l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. Les crises généralisées correspondent à des décharges électriques anormales au niveau cérébral (les 2 hémisphères sont touchés), qui se traduisent par des convulsions tonico-cloniques. Les convulsions cloniques sont des secousses musculaires incontrôlées alors que les convulsions toniques correspondent à un raidissement et une contraction soudaine des muscles du corps et des membres inférieures et supérieurs accompagnés d'un arrêt respiratoire temporaire ou définitif. Des symptômes précurseurs sont parfois observés avant l'apparition d'une convulsion généralisée comme une hypersalivation ou une respiration bruyante. Les crises partielles sont liées à une décharge électrique anormale dans une région cérébrale spécifique. Les symptômes de la crise dépendent de la zone atteinte. Des fourmillements, picotements, sensation ou encore secousses musculaires incontrôlées au niveau d'un membre peuvent être observés chez l'Homme. Des mouvements de la tête ou des yeux ou encore des signes émotionnels (peur, rire..) peuvent également faire partie des symptômes. Le projet consiste en l'utilisation de tests basés sur l’induction de crises épileptiques par le moyen de stimulation électrique ou sonore permettant de tester l'innocuité et/ou l'efficacité de substances pharmacologiques en développement.
Bénéfices attendus
Les modèles de crises généralisées et partielles induits par une stimulation sont recommandés pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou les traitements sont inefficaces (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux antiépileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements prophylactiques contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet antiépileptogène. Il n’en existe aucun à ce jour alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.
Procédures
Pour chaque procédure décrite, les candidats médicaments seront administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Si applicable, l'implantation d'un guide canule est réalisée sous anesthésie générale sur environ 60 minutes. Dans chacune des procédures décrites, le rongeur sera exposé à un stimulus, d'un durée maximale de 60 secondes chez la souris et de 3 secondes chez le rat. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés avant le test (à minima 24 heures avant la stimulation, durée de l'ordre de la minute) pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les tests modélisant des crises induisent un stress physique chez les rongeurs, également retrouvé chez les patients lors de la survenue d'une crise épileptique (avec l'apparition de mouvements involontaires saccadés ou un raidissement des membres/du corps). Des symptômes annonciateurs peuvent être également observés chez l'homme comme la nervosité, l'irritabilité ou une hypersalivation. Chez l'animal, ce stress est principalement lié à la stimulation appliquée sur une très courte durée et qui conduit à l'apparition de symptômes convulsifs. La survenue de crises tonico-cloniques peut conduire à la mort des patients épileptiques et peut donc dans certains cas provoquer une certaine souffrance chez l'animal. Des points limites prédictifs limitent cet impact. Lorsque les animaux sont implantés avec un guide canule, ils sont mis en cage de réveil et maintenus isolés pendant environ 7 jours à partir de la chirurgie afin de protéger le guide canule de leurs congénères. Le prélèvement de sang au cours d'une expérience peut également conduire à un léger stress chez l'animal vigile.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés immédiatement après la stimulation si une convulsion tonique est observée ou à la fin du test en l'absence de convulsion tonique car ces procédures ne permettent pas le maintien en vie des animaux dans de bonnes conditions.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives in silico ou in vitro permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées dépendant de la nature des données : variables dichotomiques, données paramétriques ou non paramétriques. Il est possible de tester plusieurs composés et doses dans une même expérience. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux contrôles et le nombre d'animaux testés avec une substance connue.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Une solution anesthésiante sera appliquée. Les animaux seront anesthésiés et/ou euthanasiés, immédiatement après l'apparition d'une convulsion tonique. Pour les études incluant une chirurgie pour administrer le composé par voie intracérébrale, une analgésie est assurée par l’administration d'un analgésique systémique et l'utilisation d'un analgésique local. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué pendant la chirurgie pour éviter le dessèchement de l'oeil.
Choix des espèces
Les modèles de convulsions induites par une stimulation externe sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur (souris et rat). Les procédures décrites dans ce projet sont recommandées pour évaluer de nouveaux candidats médicaments (efficacité) et/ou l'innocuité d'un composé dans le cadre de l'épilepsie. Les rongeurs utilisés sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique .
Rôle de deux enzymes dans l’épileptogenèse chez la souris atteinte de la sclérose tubéreuse de Bourneville sur le cerveau. 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une chirurgie cérébrale sous anesthésie pour la pose de transmetteurs, toutes reçoivent des injections quotidiennes pendant quinze jours, et le porteur anticipe des crises d'épilepsie potentiellement mortelles pour 10 % des animaux. L'objectif est de créer des souris porteuses de deux gènes inactivés pour étudier la sclérose tubéreuse de Bourneville. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut reproduire le développement cortical et l'épilepsie.
Objectifs
Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels dans le cerveau. Ces modèles nous permettrons de mieux comprendre les mécanismes conduisant à des désordres neurologiques et des crises épileptiques.
Bénéfices attendus
L'établissement de modèles murins pertinents de la sclérose tubéreuse de Bourneville avec atteintes cérébrales permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose tubéreuse de Bourneville et de découvrir des mécanismes génétiques responsables du développement de malformations corticales et de la formation des crises d’épilepsie. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans la sclérose tubéreuse de Bourneville et dans d’autres pathologies neurologiques et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
1200 souris seront utilisées dont 600 souris qui auront de la chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie de 3 minutes) pour subir des injections. Les 1200 souris seront soumises à des traitements pharmacologiques par injections quotidienne pendant 15 jours d'une durée de 1min. 600 souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale de 20 min afin d’enregistrer les crises épileptiques et les paramètres physiologiques en continue sans stress des animaux sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La cinétique des signes cliniques des animaux épileptiques est bien connue et démontrent un phénotype précoce et sévère. Nous anticipons que le phénotype des animaux que nous avons générés, sera potentiellement moins sévère que celui des animaux épileptiques. Cependant, nous ne pouvons exclure que ces animaux développent un phénotype équivalent et nous nous attendons à observer chez ces animaux la survenue des crises épileptiques même si plus tardives et moins fréquentes mais qui pourraient être léthales pour 10% des souris. Les traitements pharmacologiques par injection n'entrainent pas d'effet néfaste. Les injections répétées sont susceptibles d’entraîner des irritations, si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. La pose des transmetteurs pour permettre la télémétrie se fera sous anesthésie générale. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après les chirurgies. Il n'est pas connu de risque de rejet du transmetteur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Le développement corticale et l’épilepsie est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations endocrines. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes d'intérèt sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. les traitements pharmacologiques ne présentent pas de toxicité et ont déjà été testées in vitro ainsi que in vivo aux mêmes doses. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.
Réduction
L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. Dans ce modèle, un groupe de 25 animaux est suffisant donc des groupes de 25 animaux seront utilisés. L'estimation du nombre d'animaux a été réalisé en comptant une perte de 10% de nos animaux.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton, de bâtonnets de bois et de tunnel. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites 2 fois par semaine. Le traitement pharmacologique choisi sera administré quotidiennement et sera effectué par un technicien expérimenté à l'aide de seringues très fine qui donnent une injection quasi indolore. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Les traitements pharmacologiques par injection ne provoquent pas d'effet néfaste. Les injections auront lieu alternativement à gauche ou droite. Pour éviter une irritation, une solution apaisante sera appliquée. La pose de transmetteur sera faite sous anesthésie générale avec une analgésie. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après la chirurgie. Des points limites spécifiques ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.
Choix des espèces
Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes d'intérèt, jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons d’un large répertoire de lignées de souris modèles, ce qui permet d’évaluer l’interaction parmi plusieurs éléments de cette signalisation ; 4) nous disposons également de nombreux outils adaptés à la souris ; 5) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. 6) l'âge postnatal est le stade de développement privilégié pour étudier la survenue des crises épileptiques.
Evaluation préclinique de microsuture après implantation autour du système nerveux périphérique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque lapin est opéré sous anesthésie pour placer un fil de microsuture autour du nerf sciatique, puis suivi une quinzaine de jours, avec surveillance des automutilations et de la locomotion. Il s'agit d'évaluer, pour des donneurs d'ordre industriels, la tolérance de fils de suture destinés à la microchirurgie humaine, en vue d'une mise sur le marché. Le porteur affirme qu'aucune méthode ex vivo ne peut recréer ces interactions et que le nombre d'animaux, fixé par les normes, ne fait l'objet d'aucun calcul statistique.
