Troubles nerveux

2 090 rongeurs, 1 640 souris et 450 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées par de nombreuses voies, jusque dans le duodénum ou la trachée sous anesthésie, pendant jusqu'à 24 semaines, pour tester des molécules de thérapie génique contre des maladies génétiques. Le porteur mentionne des modèles génétiquement modifiés au phénotype "dommageable", les animaux étant tués avant l'apparition des symptômes. Il justifie le recours à deux espèces par les exigences des études réglementaires et qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour un développement préclinique.

Objectifs

Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent sur des pathologies génétiques essentiellement neuromusculaires. Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi. Dans ce contexte, nous développons une approche innovante de modulation de l’épissage en interférerant avec la machinerie d’épissage des ARN pré-messagers. Il s’agit plus précisément de forcer la machinerie d’épissage à former et « libérer » des ARN messagers exempts de mutations et capables d’être traduits en protéines fonctionnelles. Pour cela nous développons de courtes séquences d’oligonucléotides antisens (AON) chimiquement modifiés qui gardent la capacité de se lier aux ARN par complémentarité de bases. Le deuxième outil est matérialisé sous la forme d’un petit ARN nucléaire, l’U7snRNA, modifié au niveau de sa séquence d’origine pour participer, au même titre que les AONs, à la modulation de l’épissage des ARN mutés. Les outils dérivés de l’U7snRNA sont délivrés par deux types de vecteurs. Les premiers sont des vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV). Le deuxième type de vecteur que nous développons est matérialisé sous forme de molécule d’ADN nu dérivée du génome des AAV. Le recours aux AAV comme vecteurs de gènes est largement utilisé à travers le monde et des essais cliniques de thérapie génique sont autorisés par les instances règlementaires depuis de nombreuses années.Dans le cadre de cette approche envisagée, il s’agit de trouver la meilleure molécule et la meilleure voie d’administration pour la délivrance de nos outils thérapeutiques dans l’environnement in vivo.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une amélioration significative chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients traités.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée pourront être plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Aucun animal ne recevra plus d’une injection par jour. En revanche, afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 1, nous testerons des voies d’administration moins invasives chez le patient en vue d’un essai clinique, à savoir une administration orale (intra-stomachal ou intra dudodenum) et une administration pulmonaire (intra- nasale ou intra-tracheal). L’administration intra-duodenum sera réalisée uniquement sur un petit nombre d’animaux pour voir si la molécule passe le duodenum. Cette intervention durera 1h entre l’anesthesie et le réveil de l’animal et ne sera pas répétée. En revanche, pour l’administration intra stomachal, intra nasal et intra tracheal ; afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal et intra-nasale sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Pour les administrations intra tracheal elles se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. Pour cela, les animaux recevront une anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxilaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de même de facon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses. Cependant les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la présence de plaies seront évalués post-adminsitration jusqu’au sacrifice. Les animaux montrant un signe quelconque de détérioration de santé dûe à une potentielle toxicité de nos molécules seront sacrifiés immédiatement. Les autres nuisances qui pourraient être observées concernent surtout les animaux subissant la procédure d’administration intra-duodenum qui pourraient présenter des difficultés d’alimentation du fait du déplacement possible du duodenum lors de l’administation. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoins. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classé « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs, et les animaux dans ce projet seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si les symptômes devaient apparaitre prématurément.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de toutes les procédures afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)

Remplacement

Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.

Réduction

Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations (moins invasives pour le patient en vue d’un essai clinique) à savoir l’administration par voie orale ou pulmonaire. Les tests type student, fisher, ANOVA ou Bonferroni/Dunn seront effectués pour chaque lot afin d’obtenir une analyse statistique correcte en utilisant le moins d’animaux possibles suite au plan d’expérience préalablement défini.

Raffinement

LLors de leur arrivée, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, et les animaux seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une autorisation à part au sein de notre animalerie pour la procédure d’élevage.Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.