Objectifs
Ce projet vise à développer un modèle animal adéquat pour étudier la tolérance locale (évaluation de la réaction d’un organisme en contact avec un produit étranger). Ce type de modèle animal permettra de répondre à des besoins scientifiques et cliniques actuels pour les produits de santé en microchirurgie. Ces études entreront dans la constitution de dossiers précliniques, étape nécessaire à l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché et à l’utilisation clinique de ces produits chez l’humain. L’obtention d’un modèle animal de suture sur le nerf sciatique est nécessaire afin d’évaluer les produits de santé utilisés pour réaliser des microsutures sur les tissus en microchirurgie, opthalmologie, microchirurgie vasculaire et en neurochirurgie. Des modèles animaux mammifères suffisament grands (exemple : lapin) sont nécessaires pour pouvoir réaliser ce genre de microsuture. L’ensemble de ces données permettra de réduire les risques de complication lors des phases de tests.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’obtenir un modèle animal fiable et reproductible pour l’obtention de données de performance et de sécurité des produits de santé utilisés pour réaliser des microsutures sur les tissus en microchirurgie, opthalmologie, microchirurgie vasculaire et en neurochirurgie. Ainsi avec ce projet, il est possible d’analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l’obtention d’une mise sur le marché. Ce modèle animal pourra être utilisé en vue de sélectionner un produit parmi un panel de produits en développement (essais de screening), en comparant leurs données de performance et de sécurité. Ces essais de screening sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre total d’animaux utilisés, en poussant seulement le développement des produits les plus intéressants et en écartant rapidement des recherches les produits ne présentant pas les qualités de sécurité ou de performance satisfaisantes. Par la suite des essais de screening, ce modèle animal permet aussi de mener des essais de confirmation de performance et de sécurité d’un produit en développement, en le comparant à un autre produit déjà commercialisé, afin de s’assurer qu’il présente un bénéfice au moins égal ou supérieur.
Procédures
L’ensemble des animaux sera opéré sous anesthésie générale et traitement analgésique pour placer le fil de microsuture autour du nerf sciatique. Une intervention chirurgicale par animal sera réalisée. L’intervention chirurgicale aura une durée d’environ 20 à 40 minutes par site. Les animaux seront ensuite manipulés pendant la phase post-opératoire (envrion 14 jours) pour pouvoir apprécier la bonne guérison du site chirurgical et évaluer les signes de douleur. Enfin, pour évaluer l’efficacité et l’absence d’effet indésirable, des prises de sang pourront être réalisées sur les animaux en cours d’étude. Celles-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude).
Impact sur les animaux
A l’instar des effets secondaires possibles chez l’humain lors de microsutures, les effets indésirables connus pouvant survenir chez l’animal sont : - douleur et stress liés à l’implantation du fil de microsuture auour du nerf sciatique, controlée par la prise d’analgésique (morphonique) et par la réalisation d’une anesthésie générale.
Devenir
Afin de s’assurer de la sécurité des fils de suture, une observation des tissus environnant la zone d’implantation est nécessaire. Ceci permet d’évaluer la tolérance locale de ces produits, ce qui est l’objectif des études réalisées sur ce modèle animal. Des prélèvements de tout ou partie de certains organes peuvent éventuellement être nécessaires, en particulier en cas d’anomalie constatée, pour évaluer les effets tissulaires à l’échelle microscopique. L’ensemble de ces facteurs explique l’impossibilité en fin d’étude de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
Les essais in vivo de sutures de microchirurgie sont nécessaires car les interactions complexes s’établissant entre le fil de microsuture et le nerf sciatique ne peuvent être recréées ex vivo. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives pour prouver l’efficacité et les performances des produits de sutures de microchirurgie. Des mesures ex vivo (tests de sutures sur nerf sciatique d’un animal euthanasié) peuvent être réalisées en amont des études in vivo, et permettent d’estimer les meilleures conditions pour disposer le fil de microsuture autour du nerf sciatique à injecter chez l’animal. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de fournir l’ensemble des réponses nécessaires à l’évaluation de la performance et de la sécurité des produits de sutures de microchirurgie en vue de leur utilisation chez l’humain. Les études in vivo sont donc nécessaires pour répondre aux exigences réglementaires et de qualité dans le but de mettre sur le marché les produits de sutures de microchirurgie.
Réduction
Le donneur d’ordre demandant la réalisation de ces tests s’engage à ne pas faire renouveler à l’identique un essai déjà mené précédemment. De plus, l’interprétation des résultats nécessite toujours de comparer ceux obtenus chez des animaux qui reçoivent le produit évalué avec ceux obtenus d’animaux qui reçoivent un produit « contrôle », dont l’effet attendu est déjà connu. Pour réduire encore le nombre d’animaux inclus en étude, il est possible d’utiliser un même groupe « contrôle » pour plusieurs groupes « test » recevant des produits à tester différents. Enfin, nous avons déjà mentionné la possibilité de réaliser des études pour sélectionner parmi un panel de produits celui qui présente le plus d’intérêt à être développé, réduisant ainsi le nombre de tests réalisés sur des produits ayant un intérêt moindre. Par ailleurs, si l’effet attendu d’un produit est trop incertain, il est possible de réaliser une étude dite « pilote » sur quelques animaux seulement. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit, avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d'animaux étant réglementé par les normes, aucune approche statistique ne sera réalisée.
Raffinement
- Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et avant la chirurgie d’implantation du fil de microsuture au niveau d’un nerf périphérique, une période d’habituation aux actes spécifiques (contention,…) peut aussi être réalisée pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) -La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire immédiate, les suivis quotidiens sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements (si applicable), désinfection des sites chirurgicaux …). -Point limites stricts et spécifiques du projet : Les animaux seront suivis quotidiennement à l'aide du grille de bien-être animal portant spécifiquement sur l'alimentation, le transit et l'apparition d'automutilations. Un suivi de la locomotion des membres inférieurs sera également mis en place.
Choix des espèces
Le lapin est un modèle de plus en plus utilisé pour réaliser des expériences sur le nerf sciatique. En effet, cela fait plus de 20 ans que ce modèle est proposé pour remplacer le modèle rat qui présente de nombreux inconvénients par rapport à la taille des nerfs de ce modèle. Le lapin présente un potentiel pour les tests de dispositifs médicaux sur le nerf sciatique puisque sa taille est équivalente avec les nerfs que l’on peut retrouver au niveau du poignet ou des mains chez l’Homme (diamètre compris entre 2 et 4 mm, longueur inférieure à 30mm). L’utilisation d’animaux adultes d’un poids minimum de 2,5kg lors de la chirurgie est également recommandée, afin de limiter les risques liés à l’anesthésie et de permettre la mise en œuvre des techniques chirurgicales et post-opératoires adéquates.
Définition du tropisme de nouveaux vecteurs adéno-associés recombinants pour le ciblage de structures spécifiques du cerveau selon la voie d’injection chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
4 224 souris opérées sous anesthésie, la tête fixée dans un dispositif qui repère les coordonnées du cerveau pour y injecter un virus, et 864 autres injectées dans une veine de la queue, éveillées et sous contention après chauffage : 5 088 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort par injection à l'issue. Des prises de sang sont prévues toutes les deux semaines pendant huit semaines pour mesurer leur réponse immunitaire. Le projet doit cartographier les régions du cerveau qu'atteignent de nouveaux vecteurs viraux de thérapie génique selon la voie d'injection, avant des essais sur des lignées de souris atteintes de maladies neurodégénératives. Le porteur présente ce tri comme un moyen de réduire le nombre d'animaux non-humains utilisés plus tard, et écrit que sa stratégie "permet de limiter le nombre d'animaux utilisés (5088)".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de définir de nouveaux vecteur médicaments pouvant atteindre différentes structures du cerveau, selon différentes voies d’injection. La thérapie génique par vecteur virale (AAV) a démontré durant la dernière décennie son efficacité pour le traitement des maladies d’origine génétique. Ainsi, de nouveaux médicaments ont reçu leur autorisation de mise sur le marché . Néanmoins, de nombreux défis restent à relever. Premièrement, selon la maladie ciblée il est important de redessiner une stratégie. En effet, les essais cliniques nous montrent que la même stratégie par AAV peut avoir des effets opposés et cela même si les maladies sont proches. Deuxièmement, concernant le traitement de maladies du cerveau, le type d’injection (dans le cerveau ou dans le sang) affecte la dispersion du produit et donc, les cibles atteintes. Des études préliminaires ayant démontré l’amélioration de la distribution d’un AAV modifié pour les structures cérébrales en injection locale chez la souris, nous évaluerons l’efficacité de nos autres candidats selon différentes voies d’injections. Ces résultats permettront d’utiliser les meilleurs vecteurs dans les meilleures conditions d’injection lors des études de preuves de concept pour le traitement de différentes maladies neurodégéneratives, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats robustes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux caractériser les nouveaux vecteurs médicaments. Ainsi, lors des études de preuve de concept dans des modèles de maladies neurodégénératives, seuls les AAVs atteignant les cibles d’intérêt de manière adéquate (temps et quantitativement) seront injectés via la route d’injection la plus pertinente, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à la définition des conditions thérapeutiques. Ce projet permettra in fine le développement de médicaments innovants pour les maladies neurologiques.
Procédures
Injection locale dans le cerveau : réalisée sur animal préalablement anesthésié et analgésié et maintenu sous anesthésie. La tête de l’animal est maintenue en position par un dispositif permettant d’établir des coordonnées précises du cerveau. Geste réalisé sur 4224 animaux, une seule fois par animal. Durée totale de la chirurgie : 1h30 pour les phases de pré-chirurgie et chirurgie, puis jusqu’au réveil de l’animal. Injection par voie veineuse : réalisé sur un animal vigile sous contention après dilatation préalable des veines de la queue (chauffage). Geste réalisé sur 864 animaux, une seule fois par animal. Durée totale : maximum de 5 minutes sous contention. Prélèvements sanguins permettant de mesurer la réponse immuniaire : 1 fois toutes les 2 semaines pendant 8 semaines.
Impact sur les animaux
-Chirurgie : risque anesthésique, saignement, risque hypothermique, risque d’assèchement des muqueuses, déshydratation, perte de liquide céphalorachidien, infection. - Injection intraveineuse de l’AAV (voie caudale) : saignement, contention - Prélèvements sanguins multiples : contention, hématome
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par injection
Remplacement
Le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation d’un virus médicament pour véhiculer un gène médicament jusqu’aux cellules à traiter. Les interactions entre le virus médicament et les différentes composantes de l’organisme (système immunitaire par exemple) ne peuvent pas être toutes reproduites simultanément dans les modèles cellulaires ou informatiques. De plus, le système nerveux est un système complexe ayant une structure tridimensionelle particulière, ne pouvant être reproduite. Parallèlement à l’utilisation d’animaux, nous mettons en place des cultures de tissus qui nous permettront de réaliser une première sélection de nos virus médicaments, limitant ainsi le nombre d’animaux injectés.
Réduction
La stratégie choisie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés (5088). Seuls les virus médicament ayant été décrits comme efficaces dans le cerveau seront testés, réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. Par ailleurs, des mâles et des femelles seront inclus dans les études afin d’obtenir la meilleure représentativité des réponses biologiques et de réduire le nombre d’animaux sans introduire de biais et permettant ainsi d’optimiser l’élevage des animaux achetés chez les éleveurs agréés. Ces résultats seront ensuites utilisés pour alimenter les programmes d’essais de thérapie génique dans les modèles de maladies neurodégénératives. Ainsi le nombre d’animaux présentant un phénotype délétère dans les prochaines études pourra être réduit.
Raffinement
Des études pilotes permettront de déterminer la dose optimale de virus médicament, la vitesse d’injection et le nombre de points d’injection nécessaires et suffisant pour assurer le meilleur traitement. • Condition de vie des animaux : les animaux seront hébergés en groupes sociaux avec du matériel de nidification et un abri dans chaque cage afin de limiter le stress. Une période d’acclimation de 7 jours minimum sera respectée. Les souris seront pesées avant injection puis toutes les semaines afin de suivre les variations de poids. Les souris sont manipulées régulièrement pour s’habituer à l’utilisateur • Procédure d’injection locale : les animaux seront traités avec des anesthésiques et analgésiques avant et jusqu’à 3 jours après la chirurgie. Toute suspicion de souffrance animale sera soumise à un examen du vétérinaire présent à l’animalerie qui validera la nécessité de mise à mort ou non de l’animal. • Procédure d’injection systémique : les animaux seront placés dans un appareil de contention, sous lampe chauffante afin de maximiser la dilatation des veines de la queue et de réduire le temps de contention. • Approche statistique : Basé sur les connaissances actuelles dans le domaine de la thérapie génique, nous avons alors utilisé un test statistique définissant un nombre de 6 souris par groupe.
Choix des espèces
Il a été démontré précédement que la souris est un modèle prédictif du potentiel thérapeutique chez l’homme. De plus, les différents modèles de maladies neurodégénératives étants murins, il est nécessaire de valider les différents paramètres dans cette espèce afin de réaliser de façon efficace et optimale le développement de nouveaux traitements. Des animaux de 8 à 10 semaines seront utilisés. Ce stade correspond à un plateau dans le développement du cerveau de la souris couplé à un système immunitaire mature. De plus, la taille des animaux à cet âge est adequate avec un taux de récupération post-chirurgie plus élevé (moins de surcharge pondérale et de maladies métaboliques réduisant ainsi les risques liés à l’anesthésie et à l’analgésie)
Evaluation du tropisme et de l’expression de vecteurs adéno associés selon leur mode d’administration chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La moitié reçoit une injection intraveineuse, l'autre une injection intracérébrale par craniotomie sous anesthésie, pour cartographier la distribution de vecteurs de thérapie génique. Le porteur signale des risques de détresse respiratoire, d'hémorragie et d'hypothermie liés à l'anesthésie et à la chirurgie du crâne. L'activité relève en partie de prestations pour des start-ups, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier cette distribution dans l'"organisme entier".
Objectifs
Notre unité de développement et d’innovation technologique est impliquée dans le developpement d’approches de thérapies géniques innovantes dans le domaine des maladies neurodégénératives avec à la fois de la recherche et développement mais aussi de la prestation de service pour des start up. Ainsi nous sommes amenés à tester différents vecteurs Adeno-associés (AAV) via 2 voies d’administration : intraveineuse ou intracérébrale afin de déterminer leur tropisme chez la souris dans un premier temps sans modification génétique autrement dit contrôle ou sauvage. Ces vecteurs AAV peuvent contenir différents transgènes, soit des gènes rapporteurs fluorescents soit directement le gène d’intérêt thérapeutique pour la maladie neurodégénérative d’intérêt. Au total le projet utilisera 600 souris sur les 5 prochaines années avec des groupes de 5 à 10 individus pour l’évaluation des différents vecteurs avec une répartition variable aux environs de 300 souris pour la voie intraveineuse et 300 souris pour la voie intracérébrale.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet est d’établir la biodistribution de vecteurs adeno-associés codant différents transgenes et valider leur expression après injection intraveineuse ou intracérébrale chez la souris afin de pouvoir ensuite mener les étapes translationnelles chez le gros animal en vue de proposer des essais cliniques de phases I et II chez l’Homme et ainsi de disposer de toutes les données requises pour le dépôt d’un dossier à l’agence du médicament.
Procédures
- Les animaux seront utilisés soit pour une injection intraveineuse sous anesthésie générale (durée 5min) soit une injection intracérébrale sous anesthésie générale (durée 40min) et analgésie Les animaux seront euthanasiés après la période d’expression du gène. Les procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : - Une injection sous anesthésie avec un risque de décompensation respiratoire et un risque de saignement - un risque cardio-respiratoire, d’ hypothermique à l’anesthésie - un risque chirurgical (anesthésie, hypothermie, déshydratation, hématome, non récupération de la vigilance) lors de la procédure d’injection intracérébrale par stéréotaxie (craniotomie ciblée avec ouverture minime au site d’injection)
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données de bio distribution et de tolérance.
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier la biodistribution et l’expression des vecteurs AAV dans l’ensemble de l’organisme. Cet organisme doit être comparable à la complexité que l’on retrouve chez l’Homme. Choisir la souris permet de collecter des données d’intérêt en terme de bio-distribution pour les vecteurs et la voie d’administration choisie qui sont transposables ensuite dans le modèle murin de la pathologie (pour une preuve de concept) puis chez le gros animal (pour les études de toxicologie) puis l’Homme pour application clinique.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 5 à 10 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 600 souris sera nécessaire pour ce projet. De façon général nos résultats seront analysés statistiquement
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, La procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux seront hébergés en groupe dans des conditions SOPF (sans pathogene ni opportunistes) pour la zone d’élevage et SPF (sans pathogene) pour la zone expérimentale. Entre 3 à 6 souris par cage au maximum; Cycle nycthémèral de 12h (8h-20h jour et 20h-8h nuit) Hygrométrie controlée;Température comprise entre 20C et 24C ;Litière : copeaux de tronc d'arbre. Les animaux disposent de nourriture adaptée à leur stade physiologique (gestation etallaitement ou animaux de stock) et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et de soins adaptés. Le change de la litière/abreuvement/nourriture est réalisé 1 fois par semaine ou tous les 15 jours en fonction des besoins de la cage. Le milieu est enrichi à l’aide de carré de coton de bâtonnet de bois à ronger et si nécessaire supplémenté de lanières de kraft, et de maison de type celldom. Les animaux seront hébergés par 3 à 6 souris de moins de 30g par cage ventilée au maximum, si nécessaire en cas d’agressivité de mâles les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge) Toutes les procédures sont réalisée sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la biodistribution et l’expression des AAV recombinants suivant leur mode d’administration et ceci ne peut se faire que chez la souris contrôle comme petit animal qui nous permet de prédire la cartographie d’expression et anticiper les études d’efficacité dans le modèle murin des pathologies concernées. Les souris entre 3 et 16 semaines suivant le projet et la maladie ciblée et en rapport avec les étapes suivantes qui seront menées dans le modèle murin de la pathologie, afin d’utiliser des animaux d’âges comparables (jeunes pour des traitements précoces et plus âgés pour les traitements à un stade symptomatique
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs en robotique chirurgicale.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Cochons : 80
Moutons : 80
Bovins : 20
200 chiens, cochons, moutons et bovins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des prélèvements de sang répétés puis une ou deux chirurgies sous anesthésie, parfois précédées de la création d'une lésion par anastomose, ligature ou occlusion de vaisseaux, pour évaluer des dispositifs de robotique chirurgicale. Le porteur indique une douleur postopératoire pouvant durer plusieurs jours. Il affirme que l'expérimentation sur l'organisme entier est incontournable et relève d'une obligation réglementaire avant l'usage de ces dispositifs chez les patients.