Choix des espèces

Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique pré-clinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces étant exigés dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Cependant, afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveaux-nés à 4 semaines). Enfin, un de nos objectifs consistera à vérifier la possibilité du passage de la barrière placentaire des médicaments, et nous traiterons pour cela des adultes gestantes.

105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie pour injecter un virus et implanter une fibre optique, puis un test de reconnaissance d'objet avec enregistrement de l'activité neuronale, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur décrit des souris invalidées pour un gène lié à l'autisme et à la déficience intellectuelle, et indique que la chirurgie peut causer œdème et douleur post-opératoire. Il affirme que ces procédures sont "essentielles" et qu'aucun modèle informatique des comportements complexes n'existe encore.

Objectifs

Le but de notre projet est d'étudier la contribution d'un gène muté dans le trouble du spectre autistique. Nous explorerons son rôle dans l'apprentissage et la mémoire. Nous analyserons l'activité des circuits neuronaux du cortex préfrontal par photométrie par fibre lors d'un test de reconnaissance d'objet chez des souris invalidées pour le gène d'intérêt comparées aux souris sauvages. Nous étudierons l'activité de différentes sous-populations neuronales impliquées dans la neurotransmission excitatrice et inhibitrice.

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre de déterminer le rôle du gène d'intérêt dans l'activité des circuits corticaux préfrontaux lors de la mémoire de reconnaissance, contribuant ainsi à mieux comprendre son implication dans l'autisme et la déficience intellectuelle. L'étude dans des modèles murins des conséquences neurobiologiques de l'absence des gènes mutés dans l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux est une étape clé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogénèse de ces maladies, afin de permettre à terme de développer des approches thérapeutiques adaptés.

Procédures

Une procédure chirurgicale est effectuée sous anesthésie générale pour injecter dans le cerveau un virus exprimant un marqueur calcique fluorescent et implanter la fibre optique pour la photométrie par fibre. La durée de la chirurgie est de 30-40 min. Aucun phénotype dommageable n’est prévu suite à la procédure. Après une période de récupération de 3 semaines, les souris sont habituées pendant 3 jours (10 min, 2 fois par jour) à un champ ouvert où sera effectué le test de reconnaissance d'objet. Le jour du test, l'activité neuronale est enregistrée par photométrie par fibre pendant 15-20 min en état basal, puis pendant 10 min lorsque l'animal explore 2 objets identiques. L'animal est ensuite replacé dans sa cage et au but de 10 min, il est réintroduit dans le champ et l'activité neuronale est enregistrée pendant 10 min lorsqu'il explore un objet familier et un objet nouveau. Au total, la procédure dure 45-50 min. Après 2 jours de repos, les souris sont enregistrées à nouveau lors d'un deuxième test de reconnaissance d'objet (45-50 min). A la fin des expériences, les animaux subiront une perfusion intracardiaque avec un agent fixateur pendant 3 min, sous anesthésie profonde, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques. Au total, la procédure de perfusion dure 10-15 min.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour injecter le virus dans le cerveau et implanter la fibre optique peut causer un œdème localisé associé à une douleur post-opératoire passagère. Il existe un risque faible d'infection suite à la chirurgie et l'implantation de la fibre optique. La manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau lors du test comportemental peuvent engendrer un léger stress chez les souris. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées.

Devenir

Tous les animaux injectés avec le virus et utilisés dans les expériences de photométrie par fibre (n=105) seront perfusés avec un agent fixateur à la fin des expériences, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs puisque nous étudions des mécanismes pathologiques complexes associés à l’autisme et la déficience intellectuelle tels que des déficits cognitifs et l'activité des circuits neuronaux intacts. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre les conséquences de l'inactivation du gène d'intérêt dans le cerveau. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 105 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux au strict nécessaire afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement dans ce type d'expériences. Pour cela, le nombre d’animaux doit se situer entre 12-15 par condition étudiée. En effet, la variabilité interindividuelle élevée observée lors des tests comportementaux, y compris le test de reconnaissance d'objet, nécessite de groupes de taille relativement élevée. La taille des groupes est déterminée sur la base de la littérature scientifique et notre propre expérience dans ce type d'analyses. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. L’injection stéréotaxique de virus et la pose de fibres optiques sont réalisées sous anesthésie totale et locale pendant la chirurgie et un analgésique est administré en péri-opératoire. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance selon des points limites préétablis, est exclue du protocole et euthanasiée. Les souris sont hébergées à raison de 4 animaux par cage dans une animalerie de stabulation (température 19–21°C, cycle jour–nuit 12h–12h), avec accès libre à l’eau et aux croquettes. La stratégie d’enrichissement consiste à ajouter un nid des lanières de papier Kraft. La litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Une semaine avant le test de reconnaissance d'objet, les souris sont manipulés quotidiennement par l'expérimentateur pendant 5 min afin de les habituer et réduire le stress. De plus, les souris sont exposées au champ ouvert plusieurs fois avant le test de reconnaissance d'objet, d'abord en groupe et ensuite individuellement, afin de réduire le stress engendré par l'environnement nouveau. 48 h de repos sont réservées entre les procédures comportementales.

Choix des espèces

Le système nerveux de la souris présente des analogies avec celui de l’être humain. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé pour les études neurobiologiques et comportementales en rapport avec l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux. Enfin, on a accès à des souris transgéniques afin d’étudier le rôle des gènes d’intérêt, ce qui permet d’aborder leur fonction dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (2-6 mois). L'autisme étant un trouble qui persiste toute la vie, nous avons choisi d'étudier les conséquences de la perte du gène chez l'adulte, une fois que l'ensemble du système nerveux est développé.

Vérifier sur la souris l'effet d'une lumière dirigée vers le crâne sur des lésions de type Alzheimer permettrait, écrit le porteur, d'"entreprendre un projet pré-clinique sur singe de manière plus sereine". 100 souris, dont 60 femelles génétiquement modifiées pour développer ces lésions, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Pendant onze à douze mois, elles reçoivent chaque jour trente minutes de lumière dans leur cage, à une heure qui varie selon les groupes, subissent trois prises de sang éveillées sous la mâchoire, puis un à deux mois de tests : labyrinthe radial à huit bras, labyrinthe de Barnes, Rotarod et open field. Sous une dose létale d'anesthésique, leur sang et leur liquide céphalo-rachidien sont prélevés avant une perfusion par le cœur. Le porteur affirme qu'"un modèle animal est indispensable et représente le seul moyen de répondre à cette question".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) comporte plusieurs dysfonctionnements cellulaires tels que l’hyper-phosphorylation ou l’agrégation de petites protéines. Ces protéines sont normalement éliminées par la cellule mais en conditions pathologiques, elles sont présentes en excès et peuvent être très toxiques. Le but du projet est d’observer à quelle période de la journée, la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne a un effet curatif sur un modèle murin de la MA. Plusieurs études ont déjà pu observer que la photobiomodulation procure un bénéfice thérapeutique sur d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie de Parkinson mais aucun article ne montre in vivo à quel moment elle est la plus bénéfique. C’est pour cela que le présent projet permettra d’obtenir des réponses sur l’évolution comportemental et anatomique de la maladie dans un modèle de souris. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons constituent un modèle de choix pour la maladie d’Alzheimer. Elles développent la MA de type symptomatique à partir de 12 mois même si certaines protéines en excès sont présentes dès le 3ème mois. Cette étude permettra également d’entreprendre une voie thérapeutique non-invasive pour la médecine humaine. Pour respecter les 3Rs, ce projet comporte une procédure pilote afin de déterminer les paramètres techniques de la photobiomodulation et l’entraînement au bon geste de prélèvements du sang et du liquide céphalo rachidien sur un nombre réduit d’animaux, le raffinement avec l'utilisation d'analgésique et le suivi des animaux par l'expérimentateur. Chaque souris sera préalablement anesthésiée avant sa mise à mort pour éviter toute douleur. Pour être en accord avec la réglementation, l'expérimentateur mettra en œuvre des actions précoces et adaptées en cas d’atteinte d’un point limite et ceci afin de respecter le bien-être animal. Les différentes étapes du projet sur le modèle murin seront l’application de la photobiomodulation sur des souris âgées de 3 mois (phase 1), la réalisation de tests comportementaux (phase 2) permettant d’étudier les bénéfices symptomatiques et la mise à mort des animaux pour des analyses biochimiques et histologiques (phase 3).