Objectifs
La chirurgie assistée par ordinateur (CAO) regroupe un ensemble d'outils informatiques destinés à aider le chirurgien dans la préparation et la réalisation d’une opération, particulièrement en chirurgie des tissus mous (chirurgie viscérale, urologique ou cardiaque) et en chirurgie orthopédique avec implantation de dispositif ou non. Elle a pour objectif de faciliter la réalisation des gestes diagnostiques ou thérapeutiques par le chirurgien, afin qu’ils soient les plus précis, les plus efficaces et les moins invasifs possible. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Jusqu'à une dizaine de dispositifs pourront être évalués dans ce projet. Ce projet de recherche a pour objectif la validation de robots ou d'éléments robotiques innovants, l’apprentissage des personnels de santé, le développement de nouvelles stratégies pouvant réduire le traumatisme tissulaire, améliorer le diagnostic et pallier une dysfonction. Ces dispositifs innovants doivent être étudiés sur des modèles animaux vivants pertinents, dans le but de valider leur faisabilité, leur innocuité et leur efficacité. Ces nouvelles techniques moins invasives et ces approches originales permettront de mettre à profit pour les patients et les équipes soignantes les avancées de la robotique dans un environnement chirurgical et interventionnel. L'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs/méthodes et techniques en robotique chirurgicale par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase de recherche et de développement. Les différentes versions de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés du projet sont : - Une amélioration de la sécurité et/ou de l'efficacité des machines, dispositifs et techniques évalués. - Pour les aspects thérapeutiques, une réduction du tremblement et de la fatigue du chirurgien, une amélioration de la précision et de la technicité du geste chirurgical par un traitement informatisé de l’image, une vidéo 3D nette pendant toute la durée de l’intervention et une fiabilité du système plus importante, entrainant une plus grande précision du positionnement des prothèses et des implants et permettant par exemple d’éviter les ré opérations parfois multiples des patients. La réduction de l'invasivité du geste chirurgical et des temps opératoires (permettant par exemple la réduction du traumatisme tissulaire et du risque infectieux secondaires, corollaires de ces interventions) sont d'autres bénéfices attendus du projet. - Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients, une amélioration des capacités diagnostiques de la pathologie visée peut également être obtenue. - Les avantages peuvent aussi être éducationnels, avec des applications dans la formation des chirurgiens à des techniques opératoires complexes, la planification précise d’interventions chirurgicales délicates et la téléassistance en opérations extérieurs (OPEX) dans le cadre de la chirurgie et la médecine militaire.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'évaluation de dispositif en robotique d'assistance chirurgicale avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'évaluation de dispositif robotique d'assistance chirurgicale associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif robotique, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type anastomose, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).
Devenir
Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs et techniques testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs robotiques d’assistance chirurgicale dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs robotiques d’assistance chirurgicale.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.
Choix des espèces
Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Cela impose l’expérimentation de ces dispositifs sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille, d’où la nécessité de tester sur les espèces citées ci-dessus. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les ovins sont par exemple, le modèle le plus pertinent pour la durabilité des stratégies opératoires et dispositifs testés dans ce projet. Leur intérêt principal réside dans le fait qu’ils ne sont pas en croissance et sont particulièrement robustes. Les porcins sont par exemple, un modèle très pertinent pour la durabilité de l’ancrage des dispositifs (feuillets valvulaires épais par exemple lorsque le dispositif est implanté dans le cœur). Les porcs sont également le modèle plus proche de l’homme pour ce qui est chirurgie viscérale et seront privilégiés, de ce fait, pour la robotique utilisée en chirurgie viscérale. Les bovins sont par exemple, un modèle très pertinent pour leur grande taille et le débit élevé des dispositifs cardiovasculaire potentiellement testés dans ce projet (robotique chirurgicale utilisée pour la chirurgie cardiovasculaire). Les canins ne seront utilisés que plus rarement, lorsqu’ils sont le seul modèle à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle la plus proche de l’homme. Par exemple les canins sont le seul modèle à présenter un auricule gauche avec ostium comme chez l’homme, un comportement du tissu de conduction cardiaque proche de l’homme, etc. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Première étape du Développement d’une approche de thérapie génique pour la neuropathie à axones géants chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
90 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique sous anesthésie, avant le prélèvement de leurs organes pour analyse. Le porteur indique des risques de dépression cardio-respiratoire, d'hypothermie, de saignement et de toxicité liée au traitement. Il décrit cette étape comme préliminaire, la preuve d'efficacité contre la neuropathie à axones géants devant être menée ensuite par un collaborateur sur des souris malades.
Objectifs
La neuropathie à axones géants (GAN) est une maladie sévère du cerveau et des nerfs due à une perte de fonction d’une protéine bien identifiée (gigaxonine), conduisant au décès des patients et pour laquelle il n’existe à l’heure actuelle pas de traitement pour prévenir ou stopper les symptômes. L’objectif de ce projet est de réaliser les étapes préliminaires de la mise au point d’une approche de thérapie génique chez des souris normales, non malades . Tout d’abord par le choix de la construction génétique et virale à utiliser puis de la dose permettant une expression suffisante de la protéine d’interet. Ces données seront reprises chez notre collaborateur (pour l’étude d’efficacité thérapeutique dans le modèle murin présentant un déficit sur la protéine responsable de la maladie (gigaxonine).
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet est de réaliser les étapes préliminaires de la mise au point d’une approche de thérapie génique chez des souris normales, sans pathologie pour ces premières étapes afin de mener ensuite chez nos collaborateurs une étude de preuve de concept de l’efficacité de cette approche thérapeutique dans le modèle murin de la maladie et à plus long terme un essai chez l’Homme pour proposer une solution thérapeutique qui n'existe pas à ce jour.
Procédures
Les effets indésirables possibles sont: - Une injection sous anesthésie avec un risque de dépression cardio-respiratoire et par conséquent une douleur ou lesion sans autre geste avant l'euthanasie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont: - Une injection sous anesthésie avec un risque de dépression cardio-respiratoire - un risque d’hypothermie - un risque de saignement à l’injection - un risque éventuel de toxicité lié au traitement
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés , car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem.