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mieux comprendre l’effet de la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne dans un contexte pathologique et définir la meilleure période pour photobiostimuler le cerveau. En effet, la vérification des bienfaits sur les stigmates de la maladie d’Alzheimer dans un modèle murin permettrait d’entreprendre un projet pré-clinique sur singe de manière plus sereine. Il s’agirait également d’une stratégie non-invasive qui pourrait être rapidement adoptée pour un traitement chez l’être humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à : -la photobiomodulation durant 11/12 mois pendant 30 minutes chaque jours (à des périodes différentes de la journée selon les groupes) tout en restant dans leur cage d’hébergement (aucune manipulation) -3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles en sub-mandibulaire (à 3 mois, 7 mois, 12 mois, durée de 5 minutes maximum par souris) -des tests comportementaux à l’âge de 11/13 mois (tests mesurant les déficits cognitifs et étalés sur 1 à 2 mois par souris, 15 jours le 8-arm radial, 8 jours Barnes maze, 2 jours Rotarod, et 2 jours pour l’OF avec une moyenne de 15/20 minutes par jour, par souris et par test) -1 prélèvement sanguin et 1 prélèvement du liquide céphalo-rachidien sous anesthésie réalisée avec des doses létales, l’animal étant ensuite perfusé en intra-cardiaque afin d’effectuer des analyses immunohistochimiques et biochimiques. L’ensemble de cette procédure dure 1H30 maximum.

Impact sur les animaux

Pour la phase 1, un faible stress pourrait être attendu avec la présence de la photobiomodulation mais cela sera vite dissipé par l’habituation à la lumière des animaux au fil des semaines. Par ailleurs, les prélèvements sanguins pourront également induire un stress mais nous aurons recours à l’isoflurane pour anesthésier l’animal si le stress est trop important. La phase 2 pourrait également induire un stress chez les animaux car les tests comportementaux demandent un minimum de stress pour stimuler l’animal à effectuer le test comportemental. Des points limites seront déterminés afin de pouvoir exclure les animaux incapables d’effectuer les tests comportementaux. Enfin la phase 3 consiste à mettre à mort l’animal par perfusion intracardiaque donc chaque animal recevra une dose létale d’anesthésique afin que chaque souris ne ressente rien lors de cette procédure.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Pour obtenir des résultats les plus cohérents sur l’influence du rythme circadien pour l’application de la photobiomodulation (PBM), un modèle animal est indispensable et représente le seul moyen de répondre à cette question. A ce jour il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux par une autre alternative. En effet, un modèle intégré Alzheimer permettra d’obtenir toutes les informations sur la période de la journée la plus bénéfique pour la PBM et de déterminer l’ensemble des modifications subcellulaires générées par la PBM. L’avantage incontestable des souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d’Alzheimer (MA), que nous avons choisi, est la dynamique évolutive de la pathologie, ressemblant au développement de la MA chez l’humain. D’un point de vue comportemental, les souris présentent des déficits de mémoire, d’apathie et d'anxiété. Survenant en amont de l’apparition des plaques, des modifications du rythme circadien et une perte de protéines synaptiques ont été décelées. Par imagerie, on distingue aussi une altération de l’assimilation du glucose dans les aires cérébrales identiques à celles impactées chez l’être humain.