Remplacement
Toutes les études préalables possibles en culture ont été réalisées afin de valider la surexpression de gigaxonine comme molécule thérapeutique. Cependant, les étapes finales de choix de promoteur pour évaluer les niveaux d’expression et la toxicité associée ainsi que la dose à administrer en vue de l’etude thérapeutique ne peux être remplacée et doit être menée chez la souris. Les étapes pour choisir la meilleure construction génétique a utiliser et notamment le choix du promoteur nécessite un passage dans un individu vivant, la souris étant le modèle de choix. Cette étude va nous permettre d’apprécier les niveaux d’expression ainsi que la toxicité associée à notre thérapie génétique au sein d’un organisme mammifère dans son intégrité. Ces données vont nous aiguiller sur la dose à administrer qui sera à utiliser pour débuter la phase thérapeutique
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en prenant en compte la fiabilité statistique des échantillons. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 10 souris par groupe a été choisi pour la première étape et valider les niveaux d’expression à 1 mois, et 15 souris par groupe pour la seconde étape sur un suivi de 5 mois . Ceci va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 90 souris est nécessaire pour ce projet. De façon général nos résultats seront analysés statistiquement avec des tests adaptés.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (et prise en compte des points limites éventuels) et de soins adaptés si nécessaire. Les animaux seront hébergés dans des conditions très protégeés pour la zone d’élevage et sans pathogène pour la zone expérimentale (portoirs ventilés en pression positive ; Entre 3 à 6 souris par cage au maximum ; Cycle nycthémère de 12h ; Hygrométrie et température contrôlés), ainsi que de l’enrichissement répondant aux besoins physiologiques des souris (nidification, cachette et matériel à ronger). Les procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
Notre étude doit déterminer les niveaux d’expression et sera ainsi menée sur des souris C57BL6J possédant le même fond génétique que les souris qui seront utilisées par la suite par notre collaborateur. Les souris (mâles et femelles) seront utilisées à l’âge d’un mois correspondant à l’âge de traitement nécessaire pour la suite dans les souris modèle de la pathologie et suivi sur 1 mois ou 5 mois post injection intraveineuse. Cet âge correspond de plus à un individu développé et myélinisé similaire à l'âge de traitement des enfants GAN par le futur
Prélèvements sanguins ponctuels pour les mises au point, la calibration de techniques, les dépistages ou la réalisation de test préliminaires in vitro chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
200 macaques à longue queue vont être utilisés, réutilisés après une période de repos, dans des procédures classées de souffrance légère. Ils subissent des prélèvements de sang répétés au niveau des veines et artères fémorales ou céphaliques, le plus souvent sans anesthésie, jusqu'à 20 % de leur volume sanguin par ponction. Le porteur indique que ces prélèvements peuvent provoquer stress, hématomes et anémie transitoire, et plus rarement une fistule entraînant une boiterie. Il présente ces prélèvements de matériel biologique comme un moyen de mettre au point des tests et de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de répondre à un besoin en mettant à disposition d’un donneur d’ordre du matériel biologique (sang ou dérivés) afin de pouvoir mettre au point des tests, calibrer des appareils souvent nécessaires avant une étude ou encore réaliser une série de dépistages avant l’entrée en étude d’animaux. La mise au point de ces tests doit fréquemment passer par la stimulation de cellules immunitaires présentes dans le sang frais, évaluer les effets non-spécifiques portés par les protéines de matrices biologiques (sang, plasma, urine…), ou encore évaluer le statut sérologique d'un animal. Il est donc nécessaire de fournir les matrices correspondantes provenant des espèces d'intérêt, de manière à améliorer la qualité des tests lors d'étude in vivo et ce faisant diminuer la quantité d'animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Des prélèvements sont quelques fois nécessaires pour la mise au point de techniques, la calibration de matériel, la sélection de paramètres. Ces mises au point peuvent servir pour une étude chez le primate non humain (PNH). Ces prélèvements servent également à la réalisation de test in vitro préliminaires, évitant ainsi le recours à l’animal pour des tests préliminaires. Dans ce contexte, les différents prélèvements réalisés vont permettre d’améliorer les techniques et ainsi de raffiner les méthodes utilisées et également de réduire le nombre d’animaux.
Procédures
La majorité des animaux sera soumis à des prélèvements sanguins au niveau des veines et/ou artères fémorales et ou céphaliques sans anesthésie d'une durée de quelques secondes (de 10 secondes à 30 secondes) en fonction du nombre de tubes à remplir. En cas de besoin (pour la contention d’un animal de plus de 5kg par exemple) les prélèvements pourront se faire sous sédation. Les prélèvements de sang seront réalisés à hauteur du volume maximum prélevable en fonction du % du volume sanguin circulant (VSC), selon les recommandations généralement acceptées et établies par Diehl et al.,2001 soit 7,50 % du VSC suivi d'une période de repos de 7 jours (par exemple 15,8 ml pour un animal pesant 3 Kg); 10% du VSC suivi d'une période de repos de 2 semaines (par exemple 21 ml pour un animal pesant 3 Kg); 15% du VSC suivi d'une période de repos de 3 semaines (par exemple 31,5 ml pour un animal pesant 3 Kg); 20% du VSC suivi d'une période de repos de 4 semaines (par exemple 42 ml pour un animal pesant 3 Kg).
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins peuvent provoquer du stress et/ou l’apparition d’hématome(s) au niveau de la zone de ponction. Lors de prélèvements fréquents ou en grande quantité, une anémie transitoire peut également apparaître. Très rarement, une fistule artério-veineuse peut apparaître et entraîner une boiterie ou gêne chez l’animal.
Devenir
Les animaux pourront être réutilisés après une période de repos suffisante après un examen vétérinaire avant d'entrer dans une nouvelle procédure. Le degré de gravité réel sera pris en compte.
Remplacement
Les animaux ne peuvent être remplacés car ces études vont permettre de mettre au point des tests sur des animaux de même espèce ou alors vont permettre de selectionner des animaux parmi un groupe d'animaux de la même espèce. Indirectement l'utilisation des ces prélèvements peut permettre de remplacer l'animal. Par exemple, des prélèvements de sang total peuvent permettre d’évaluer de façon préliminaire la toxicité ou l’efficacité d’une ou plusieurs molécules (par exemple lors de tests de stimulation immunologiques), ou de différentes doses d’un candidat médicament.
Réduction
Ce nombre est évalué à partir des données de réalisation des années précédentes de l’installation d’essai pour ces mêmes procédures. Ces données sont présentées annuellement à la structure de bien-être animal. Ce nombre prend en compte le besoin de réaliser des screening d'animaux concernant leur taux d'anticrops contre un pathogène particulier, dans le cadre d'étude de challenge viral ou de biodistributions d'une thérapie génique par vecteur viral. La réalisation de trois études de ce type par an nécessite le screening d'une vingtaine d'animaux en moyenne. Les autres animaux correspondent à des demandes fréquentes de matrices biologiques (sérum, plasma, sang), dans le but de validation ou de mise au points de méthodes de bioanalyses ou des tests in vitro (immunostimulation). L’utilisation de matrice biologique, tel que le sang, de l’animal cible pour faire des mises au point ou des calibrations de techniques permet par exemple la sélection de la fenêtre de lecture pour les analyses cytométriques et permet in fine de réduire le nombre d’animaux utilisés. Aucun test statistique ne sera réalisé.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets seront mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises seront distribuées quotidiennement aux animaux (après les manipulations et en fin de journée) dans la litière et dans des dispostifs à friandises (tube, jouets...). Les animaux bénéficieront de séances d'approches associées à du renforcement positif afin de les préparer et de réduire le stress lié aux actes contraignants (contention, prise de sang...). Un score du stress et de la douleur accompagné de points limites permet d’évaluer quotidiennement le bien-être de l’animal. Les prélèvements seront réalisés selon les recommandations éthiques européennes en termes de quantité prélevée et de délai de réutilisation. Une observation du site de prélèvement pendant quelques minutes sera réalisée après chaque prélèvement. Le plus possible, les prélèvements seront réalisés sur animaux non-anesthésiés et non-sédatés afin de préserver leur état physiologique naturel et de ne pas perturber leur rythme quotidien. La sédation peut en effet impacter l'appétit des animaux, causer des nausées, etc.
Choix des espèces
L’utilisation du singe cynomolgus est nécessaire pour les mises au point et calibration des techniques qui seront utilisées dans le cadre d’étude in vivo chez cette même espèce. Aussi les dépistages sérologiques/recherche d’anticorps spécifiques seront effectués sur un panel de singe cynomolgus préselectionné pour être inclus en étude (une demande d’autorisation spécifique pour ces études sera faite). Les animaux seront des animaux juvéniles ou matures selon l'ojectif des études subséquentes.
Etudes des activités électriques corticales et sous-corticales chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une neurochirurgie d'environ une heure pour implanter des électrodes d'enregistrement cérébral, puis des stimulations sonores et des injections de composés pouvant aller jusqu'à deux par jour pendant vingt-huit jours. Le porteur, qui travaille pour un donneur d'ordre, veut identifier des marqueurs cérébraux transposables à l'humain pour tester des molécules contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Il affirme que ces mécanismes complexes ne peuvent pas être reproduits par des modèles cellulaires ou informatiques.
Objectifs
Les maladies neurologiques et psychiatriques représentent un enjeu majeur de santé publique et touchent de plus en plus de personnes du fait de la croissance et du vieillissement de la population mondiale. Consciente des limites des traitements actuels, l’industrie pharmaceutique investit du temps et de l’argent pour tenter de mettre sur le marché de nouvelles thérapies du Système Nerveux Central avec un axe prioritaire sur les troubles de la mémoire, de la perception ou encore les troubles psychiatriques (en 2013, 287 molécules en développement pour la maladie d’Alzheimer et 110 molécules pour la Schizophrénie). L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des composés sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Cela signifie d’appréhender cette problématique par une approche consistant à utiliser les données existantes de la recherche clinique pour construire de nouvelles solutions de recherche préclinique et se baser sur des marqueurs biologique des pathologies utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères montrant le fort potentiel translationnel de cette méthode. Dans ce projet, nous étudierons les activités électriques cérébrales spontanées et évoquées chez des animaux contrôles et des animaux reproduisant des symptômes de pathologies humaines.
Bénéfices attendus
Le développement de nouveaux médicaments est très coûteux et prend beaucoup de temps. Afin d’optimiser ce développement et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, la priorité est donnée à la découverte et utilisation de marqueurs d’évaluation d’efficacité quantifiables, fiables et facilement transposables entre les études précliniques et cliniques. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des souris afin de modéliser des pathologies neurologiques et psychiatriques. Nous cherchons à mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques sur des modèles animaux de pathologies neurologiques. Ces marqueurs biologiques translationnels nous permettront également de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Procédures
L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal vigile une à deux fois par semaine. Lors des tests pharmacologiques en courte durée, un protocole de stimulation sonore sera appliqué avant et après une administration d’un composé médicamenteux. Lors des tests pharmacologiques en administration longues durée, les injections peuvent être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir une neurochirurgie d’environ une heure comprenant la période d’anesthésie. Afin de prévenir toute douleur lors de cette neurochirurgie, une injection d'antidouleur sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores une à deux fois par semaine. Il est possible que les animaux aient un léger sursaut à la première stimulation sonore mais les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress à long terme sur les animaux. Certains animaux subiront également des traitements pharmacologiques ; l'injection peut induire un stress, une douleur au site d’injection mais sur un temps très bref de quelques secondes. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées. Lors des expériences, les animaux seront installés dans des isoloirs, ils seront libres de leurs mouvements mais dans un espace réduit.
Devenir
Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électroencéphalographiques. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.
Remplacement
Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle adresse des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).
Réduction
Dans ce projet, les changements des activités cérébrales enregistrées par éléctroencéphalogramme seront mesurés pour les activités de base. Pour les activités cérébrales induites par des stimulations sonores, nous évaluerons les réponses électriques enregistrées. Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Il a été estimé selon notre expérience antérieure nous ayant permis d'obtenir un nombre suffisant d’animaux enregistrés pour réaliser les tests statistiques précédents.
Raffinement
Après une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement, les souris subiront une neurochirurgie. Une injection d'antidouleur sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et de définir les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton, maison en carton). Pour les expériences d’enregistrements évoqués, les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux.
Choix des espèces
Dans ce projet nous utiliserons des souris. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques spontanées et induites et ils peuvent être utilisés pour le développement de nouveaux médicaments. La sélection de la souris est aussi basée sur des études précédentes réalisées par le client. Les animaux sont manipulés au minimum à l'âge de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, les circuits électriques du cerveau sont matures et présentent des caractéristiques matures.
Etude du rôle des cytokines inflammatoires sur la réactivité astrocytaire dans un modèle d’allodynie mécanique chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
270 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections de cytokines inflammatoires, dont jusqu'à six injections directement dans le liquide céphalo-rachidien au niveau du tronc cérébral, pour provoquer une allodynie, une douleur déclenchée par un contact normalement indolore, puis subissent des tests comportementaux avant d'être tués. Le porteur reconnaît qu'il lui est "impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l'expérience", puisque c'est la douleur elle-même qui est étudiée. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'étude in vivo de l'intégration de la douleur.
Objectifs
La douleur est un processus physiologique nécessaire à la survie : elle prévient l’organisme d’un danger imminent et permet la mise en œuvre de réponses adaptées qui visent à en limiter les effets délétères. Cependant, lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui aparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Les traitements disponibles ne sont souvent que partiellement efficaces et peuvent s’accompagner d’effets secondaires importants. Il est donc essentiel de découvrir de nouveaux traitements, et pour ce faire, de déchiffrer les mécanismes responsables de l’apparition de ces douleurs chroniques. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. En condition physiologique, les informations non douloureuses et douloureuses ne sont pas intégrées au même niveau du tronc cérébral, permettant ainsi de dissocier distinctement les deux modalités sensorielles (tact et douleur). Cependant, en condition pathologique, comme dans le cas de l’allodynie, le tact va être capable de devenir douloureux. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans l'apparition de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau trigéminal sont peu connus. Les résultats obtenus ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution des canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation de canaux astrocytaires, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Diverses études démontrent que certaines molécules libérées, dont les cytokines, sont capables d’activer les astrocytes. C'est pourquoi nous nous intéresserons à savoir quelle cytokine induit un dysfonctionnement et de déterminer si son blocage a des effets bénéfiques.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation d'un canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 3 : • Injections intra-péritonéales : ces injections(
Impact sur les animaux
Injectant des cytokines pro-inflammatoires chez l’animal, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Cependant, puisque nous travaillons sur la douleur, il nous est impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l’expérience. Les résultats obtenus des travaux du laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.
Devenir
A la fin des procédures , les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique, protéique ou électrophysiologique.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique.
Réduction
Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (lésion de notre région d’intérêt lors des injections intracisternales, problème au moment de la dissection, mauvaise apprentissage lors de l’habituation aux tests comportementaux…). Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux maximum par groupe: habituation, injections médullaire et systémique,comportement, stimulation et perfusion. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et immunohistochimiques seront réalisées avec les mêmes groupes.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g.Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à J+7 après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale létale de pentobarbital (150 mg/kg). Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.
Choix des espèces
La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée et est la plus adaptée pour les études comportementales dans le domaine de la douleur en santé humaine. Nous utiliserons des animaux entre 3 à 5 et de 5 à 8 semaines (de 3 à 8 semaines), pour comparer avec les données du laboratoire.
La surexpression du gène de la neuroglobine permet-elle de diminuer les déficits moteurs et cognitifs des souris souffrant d’une ataxie cérébelleuse ?
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La lignée Harlequin utilisée présente d'elle-même un retard de croissance, une ataxie, une perte de vision et, pour une partie des animaux, hydrocéphalie, prolapsus pénien ou dermatite ulcéreuse, avant même le protocole d'injection intraveineuse d'un gène-médicament et les neuf tests comportementaux. Le porteur indique que 20 souris seront écartées pour anomalies et que la mise à mort sert à prélever cervelet et cerveau. Il affirme que la preuve d'efficacité "ne peut être obtenue que par une étude exhaustive chez l'animal", les approches in vitro restant selon lui insuffisantes.
Objectifs
Les maladies neurologiques liés à un gène défectueux sont incurables malgré les progrès de la génétique de ces 35 dernières années. Il a été démontré que des anomalies mitochondriales sont très souvent impliquées dans ces maladies. Les mitochondries sont des structures cellulaires produisant de l’énergie et régulant des processus essentiels à la vie cellulaire, spécialement des neurones. Les pathologies mitochondriales affectent un adulte sur 5000 ; le système nerveux central est atteint dans la grande majorité des patients et à ce jour aucune thérapie efficace n’existe pour améliorer leur qualité de vie. Nous avons pour objectif de développer un traitement conduisant à la surexpression du gène qui code une protéine mitochondriale sur laquelle nous travaillons depuis 12 ans et qui possède des propriétés protectrices de la fonction des neurones. Ce traitement va consister à injecter, grâce à un vecteur approprié, le gène dont nous comptons augmenter l’abondance de notre protéine d’intérêt par voie intraveineuse chez un modèle de souris souffrant d’une maladie mitochondriale qui entraine, entre autres, une ataxie cérébelleuse (trouble de l'équilibre et de la coordination). Le but de notre projet de recherche est donc de démontrer qu’en augmentant la quantité de notre protéine d’intérêt dans le cerveau et cervelet, nous pourrions améliorer l’état de santé générale de nos animaux grâce à la diminution de leurs troubles moteurs. Ainsi, une étude clinique pourrait être développée pour améliorer les conditions de vie des patients souffrant d'un éventail de maladies neurologiques.
Bénéfices attendus
Les mitochondries sont des structures cellulaires produisant de l’énergie et régulant des processus essentiels à la vie cellulaire, spécialement des neurones. Toute anomalie des mitochondries est responsable des pathologies graves qui affectent des tissus à forte demande énergétique (cerveau, cœur, muscle, foie) nommées « maladies mitochondriales ». Ces maladies sont très fréquentes (1 adulte sur 5000) et aucun traitement n’existe permettant de les soigner efficacement et de façon pérenne les patients. L'objectif de notre projet de recherche est de développer un traitement conduisant à une expression élevée du gène de notre protéine d’intérêt. Cette protéine se localise dans les mitochondries et possède des propriétés neuroprotectrices ; le traitement vise à augmenter son abondance dans les neurones. Si nous parvenons à montrer le rôle bénéfique de cette protéine pour la survie des neurones chez les souris Harlequin, nous pourrons ensuite montrer son efficacité dans d’autre modèle de maladies mitochondriales et ainsi une étude clinique chez l’Homme pourrait être initiée dans le cadre d’une grande variété de maladies neurologiques. Elle visera à améliorer les conditions de vie de patients pour lesquelles aucune thérapie n’a démontré son efficacité à ce jour.