Réduction

En prenant connaissance des bases de données sur les tests comportementaux, en prenant en compte des connaissances du modèle transgénique par le concepteur du projet, en prenant en compte des conditions de photobiomodulation et en prenant en compte des paramètres statistiques sur le logiciel G*Power (f=0.25, pouvoir statistique=0.7, p value

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure expérimentale, des points limites ont été déterminés pour agir en fonction de la douleur ou du mal être ressenti. La phase 1 n’a à priori aucune incidence sur le bien-être de l’animal mais une surveillance accrue sera faite les premières semaines afin d’évaluer les éventuels effets indésirables que pourrait être produit par la photobiomodulation. Par ailleurs, l’expérience pilote permettra de mieux anticiper les mesures à prendre pour diminuer au maximum les répercussions de cette procédure. En ce qui concerne la phase 2, les tests comportementaux procurent différents niveaux de stress. Avant de commencer la procédure, l’expérimentateur ira chaque jour pendant une semaine pour habituer l’animal à être manipulé. Pour finir, en ce qui concerne la phase 3, les souris recevront une dose létale d’anesthésique permettant de diminuer à zéro la douleur infligée lors de la perfusion intracardiaque et du prélèvement du liquide céphalo-rachidien.

Choix des espèces

Pour analyser l’efficacité de la photobiomodulation (PBM) extracrânienne aux différentes périodes de la journée, pour vérifier la pénétrance de la PBM à travers la boite crânienne et pour observer toutes les conséquences subcellulaires dans un contexte Alzheimer, la souris génétiquement modifiée modèle de la maladie d’Alzheimer correspond à l’espèce la plus pertinente pour tester cette hypothèse.

4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.

Objectifs

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).

Remplacement

Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.

Réduction

Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.

1 402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées à des additifs alimentaires de la vie in utero à l'âge adulte, elles subissent deux tests comportementaux au sevrage et huit à l'âge adulte, dont le porteur ne précise pas la nature. Il affirme que ces tests ne durent que quelques minutes et n'induisent pas de stress majeur, et que l'exposition alimentaire ne peut être étudiée que sur des animaux vivants. Toutes les souris sont mises à mort pour des analyses biochimiques et cellulaires.

Objectifs

Le projet porte sur l’étude de l’impact d’une exposition chronique à des additifs alimentaires sur la mise en place du cerveau et de ses fonctions depuis la vie in utero jusqu’à l’âge adulte, en observant la régulation et les fonctions microgliales ainsi que le développement cérébral et le comportement

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats permettra de mettre en avant l’importance de la période périnatale ou non dans l’exposition aux additifs alimentaires, d'explorer le devenir périnatal des additifs alimentaires, et d’en évaluer les effets sur les fonctions cérébrales des descendants, jusque dans leurs intéractions directes. Ceci permettra de d’accroitre les connaissances scientifiques sur les additifs alimentaires qui sont largement critiqués voir prohibés dans l’alimentation et de valider ou non leur lien avec des altérations comportementales, neurologiques et moléculaires.

Procédures

Tests comportementaux au sevrage (2 tests) et à l’age adulte (8 tests) – quelques minutes par test

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de réaliser des analyses biochimiques et cellulaires lors des différents temps d'exposition proposés dans le projet.

Remplacement

L’étude de l’exposition à des additifs alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant la différence entre plusieurs groupes.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l'inconfort (manipulation régulière et hébergement en cage collective avec enrichissement, utilisation d'antalgiques) des animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement (test comportementaux et électrophysiologie). Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines) afin qu’ils soient capables de procréer et leurs descendants seront utilisés au sevrage ou à l’âge de 3 mois selon les procédures. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition périnatale suivie d’une exposition post-sevrage sur le développement des fonctions cérébrale, ainsi que son maintien chez l’adulte.