Procédures
Le modèle expérimental utilisé présente des signes cliniques dommageables de par sa modification génétique : retard de croissance, perte de poids, atrophie musculaire, déficits moteurs, perte de la vision, troubles de l’équilibre et de la coordination. Ils sont dus à la perte des neurones dans le cerveau et le cervelet car ils ne produisent pas l’énergie requise pour assurer leur bon fonctionnement. Le gène médicament que nous testerons sera administré aux souris par voie intraveineuse. Cette injection se fera sous anesthésie générale et ne durera au maximum que 4-5 minutes. Chez certains animaux, un prélèvement de sang, sur l’œil non injecté, sera réalisé deux mois après le traitement pour vérifier l’absence du médicament dans le sang périphérique et permettre la sortie des souris traitées de la zone de confinement. Ce prélèvement se fera sous anesthésie gazeuse et durera 2 à 3 minutes. Des tests comportementaux seront réalisés 2 et 5 mois après la thérapie génique ainsi que sur un groupe d’animaux non traités. Ces tests seront réalisés sur animaux vigiles et seront répartis sur 10 jours à raison de 1 ou au maximum 2 tests par jour. Un dernier test sera effectué la semaine suivante, il sera réalisé 3 fois avec une journée de repos entre chaque test.
Impact sur les animaux
Effets indésirable liés au modèle animal : Dès leur plus jeune âge, les souris étudiées présentent un retard de croissance avec un poids corporel plus faible que la normal et une alopécie importante avec des zones des poils irrégulièrement reparties dans le corps. À partir de 4 mois d’âge, ces souris développent une ataxie qui se caractérise par des troubles de locomotion, des pertes d’équilibre, de l’incoordination des mouvements et la réduction de la force musculaire. En géneral, une perte de la vision survient chez les souris entre 6 à 8 mois d’âge. Un petit pourcentage de ces souris souffre également de : - Hydrocéphalie, excès de liquide céphalo-rachidien dans le cerveau pouvant entraîner des troubles neurologiques (2 souris /100). - Microphtalmie, réduction de la taille du globe oculaire pouvant compromettre la fonction visuelle (2 souris/100). - Prolapsus pénien, gonflement des organes génitaux qui pourrait être douloureux et empêcher l’animal d’uriner normalement (4 souris/100). - Dermatite ulcéreuse, inflammation cutanée avec démangeaison ; elle est fréquente chez la souris Harlequin à cause de leur alopécie. Effets indésirables liés au projet : Les injections intraveineuses sont réalisées sous anesthésie gazeuse ; cette dernière pourrait produire de l’hypothermie ou un arrêt respiratoire. Malgré sa rapidité, l’intervention pourrait entraîner du stress chez l’animal enfin dans de rares cas un petit saignement à l’œil pourrait se produire. Huit tests comportementaux seront réalisés, pendant 10 jours puis un dernier test sera effectué la semaine suivante, il sera réalisé 3 fois avec une journée de repos entre chaque test. Cette série de tests sera effectuée 2 mois après l’injection et avant l’euthanasie, 3 mois plus tard. La réalisation de ces tests pourrait augmenter le stress chez l’animal de par leur fréquente manipulation mais aussi de la fatigue.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés lorsque le projet sera terminé pour pouvoir utiliser les cervelets / cerveaux pour les études histologiques, biochimiques et de biologie moléculaire.
Remplacement
La démonstration de l’efficacité biologique de la thérapie génique avec notre protéine d’intérêt dans le modèle expérimental d’ataxie cérébelleuse ne peut être obtenue que par une étude exhaustive chez l’animal. Elle combinera des évaluations morphologiques et fonctionnelles du cervelet mais aussi l’étude des capacités motrices et cognitives des souris traitées pour établir une amélioration de celles-ci suite à la thérapie, amélioration qui indiquera que leur cervelet fonctionne mieux. Les études in vitro ou ex vivo (cultures de neurones cérébelleux ou tranches de cervelet) pourraient être effectuées pour compléter les études histologiques. Cependant, les données récoltées in vitro resteront insuffisantes et ne permettront pas d’aboutir à une preuve de concept robuste dans le cadre de cette étude préclinique pour rédiger une demande d’autorisation d’un essai clinique chez l’homme.
Réduction
Pour ce projet nous allons utiliser au total 560 souris dont 310 souris souffrant de la pathologie : 250 entre elles recevront les différents traitements, 40 ne seront pas traitées pour nous servir de référence et 20 seront exclues car présentant des anomalies. Pour comparer les effets de nos traitements, 250 souris en bonne santé seront également utilisées : 220 recevront les différents traitements et 40 autres ne seront pas traitées. Ces nombres ont été rigoureusement définis en fonction de notre expérience sur le modèle des souris utilisées et grâce à un calcul de puissance et du nombre des souris nécessaires. Ainsi, la taille de chaque groupe de souris incluses dans les procédures a été définie afin de récolter suffisamment de données expérimentales pour appliquer des tests statistiquement robustes.
Raffinement
Les souris seront hébergées entre 2 et 4 par cage dans des portoirs ventilés, nourries et abreuvées ad libitum. Chaque cage comportera un environnement enrichi (maisonnette en plastique ou cellulose et coton). Les pièces de l’animalerie sont maintenues à 20-22 °C avec contrôle d’humidité et un cycle jour/nuit de 12 heures. Les injections intraveineuses de chacun des vecteurs chez les souris seront réalisées sous anesthésie volatile. Si une détresse respiratoire est observée pendant l’anesthésie, la quantité d’anesthésiant sera diminuée pour entraîner ainsi une meilleure oxygénation des souris. Le site d'injection sera examiné pour rechercher un saignement ou autre traumatisme. Chaque animal sera évalué les 2 jours qui suivent l’injection pour confirmer l’absence de blessure / inflammation ou signe de souffrance dans l’œil injecté et la grille d’évaluation sera renseignée. Les souris traitées seront évaluées à deux reprises (2 et 5 mois après la thérapie génique) pour établir leurs capacités motrices et cognitives en les faisant réaliser 9 tests comportementaux. Avant ces séances, les souris auront une semaine pour s’habituer à l’expérimentateur. Le jour du test, les souris seront installées dans la pièce 30 minutes avant celui-ci pour minimiser leur stress et assurer la fiabilité des données obtenues. Huit de ces tests seront répartis sur 10 jours, puis la semaine suivante le dernier test sera réalisé afin d’éviter l’angoisse, la fatigue ou le stress des animaux ; l’ordre de réalisation de tests sera également choisi pour réduire au minimum les nuisances chez les souris testées. Par ailleurs, tous les 2 jours pendant ces séances la grille d’évaluation sera remplie de manière détaillée et avec soin pour chaque souris ; des mesures adaptées seront prises si le bien-être des souris venait à être compromis suite à ces tests.
Choix des espèces
Le modèle de souris sur lequel nous travaillons est particulièrement adapté à notre projet de recherche puisqu’il reproduit fidèlement une maladie neurologique chez l’Homme dont la cause génétique est le dysfonctionnement des structures cellulaires responsables de la production d’énergie, les mitochondries. Comme l’anomalie génétique responsable de la pathologice chez ces souris se localise dans le chromosome X, les souris mâles présentent des symptômes plus graves que les souris femelles. En effet, ces dernières accumulent deux fois plus de la protéine déficitaire chez les mâles ; ceci réduit significativement la gravité de leurs symptômes. Ainsi, des souris mâles âgées de 26-28 jours recevront le traitement par voie intraveineuse. Les souris seront soumises à un ensemble de tests comportementaux et seront euthanasiées cinq mois après le traitement ; les cervelets seront récoltés pour des évaluations morphologiques et fonctionnelles.
Etude des effets neurodéveloppementaux chez le rat de l’exposition à des mélanges de pesticides et à des champs électromagnétiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
805 rats, rates gestantes et leur descendance, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les rates exposées à un cocktail de pesticides et à des champs électromagnétiques de type 5G subissent échographies sous anesthésie et prélèvements de lait sous ocytocine, et leurs ratons passent des tests nommés de redressement, d'agrippement, de réflexe et d'open field avant d'être tués pour analyses cérébrales. Le porteur affirme retenir des doses proches des valeurs "sans effet" et n'attendre aucun impact majeur, tout en prévoyant des animaux surnuméraires. Il indique qu'aucune approche in vitro ou informatique ne modélise ces co-expositions et conclut que l'étude "sur rat vivant" est la seule possible.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en évidence les éventuels effets d’un cocktail de pesticides, d’une exposition aux champs électromagnétiques de nouvelle génération type 5G (CEM) ou de la co-exposition cocktail de pesticides + CEM sur le neurodéveloppement d’animaux. Ce projet sera réalisé sur 805 rats Sprague Dawley (Procédure 1 : 2 rates adultes gestantes et 12 fœtus, Procédure 2 : 15 rates adultes gestantes et 90 ratons, Procédure 3 : 98 rates adultes gestantes et 588 ratons).
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des réponses aux questions scientifiques et aux préoccupations sociétales concernant les possibles effets neurobiologiques des expositions durant le développement aux champs électromagnétiques et à un cocktail de pesticides avec le minimum de rats possibles pour conclure et répondre à l’objectif du projet.
Procédures
Aucune intervention ne sera réalisée sur animaux vigiles. Les rates gestantes des procédures 1, 2 et 3 seront soumises à une échographie sous anesthésie au jour de gestation (G)14. La durée maximale sera de 1h. Les rates des procédures 1 et 2 seront soumises à des injections d’ocytocine (hormone de lactation pour permettre le prélèvement de lait maternel sous anesthésie au 16ème-19ème jour gestationnel). De même, les rates de la procédures 3 seront soumises à des injections d’ocytocine pour réaliser des prélèvements de lait maternel à jour post natal (PND) 15 et 21. Des tests néonataux seront réalisés à PND3 et PND10 chez 1raton/sexe/portée: un test déterminera la capacité du raton à se redresser en partant d'une position où il est sur le dos (durée maximum d'environ 60 secondes), un autre test estimera la capacité d'un raton à s'agripper à une barre (environ 60 secondes) et un dernier test déterminera l'intégrité des réflexes de placement en mesurant la durée de pivotement de l'animal à 180° sur un plan incliné (durée maximum d'environ 60 secondes). Le test de l’open field sera réalisé à PND16 et PND20 chez 1 raton/sexe/portée. Il permettra d'évaluer le comportement anxieux et la locomotion motivée par l'exploration en positionnant l'animal au centre d'une enceinte standard (durée maximum 30 minutes).
Impact sur les animaux
Les doses d’exposition aux pesticides et/ou CEM seront proches des valeurs dites « sans effet toxique observé » ou « sans effet » et ne devraient pas avoir d’impact majeur sur l’animal (malformations fœtales par exemple). Seuls la réalisation des tests comportementaux, les manipulations quotidiennes et les prélèvements (le lait avec les injections pour le prélever, le sang) ou observations spécifiques (échographie), semblent pouvoir causer des effets délétères comme du stress chez les rats. L’hébergement individuel des rates en période périnatale pourrait également être une nuisance causant du stress chez les animaux.
Devenir
Tous les rats seront mis à mort à des temps définis dans le but de réaliser des prélèvements biologiques post mortem pour effectuer des analyses biochimiques et de biomarqueurs cérébraux, ainsi que des dosages dans différents organes cibles.
Remplacement
Les approches informatiques et de cultures cellulaires existantes, ne permettent pas actuellement, de modéliser au mieux l’impact de l’exposition précoce au CEM et à un cocktail de pesticides et surtout à leur co-exposition sur le neurodéveloppement et ce qui en résulte sur les fonctions sensorielles et motrices. En effet, les êtres vivants sont complexes et différents systèmes peuvent intervenir pour limiter les effets d’une exposition ou à contrario être impactés par cette exposition et leur dysfonctionnement entrainant des répercussions sur d’autres organes, cellules, fonction. Pour avoir des réponses prenant en compte tous ces paramètres, la seule approche possible est l’étude sur rat vivant.
Réduction
Pour minimiser le nombre d’animaux à inclure dans l’étude, plusieurs paramètres seront étudiés sur chaque animal. Des animaux supplémentaires seront ajoutés au protocole afin de s’assurer d’obtenir un nombre de ratons suffisant pour réaliser l’étude. Ces animaux supplémentaires ne seront commandés et utilisés qu’en cas de nécessité. Les ratons surnuméraires de chaque groupe pourront être utilisés pour la mise au point de protocoles d’analyses tissulaires post-mortem ce qui évitera de commander des animaux de nécropsie spécifiquement à cet effet. Ainsi, deux rates gestantes permettront de mettre au point les protocoles d’échographie et de prélèvement de lait et 15 rates gestantes permettront de doser les pesticides dans différents organes. En effet, 4 animaux minimum par groupe sont nécessaires pour le dosage en toxicologie. Les effets des pesticides pouvant entraîner, selon la dose utilisée mais aussi selon la sensibilité des individus à la substance, des effets secondaires non prévisibles, demandant d’exclure l’animal de l’étude, un cinquième individu est ajouté aux différents groupes (3 groupes au total). Enfin, 98 rates permettront d’étudier les effets de l’exposition aux pesticides et aux CEM sur leur descendance. Pour obtenir le nombre minimal requis de ratons (36/groupe), un minimum de 6 mères par condition (8 conditions) est requis. Une rate supplémentaire par groupe pourra être utilisée en cas de taille insuffisante de la portée et pour mettre au point certains protocoles. Le nombre d’animaux contrôles est plus important que le nombre d’animaux exposés car la configuration d’hébergement ne permet de réaliser les expérimentations qu’entre un groupe exposé et un groupe contrôle et non de façon concomitante, situation qui avait été envisagée pour diminuer le nombre d’animaux contrôle et donc le nombre d’animaux supplémentaires. Les pesticides étudiés étant volatils, il n’est pas possible de mettre les groupes exposés aux pesticides avec les contrôles dans une chambre et d’avoir les groupes exposés aux CEM dans l’autre chambre. De plus, le laboratoire possède deux chambres d’exposition hébergeant au maximum 7 cages. Les données seront réalisées à l'aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Chaque animal sera observé quotidiennement selon différents critères préétablis afin de déterminer un score à partir d’une grille. Cette grille prendra en compte l’apparence, le comportement et certains signes cliniques, etc. Selon le score obtenu, une action sera mise en place pour soulager l’animal d’une quelconque souffrance. De plus, les animaux seront pesés tous les 2 jours. En période périnatale, une attention particulière sera portée au bien-être des mères et de leur portée et à la nidification. Ainsi, les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être (cylindre en carton, lanière en papier kraft, coton pour la nidification, bâtons de bois à ronger). Pendant la période périnatale, les rates seront hébergées individuellement puis avec leur portée. La prise alimentaire sera mesurée par une balance reliée à la mangeoire. Un test de détection de pesticides sera réalisé au jour 15 de gestation par prélèvement des fèces dans la cage, sans risque de douleur pour l’animal. Sauf contre-indication (âge et poids), une anesthésie gazeuse sera pratiquée en association avec un traitement analgésique avant la mise à mort des animaux. Le suivi des malformations fœtales sera réalisé de façon non-invasive par échographie. Pour limiter la contrainte appliquée aux animaux, ces derniers seront exposés au cocktail de pesticides via l'alimentation et non par gavage.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est un modèle de référence pour les études de toxicologie. En effet, le modèle rat est un bon indicateur pour prédire les éventuels effets toxicologiques chez l’Homme avec des systèmes biologiques et physiologiques largement décrit dans la littérature. Dans la procédure 1, les rates (âge dépendant du fournisseur, environ 15 semaines) arriveront gestantes (G3) au laboratoire pour réaliser des tests pour optimiser le prélevement de lait. Ils commenceront à G16 afin de s’assurer que le stade de gestation est suffisamment avancé pour optimiser le prélèvement (activation de la boucle d’éjection du lait). Une échographie sera réalisée à G14 pour mettre au point cette technique. Dans la procédure 2, des rates gestantes (G3) seront exposées au cocktail de pesticides ou non (groupe contrôle) quotidiennement par alimentation afin d'évaluer l'imprégnation des organes à ce cocktail ainsi que les fœtus. Dans la procédure 3, des ratesgestantes (G3) seront exposées aux différents agents chimiques et/ou physiques de G7 jusqu’au sevrage de leur descendance (PND21) pour évaluer les effets d'une exposition in utero. Le comportement des ratons sera observé à PND3, PND7, PND16, PND18 et PND20 (1raton/sexe/portée) et mis à mort à différents temps PND3, PND7, PND21 (1raton/sexe/portée) pour observer l’évolution du neurodéveloppement.